KR20100096010A - Ｄｒｇ2 유전자의 신규한 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 DRG2(developmentally regulated GTP-binding protein 2) 유전자의 신규한 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 DRG2 유전자의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 갖는 프로브 또는 프라이머를 포함하는 대사성 질환의 진단용 조성물, 키트 및 마이크로어레이에 관한 것이며, 또한, 상기 유전자의 발현을 억제하거나 또는 상기 유전자로부터 발현되는 단백질의 활성을 억제할 수 있는 억제제를 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 및 상기 억제제를 스크리닝 하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 DRG2 유전자는 세포내에서 과발현시 지질의 축적 및 지방세포의 크기를 증가시키고 지질대사 관련 유전자들의 발현을 촉진시킴으로써 대사성 질환을 유발시키므로, 이 유전자의 발현을 저해시키면 대사성 질환의 유발을 억제시키는 작용효과를 가져온다. 따라서 DRG2 유전자는 대사성 질환의 진단 또는 치료제의 표적 유전자로 활용될 수 있다.

Description

ＤＲＧ2 유전자의 신규한 용도{Novel use of DRG2 gene}
본 발명은 DRG2(developmentally regulated GTP-binding protein 2) 유전자의 신규한 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는, 대사성 질환과 관련된 DRG2 유전자의 신규한 용도에 관한 것이다.
대사성 질환(Metabolic Disease)이란 체내의 과잉영양 축적 및 운동부족으로 인한 비만, 당뇨, 고혈압 및 동맥경화 등과 같은 위험인자가 함께 나타나는 증후군을 말하며, 최근에는 세계보건기구와 미국 국립보건연구원의 심, 폐, 혈액 연구소가 제정한 성인 치료프로그램 III을 통해 대사증후군 또는 인슐린저항성(Insulin resistance syndrome) 증후군이라고 공식 명명되었다. 또한, 2001년에 공표된 미국 NCEP(National Cholesterol Education Program)의 ATP에 따르면, 허리둘레가 남자 40인치(102 cm), 여자 35인치(88 cm) 이상인 복부 비만, 중성지방(triglycerides) 150 mg/dL 이상, HDL 콜레스테롤이 남자 40 mg/dL, 여자 50 mg/dL 이하, 혈압 130/85 mmHg 이상, 공복혈당(fasting glucose)이 110 mg/dL 이상 등의 다섯 가지 위험인자 중 한 환자가 세 개 이상을 나타낼 경우 이를 대사성 질환으로 판정하게 되며, 동양인의 경우에 있어서는 허리둘레가 남자 90 , 여자 80 이상일 때 복부비만으로 다소 조정되어 있고, 이와 같은 규정을 적용할 경우 한국인은 전 인구의 25 % 정도가 대사증후군 증상을 나타낸다는 최근의 연구 보고도 있다.
한편, 경제발전에 따른 생활수준의 향상으로 대사성 질환의 주원인이 되는 비만에 속하는 현대인들이 급속히 증가하고 있다. 이러한 비만은 과다 열량의 섭취로 인해 여분의 열량이 체내에 지방의 형태로 축적되는 현상을 말하는 것으로서, 특히 내장 기관에 증식되고 있는 지방세포가 더욱 직접적으로 지질대사에 영향을 주어 발생한다고 알려져 있다(Bjorntorp P, Diabetes Care14, 1132~1143, 1991, Frayn KN, Visceral fat and insulin resistance-causative or correlatives British J Nutr 83, 71~77, 2000, Wajchenberg BL, Endocr Rev 21: 697~738, 2000). 또한, 이러한 비만 및 당뇨병과 같은 대사성 질환을 일으킬 수 있는 위험 요인 중 대표적인 것이 지방화(Adipogenesis)인데, 지방화란 미성숙지방세포(preadipocytes)로부터 지방세포가 분화되어 지방을 축적하게 되는 과정을 말하며, 성숙한 지방 세포는 섬유아세포(fibroblast)와 같은 미성숙지방세포로부터 분화되어 궁극적으로 세포 내에 지방 방울(lipid droplet)을 형성하게 된다.
지방세포 분화는 근세포, 골세포 또는 지방세포를 형성할 수 있는 중간엽 줄기세포에서 시작되며, 지방전구세포에서 형태학적으로나 생화학적으로 완벽히 성숙된 지방세포로 분화되기 위해서는 지방세포 분화와 관련된 유전자의 조절부위에 중요한 전사활성인자가 활성되어야 하며(Gregiore et al., 1998), 여러 호르몬과 다양한 전사인자들의 상호작용을 통하여 매우 복잡한 과정으로 이루어진다. 지방세포 분화를 유도하는 외부 신호 중 인슐린은 가장 널리 알려져 있는 호르몬으로서 지방세포의 대사조절에 중추적인 역할을 담당하고 있다. 지방전구세포는 인슐린 자극에 의해 지방세포로 분화를 시작하는데 인슐린은 당질의 흡수와 중성지방의 합성을 증가시키는 등의 복잡한 기전을 통해 지질의 형태로 에너지를 저장하고, 리포프로틴 리파아제(lipoprotein lipase)를 활성화시킴으로써 혈액 내에 순환하는 리포프로틴 유래의 지방산 흡수를 촉진하기도 한다(Giorgino et al., 2005). 또한, 지방세포의 분화조절은 최종적으로 PPAR, C/EBP family, ADD1/SREBP 등의 전사인자들이 담당하고 있는 것으로 알려져 있다(Rosen et al., 2000). 이들 전사인자들은 지방세포의 분화과정 중 다른 시점에서 발현이 유도되며 서로 상호작용을 통하여 여러 지방세포 특이 유전자들의 발현을 조절하고, 지방대사의 활성화와 지방세포 분화를 유도한다고 밝혀져 있다(Morrision and Farmer,2000). 이러한 전사조절인자 중 대표적인 것으로서 C/EBP(CCAAT/enhancer binding protein)와 PPAR(peroxisome proliferation activating receptor)를 들 수 있다. 이들은 지방세포 특이유전자의 조절부위에 결합하여 전사를 촉진함으로써 지방세포분화를 촉진시킨다. 또한, 3T3-L1 지방전구세포주가 지방세포로 분화되기 위해서는 많은 지방특이 유전자의 전사가 복합적으로 활성화되어야 하는데 이들의 변화를 유발시키는 중요한 요소인 C/EBPa는 지방특이 유전자의 조절부위에 결합하여 전사를 촉진시킨다. 다른 전사인자인 PPAR의 경우, 분화과정의 초기 단계인 지방전구세포에서 최고로 발현되어 지방 특이적 유전자에 직접 작용하는 중요 조절자로서 모든 지방생성과정의 프로그램을 관장한다(Olofsson et al., 2008).
따라서 비만을 포함하는 대사성 질환들은 앞서 기술한 바와 같이 세포 내에서 매우 복잡한 메카니즘에 의해 유발되는 것인 만큼, 상기 메카니즘을 보다 효율적으로 조절함으로써 대사성 질환을 진단하고 예방 및 치료할 수 있는 기술들의 개발이 필요하다. 한편, 현재까지 개발된 종래기술들에 있어서, 세계적으로 많은 관심을 가지고 있는 비만치료제의 경우, 지금까지 알려진 비만치료제들 중 가장 대표적인 약물들로는 제니칼(XenicalTM, 로슈제약회사, 스위스), 리덕틸(ReductilTM, 애보트사 미국), 엑소리제(ExoiseTM, 아코파마, 프랑스) 등이 있다. 그러나 이들 약물들은 심장질환, 호흡기 질환, 신경계질환 등의 부작용과 함께 그 효능의 지속성이 낮아 더욱 효율적인 비만치료제의 개발이 필요한 실정이다.
이에 본 발명자들은 대사성 질환을 진단하고 예방하며 치료할 수 있는 새로운 방법을 연구하던 중, DRG2(developmentally regulated GTP-binding protein 2) 유전자가 세포 내에서 과발현시 지질의 축적 및 지방세포의 크기를 증가시키고, 지질대사 관련 유전자들의 발현을 촉진시킴으로써 대사성 질환을 유발할 수 있다는 기작을 최초로 확인함으로써 지질대사에 있어서 DRG2 유전자의 신규한 용도를 규명하였다.
따라서 본 발명의 목적은 대사성 질환의 진단용 조성물, 진단용 키트 및 진단용 마이크로어레이를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 대사성 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 물질을 스크리닝 하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 DRG2(developmentally regulated GTP-binding protein 2) 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는 프로브 또는 프라이머를 포함하는 대사성 질환의 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 DRG2(developmentally regulated GTP-binding protein 2) 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는 프로브 또는 프라이머를 포함하는 대사성 질환의 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 DRG2(developmentally regulated GTP-binding protein 2) 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는 프로브 또는 프라이머를 포함하는 대사성 질환의 진단용 마이크로어레이를 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) DRG2(developmentally regulated GTP-binding protein 2) 유전자 또는 단백질을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; (b) 상기 DRG2 유전자의 발현양, DRG2 단백질의 양 또는 DRG2 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 측정 결과, DRG2 유전자의 발현양, DRG2 단백질의 양 또는 DRG2 단백질의 활성이 감소되는 경우에 상기 시료는 대사성 질환의 치료 또는 예방용 물질로 판정하는 단계를 포함하는, 대사성 질환의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법을 제공한다.
나아가 본 발명은 DRG2(developmentally regulated GTP-binding protein 2) 유전자의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 가지는 안티센스 또는 siRNA(small interference RNA) 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 DRG2 유전자는 세포내에서 과발현시 지질의 축적 및 지방세포의 크기를 증가시키고 지질대사 관련 유전자들의 발현을 촉진시킴으로써 대사성 질환을 유발시키므로, 이 유전자의 발현을 저해시키면 대사성 질환의 유발을 억제시키는 작용효과를 가져온다. 따라서 DRG2 유전자는 대사성 질환의 진단 또는 치료제의 표적 유전자로 활용될 수 있다.
도 1a는 본 발명의 DRG2 유전자가 과발현된 형질전환 마우스 및 대조군 마우스 간의 식이섭취 변화를 나타낸 것이다.
도 1b는 본 발명의 DRG2 유전자가 과발현된 형질전환 마우스 및 대조군 마우스를 고지방식이와 일반식이로 투여한 후 체중의 변화를 나타낸 것이다.
도 2a는 본 발명의 DRG2 유전자가 과발현된 형질전환 마우스 및 대조군 마우스에게 고지방식이 및 일반식이를 투여한 후 복부를 절단하여 지방량을 비교한 사진이다.
도 2b는 본 발명의 DRG2 유전자가 과발현된 형질전환 마우스 및 대조군 마우스에게 고지방식이 및 일반식이를 투여한 후 생식기 주변의 지방량을 비교한 사진이다.
도 2c는 본 발명의 DRG2 유전자가 과발현된 형질전환 마우스 및 대조군 마우스에게 고지방식이 및 일반식이를 투여한 후 총 체중을 비교한 그래프이다.
도 2d는 본 발명의 DRG2 유전자가 과발현된 형질전환 마우스 및 대조군 마우스에게 고지방식이 및 일반식이를 투여한 후 생식기 주변의 지방량을 비교한 그래프이다.
도 2e는 본 발명의 DRG2 유전자가 과발현된 형질전환 마우스 및 대조군 마우스에게 고지방식이 및 일반식이를 투여한 후 신장 주변의 지방량을 비교한 그래프이다.
도 3a 및 3b는 본 발명의 DRG2 유전자의 과발현으로 인한 지질대사 관련 유전자들인 AQP-7, aP2, PPARr, SREBP1, Glyk 유전자의 발현 정도를 PCR을 통해 분석한 결과이며, GAPDH는 대조군으로 사용한 것이다.
도 4는 본 발명의 DRG2 유전자가 과발현된 형질전환 마우스 및 대조군 마우스의 조직 절편을 대상으로 H&E 염색법 및 oil red O 염색법을 이용하여 지방 세포의 크기 및 지질의 축적 정도를 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 5a는 본 발명의 DRG2 유전자가 과발현된 형질전환 마우스 및 대조군 마우스에게 고지방식이 및 일반식이를 투여한 다음 공복시의 혈당을 측정하여 비교한 그래프이다.
도 5b는 본 발명의 DRG2 유전자가 과발현된 형질전환 마우스 및 대조군 마우스에게 고지방식이 및 일반식이를 투여한 다음 글루코스를 주입후 혈당의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 6a 내지 6c는 본 발명의 DRG2 유전자가 과발현된 형질전환 마우스 및 대조군 마우스의 혈청을 대상으로 ELISA를 이용하여 혈청내의 인슐린, 렙틴 및 당내성의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 7은 DRG2 유전자에 의한 PPAR-감마 활성도를 루시퍼레이즈 활성 분석을 통해 확인한 것을 나타낸 그래프이다.
도 8에서 8a는 전구지방세포 및 분화된 지방세포의 사진을 나타낸 것이고,
8b는 분화된 지방세포에서 DRG2 및 지방세포 분화에 중요한 역할을 하는 인자인 SREBP-1, AP2와 PPAR-감마의 발현 양상을 RT-PCR을 통해 확인한 것을 나타낸 사진이다.
DRG(developmentally regulated GTP-binding protein) 단백질은 GTP와 상호작용에 필요로 하는 G1~G5를 모두 가지고 있는 GTPase에 속하는 단백질 중의 하나이다(Leipe et al, 2002). 이러한 DRG는 대부분이 게놈 DNA 또는 cDNA의 클로닝 과정에서 최근에 우연히 발견된 것들이기 때문에 뚜렷한 기능은 잘 알려져 있지 않다. 단지 DRG가 다양한 종의 세포에서 핵심적인 기능을 수행할 가능성에 대해 언급된 바 있고(Li and Trueb, 2000), cDNA의 클로닝을 통하여 생쥐 태아의 뇌의 분화초기에 높게 발현되었다가 분화가 진행되면서 발현이 감소한다는 결과가 보고된 바 있다(Kumar et al., 1992). 또한, DRG는 주로 세포질에 존재하며(Sazuka et al., 1992), 세균에서부터 사람에 이르기까지 거의 모든 종류의 세포에 존재한다.
진핵생물의 DRG류로는 DRG1과 DRG2로 분류될 수 있는데, DRG1은 사람의 22번 염색체의 22q12-q13.1 부위에 존재하고, DRG2는 사람의 17번 염색체의 17p11.2 부위에 존재한다고 알려져 있다(Li and Trueb., 2000). 두 유전자 중, DRG2는 비교적 최근에 발견된 유전자로써 최근 보고된 결과에 의하면, DRG2 단백질은 뇌의 분화 초기에 증가했다가 분화가 진행됨에 따라 발현이 감소하고(Sazuka et al., 1992), 또한 DRG2가 과발현된 사람의 T-세포인 Jurkat세포의 경우, 세포주기가 G2/M에서 정지되어 세포의 성장이 억제되는 반면, 세포고사는 감소한다는 결과가 밝혀진 바 있다(Ko et al., 2004). 그러나 DRG2 유전자에 대한 다른 기능에 대해서는 전혀 알려진 바가 없었다.
이에 본 발명자들은 세균에서부터 사람에 이르기까지 DRG2 유전자가 잘 보존되어 있는 것으로 보아 상기 유전자가 세포내에서 중요한 역할을 할 것이라고 생각하였고, 그 기능을 규명하기 위해 DRG2 유전자가 과발현되는 형질전환 마우스를 제작하여 표현형을 분석하였다. 그 결과, 본 발명의 일실시예에 따르면, DRG2 유전자가 과발현된 형질전환 마우스의 경우, 형질전환하지 않은 대조군 마우스에 비해 생식기 주변의 지방(epididymal fat) 및 신장 주변 지방의 무게가 월등히 증가한 것을 확인할 수 있었고, 전반적인 복부 지방의 분포도 대조군에 비해 DRG2 유전자가 과발현된 형질전환 마우스에서 현저히 증가한 것을 확인할 수 있었다(실시예 2 참조).
또한, 본 발명자들은 DRG2 유전자가 지방대사 뿐만 아니라 지방세포 분화에도 영향을 줄 수 있다고 판단되어 DRG2 유전자가 지방세포 분화와 관련된 유전자들에게 어떠한 영향을 주는지 조사하였다. 그 결과, 본 발명의 일실시예에 따르면, DRG2 유전자의 과발현은 지질대사 과정에서 지방세포 분화에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 aP2, PPAR 및 SREBP-1 유전자의 발현을 촉진시킨다는 사실을 확인하였다(실시예 3 참조).
나아가 본 출원인은 DRG2 유전자의 과발현이 대사성 질환을 유발시킬 수 있는지를 확인한 결과, 본 발명의 일실시예에 따르면, DRG2 유전자가 과발현된 형질전환 마우스의 경우 대조군에 비해 지질의 축적이 증가하여 지방간이 형성된 것을 확인할 수 있었고, 지방 세포의 크기도 증가한 것으로 나타났으며(실시예 4 참조), 당내성이 증가하는 인슐린 저항성이 유발되는 것을 확인할 수 있었다(실시예 5 및 6 참조).
또한, 본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명에 따른 DRG2에 의해 지방세포 분화 조절에 중요한 역할을 수행하는 전사조절인자인 PPAR-감마의 활성도를 조절하는 역할을 하는지 루시퍼레이즈 분석을 통해 확인한 결과, DRG2에 의해 PPAR- 감마의 활성도는 증가하는 것으로 나타났고(실시예 7 참조), 분화된 지방세포에서 DRG2 유전자의 발현 양상을 분석한 결과, 분화된 지방세포에서 DRG2의 합성이 증가하는 것으로 나타났다(실시예 8 참조).
따라서 본 발명에 따른 DRG2 유전자의 발현량을 측정할 경우, 대사성 질환을 진단할 수 있다.
그러므로 본 발명은 DRG2(developmentally regulated GTP-binding protein 2) 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는 프로브 또는 프라이머를 포함하는 대사성 질환의 진단용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 진단용 조성물에 포함되는 상기 프로브 또는 프라이머는 DRG2(developmentally regulated GTP-binding protein 2) 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는 특징이 있으며, 본 발명에서 언급한 DRG2(developmentally regulated GTP-binding protein 2) 유전자의 서열은 서열번호 15에 나타내었다. 상기 진단은 병리 상태를 확인하는 것을 나타내는 용어로서, 본 발명에서의 진단은 DRG2 유전자의 발현 유무 및 발현 정도를 확인하여 대사성 질환의 발병여부, 발전 및 경감 등을 판단하는 것도 포함하는 의미를 갖는다.
본 발명의 진단용 조성물은 본 발명의 DRG2 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는 프로브 또는 프라이머 이외에도 상기 프로브 또는 프라이머의 구조 또는 생리활성을 안정하게 유지시켜 주는 완충액 또는 반응액이 추가로 포함할 수 있으며, 안정성을 유지하기 위해, 분말 상태 또는 적절한 완충액에 용해된 상태 또는 4가 유지된 상태로 제공될 수 있다.
또한, 본 발명의 진단용 조성물은 진단의 신속도 및 편리성을 높이기 위해, 적합한 담체 또는 지지체상에 공지된 다양한 방법을 이용하여 고정화된 상태로 제공될 수 있다(Antibodies: A Labotory Manual, Harlow & Lane; Cold SpringHarbor, 1988). 적합한 담체 또는 지지체의 예로는 아가로스, 셀룰로즈, 니트로셀룰로즈, 덱스트란, 세파덱스, 세파로즈, 리포솜, 카복시메틸 셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 폴리스테린, 반려암, 여과지, 이온교환수지, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 유리, 폴리아민-메틸 비닐-에테르-말레산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레산 공중합체, 나일론, 컵, 플랫 팩(flat packs) 등이 포함될 수 있다. 그 외의 다른 고체 기질로는 세포 배양 플레이트, ELISA 플레이트, 튜브 및 폴리머성 막이 있다. 상기 지지체는 임의의 가능한 형태, 예를 들어 구형(비드), 원통형(시험관 또는 웰 내면), 평면형(시트, 시험 스트립)을 가질 수 있다.
본 명세서에서, 상보적(complementary)이라는 용어는 어떤 특정한 혼성화 또는 어닐링 조건 하에서 본 발명의 DRG2 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도의 상보성을 갖는 것을 의미한다. 따라서 상보적이라는 용어는 완전 상보적(perfectly complementary)과는 다른 의미를 가지며, 본 발명의 프라이머 또는 프로브는 DRG2 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도이면, 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 염기서열을 가질 수 있다.
본 명세서에서, 프로브라는 용어는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타켓 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것을 말한다. 본 발명에 따른 프로브는 단일쇄일 수 있으며, 바람직하게는 올리고디옥시리보뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 프로브는 자연 dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 펩타이드 핵산 (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.
본 명세서에서, 프라이머란 용어는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있을 수 있다. 또한, 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 DRG2 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머는 유전자 증폭 반응에 이용될 수 있는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 서열번호 1 및 2로 이루어진 프라이머 쌍일 수 있다. 상기 증폭 반응은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 말하며, 이러한 유전자 증폭 반응들에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있고, 예컨대, 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 리가아제 연쇄반응(LCR), 전자 중재 증폭(TMA), 핵산 염기서열 기판 증폭(NASBA) 등이 포함될 수 있다.
본 명세서에서 대사성 질환이란 체내의 에너지 대사 과정의 이상으로 야기되는 질환을 일컫는 용어로서, 지방세포의 분화 및 지질대사의 조절이상으로 야기되는 질환을 말한다. 상기 대사성 질환으로는 이에 제한되지는 않으나, 비만, 당뇨병, 고지혈증, 고콜레스테롤증, 동맥경화증 및 지방간 등이 포함될 수 있다. 또한, 본 발명은 DRG2(developmentally regulated GTP-binding protein 2) 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는 프로브 또는 프라이머를 포함하는 대사성 질환의 진단용 키트를 제공한다.
상기 진단용 키트에 포함되는 프로브 또는 프라이머용어에 대해서는 앞서 기술된 바와 같으며, 바람직하게 상기 프라이머는 서열번호 1 및 2로 이루어진 프라이머 쌍일 수 있다. 본 발명의 대사성 질환 진단용 키트가 만일 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있으며, 본 발명의 대사성 질환 진단용 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
또한, 본 발명은 DRG2(developmentally regulated GTP-binding protein 2) 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는 프로브 또는 프라이머를 포함하는 대사성 질환의 진단용 마이크로어레이를 제공한다.
본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기 프로브 또는 프라이머는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기체(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기체는 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함할 수 있다. 상기 혼성화 어레이 요소는 상기 기체 상에 배열되고 고정화되며, 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기체에 결합될 수 있다.
한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료 DNA는 표지(labeling)되고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화 될 수 있다. 혼성화 조건은 다양할 수 있으며, 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) DRG2(developmentally regulated GTP-binding protein 2) 유전자 또는 단백질을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; (b) 상기 DRG2 유전자의 발현양, DRG2 단백질의 양 또는 DRG2 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 측정 결과, DRG2 유전자의 발현양, DRG2 단백질의 양 또는 DRG2 단백질의 활성이 감소되는 경우에 상기 시료는 대사성 질환의 치료 또는 예방용 물질로 판정하는 단계를 포함하는, 대사성 질환의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 따르면, 먼저 DRG2 유전자 또는 단백질을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시킬 수 있다. 여기서 상기시료는 DRG2 유전자의 발현량, DRG2 단백질의 양 또는 DRG2 단백질의 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 뉴클레오티드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 이후, 시료가 처리된 세포에서 DRG2 유전자의 발현량, DRG2 단백질의 양 또는 DRG2 단백질의 활성을 측정할 수 있으며, 측정 결과, DRG2 유전자의 발현량, DRG2 단백질의 양 또는 DRG2 단백질의 활성이 감소되는 것이 측정되면 상기 시료는 대사성 질환의 치료 또는 예방용 물질로 판정될 수 있다.
상기에서 DRG2 유전자의 발현량, DRG2 단백질의 양 또는 DRG2 단백질의 활성을 측정하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 수행될 수 있는데, 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블랏, 노던 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)등을 이용하여 수행할 수 있다.
나아가 본 발명은 DRG2(developmentally regulated GTP-binding protein 2) 유전자의 발현을 억제하거나 또는 DRG2 단백질의 발현 및 활성을 감소시키는 물질을 유효성분으로 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 화학물질, 뉴클레오티드, 안티센스, siRNA 올리고뉴클레오타이드 또는 천연물 추출물을 유효성분으로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 본 발명의 DRG2(developmentally regulated GTP-binding protein 2) 유전자의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 가지는 안티센스 또는 siRNA(small interference RNA) 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 포함할 수 있다.
본 발명에서 "안티센스 올리고뉴클레오타이드란 용어는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 본 발명의 안티센스 서열은 DRG2 mRNA에 상보적이고 DRG2 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하며, DRG2 mRNA의 번역, 세포질내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다.
또한, 상기 안티센스 핵산은 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5(3):343-55(1995)). 핵산 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 핵산은 하나 이상의 치환된 당 모이어티(sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 핵산은 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴, 6-메틸아데닌, 5-메틸피리미딘(특히 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6 (6-아미노헥실)아데닌, 2,6-디아미노퓨린 등이 있다. 또한, 본 발명의 안티센스 핵산은 상기 안티센스 핵산의 활성 및 세포 흡착성을 향상시키는 하나 이상의 모이어티(moiety) 또는 컨쥬게이트(conjugate)와 화학적으로 결합될 수 있다. 콜레스테롤 모이어티, 콜레스테릴 모이어티, 콜릭산, 티오에테르, 티오콜레스테롤, 지방성 사슬, 인지질, 폴리아민, 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 아다맨탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 옥타데실아민, 헥실아미노-카르보닐-옥시콜에스테롤 모이어티 등의 지용성 모이어티 등이 있고 이에 제한되지는 않는다. 지용성 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드와 제조 방법은 본 발명의 기술 분야에서 이미 잘 알려져 있다(미국특허 제5,138,045호, 제5,218,105호 및 제5,459,255호). 상기 변형된 핵산은 뉴클레아제에 대한 안정성을 증가시키고 안티센스 핵산과 표적 mRNA와의 결합 친화력을 증가시킬 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드는 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 일예는 RNA 중합효소 I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 인식부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 이런 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 "siRNA용어는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다(국제공개 특허번호 00/44895, 01/36646, 99/32619, 01/29058, 99/07409 및 00/44914 참조). siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운(knock-down) 방법으로서 또는 유전자치료 방법으로 제공된다.
본 발명의 siRNA 분자는, 센스 가닥(DRG2 mRNA 서열에 상응하는 서열)과 안티센스 가닥(DRG2 mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있으며, 또한, 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다. 나아가 siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 또한, siRNA 말단 구조는 DRG2 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하고, 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다.
또한, 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오티드 서열이 삽입된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며, 전체적으로는 스템-앤드-루프 구조를 형성하게 된다. 이 스템-앤드-루프 구조는 인 비트로 또는 인 비보에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성의 siRNA 분자를 생성한다.
상기 본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르 브산과 같은 항산화제가있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995). 본 발명에 따른 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는, 이에 한정되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있다.
상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 상기에서 '유효량' 이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 연령, 성별 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 바람직하게는 1~10000/체중kg/day, 더욱 바람직하게는 10~1000/체중kg /day의 유효용량으로 하루에 수회 반복 투여될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1>
비만 마우스의 제작
본 발명자들은 DRG2 유전자가 과발현된 형질전환 마우스를 제작하기 위하여 유전자 변형 실험동물 제작 전문 업체인 마크로젠에 의뢰하여 제작하였으며, 이때 형질전환을 위한 마우스로는 C57BL/6을 사용하였다. DRG2를 과발현시킨 형질전환 마우스와 대조군 마우스인 C57BL/6를 12시간-광처리 및 12시간-어둠처리의 일주기하에서 4주정도 물과 먹이를 풍부하게 공급하면서 사육하였다. 이후 비만 동물 모델을 유도하기 위하여 DRG2가 과발현된 마우스 및 대조군 C57BL/6 마우스에게 5주간 고지방식이로 비만을 유도하였으며, 상기 실험군에 대한 대조군으로는 동일한 기간 동안 일반식이로 투여한 같은 주령의 DRG2 과발현된 마우스와 대조군인 C57BL/6 마우스를 사용하였다. 이후 비만이 유도되었는지의 확인은 사육기간 동안 먹이 섭취량과 체중의 변화를 일주일에 한 번씩 측정함으로써 확인하였다.
그 결과, DRG2가 과발현된 형질전환 마우스와 형질전환시키지 않은 대조군 C57BL/6 마우스의 식이 섭취 변화는 뚜렷한 차이를 보이지 않았다(도 1a). 또한, 고지방식이를 투여한 형질전환 마우스 및 대조군 C57BL/6 마우스군은 일반 식이를 투여한 군에 비해 체중이 월등이 증가하였으나(도 1b), 고지방식이 투여군 및 일반식이 투여군에서 형질전환 마우스 및 대조군 마우스 간에는 큰 차이를 보이지 않는 것으로 나타났다(도 1c).
< 실시예 2>
DRG2 유전자가 과발현된 마우스에서 각 조직의 지방량 측정
상기 실시예 1에서 고지방식이 및 일반식이를 투여한 DRG2 유전자가 과발현된 형질전환 마우스와 대조군인 C57BL/6 마우스를 대상으로 각 조직에서의 지방량을 측정하였다. 이를 위해 각 마우스를 희생시킨 후 혈액을 채취하여 13200rpm으로 2분간 원심분리하여 상층의 혈층 만을 튜브에 분리하였다. 이후, 지방이 손상되지 않도록 조심스럽게 생식기 주변의 지방(epididymal fat)과 신장 주변의 지방 (perirenal fat) 및 간을 즉시 떼어내어 각각의 무게를 측정하였다.
그 결과, 고지방식이 및 일반식이를 투여한 모든 군에 있어서, DRG2 유전자가 과발현된 형질전환 마우스가 대조군 마우스에 비해 생식기 주변 지방(epididymal fat)의 양이 크게 증가한 것을 확인할 수 있었다(도 2b 및 2d). 또한, 신장 주변 지방의 무게를 측정한 결과, 생식기 부위의 지방 측정 결과와 동일하게 형질전환 마우스가 대조군 마우스에 비해 지방의 양이 월등히 증가한 것을 확인할 수 있었다(도 2e).
나아가 일반식이군과 고지방식이군을 투여한 각각의 군에 있어서, 대조군에 비하여 형질전환된 각 마우스의 체중이 다소 작은 경향을 보였지만 통계적 유의성은 없었으며(도 2c), 오히려 마우스들의 복부를 개방하여 전반적인 복부 지방의 분포를 확인한 결과, 형질전환 마우스가 대조군 마우스에 비해 복부지방의 분포도 뚜렷이 증가한 것을 확인 할 수 있었다(도 2a).
따라서 본 발명자들은 상기와 같은 결과를 통해 DRG2 유전자가 과발현되면 체내의 지방량을 증가시킨다는 사실을 확인할 수 있었으며, 총 체중에 변화에 있어서는 실험군 및 대조군 간의 체중변화가 거의 없는 것을 확인함으로써 DRG2 유전자가 체중을 변화시킬 수 있는 다른 조직의 분화 및 생리 조절 작용에도 역할을 할 수 있음을 예상할 수 있었다.
< 실시예 3>
DRG2 유전자의 과발현에 따른 지질대사 관련 유전자들의 발현 변화 분석
본 발명자들은 상기 실시예 2를 통해 DRG2 유전자의 과발현이 체내 지방의 양을 증가시킨다는 사실을 확인함으로써 DRG2 유전자가 지질대사 관련 유전자들의 발현에도 영향을 미칠 수 있는지를 다음과 같은 실험을 수행하여 확인하였다.
<3-1> RNA 추출
상기 실시예 1의 각 마우스들에서 떼어낸 지방조직에 1 ml의 트리졸시약(Sigma. Spruce Street, SL)을 첨가하여 얼음에 방치한 다음 세포균질기(homogenizer)를 사용하여 조직을 용해시켰다. 이후 4에서 5분간 둔 다음, 200 ㎕의 클로로포름(Sigma. Spruce Street, SL)을 처리하여 15초 볼택싱(vortexing) 한 후, 다시 4℃에서 10분간 둔 다음 14000rpm으로 20분간 원심분리하여 RNA와 DNA 및 단백질 층을 분리시켰다. 이후, 지방조직 유래의 기름이 같이 들어가지 않도록 RNA를 포함한 투명한 상층액을 새로운 튜브에 조심스럽게 옮기고 500㎕의 이소프로판올을 첨가하여 볼택싱 한 뒤 4에서 5분간 둔 다음 14000rpm으로 15분간 원심 분리하여 RNA를 침전시켰다. 상층액을 제거하고 펠렛에 70% 에탄올을 500㎕씩 넣어 14000rpm으로 5분간 원심분리로 세척한 뒤 상층액을 모두 제거하였다. 튜브를 원심분리하여 상층액을 완전히 제거한 후에 공기 중에서 건조시키고 15㎕ DEPC 물을 넣어 RNA를 녹임으로써 상기 각 마우스의 지방조직으로부터 RNA를 수득하였다. 이렇게 수득한 RNA는 스팩트로포토미터로 각 농도를 측정하였고, 1㎕의 양을 1% 아가로스 젤에 전기영동하여 수득한 RNA를 확인한 후 하기의 실험에 사용하였다.
<3-2> cDNA 합성
상기 실시예 <3-1>에서 추출한 각 마우스의 RNA 2㎍에 1㎕의 올리고 dT(QIAGEN)를 첨가하고 DEPC 물로 9㎕가 되게 부피를 맞춘 다음 상기 혼합액을 잘 섞었다. 이후, 67 워터 배스에서 10분간 RNA를 변성시킨 후, 바로 얼음에 넣어 10분간 냉각시키고, 4㎕의 5x M-MLV 반응버퍼(Promega), 2㎕의 100mM DTT 및 1㎕의 M-MLV 역전사 효소(Promega)를 넣은 후 37 워터 배스에서 2시간 동안 반응시켜 cDNA를 합성시켰다.
<3-3> 역전사 -중합효소 연쇄반응
상기 실시예 <3-2>에서 합성한 각 마우스의 cDNA를 대상으로 역전사 PCR 반응을 수행하였다. 상기 반응은 합성한 각각의 cDNA 1㎕에 하기 표 1에 기재된 프라이머 각각을 10pmol의 농도로 각각 1㎕씩 첨가 한 후, 2x PCR 프리-믹스(sun genetics)를 사용하여 전체 부피를 10㎕로 맞춘 후 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 94에서 4분 동안 선-변형(pre-denaturation), 94 에서 40초 동안 변형시키고, 각 프라이머의 적정 온도 (DRG2: 50; aP2, PPAR, SREBP1, Glyk 및 AQP7: 55)에 따라 40초 동안 어닐링 및 72에서 1분 동안 연장반응 하는 조건으로 28~33 사이클을 수행하였고 끝으로 72에서 7분 동안 후-연장반응을 수행하였다. 이때 대조군으로는 GAPDH 프라이머를 사용하였다.
프라이머 목록
유전자별 프라이머 염기서열 서열번호
DRG2 - 정방향 5'-CTG CGT CCT ATG AGT TTA CC-3' 1
DRG2 - 역방향 5'-GTC CTC ATG CTC CAT AGT GT-3' 2
PPAR - 정방향 5'-CTC CTG TTG ACC CAG AGC AT-3' 3
PPAR - 역방향 5'- CAA CCA TTG GGT CAG CTC TT-3' 4
aP2 - 정방향 5'-GTG GGA ACC TGG AAG CTT GT-3' 5
aP2 - 역방향 5'-CTG TCG TCT GCG GTC ATT TC-3' 6
SREBP1 - 정방향 5'-GTA GCC CCT TGT CTT TTG GC-3' 7
SREBP1 - 역방향 5'-CGG TGT GTA CCC GTA GCA TC-3' 8
Glyk - 정방향 5'-TTG GTG GGA CAA ATG TGC TT-3' 9
Glyk - 역방향 5'-CCT GAA AAT GCT GGA ACG AA-3' 10
AQP7 - 정방향 5'-TTT TGG ATT CGG AGT GAC CA-3' 11
AQP7 - 역방향 5'-GTC ACG AAT GCC TCA TCC AC-3' 12
GAPDH - 정방향 5'-CCC ATG TTT GTG ATG GGT GT-3' 13
GAPDH - 역방향 5'-ATC GAA GGT GGA AGA GTG GG-3' 14
그 결과, 도 3a 및 3b에 나타낸 바와 같이, 지질결합 단백질로서 지방세포에서 발현되는 aP2, 인슐린 표적장기에 분포하고 간, 골격근, 지방조직 등 지방세포 형성(adipogenesis)과 지방형성(lipogenesis)를 자극하여 지방전구세포에서 지방세포로의 분화에 중요한 역할을 하는 PPAR, 지방조직과 간에서 다량으로 발현되고 지방산 대사와 지방 생합성에 주로 관여하는 SREBP-1 유전자 모두는 DRG2 과발현된 마우스에서 대조군 마우스에 비해 mRNA의 양이 증가한 것으로 나타났다. 반면, AQP 7은 글리세롤 채널로서 이것이 결핍되면 세포내의 글리세롤 함량이 증가하면서 글리세롤 카이네이즈(Glyk)의 활성화가 높아지고 결국 지방세포 안에 중성지방의 축적이 증가하면서 비만이 초래되는데, 이러한 AQP-7 및 Glyk 유전자는 대조군에 비해 형질전환 마우스에서 mRNA가 감소하는 것으로 나타났다.
따라서 상기 결과로 본 발명의 DRG2 유전자는 지질대사와 관련된 지방세포 분화 조절 유전자들의 발현에도 영향을 미치는 것을 알 수 있었다.
< 실시예 4>
DRG2 과발현으로 인한 지방세포 변화와 지방간 형성 검사
본 발명자들은 DRG2 유전자의 과발현으로 나타나는 지방량의 증가와 관련하여 지방세포의 형태에 어떤 영향을 주는지 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.
<4-1> oil red O 염색
상기 실시예 1에서 제조된 DRG2 유전자의 과발현 형질전환 마우스 및 대조군 마우스의 간 조직을 일부분 떼어낸 후, 상기 간 조직을 PBS로 2번 세척한 뒤, 10% 포르말린 용액에 30분 동안 고정시켰다. 고정시키는 동안 오일 래드 오 스탁(oil red o stock) 용액을 상기 용액 대 물의 비가 3:2가 되도록 혼합하여 오일 래드 오 워킹 용액을 제조하였다. 이후 상기 10% 포르말린 용액을 제거한 뒤 물로 조심스럽게 세척한 후 60% 이소프로판올 용액으로 2~5분간 처리 후, 상기 제조한 오일 래드 오 워킹 용액으로 1시간 처리하였다. 이후 물로 세척한 다음 세포를 현미경으로 관찰하였다.
<4-2> H&E 염색
상기 실시예 1에서 제조된 DRG2 유전자의 과발현 형질전환 마우스 및 대조군 마우스의 고환 주변의 지방, 신장 주변의 지방 및 간의 일부분을 떼어낸 후 24시간 동안 10%의 포르말린 용액에 고정시켰다. 이후 조직 절편기를 이용하여 조직 절편 슬라이드 글라스를 제작한 후 헤마토크실린/에오신(Hematoxylin/Eosin)으로 염색한 후 현미경을 사용하여 상기 조직들을 관찰하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, oil red O 염색 및 H&E 염색을 각각 수행한 결과, DRG2가 과발현된 형질전환 마우스의 경우, 대조군 마우스에 비해 단위 면적당 지방세포의 수가 현저히 감소한 반면, 각 세포의 크기는 크게 증가한 것으로 나타났고, 또한, 지질의 축적 증가도 대조군 마우스에 비해 DRG2가 과발현된 형질전환 마우스에서 월등히 높은 것으로 나타났다. 따라서 상기 결과를 토대로, DRG2 유전자는 지방조직에서 지질 축적을 촉진하여 지방간을 형성시킬 뿐만 아니라 지방 세포의 크기를 증가시켜 비만을 촉진한다는 것을 알 수 있었다.
< 실시예 5>
당내성 테스트
DRG2의 과발현으로 촉진되는 지방량의 증가가 당대사에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. 먼저, 고지방식과 일반식이를 각각 투여하고 있는 DRG2 과발현 마우스 및 대조군 마우스를 전날 저녁 6시부터 금식시켜 다음날 아침 10시에 글루코스 2g/kg을 상기 각 마우스의 복강에 주사 한 다음, 꼬리부분의 혈액을 조금 채취한 후 혈당기기를 이용하여 30분 간격으로 4번씩 혈당을 측정하였다. 이때 상기 실험군들에 대한 대조군으로는 글루코스를 주사하기 이전에 측정한 공복기의 혈당 수치를 사용하였다.
그 결과, DRG2 과발현 마우스의 경우, 일반식과 고지방식을 투여한 모든 실험군에서 공복기의 혈당이 대조군에 비해 증가하는 것으로 나타났다(도 5a). 또한, 고지방식이를 투여한 DRG2 과발현 마우스 군은 당내성이 크게 증가하는 인슐린 저항성이 유발됨을 확인하였다(도 5b). 따라서 본 발명자들은 상기 결과를 통해 DRG2의 과발현이 당내성을 증가시키는 것으로 미루어 보아 당뇨병 유발과도 연관이 있다는 것을 알 수 있었다.
< 실시예 6>
DRG2 과발현으로 인한 대사 인자들의 변화 측정
나아가 본 발명자들은 DRG2의 과발현과 대사 인자들과의 연관성을 확인하기 위하여, 고지방식을 투여한 DRG2 과발현 마우스와 대조군 마우스의 혈청을 ELISA 키트를 사용하여 인슐린, 렙틴 및 레지스틴의 수치를 확인하였으며, 일반적으로, 인슐린, 렙틴 및 레지스틴은 당뇨병과 비만 시 수치 증가를 동반하며 대표적인 대사질환의 표지인자로 사용되고 있다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 인슐린과 렙틴은 대조군에 비해 DRG2 과발현 마우스에서 증가하는 것으로 나타난 반면(도 6a 및 6b), 지방세포 분화를 촉진시키고 인슐린 저항성에 관여하는 것으로 알려진 레지스틴은 두 실험군 사이에 유의적인 차이가 없는 것으로 나타났다(도 6c). 따라서 DRG2의 과발현은 혈중의 인슐린과 렙틴의 농도를 증가시켜 인슐린 저항성을 유발시킴에 따라 이와 관련된 지질대사질환을 초래할 수 있음을 알 수 있었다.
< 실시예 7>
DRG2 에 의한 PPAR -감마 활성도의 조절 분석
본 발명자들은 DRG2가 지방세포의 분화조절에 중요한 역할을 수행하는 전사조절인자인 PPAR-감마와 상호작용하여 지방세포의 분화를 조절하는 작용을 할 것으로 판단하고, 이를 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 즉, 전구지방세포 3T3-L1에 PPAR-감마의 결합 사이트가 포함된 루시퍼레이즈 리포터 벡터를 PPAR-감마 및 DRG2 발현 벡터와 함께 세포내로 리포펙타민 시약을 이용하여 주입시켰다. 그런 다음, 24시간 후 PPAR-감마 아고니스트(agonist)인 rosiglitazone을 2 μM로 처리하고 24시간을 더 배양한 후 세포들을 용해시킨 다음, 당업계에 공지된 루시퍼레이즈 분석을 통해 루시퍼레이즈 리포터의 활성도를 측정하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, DRG2에 의해 PPAR-감마의 활성도는 증가하는 것으로 나타났으며, PPAR-감마와 함께 처리하였을 경우에는 활성도가 더욱 증가하는 것으로 나타났다. 또한, PPAR-감마 아고니스트(agonist)인 rosiglitazone을 처리하였을 경우, DRG2에 의해 증가되는 PPAR-감마의 활성도는 DRG2 및 DRG2와 PPAR-감마를 함께 처리하였을 경우보다 더욱 증가하는 것으로 나타났다.
그러므로 상기 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 DRG2 유전자는 PPAR-감마와 밀접한 관계를 가지고 있으며, 따라서 지방세포의 분화를 조절할 수 있음을 알 수 있었다.
< 실시예 8>
분화된 지방세포에서 DRG2 의 발현 양상 분석
나아가 본 발명자들은 분화된 지방세포에서 DRG2 유전자의 발현 양상을 조사하기 위해 전구지방세포를 대상으로 분화 조건을 유도하여 지방세포로 분화시키고, 상기 분화된 지방세포에서 DRG2 및 지방세포 분화와 관련된 유전자들은 SREBP-1, PPAR-감마와 지방세포의 분화를 유도하는 핵심 유전자로 알려진 AP2의 발현 양상을 RT-PCR을 통해 분석하였고, 이러한 분석은 다음과 같은 실험방법으로 진행하였다.
<8-1> 지방세포의 분화 유도
전구 지방세포주인 3T3-L1을 지방세포로 분화를 유도하기 위해서 10%의 소태아 혈청(GIBCO), 페니실린 스트렙토마이신(0.1g)이 함유된 High-DMEM(4.00mM L-Glutamine, 4500mg L-Glucose, sodium pyruvate) 배지에서 세포가 플레이트에 가득찬 상태가 될 때까지 배양하였다. 이후 세포의 성장이 어레스트(arrest)가 될 수 있도록 가득찬(Confluent) 상태가 된 날부터 이틀을 더 배양한 후, 상기 High-DMEM 배지에 IBMX(0.5mM), Dexamethasone(1μM) 및 인슐린(10μg/ml)으로 구성된 혼합액을 이틀 동안 처리 하였다. 이후, 다시 이틀 뒤에 인슐린(5μg/ml)이 들어있는 배지로 교환해주고 세포가 플레이트에서 떨어지지 않도록 조심스럽게 배지를 제거하면서 이틀에 한번씩 인슐린 함유 배지로 교환해 주면서 7일 동안 유지시켰다(Fu et al., 2005에 기재된 방법 참조).
<8-2> RT - PCR 수행
상기 <8-1>에서 배양한 세포들에 대해 500ul의 트리졸 시약(Sigma. Spruce Street, SL)를 첨가하여 세포를 용해시켰다. 이후, 4℃ 에서 5분간 둔 다음, 200μl 클로로포름 (Sigma. Spruce Street, SL)을 처리하여 15초 가량 볼택싱한 후, 4℃에서 10분간 방치하고, 14000rpm에서 20분간 원심 분리하여 RNA, DNA 및 단백질 층을 각각 분리시켰다. 이후, RNA를 포함하는 투명한 상층액을 새로운 튜브에 옮기고, 500 μl의 이소프로판올을 첨가하여 볼택싱한 뒤, 4℃에서 5분간 둔 다음, 14000rpm으로 15분간 원심 분리하여 RNA를 침전시켰다. 이후, 상층액은 제거하고 펠렛에 70% 에탄올을 500 μl 씩 넣어 14000 rpm으로 5분간 원심분리하여 펠렛을 세척한 다음 상층액을 모두 제거하였다. 이후, 튜브를 상온에서 건조시킨 후, 15μl DEPC 물을 첨가하여 RNA를 녹여 분리하였다. 추출한 상기 RNA는 스펙트로포토미터 농도를 측정하였고, 1μl의 양을 1% 아가로즈 겔에 전기영동하여 확인한 후, cDNA 합성 실험에 사용하였다.
cDNA 합성은 상기 방법으로 추출한 2μg의 총 RNA에 1 μl의 Oilgo dT (QIAGEN)를 넣고 DEPC 물로 9 μl 를 맞춘 혼합액를 잘 섞어준 다음, 67℃ water bath에서 10분간 변성시킨 후, 곧바로 얼음에 넣어 10분간 냉각시키고, 4μl의 5x M-MLV 반응 버퍼 (Promega), 2 μl의 100mM DTT 및 1 μl 의 M-MLV Reverse Transcriptase(Promega)를 첨가한 다음, 37℃ water bath에서 2시간 동안 cDNA를 합성시켰다.
이후, 상기 합성된 cDNA를 대상으로 DRG2 유전자의 증폭은 서열번호 1 및 2의 프라이머를 이용하여 PCT을 수행하였고, PPAR-감마는 서열번호 3 및 4의 프라이머를 사용하였으며, AP2는 서열번호 5 및 6의 프라이머를 사용하였고, SREBP1은 서열번호 7 및 8의 프라이머를 사용하였으며, 대조군으로는 서열번호 13 및 14의 프라이머를 사용하여 GAPDH 유전자를 증폭시킨 것을 사용하였다. 이때 PCR은 상기 프라이머를 10 pmol 농도로 각각 1 μl를 첨가 한 후에, 2x PCR Pre-mix(sun genetics) 사용하여 전체 부피가 10 μl가 되도록 맞춘 후, 94℃에서 4 분 동안 프리-변성(pre-denaturation)시키고, 94℃에서 40초 동안 변성시킨 다음, 각 프라이머의 적정 온도 (DRG2: 50℃; aP2, PPARγ, SREBP1: 55℃)에 따라 40초 동안 어닐링, 72℃에서 1분 동안 연장시켜 33회 반복 수행한 다음, 마지막에는 72℃에서 7 분 동안 후속 연장반응 시켰다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 지방세포 분화에 중요한 역할을 수행하는 전사조절인자인 SREBP1과 PPAR-감마의 합성은 분화된 세포에서 발현이 더 증가하는 것으로 나타났고, 지방세포 분화 유도에서 핵심 유전자인 AP2 또한 합성이 증가한 것으로 나타났다. 이러한 결과를 통해 상기 본 발명에 따른 실험과정에서 전구 지방세포들이 지방세포로 유도되었음을 확인할 수 있었으며, 분화된 지방세포에서 DRG2의 발현양상을 확인한 결과, DRG2의 합성 또한 증가하는 것으로 나타났다.
따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 DRG2가 지방세포 분화 조절에서 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었으며, 분화된 지방세포에서 그 발현양이 증가되고 있음을 확인함에 따라 상기 유전자의 발현을 억제하거나 또는 상기 유전자로부터 발현되는 단백질의 활성을 억제할 수 있다면 대사성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> Industry academy cooperation foundation ulsan university <120> Novel use of DRG2 gene <160> 15 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DRG2 F-primer <400> 1 ctgcgtccta tgagtttacc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DRG2-R primer <400> 2 gtcctcatgc tccatagtgt 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPARr-F primer <400> 3 ctcctgttga cccagagcat 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPARr-R primer <400> 4 caaccattgg gtcagctctt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aP2-F primer <400> 5 gtgggaacct ggaagcttgt 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aP2-R primer <400> 6 ctgtcgtctg cggtcatttc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SREBP1-F primer <400> 7 gtagcccctt gtcttttggc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SREBP1-R primer <400> 8 cggtgtgtac ccgtagcatc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyk-F primer <400> 9 ttggtgggac aaatgtgctt 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyk-R primer <400> 10 cctgaaaatg ctggaacgaa 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AQP7-F primer <400> 11 ttttggattc ggagtgacca 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AQP7-R primer <400> 12 gtcacgaatg cctcatccac 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH-F primer <400> 13 cccatgtttg tgatgggtgt 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH-R primer <400> 14 atcgaaggtg gaagagtggg 20 <210> 15 <211> 1095 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> gene <222> (1)..(1095) <223> DRG2 gene sequence <400> 15 atggggatct tggagaaaat ctcggagatc gagaaggaga tcgctcgaac gcagaagaac 60 aaggccaccg agtaccacct gggcctgctg aaagcaaaac tggccaagta tcgggcccag 120 ctcctggaac catccaaatc cgcctcatcc aaaggagagg gctttgatgt catgaagtca 180 ggtgatgccc gtgtggcact gattggcttt ccctctgtgg gtaagtccac cttcttgagt 240 ctgatgacct ctacagccag cgaagctgcg tcctatgagt ttaccaccct gacgtgcatc 300 cctggggtca ttgaatacaa aggtgccaac atccagctct tggaccttcc tggaatcatt 360 gaaggagcag cacaaggccg aggccgtggc cggcaggtga ttgccgtagc acgcacagct 420 gatgtcgtcg tcatgatgct ggatgccacc aagggagatg tgcagaggtc cctgctggag 480 aaggagctgg agtctgtggg tattcgcctg aacaagcata agcccaacat ctatttcaag 540 cccaagaaag gtggtggcat ctcctttaac tcaacagtca cactgacaca atgctctgag 600 aagctggtgc agctcatcct acatgaatac aagatcttca acgccgaggt actcttccga 660 gaagactgct ctccagacga cttcatcgat gtgattgtgg gcaaccgggt gtatatgccc 720 tgcctctatg tgtataacaa aatcgaccag atctccatgg aagaagtaga ccgtttagct 780 cgaaagccca acagtgtagt tatcagttgc ggtatgaagt tgaacctcga ctacctgctg 840 gagatgctgt gggagtacct ggccctcacc tgcatttaca ccaagaagag aggacagaga 900 ccggacttca cagacgccat cattctccgg aaaggggcct ctgttgaaca cgtgtgccac 960 cgcatccatc ggtcactggc cagccagttc aagtacgcct tggtgtgggg taccagcacc 1020 aagtacagcc cacagcgggt aggcctgacc cacactatgg agcatgagga cgtcatccag 1080 attgtgaaga agtag 1095

Claims (14)

  1. DRG2(developmentally regulated GTP-binding protein 2) 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는 프로브 또는 프라이머를 포함하는 대사성 질환의 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 프로브 또는 프라이머는 서열번호 1 및 2로 이루어진 것을 특징으로 하는 대사성 질환의 진단용 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 대사성 질환은 비만, 당뇨병, 고지혈증, 고콜레스테롤증, 동맥경화증 및 지방간으로 이루어진 군중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 대사성 질환의 진단용 조성물.
  4. DRG2(developmentally regulated GTP-binding protein 2) 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는 프로브 또는 프라이머를 포함하는 대사성 질환의 진단용 키트.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 프로브 또는 프라이머는 서열번호 1 및 2로 이루어진 것을 특징으로 하는 대사성 질환의 진단용 키트.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서,
    상기 대사성 질환은 비만, 당뇨병, 고지혈증, 고콜레스테롤증, 동맥경화증 및 지방간으로 이루어진 군중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 대사성 질환의 진단용 키트.
  7. DRG2(developmentally regulated GTP-binding protein 2) 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는 프로브 또는 프라이머를 포함하는 대사성 질환의 진단용 마이크로어레이.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 프로브 또는 프라이머는 서열번호 1 및 2로 이루어진 것을 특징으로 하는 대사성 질환의 진단용 마이크로어레이.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서,
    상기 대사성 질환은 비만, 당뇨병, 고지혈증, 고콜레스테롤증, 동맥경화증 및 지방간으로 이루어진 군중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 대사성 질환의 진단용 마이크로어레이.
  10. (a) DRG2(developmentally regulated GTP-binding protein 2) 유전자 또는 단백질을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 DRG2 유전자의 발현양, DRG2 단백질의 양 또는 DRG2 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계의 측정 결과, DRG2 유전자의 발현양, DRG2 단백질의 양 또는 DRG2 단백질의 활성이 감소되는 경우에 상기 시료는 대사성 질환의 치료 또는 예방용 물질로 판정하는 단계를 포함하는, 대사성 질환의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 (b) 단계의 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블랏, 노던 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)으로 이루어진 군중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    상기 대사성 질환은 비만, 당뇨병, 고지혈증, 고콜레스테롤증, 동맥경화증 및 지방간으로 이루어진 군중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법.
  13. DRG2(developmentally regulated GTP-binding protein 2) 유전자의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 가지는 안티센스 또는 siRNA(small interference RNA) 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 대사성 질환은 비만, 당뇨병, 고지혈증, 고콜레스테롤증, 동맥경화증 및 지방간으로 이루어진 군중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
KR1020100014758A 2009-02-23 2010-02-18 Ｄｒｇ2 유전자의 신규한 용도 KR101303462B1 (ko)

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CN109680055A (zh) * 2018-12-11 2019-04-26 首都医科大学附属北京儿童医院 一种与先天性气管软化相关的cnv片段及其应用
KR20220028365A (ko) * 2020-08-28 2022-03-08 재단법인대구경북과학기술원 Drg2 유전자의 도파민 방출 조절제로서의 용도

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