KR20220028365A - Drg2 유전자의 도파민 방출 조절제로서의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 DRG2 유전자의 도파민 방출 조절제로서의 용도에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 DRG2 유전자를 이용한 도파민 기능장애 질환 진단을 위한 정보제공방법; 도파민 기능장애 질환을 예방 또는 치료하기 위한 후보물질 스크리닝 방법; DRG2 유전자를 녹아웃(Knock-out)시킨 도파민 기능장애 질환 동물 모델; 및 상기 동물 모델을 이용한 도파민 기능장애 질환을 예방 또는 치료하기 위한 후보물질 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명은 DRG2 유전자의 새로운 기능으로서 뇌의 도파민성 뉴런으로부터 도파민 방출 조절제로서의 용도를 처음으로 규명하였다. 따라서, DRG2의 결핍, 비정상적인 발현 또는 기능이상을 확인함으로써 도파민 작용과 관련된 다양한 질환(운동장애, 우울증, 정서질환, 파킨슨병 등)의 진단이 가능하다. 또한, DRG2 유전자를 녹아웃(Knock-out)시킨 동물의 경우 도파민 기능장애 질환 동물 모델로 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 DRG2 유전자의 도파민 방출 조절제로서의 용도에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 DRG2 유전자를 이용한 도파민 기능장애 질환 진단을 위한 정보제공방법; 도파민 기능장애 질환을 예방 또는 치료하기 위한 후보물질 스크리닝 방법; DRG2 유전자를 녹아웃(Knock-out)시킨 도파민 기능장애 질환 동물 모델; 및 상기 동물 모델을 이용한 도파민 기능장애 질환을 예방 또는 치료하기 위한 후보물질 스크리닝 방법에 관한 것이다.
도파민은 뇌에서의 신경전달자이다. 이러한 발견이 1950년대에 이루어진 이래, 뇌에서 도파민의 기능이 집중적으로 연구되었다. 오늘날까지, 도파민이 운동, 인지, 감각, 감정 및 자율적 기능(예: 식욕, 체온, 수면의 조절)을 포함하여 뇌 기능의 몇몇 양태에서 중요한 것으로 확립되어 있다. 따라서, 도파민성 기능의 조절은 뇌기능에 영향을 미치는 광범위한 장애의 치료에 유익할 수 있다. 사실, 중추 도파민 수용체에서 직접 또는 간접적으로 작용하는 약물은 신경 및 정신 질환, 예를 들면, 파킨슨병 및 정신분열증의 치료에서 일반적으로 사용되고 있다. 그러나, 현재 이용가능한 도파민성 약제는 심각한 부작용을 가질 수 있다.
한편, DRG(developmentally regulated GTP-binding protein) 단백질은 GTP와 상호작용에 필요로 하는 G1~G5를 모두 가지고 있는 GTPase에 속하는 단백질 중의 하나이다(Leipe et al, 2002). 이러한 DRG는 대부분이 게놈 DNA 또는 cDNA의 클로닝 과정에서 최근에 우연히 발견된 것들이기 때문에 뚜렷한 기능은 잘 알려져 있지 않다. 단지 DRG가 다양한 종의 세포에서 핵심적인 기능을 수행할 가능성에 대해 언급된 바 있고(Li and Trueb, 2000), cDNA의 클로닝을 통하여 생쥐 태아의 뇌의 분화초기에 높게 발현되었다가 분화가 진행되면서 발현이 감소한다는 결과가 보고된 바 있다(Kumar et al., 1992). 또한, DRG는 주로 세포질에 존재하며(Sazuka et al., 1992), 세균에서부터 사람에 이르기까지 거의 모든 종류의 세포에 존재한다.
진핵생물의 DRG류로는 DRG1과 DRG2로 분류될 수 있는데, DRG1은 사람의 22번 염색체의 22q12-q13.1 부위에 존재하고, DRG2는 사람의 17번 염색체의 17p11.2 부위에 존재한다고 알려져 있다(Li and Trueb., 2000). 두 유전자 중, DRG2는 비교적 최근에 발견된 유전자로써, DRG2 단백질은 뇌의 분화 초기에 증가했다가 분화가 진행됨에 따라 발현이 감소한다고 알려져 있다. 그러나, DRG2는 비교적 최근에 발견되어 아직까지 그 기능이 잘 밝혀져 있지 않은 실정이다.
이러한 배경 하에, 본 발명자는 성체 마우스 뇌에서 DRG2의 표현 패턴 및 DRG2 녹아웃(KO) 마우스를 이용한 마우스 뇌 기능에 DRG2 결핍의 영향을 조사하였다. 그 결과, DRG2 단백질은 신경교세포가 아닌 신경세포(뉴런)에서 주로 발현되며, DRG2 녹아웃(KO) 마우스에서 DRG2 결핍이 선조체 영역에서 도파민 뉴런 집단(neuron population) 또는 도파민 합성에 영향을 주지 않는 반면, 선조체 영역 및 운동 기능에서 도파민 방출에 결함을 나타내는 것을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 DRG2 유전자를 이용한 도파민 기능장애 질환의 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, DRG2 유전자를 이용한 도파민 기능장애 질환을 예방 또는 치료하기 위한 후보물질 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, DRG2 유전자를 녹아웃(Knock-out)시킨 도파민 기능장애 질환 동물 모델을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 DRG2 유전자 녹아웃(Knock-out) 동물모델을 이용한 도파민 기능장애 질환을 예방 또는 치료하기 위한 후보물질 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서,
본 발명은 분석하고자 하는 대상 시료에서 DRG2 유전자의 발현량을 측정하여 정상 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 도파민 기능장애 질환의 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 대상 시료의 DRG2 유전자의 발현량이 정상 대조군 대비 감소된 경우 도파민 기능장애 질환으로 진단할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 도파민 기능장애 질환은 운동장애, 우울증, 정서질환, 강박장애, 자폐증, 정신분열증, 주의력결핍과잉행장애, 알츠하이머병, 파킨슨병, 크로이츠펠트-야코프병, 치매 및 헌팅톤병으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 a) 뇌 유래 신경세포에 분석하고자 하는 시험물질을 접촉시키는 단계; b) 상기 시험물질을 접촉한 신경세포에서 DRG2의 발현 정도를 측정하는 단계; 및 c) 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 DRG2의 발현 정도가 증가한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는, 도파민 기능장애 질환을 예방 또는 치료하기 위한 후보물질 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 b) 단계의 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응 (reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응 (real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석 (radioimmunoassay;RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 면역침전분석법 (immunoprecipitation assay) 및 면역조직 화학적 분석(immunohistochemical analysis)으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 DRG2 유전자를 녹아웃(Knock-out)시킨 도파민 기능장애 질환 동물 모델을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 동물 모델은 DRG2 유전자가 녹아웃(Knock-out)됨으로써 뇌의 선조체(Striatum)에서 도파민 방출이 감소될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 동물은 마우스, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 랫트, 소, 양, 돼지 및 염소로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 도파민 기능장애 질환은 운동장애, 우울증, 정서질환, 강박장애, 자폐증, 정신분열증, 주의력결핍과잉행장애, 알츠하이머병, 파킨슨병, 크로이츠펠트-야코프병, 치매 및 헌팅톤병으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 ⅰ) 실험군으로서 제6항의 동물모델에 시험물질을 투여하는 단계; ⅱ) 상기 ⅰ)의 실험군과 시험물질을 처리하지 않은 대조군 동물모델과의 운동협응(Motor coordination)을 측정하여 비교하는 단계; 및 ⅲ) 대조군과 비교하여 상기 ⅰ)의 실험군에서 운동협응(Motor coordination)이 개선되는 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는, 도파민 기능장애 질환을 예방 또는 치료하기 위한 후보물질 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명은 DRG2 유전자의 새로운 기능으로서 뇌의 도파민성 뉴런으로부터 도파민 방출 조절제로서의 용도를 처음으로 규명하였다. 따라서, DRG2의 결핍, 비정상적인 발현 또는 기능이상을 확인함으로써 도파민 작용과 관련된 다양한 질환(운동장애, 우울증, 정서질환, 파킨슨병 등)의 진단이 가능하다. 또한, DRG2 유전자를 녹아웃(Knock-out)시킨 동물의 경우 도파민 기능장애 질환 동물 모델로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 DRG2 녹아웃 (KO) 마우스의 다중 표현형 특징을 나타낸 것이다. (A) 및 (B)는 DRG2+/+, DRG2+/- 및 DRG2-/- 각각의 마우스 대뇌 피질에서 DRG2의 발현 수준을 측정한 결과이다(1A: RT-PCR, 1B: 웨스턴 블롯). (C)는 한배에서 출생한 DRG2+/+, DRG2+/-, DRG2-/- 마우스의 생후 1일(상단) 및 12주(하단)에 신체 크기를 비교한 사진이다. (D)는 DRG2+/+, DRG2+/-, DRG2-/- 마우스의 시간 경과에 따른 생존 곡선을 나타낸 것이다(각 그룹당 n = 12). (E)는 DRG2+/+, DRG2+/-, DRG2-/- 마우스의 출생 후 1 일째에 마이크로 CT 스캔 이미지를 나타낸 것이다(상단-전신; 중간-두개골 측면; 하단-두개골 윗면; 화살촉-감소된 광물화를 가리침; 화살표-DRG2-/- 마우스의 앞다리와 뒷다리의 반경과 척골의 감소를 보여줌). DRG2-/- 마우스는 증대된 대천문(anterior fontanelle, AF) 및 감소된 상악-전상악(premaxillary-maxillary, PM)을 보였다. 스케일 바, 500μm. (F)는 DRG2+/+, DRG2+/-, DRG2-/- 마우스의 체중을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다(각 그룹당 n = 12). 일원 분산 분석: ***p <0.001. 오차 막대는 SEM을 나타낸다.
도 2는 마우스 뇌에서 DRG2의 발현 양상을 프로파일링한 것이다. (A)는 DRG2 단백질의 조직 분포에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과이다. (B)는 마우스 뇌 영역에서 DRG2 발현에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과이다. (C)는 4개의 뇌 영역에서 나이(age)에 따른 DRG2 단백질 발현의 변화를 측정한 결과이다. DRG2 발현을 β-액틴으로 정규화하였다. 각 데이터 포인트는 평균±표준편차로 나타내었다(n = 6). (D) 마우스 뇌에서 DRG2 발현의 인시츄 하이브리디제이션(In situ hybridization) 분석 결과이다. 성체 마우스 뇌의 시상 부분을 DRG2 안티센스 프로브와 혼성화했다. DRG2 mRNA(빨간색 점) 및 DAPI(파란색)로 대조 염색된 핵에 대한 대표적인 이미지를 나타낸 것이다. 박스형 영역은 하단 패널에서 더 높은 배율로 나타내었다. 스케일 바 1mm. (E) 항-DRG2 1차 항체 및 Alexa-488 표지된 2차 항체를 사용하여 마우스 뇌의 시상 및 관상 섹션에서 DRG2 발현 정도를 확인한 면역조직화학 분석 결과이다. 핵은 DAPI로 염색되었다. (a) 마우스 뇌의 시상 부분. (b-i)는 (a)에서 시상 이미지 내 특정 영역의 더 높은 배율을 나타냄((b) CTX, (c) THs, 시상 (d) PB, 상완 주위 핵 (e) HY, 시상하부 (f) CB, (g) CTX, (h) HIP, (i) SN). (f)의 화살표는 푸르키니에세포층을 나타낸다. 스케일 바, 100μm. (j-l)는 세 개의 다른 평면에서 마우스 뇌의 관상면(coronal section)을 보여준다. 단면의 평면을 보여주는 뇌의 시상 다이어그램이 각 이미지 내에 표시되었다. AOB, accessory olfactory bulb; AUD, auditory areas; BMA, basomedial amygdala nuclear; CA1, cornu ammonis1; CA3, Cornu Ammonis3; DG, dentate gyrus; CB, cerebellum; CP, caudate putamen; CTX, cerebral cortex; ENT, Entorhinal area; HIP, hippocampus; HY, hypothalamus; MB, mid brain; Mo, somatomotor area; NAc, nucleus accumbens; PB, parabrachial nucleus; Pir, piriform cortex; PTLP, posterior parietal association areas; RSP, retrosplenial area; SCN, suprachiasmatic nucleus; SN, substantia nigra; SNc, substantia nigra pars compacta; SNr, substantia pars reticulate; SS, somatosensory area; Str, striatum; SUB, subiculum; THs, thalamus; VIS, visual area; VTA, ventral tegmental area; WB, whole brain.
도 3은 마우스 뉴런에서 DRG2의 발현 양상을 프로파일링한 것이다. (A)는 해마 (HIP)의 흑질 (SN) 및 치상회 (DG)의 뉴런 세포체에서 뉴런 마커 Tuj1, 성상세포 마커 GFAP, 미세아교세포 마커 Iba1 및 DRG2의 면역조직화학염색 결과를 나타낸 것이다. 핵은 DAPI로 염색되었다. 스케일바, 20 μm. (B-E)는 마우스 해마에서 DRG2 발현의 인시츄 하이브리디제이션(In situ hybridization) 분석 결과이다. (B 및 C) 마우스 뇌의 해마 섹션을 vGlut2, GAD67 (회색 점), vGlut1, GAD65 (녹색 점) 및 DRG2 (빨간색 점)에 대한 안티센스 프로브로 혼성화시켰다. 핵은 DAPI로 염색되었다. 스케일바, 200μm. (B, C) 이미지의 박스 영역을 각각 하단 패널(D, E)에서 더 높은 배율로 표시하였다. 스케일바, 20 μm.
도 4a는 DRG2 결핍 마우스의 주지성 테스트(geotaxis test) 결과를 나타낸 것이다. 왼쪽은 주지성 테스트를 수행하는 마우스를 보여주는 일련의 사진이며, 오른쪽은 주지성 테스트를 완료하기까지 지연시간을 측정한 그래프이다(평균±표준편차, 최대 60초, 각 그룹당 n = 8). *p <0.05, **p <0.005.
도 4b는 DRG2 결핍 마우스의 로타로드 테스트(rotarod test) 결과를 나타낸 것이다. DRG2+/+ 및 DRG2-/- 마우스는 생후 6, 12, 40 주령에 비교되었다. 6주령에 암컷과 수컷 마우스를 비교했으며, 12주령 및 40주령에는 암컷 마우스를 비교하였다. 데이터는 떨어질 때까지의 시간을 나타낸 것이다(평균±표준편차, 최대 300초, 각 그룹당 n = 8). *p <0.05, **p <0.005, ***p <0.001. 스튜던트의 t- 검정.
도 4c는 DRG2 결핍 마우스의 Y-maze 테스트 결과를 나타낸 것이다(alternation triplets의 백분율, 총 통과 횟수 및 총 거리). DRG2+/+ 및 DRG2-/- 마우스의 암컷과 수컷 모두 6주령과 12주령에 비교되었다. 데이터는 평균±표준편차(각 그룹당 n = 8)로 나타내었다.
도 4d는 DRG2 결핍 마우스의 십자형 높은 미로시험(Elevated Plus Maze(EPM) test) 결과를 나타낸 것이다. DRG2+/+ 및 DRG2-/- 마우스의 암컷과 수컷 모두 6주령 및 40주령에 비교되었다. 왼쪽의 도면은 EPM 장치에서 탐색하는 DRG2+/+ 및 DRG2-/- 마우스의 전형적인 예를 보여주는 대표적인 이미지이다. 가운데 및 오른쪽의 그래프는 open arm에서 보낸 시간을 백분율로 나타낸 것이다. 데이터는 평균±표준편차(각 그룹당 n = 8)로 나타내었다. *p <0.05.
도 5a는 DRG2 결핍 마우스의 뇌에서 DRG2 및 티로신 하이드록실라제(TH)에 대한 안티센스 프로브를 사용하여 더블 인시츄 하이브리디제이션(double in situ hybridization) 분석을 수행한 결과이다. 성체 마우스 뇌의 관상면을 DRG2 (적색) 및 TH (녹색)에 대한 안티센스 프로브와 혼성화하였다. 핵은 DAPI로 염색되었다. 맨 위쪽은 DRG2 및 TH의 대표 이미지를 나타낸 것이다. 스케일바, 500μm. 중간 및 아래쪽의 이미지는 상단 패널의 VTA 및 SN의 박스 영역을 더 높은 배율로 나타낸 것이다. 스케일바, 20μm.
도 5b는 VTA 영역에서 TH 양성 및 음성 세포의 DRG2 발현 패턴을 분석한 결과이다. 맨 위쪽은 마우스 VTA 영역에서 DRG2 및 TH 발현의 인시츄 하이브리디제인션(in situ hybridization) 분석 결과이다. 스케일바, 20μm. 중간 이미지는 상단 패널의 (a) TH 양성 및 (b) TH 음성 세포의 박스 영역은 더 높은 배율로 나타낸 것이다. 스케일바, 5μm. 아래쪽 그래프는 SN 및 VTA 영역에서 TH-양성 또는 TH-음성 세포상의 DRG2 mRNA 도트의 수를 정량화하여 나타낸 것이다. 데이터는 평균±표준편차(각 그룹당 n = 8)로 나타내었다. ***p <0.0001.
도 5c에서 왼쪽의 이미지는 1년령 DRG2+/+ 및 DRG2-/- 마우스의 Str, SN, NAc 및 VTA에서 TH 뉴런에 대한 면역조직화학염색 결과를 나타낸 것이며(점선으로 표시한 영역은 정량화 영역을 나타냄, 스케일바-500μm), 오른쪽의 그래프는 상기 이미지에서 TH 뉴런을 정량화하여 나타낸 것이다.
도 5d는 DRG2+/+ 및 DRG2-/- 마우스의 선조체에서 도파민, 3,4-디하이드록시페닐아세트산(DOPAC), 3-메톡시티라민(3-MT), 호모바닐산 (HVA), 에피네프린(EPI) 및 세로토닌(5-HT) 수준을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다. 데이터는 평균±표준편차(각 그룹당 n = 8)로 나타내었다. **p <0.005, ***p <0.001.
도 5e는 DRG2+/+ 및 DRG2-/- 마우스의 선조체 슬라이스에서 도파민 방출에 대한 FSCV (Fast-scan cyclic voltammetry) 분석 결과이다. 관상면 뇌 슬라이스에서 도파민 방출은 단일 전기 자극 펄스에 의해 유발되었으며 선조체의 세포 외 도파민 농도는 FSCV를 사용하여 측정되었다. 데이터는 도파민 농도 곡선 아래 영역을 나타내었다(평균±표준편차, 각 그룹당 n = 3). **p <0.001.
도 5f는 DRG2-/- 마우스의 운동 행동에 대한 L-DOPA 투여의 효과를 나타낸 것이다. DRG2-/- 마우스는 i.p. L-DOPA (50mg / kg)를 주입하고 회전하는 막대에서 테스트하였다. 데이터는 로타로드 테스트에서 떨어지는 지연 시간을 나타낸다(평균±표준편차, 최대 300 초, 각 그룹당 n = 6). *p <0.05, ***p <0.001.
도 6은 마우스 뇌에서 DRG2의 발현 패턴 및 DRG2 발현이 뇌 중량에 미치는 영향을 평가한 것이다. (A) 및 (B)는 각각 해마(HIP) 및 대뇌 피질(CTX)에서 DRG2의 발현과 세포-타입 특이적 마커(성상세포 마커 GFAP; 미세아교세포 마커 Iba1; 및 뉴런 마커 Tuj1)의 발현을 면역조직화학 분석을 통해 비교한 것이다. 마우스 뇌의 관상면은 DRG2, 뉴런 마커 Tuj1, 성상세포 마커 GFAP 및 미세아교세포 마커 Iba1에 대한 항체와 함께 배양되었다. 핵은 DAPI로 염색되었다. 스케일바 20μm. (C)는 마우스 배아 뇌에서 분리된 뉴런, 성상세포 및 미세아교세포에서의 DRG2 발현량을 웨스턴 블롯 분석을 통해 확인한 것이다. 동일한 양의 총 단백질(각 샘플 당 총 단백질 10μg)을 로딩했다. (D)는 3 개월된 DRG2+/+, DRG2+/- 및 DRG2-/- 마우스의 뇌를 비교한 사진이다. 왼쪽에 있는 그래프는 각 그룹의 뇌 무게를 측정한 결과이다(평균±표준편차, 각 그룹당 n = 6). (E)는 3 개월된 DRG2+/+ 및 DRG2-/- 마우스의 관상면의 DAPI 염색 사진이다. 상단 2개 패널은 전체 관상 부분의 이미지를 나타낸 것이며(스케일 바, 1mm), 하단 2개 패널은 상위 2 개 패널의 박스형 영역은 더 높은 배율로 표시한 것이다(스케일바, 500μm).
도 7은 DRG2+/+ 및 DRG2-/- 마우스의 SN, VTA, NAc 및 Str 영역에서 티로신 하이드록실라제(TH)-양성 뉴런의 강도 및 분포를 면역조직화학염색을 통해 확인한 결과이다. 24 개월령 DRG2+/+ 및 DRG2-/- 마우스 뇌의 연속 관상 절편을 TH에 대한 항체와 함께 배양하였다. (A)는 선조체(Str), 중뇌의 흑질(SN) 및 복측피개영역(VTA)의 TH 양성 뉴런은 스트렙트아비딘-호스라디쉬 퍼옥시다아제(streptavidin-horseradish peroxidase) 복합체와 함께 배양하여 시각화되었다(스케일바, 500μm.). (C)는 SN, Str, Nac core, 및 Nac shell의 TH 양성 뉴런은 Alexa-488 표지된 이차 항체와 함께 배양하여 시각화되었다(스케일바, 100 μm). 맨 아래쪽의 그래포는 각 뇌 영역의 TH 양성 뉴런의 강도를 나타낸다(평균±표준편차, 각 그룹당 n = 3).
도 2는 마우스 뇌에서 DRG2의 발현 양상을 프로파일링한 것이다. (A)는 DRG2 단백질의 조직 분포에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과이다. (B)는 마우스 뇌 영역에서 DRG2 발현에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과이다. (C)는 4개의 뇌 영역에서 나이(age)에 따른 DRG2 단백질 발현의 변화를 측정한 결과이다. DRG2 발현을 β-액틴으로 정규화하였다. 각 데이터 포인트는 평균±표준편차로 나타내었다(n = 6). (D) 마우스 뇌에서 DRG2 발현의 인시츄 하이브리디제이션(In situ hybridization) 분석 결과이다. 성체 마우스 뇌의 시상 부분을 DRG2 안티센스 프로브와 혼성화했다. DRG2 mRNA(빨간색 점) 및 DAPI(파란색)로 대조 염색된 핵에 대한 대표적인 이미지를 나타낸 것이다. 박스형 영역은 하단 패널에서 더 높은 배율로 나타내었다. 스케일 바 1mm. (E) 항-DRG2 1차 항체 및 Alexa-488 표지된 2차 항체를 사용하여 마우스 뇌의 시상 및 관상 섹션에서 DRG2 발현 정도를 확인한 면역조직화학 분석 결과이다. 핵은 DAPI로 염색되었다. (a) 마우스 뇌의 시상 부분. (b-i)는 (a)에서 시상 이미지 내 특정 영역의 더 높은 배율을 나타냄((b) CTX, (c) THs, 시상 (d) PB, 상완 주위 핵 (e) HY, 시상하부 (f) CB, (g) CTX, (h) HIP, (i) SN). (f)의 화살표는 푸르키니에세포층을 나타낸다. 스케일 바, 100μm. (j-l)는 세 개의 다른 평면에서 마우스 뇌의 관상면(coronal section)을 보여준다. 단면의 평면을 보여주는 뇌의 시상 다이어그램이 각 이미지 내에 표시되었다. AOB, accessory olfactory bulb; AUD, auditory areas; BMA, basomedial amygdala nuclear; CA1, cornu ammonis1; CA3, Cornu Ammonis3; DG, dentate gyrus; CB, cerebellum; CP, caudate putamen; CTX, cerebral cortex; ENT, Entorhinal area; HIP, hippocampus; HY, hypothalamus; MB, mid brain; Mo, somatomotor area; NAc, nucleus accumbens; PB, parabrachial nucleus; Pir, piriform cortex; PTLP, posterior parietal association areas; RSP, retrosplenial area; SCN, suprachiasmatic nucleus; SN, substantia nigra; SNc, substantia nigra pars compacta; SNr, substantia pars reticulate; SS, somatosensory area; Str, striatum; SUB, subiculum; THs, thalamus; VIS, visual area; VTA, ventral tegmental area; WB, whole brain.
도 3은 마우스 뉴런에서 DRG2의 발현 양상을 프로파일링한 것이다. (A)는 해마 (HIP)의 흑질 (SN) 및 치상회 (DG)의 뉴런 세포체에서 뉴런 마커 Tuj1, 성상세포 마커 GFAP, 미세아교세포 마커 Iba1 및 DRG2의 면역조직화학염색 결과를 나타낸 것이다. 핵은 DAPI로 염색되었다. 스케일바, 20 μm. (B-E)는 마우스 해마에서 DRG2 발현의 인시츄 하이브리디제이션(In situ hybridization) 분석 결과이다. (B 및 C) 마우스 뇌의 해마 섹션을 vGlut2, GAD67 (회색 점), vGlut1, GAD65 (녹색 점) 및 DRG2 (빨간색 점)에 대한 안티센스 프로브로 혼성화시켰다. 핵은 DAPI로 염색되었다. 스케일바, 200μm. (B, C) 이미지의 박스 영역을 각각 하단 패널(D, E)에서 더 높은 배율로 표시하였다. 스케일바, 20 μm.
도 4a는 DRG2 결핍 마우스의 주지성 테스트(geotaxis test) 결과를 나타낸 것이다. 왼쪽은 주지성 테스트를 수행하는 마우스를 보여주는 일련의 사진이며, 오른쪽은 주지성 테스트를 완료하기까지 지연시간을 측정한 그래프이다(평균±표준편차, 최대 60초, 각 그룹당 n = 8). *p <0.05, **p <0.005.
도 4b는 DRG2 결핍 마우스의 로타로드 테스트(rotarod test) 결과를 나타낸 것이다. DRG2+/+ 및 DRG2-/- 마우스는 생후 6, 12, 40 주령에 비교되었다. 6주령에 암컷과 수컷 마우스를 비교했으며, 12주령 및 40주령에는 암컷 마우스를 비교하였다. 데이터는 떨어질 때까지의 시간을 나타낸 것이다(평균±표준편차, 최대 300초, 각 그룹당 n = 8). *p <0.05, **p <0.005, ***p <0.001. 스튜던트의 t- 검정.
도 4c는 DRG2 결핍 마우스의 Y-maze 테스트 결과를 나타낸 것이다(alternation triplets의 백분율, 총 통과 횟수 및 총 거리). DRG2+/+ 및 DRG2-/- 마우스의 암컷과 수컷 모두 6주령과 12주령에 비교되었다. 데이터는 평균±표준편차(각 그룹당 n = 8)로 나타내었다.
도 4d는 DRG2 결핍 마우스의 십자형 높은 미로시험(Elevated Plus Maze(EPM) test) 결과를 나타낸 것이다. DRG2+/+ 및 DRG2-/- 마우스의 암컷과 수컷 모두 6주령 및 40주령에 비교되었다. 왼쪽의 도면은 EPM 장치에서 탐색하는 DRG2+/+ 및 DRG2-/- 마우스의 전형적인 예를 보여주는 대표적인 이미지이다. 가운데 및 오른쪽의 그래프는 open arm에서 보낸 시간을 백분율로 나타낸 것이다. 데이터는 평균±표준편차(각 그룹당 n = 8)로 나타내었다. *p <0.05.
도 5a는 DRG2 결핍 마우스의 뇌에서 DRG2 및 티로신 하이드록실라제(TH)에 대한 안티센스 프로브를 사용하여 더블 인시츄 하이브리디제이션(double in situ hybridization) 분석을 수행한 결과이다. 성체 마우스 뇌의 관상면을 DRG2 (적색) 및 TH (녹색)에 대한 안티센스 프로브와 혼성화하였다. 핵은 DAPI로 염색되었다. 맨 위쪽은 DRG2 및 TH의 대표 이미지를 나타낸 것이다. 스케일바, 500μm. 중간 및 아래쪽의 이미지는 상단 패널의 VTA 및 SN의 박스 영역을 더 높은 배율로 나타낸 것이다. 스케일바, 20μm.
도 5b는 VTA 영역에서 TH 양성 및 음성 세포의 DRG2 발현 패턴을 분석한 결과이다. 맨 위쪽은 마우스 VTA 영역에서 DRG2 및 TH 발현의 인시츄 하이브리디제인션(in situ hybridization) 분석 결과이다. 스케일바, 20μm. 중간 이미지는 상단 패널의 (a) TH 양성 및 (b) TH 음성 세포의 박스 영역은 더 높은 배율로 나타낸 것이다. 스케일바, 5μm. 아래쪽 그래프는 SN 및 VTA 영역에서 TH-양성 또는 TH-음성 세포상의 DRG2 mRNA 도트의 수를 정량화하여 나타낸 것이다. 데이터는 평균±표준편차(각 그룹당 n = 8)로 나타내었다. ***p <0.0001.
도 5c에서 왼쪽의 이미지는 1년령 DRG2+/+ 및 DRG2-/- 마우스의 Str, SN, NAc 및 VTA에서 TH 뉴런에 대한 면역조직화학염색 결과를 나타낸 것이며(점선으로 표시한 영역은 정량화 영역을 나타냄, 스케일바-500μm), 오른쪽의 그래프는 상기 이미지에서 TH 뉴런을 정량화하여 나타낸 것이다.
도 5d는 DRG2+/+ 및 DRG2-/- 마우스의 선조체에서 도파민, 3,4-디하이드록시페닐아세트산(DOPAC), 3-메톡시티라민(3-MT), 호모바닐산 (HVA), 에피네프린(EPI) 및 세로토닌(5-HT) 수준을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다. 데이터는 평균±표준편차(각 그룹당 n = 8)로 나타내었다. **p <0.005, ***p <0.001.
도 5e는 DRG2+/+ 및 DRG2-/- 마우스의 선조체 슬라이스에서 도파민 방출에 대한 FSCV (Fast-scan cyclic voltammetry) 분석 결과이다. 관상면 뇌 슬라이스에서 도파민 방출은 단일 전기 자극 펄스에 의해 유발되었으며 선조체의 세포 외 도파민 농도는 FSCV를 사용하여 측정되었다. 데이터는 도파민 농도 곡선 아래 영역을 나타내었다(평균±표준편차, 각 그룹당 n = 3). **p <0.001.
도 5f는 DRG2-/- 마우스의 운동 행동에 대한 L-DOPA 투여의 효과를 나타낸 것이다. DRG2-/- 마우스는 i.p. L-DOPA (50mg / kg)를 주입하고 회전하는 막대에서 테스트하였다. 데이터는 로타로드 테스트에서 떨어지는 지연 시간을 나타낸다(평균±표준편차, 최대 300 초, 각 그룹당 n = 6). *p <0.05, ***p <0.001.
도 6은 마우스 뇌에서 DRG2의 발현 패턴 및 DRG2 발현이 뇌 중량에 미치는 영향을 평가한 것이다. (A) 및 (B)는 각각 해마(HIP) 및 대뇌 피질(CTX)에서 DRG2의 발현과 세포-타입 특이적 마커(성상세포 마커 GFAP; 미세아교세포 마커 Iba1; 및 뉴런 마커 Tuj1)의 발현을 면역조직화학 분석을 통해 비교한 것이다. 마우스 뇌의 관상면은 DRG2, 뉴런 마커 Tuj1, 성상세포 마커 GFAP 및 미세아교세포 마커 Iba1에 대한 항체와 함께 배양되었다. 핵은 DAPI로 염색되었다. 스케일바 20μm. (C)는 마우스 배아 뇌에서 분리된 뉴런, 성상세포 및 미세아교세포에서의 DRG2 발현량을 웨스턴 블롯 분석을 통해 확인한 것이다. 동일한 양의 총 단백질(각 샘플 당 총 단백질 10μg)을 로딩했다. (D)는 3 개월된 DRG2+/+, DRG2+/- 및 DRG2-/- 마우스의 뇌를 비교한 사진이다. 왼쪽에 있는 그래프는 각 그룹의 뇌 무게를 측정한 결과이다(평균±표준편차, 각 그룹당 n = 6). (E)는 3 개월된 DRG2+/+ 및 DRG2-/- 마우스의 관상면의 DAPI 염색 사진이다. 상단 2개 패널은 전체 관상 부분의 이미지를 나타낸 것이며(스케일 바, 1mm), 하단 2개 패널은 상위 2 개 패널의 박스형 영역은 더 높은 배율로 표시한 것이다(스케일바, 500μm).
도 7은 DRG2+/+ 및 DRG2-/- 마우스의 SN, VTA, NAc 및 Str 영역에서 티로신 하이드록실라제(TH)-양성 뉴런의 강도 및 분포를 면역조직화학염색을 통해 확인한 결과이다. 24 개월령 DRG2+/+ 및 DRG2-/- 마우스 뇌의 연속 관상 절편을 TH에 대한 항체와 함께 배양하였다. (A)는 선조체(Str), 중뇌의 흑질(SN) 및 복측피개영역(VTA)의 TH 양성 뉴런은 스트렙트아비딘-호스라디쉬 퍼옥시다아제(streptavidin-horseradish peroxidase) 복합체와 함께 배양하여 시각화되었다(스케일바, 500μm.). (C)는 SN, Str, Nac core, 및 Nac shell의 TH 양성 뉴런은 Alexa-488 표지된 이차 항체와 함께 배양하여 시각화되었다(스케일바, 100 μm). 맨 아래쪽의 그래포는 각 뇌 영역의 TH 양성 뉴런의 강도를 나타낸다(평균±표준편차, 각 그룹당 n = 3).
본 발명자들은 DRG2 녹아웃(KO) 동물모델을 이용하여 마우스 뇌 기능에 DRG2 결핍의 영향을 조사하였으며, 그 결과 DRG2가 도파민성 뉴런으로부터 도파민 방출 조절제로서 기능함을 최초로 규명하였다.
하나의 양태로서, 본 발명은 분석하고자 하는 대상 시료에서 DRG2 유전자의 발현량을 측정하여 정상 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 도파민 기능장애 질환의 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명에서 용어, “도파민(dopamine)”은 카테콜아민 계열의 유기 화합물로, 다양한 동물들의 중추 신경계에서 발견되는 호르몬이나 신경전달물질을 의미한다.
본 발명에서 용어, “도파민 기능장애 질환”은 도파민의 비정상적인 기능장애에 의해 유발될 수 있는 질환으로서, 도파민의 분비량 감소에 따른 운동장애, 우울증, 정서질환, 강박장애, 알츠하이머병, 파킨슨병, 자폐증, 정신분열증, 주의력결핍과잉행장애(ADHD) 등의 질환과 도파민 분비량의 비정상적인 증대에 따른 조증(燥症), 중독증, 충동조절장애 등을 포함하는 개념이다.
본 발명의 정보제공방법에서 대상 시료의 DRG2 유전자의 발현량이 정상 대조군 대비 감소된 경우 도파민 기능장애 질환으로 진단할 수 있다.
상기 도파민 기능장애 질환은 운동장애, 우울증, 정서질환, 강박장애, 자폐증, 정신분열증, 주의력결핍과잉행장애, 알츠하이머병, 파킨슨병, 크로이츠펠트-야코프병, 치매 및 헌팅톤병 등을 예시할 수 있으나, 도파민의 기능장애와 관련된 질환이라면 그 종류를 특별히 한정하는 것은 아니다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 a) 뇌 유래 신경세포에 분석하고자 하는 시험물질을 접촉시키는 단계; b) 상기 시험물질을 접촉한 신경세포에서 DRG2의 발현 정도를 측정하는 단계; 및 c) 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 DRG2의 발현 정도가 증가한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는, 도파민 작용성 기능장애 질환을 예방 또는 치료하기 위한 후보물질 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 a) 단계에서 신경세포(뉴런)는 뇌 조직으로부터 유래한 신경세포이며, 바람직하게는 중뇌의 흑질(SN), 해마(HIP) 및 피질(CTX) 영역으로부터 유래된 신경세포일 수 있다.
본 발명의 b) 단계에서 DRG2의 발현 정도를 측정하기 위한 방법은 역전사 중합효소 연쇄반응 (reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응 (real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석 (radioimmunoassay;RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 면역침전분석법 (immunoprecipitation assay) 및 면역조직 화학적 분석(immunohistochemical analysis)으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 DRG2 유전자를 녹아웃(Knock-out)시킨 도파민 기능장애 질환 동물 모델을 제공한다.
상기 DRG2 유전자는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이와 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가질 수 있다.
본 발명에서 용어, “서열 상동성”은 공여체 및 표적 유전자 폴리뉴클레오티드 서열들과 관련하여, 서열들을 배열하고, 필요한 경우, 최대 백분율 서열 동일성을 달성하기 위해 간격을 도입한 후, 표적 유전자 서열 중의 뉴클레오티드 잔기와 비교한 공여체 서열 중의 뉴클레오티드 잔기의 동일성 백분율로 정의된다. 백분율 뉴클레오티드 서열 상동성을 결정하기 위한 정렬은 당해기술에 해당하는 다양한 방식으로 달성될 수 있는데, 예를 들면 상용화된 컴퓨터 소프트웨어 BLAST, BLAST-2, ALIGN, ClustalW2 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어 등을 사용할 수 있다. 당해기술의 숙련가들은 서열의 정렬을 위한 적절한 매개변수들, 예를 들면 비교될 서열들의 전장에 걸친 최대 정렬을 달성하기에 필요한 모든 알고리즘 등을 결정할 수 있다.
본 발명에서 용어, “질환 모델 동물”이란 사람의 질병과 아주 유사한 형태의 질병을 가진 동물을 말한다. 사람의 질병 연구에 있어 질환 모델 동물이 의미를 갖는 것은 사람과 동물들 간의 생리적 또는 유전적인 유사성에 의한다. 질병 연구에 있어 생체의학 질환 모델 동물은 질병의 다양한 원인과 발병과정 및 진단에 대한 연구용 재료를 제공해주고, 질환 모델 동물의 연구를 통해 질병에 관련된 유전자들을 알아내고, 유전자들 간의 상호작용을 이해할 수 있게 하고, 개발된 신약후보물질의 실제 효능 및 독성 검사를 통해 실용화 가능성의 여부를 판단하는 기초 자료를 얻을 수 있다.
본 발명에서 용어, “녹아웃(knock-out)”은 표적 유전자의 기능 저하를 가져다 주는 유전자 서열 상의 변형을 의미하는데, 바람직하게는 이로써 표적 유전자 발현이 탐지 가능하지 않거나 무의미하다. 본 발명에서 DRG2 유전자의 녹아웃은 DRG2 유전자의 기능이 실질적으로 저하되어 발현이 탐지될 수 없거나 또는 무의미한 수준으로만 존재하는 것을 의미한다. 녹아웃 형질전환체는 DRG2 유전자의 이형 접합성 녹아웃 또는 DRG2 유전자의 동형 접합성 녹아웃을 갖는 형질전환성 동물일 수 있다. 녹아웃에는 예를 들어, 표적 유전자 변형을 증진시키는 물질에 해당동물을 노출시키거나, 표적 유전자 부위에서 재조합을 증진시키는 효소를 도입시키거나 또는 출생 후에 표적 유전자 변형을 지시하는 기타 방법시, 표적 유전자의 변형이 일어날 수 있는 조건적 녹아웃이 또한 포함된다.
본 발명에서 용어, “동물”은 인간 이외의 임의의 포유류 동물을 의미한다. 상기 동물은 배아, 태아, 신생아 및 성인을 포함하는 모든 연령의 동물을 포함한다. 본 발명에서 사용하기 위한 동물들은, 예를 들어, 상업용 소스로부터 이용할 수 있다. 이런 동물들은 실험용 동물 또는 다른 동물, 토끼, 설치류(예를 들어, 생쥐, 쥐, 햄스터, 게르빌루스 및 기니피그), 소,양, 돼지, 염소, 말, 개, 고양이, 새(예를 들어, 닭, 칠면조, 오리, 거위), 영장류(예를 들어, 침팬지, 원숭이, 붉은털원숭이)를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 용어, “표적 유전자”는 구체적으로 달리 명시되지 않는 한, 세포 내 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 가리킨다. “표적 서열”은, 구체적으로 달리 명시되지 않는 한, 표적 유전자의 일부분, 예를 들어, 표적 유전자의 하나 이상의 엑손 서열, 표적 유전자의 인트론 서열 또는 조절 서열, 또는 표적 유전자의 엑손 및 인트론 서열, 인트론 및 조절 서열, 엑손 및 조절 서열, 또는 엑손, 인트론 및 조절 서열의 조합을 가리킨다.
본 발명의 동물 모델은 DRG2 유전자가 넉아웃(Knock-out)됨으로써 뇌의 선조체(Striatum)에서 도파민 방출이 감소되며, 이로 인해 운동협응장애(motor coordination disorder) 및 불안 행동을 보이는바, 도파민 기능장애 질환 동물 모델로 이용될 수 있다.
상기 도파민 기능장애 질환은 운동장애, 우울증, 정서질환, 강박장애, 자폐증, 정신분열증, 주의력결핍과잉행장애, 알츠하이머병, 파킨슨병, 크로이츠펠트-야코프병, 치매 및 헌팅톤병 등을 예시할 수 있으나, 도파민의 기능장애와 관련된 질환이라면 그 종류를 특별히 한정하는 것은 아니다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 ⅰ) 실험군으로서 DRG2 유전자를 녹아웃(Knock-out)시킨 도파민 기능장애 질환 동물 모델에 시험물질을 투여하는 단계; ⅱ) 상기 ⅰ)의 실험군과 시험물질을 처리하지 않은 대조군 동물 모델과의 운동협응(Motor coordination)을 측정하여 비교하는 단계; 및 ⅲ) 대조군과 비교하여 상기 ⅰ)의 실험군에서 운동협응(Motor coordination)이 개선되는 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는, 도파민 기능장애 질환을 예방 또는 치료하기 위한 후보물질 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 ⅱ) 단계에서는 DRG2 유전자를 녹아웃(Knock-out)시킨 도파민 기능장애 질환 동물 모델에 시험물질을 투여한 실험군과, 시험물질을 처리하지 않은 대조군 동물 모델과의 운동협응(Motor coordination) 측정 이외에도 추가적으로 우울 행동을 더 측정할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예>
1. 재료 및 방법
<1-1> 마우스 사양관리
DRG2+/--C57BL/6(이종접합성 돌연변이체) 및 DRG2-/--C57BL/6(동종접합성 돌연변이체) 마우스 및 유전자형 프라이머 세트는 이전에 설명되었다(Mani, M.; Lee, U.H.; Yoon, N.A.; Kim, H.J.; Ko, M.S.; Seol, W.; Joe, Y.; Chung, H.T.; Lee, B.J.; Moon, C.H.; et al. Developmentally regulated GTP-binding protein 2 coordinates Rab5 activity and transferrin recycling. Mol. Biol. Cell 2016, 27, 334-348.). 이형접합성 돌연변이체 마우스를 교배한 후 유전자형 분석을 통해 DRG2+/+-C57BL/6(야생형) 및 DRG2-/--C57BL/6(동종접합성 돌연변이체) 마우스를 동정하였으며, DRG2-/- 마우스를 10 세대 동안 C57BL/6 WT 배경에 역교배시킨 후, 한국뇌연구원(KBRI)의 동일한 동물 시설에서 유지시켰다. 마우스를 케이지 당 2-5 마리 동물 그룹에 수용하였고, 자유롭게 먹이와 물의 섭취를 허용하였다. 07:00에 점등하여 12-12 명(明)/암(暗) 주기를 유지하였으며, 주변 온도 20-22℃ 하에서 일정한 공기 흐름을 통한 습도 (약 55 %)를 유지하였다. 동물의 건강을 정기적으로 모니터링하였다. 모든 실험 설계는 KBRI (IACUC-18-00018)의 기관 동물 관리 사용위원회 (IACUC)에 의해 검토되고 승인되었다(2018. 08. 07). 행동 시험은 시험실에서 일주기의 명(明) 주기 동안 수행되었다. 로타로드 시험, Y- 미로시험 및 십자형 높은 미로시험(Elevated Plus Maze test)은 동일한 마우스를 사용하여 수행하였다. 시험 당일에, 마우스를 시험실에 습관화시키고, 그들의 홈 케이지에 적응시키기 위해 30 분을 제공하였다.
<1-2> 로타로드 시험(Rotarod Test)
운동 능력 학습을 평가하기 위해 로타로드 테스트를 수행하였다. 훈련 세션 전에, 마우스를 3분 동안 정지 드럼에 머무르도록 습관화하였다. 세션 직전 매일 1분 동안 습관을 반복하였다. 마우스를 300초 동안 20rpm의 고정 속도로 회전 막대(Yusung Lab, Seoul, Korea)에서 시험하였고, 마우스 행동을 연속 3일 동안 세션 당 3회 시험하여 평가하였다. 각 시험 사이에 휴식 시간 180 초간 허용되었다. 시험의 종료는 마우스가 막대에서 떨어지거나 마우스가 300 초에 도달한 시간으로 하였다. 각 시험마다 지연 시간을 기록하였다.
<1-3> Y-미로시험(Y-maze test)
공간 학습을 위해, 본 실험에서는 희미한 빛으로 조명되는 3개의 세 개의 동일한 arm(길이 50cm, 너비 16cm, 높이 32cm, 서로 120°로 설정)을 포함하는 직접 제작한 Y 미로를 사용하였다. 시험실의 시각적 세부 사항은 교육 세션 전반에 걸쳐 일정하게 유지하였다. 시험 시작 전날, 5분 동안 미로를 자유롭게 탐험하도록하여 마우스를 습관화시켰다. 실험 동물을 출발점에 위치시키고 8분 동안 3개의 Open arm을 방문하도록 하였다. 시험 간격 동안, 각각의 실험 동물은 그들의 홈 케이지에 수용되었다. 정량 분석을 위해, alternation triplets(3개의 다른 구역에 차례로 들어간 경우)의 백분율, 총 통과(total entry) 횟수를 움직임의 비디오 분석 시스템으로 온라인으로 기록하였다(Ethovision 2.3, Noldus, Ltd., Wageningen, NL, USA).
<1-4> 십자형 높은 미로시험(Elevated Plus Maze(EPM) test)
불안감과 같은 행동을 측정하기 위해, 십자형 높은 미로시험(Elevated Plus Maze test)을 진행하였다. 이 장치는 측벽으로 둘러싸인 두 개의 Closed arm(길이 50.8cm, 너비 12cm, 높이 40.6-cm)과 두 개의 Open arm(길이 50.8cm 및 너비 12cm)로 구성되어 있으며, EPM의 높이는 지면으로부터 72.4cm 올라간 위치에 공통 중앙 플랫폼(10×10 cm)이 형성되어 있다. 마우스를 미로의 중앙에 위치시키고 10분 동안 탐구함으로써 습관화하였다. 그 후, 각각의 마우스를 Open arm을 향한 중앙 플랫폼에 개별적으로 배치하고 5분 동안 미로를 자유롭게 탐험하도록 하였다. 각 세션 후, 장치를 10% 에탄올로 세척하였다. 마우스 활동은 움직임의 비디오 분석 시스템 (Ethovision 2.3, Noldus, Ltd., Wageningen, NL, USA)을 이용하여 온라인으로 기록되었다. Open arm에서 보낸 시간의 백분율은 불안과 같은 행동의 지표로 사용되었다.
<1-5> 음성 주지성 시험(Negative Geotaxis Test)
음성 주지성(Negative Geotaxis)은 이전 보고서의 프로토콜에 따라 평가되었다. 간략하게는, 마우스를 5분 동안 그리드(grid) 상에 배치하여 마우스를 습관화시키고, 마우스 머리가 아래쪽을 향한 상태에서 대략 35°의 경사진 거친 표면 그리드(grid) 상에 각각의 신생아 (P4 이상)를 배치함으로써 테스트하였다. 새끼는 다음과 같이 점수를 매겼다 : 60 초 이내에 돌아 다니거나 위로 올라가거나, 시도했지만 60 초 이내에 돌아 다니지 못했거나, 근육이 약해져서 거의 견딜 수 없거나 완전한 마비로 인해 시험을 수행하지 못한 경우.
<1-6> 인시츄 하이브리디제이션(In Situ Hybridization)
간략하게는, 동결 절편을 해마체(hippocampal formation) 사이로 관상으로(coronally) 절단하였다. 절편을 Superfrost Plus Microscope Slides(# 12-550-15, ThermoFisher Scientific, MA, USA, MA)에 해동-장착(thaw-mounting)하였다. 절편을 4% 파라포름알데히드에 10분 동안 고정시키고, 증가하는 농도의 에탄올에서 5분 동안 탈수시킨 다음, 공기 건조시켰다. 이어서 조직 절편을 실온에서 10분 동안 프로테아제 소화를 위해 전처리하였다. 프로브 하이브리드화 및 증폭은 HybEZ hybridization oven(Advanced Cell Diagnostics, Hayward, CA, USA)을 사용하여 40℃에서 수행되었다. 이 연구에 사용된 프로브는 Mm-DRG2dml (nt) 2-306, Mm-Gad1-C2dml nt 62-3113, Mm-Gad2-C3dml nt 552-1506, Mm-Slc17a7/Vglut1-C3의 nt 464-1415, Mm-Slc17a6/Vglut2-C2의 nt 1986-2998, and Mm-TH-C2의 nt 483-1603에 상보적인 3개의 합성 올리고 뉴클레오티드였다(Advanced Cell Diagnostics, Hayward, CA, USA). 표지된 프로브를 Alexa Fluor 488, Atto 550 및 Atto 647에 접합시켰다. 조직 절편을 슬라이드 당 2 시간 동안 40℃에서 표지된 프로브 혼합물과 혼성화시켰다. 결합되지 않은 혼성화 프로브는 실온에서 2분 동안 1x 세척 버퍼를 이용하여 절편을 3회 세척함으로써 제거하였다. 신호 증폭을 위하여 Amplifier 1-FL 30분, Amplifier 2-FL 15분, Amplifier 3-FL 30분 및 Amplifier 4 Alt B-FL 15분 동안 40℃에서 반응시키는 과정을 포함하였다. 이후, 실온에서 2분 동안 1x 세척 버퍼로 세척하여 각 amplifier solution을 제거하였다. TCS SP8 Dichroic/CS(Leica, Wetzlar, Germany)를 사용하여 슬라이드를 관찰, 분석, 사진을 찍었으며, ImageJ program (NIH)을 사용하여 이미지를 분석하였다.
<1-7> TH 양성 뉴런의 면역블롯팅, 면역염색 및 정량
마우스 조직을 수집하기 위하여, 마우스를 2.5% 아베르틴(Avertin) 용액으로 깊게 마취시키고 차가운 PBS 용액으로 경심관류로 관류하여 혈액을 제거하였다. 각각의 장기 조직을 신속하게 해부하고 액체 질소에서 급속냉동하여 -80℃에서 보관하였다. 마우스 조직 용해물을 RIPA 버퍼(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 및 프로테아제 및 포스파타제 억제제를 함유하는 T-PER 버퍼(ThermoFisher Scientific, MA, USA)로 균질화시켰다. 조직 추출물은 14,000 rpm에서 4℃에서 20분 동안 2회 원심분리하여 상청액을 수집하였다. 동일한 양의 단백질을 SDS-PAGE로 분리하고 PVDF 멤브레인 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)으로 옮겼다. 이어서, 멤브레인을 실온에서 1시간 동안 5%(w/v) nonfat milk(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)가 함유된 TBS로 차단하였다. 항-DRG2(anti mouse-DRG2 (Proteintech, Rosemont, IL, USA)), 항-액틴 1차 항체(anti-β-actin (Cell Signaling, Danvers, MA, USA))를 5% normal goat serum이 함유된 TBS-T(TBS-Tween 20; 0.05% Tween 20)로 희석시키고, 4℃에서 하룻밤동안 멤브레인과 함께 반응시켰다. 결합되지 않은 항체를 제거하기 위하여 TBST에서 막을 실온에서 매번 15분 동안 4회 세척하였다. HRP와 접합된 이차 항체를 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. TBST로 광범위하게 세척한 후, GE HealthCare Chemi image documentation system을 사용하여 면역반응성을 검출하였다.
면역세포화학은 2.5% 아베르틴(Avertin) 용액으로 깊게 마취되고 차가운 PBS 용액으로 경심관류로 관류된 후 PBS에서 4% 파라포름알데히드 (PFA)로 채취된 마우스로부터 수득한 샘플에 대해 수행하였다. 해부된 뇌는 4℃에서 하룻밤동안 PBS에서 4% PFA에 유지시킨 후, 고정된 뇌를 4℃에서 적어도 하룻밤동안 4% PFA를 함유하는 10% 수크로스 1x PBS 버퍼에 유지시켰다. 이후, 고정된 뇌를 cryostat(CM1850, Leica, Wetzlar, Germany)을 사용하여 50-100 μm 두께로 절편화하기 전에 O.C.T. 화합물(Sakura Finetek, Torrance, CA, USA, USA)에 침지시켰다. 각각의 뇌 절편을 PBS로 1회 세척한 다음, 실온에서 1시간 동안 0.2 % 트리톤 X-100를 함유하는 PBS로 투과시키고, 이후 실온에서 1시간 동안 2.5% normal goat serum를 포함하는 PBS로 차단시켰다. 1 차 항체(rabbit anti-DRG2 (NOVUS, Centennial, CO, USA), mouse anti-Tuj1 (Abcam, Cambridge, UK), mouse anti-GFAP (Abcam, Cambridge, UK), goat anti-Iba1 (Abcam, Cambridge, UK), 및 mouse anti-TH (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA))를 블로킹 버퍼에 희석하고, 4℃에서 하룻밤동안 절편에 적용하였다. 이어서, 절편을 매번 15분 동안 0.1% 트윈 20을 함유하는 PBS로 4회 세척하고, 실온에서 2시간 또는 4℃에서 하룻밤동안 Alexa Fluor 488/594 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA)와 접합된 2차 항체로 염색한 다음, PBS에서 15분 동안 DAPI 염색하였다. 비오티닐화된 일차 항체를 TH 뉴런 염색에 사용하였고, 항-비오틴 이차 항체의 첨가에 이어 스트렙타비딘-호스라디쉬 퍼옥시다아제 복합체(streptavidin-horseradish peroxidase complex)와 함께 1시간 동안 인큐베이션시킨 후, 디아미노벤지딘(diaminobenzidine)에 노출시켰다. 절편을 추가적으로 0.1% 트윈 20을 함유하는 PBS로 3회 세척하고, 물로 2회 세척하였다. 상기 절편은 VECTASHIELD(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)로 마운팅하고, KBRI의 Advanced Neural Imaging Center에서 60x, 1.4NA 오일 침지 대물렌즈와 함께 Nikon A1rsi/Ni-E 도립공초점현미경(inverted confocal microscope)을 사용하여 단면의 이미지를 캡처했다.
TH 양성 세포의 수는 유전자형이 없는 수동으로 계산되었다. TH 양성 뉴런이 보일 때 중뇌의 흑질(SN), 복측피개영역(VTA), 중격의지핵(NAc) 및 선조체(Str) 섹션의 첫 번째 슬라이드부터 시작하여 모든 TH 뉴런은 양쪽 뇌 반구에서 전체 중뇌의 흑질(SN) 및 복측피개영역(VTA)을 통해 6 개의 슬라이드 마다 계수되었다. DRG2-/- 마우스 뇌에서 TH 양성 뉴런의 추정된 총 수는 TH 양성 세포 수를 추가하여 계산했으며, DRG2+/+ 마우스 뇌에서 TH 양성 뉴런의 %로 나타내었다. 선조체(Str) 및 중격의지핵(NAc)의 TH 염색 강도는 ImageJ software에 의해 측정되었다. 각 그룹으로부터 3 마리의 마우스를 24 개월령에 분석하였다.
<1-8> 고성능 액체크로마토그래피 (HPLC)를 사용한 도파민 방출 측정
해부된 선조체(Str) 조직을 액체 질소에서 동결시키고 -80℃에서 저장하였다. 선조체(Str) 조직 샘플을 0.3 N 과염소산에서 균질화한 다음, 12V에서 초음파 처리를 7회 수행하였다. 용해물을 4℃에서 10 분 동안 18,000 x g에서 원심분리하였다. 상등액 (10 μL)의 샘플을 UltiMate ™ 3000 ECD-3000RS(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA)로 구성된 HPLC-ECD 시스템에 주입하였다. Hypersil ™ BDS 가드 컬럼(28103-013001, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) 및 UniGuard ™ 가드 카트리지 홀더 (852-00, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 포함하는 Hypersil ™ BDS C18 컬럼 (3 μm, 3 x 150 mm)에서 크로마토그래피 분리가 이루어졌다. 이동상은 Dionex ™ 이동상 (70-3829, ThermoFisher Scientific, MA, Waltham, USA)이었다. 칼럼 온도는 35℃이고, 유량은 0.5mL/min이었다. ECD 세포 전위는 250mV 및 400mV였다. 각 신경 전달 물질의 피크는 표준 도파민 피크의 시간과 비교하여 체류 시간(retention time)으로 확인되었다. 샘플 크로마토그램의 피크 면적을 표준 도파민 크로마토그램의 피크 면적과 비교함으로써 농도를 계산하였다. 데이터 수집 및 처리에는 Dionex™ Chromeleon™ CDS software (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA)가 사용되었다. 도파민 (H8502), DOPAC (850217), 3-MT (M4251), HVA (H1252), EPI (E4375) 및 5-HT (H9523)를 포함한 모든 표준 신경 전달 물질은 Sigma-Aldrich에서 구입하였다.
<1-9> 슬라이스 고속스캔전압전류법(Fast Scan Cyclic Voltammetry, FSCV)에 의한 Str로부터의 도파민 방출 측정
선조체(Str)에서 전기적으로 유발된 도파민 방출은 FSCV에 의해 측정되었다. 이소플루란(isoflurane)을 사용하여 마우스를 마취시키고 희생시켰다. 뇌를 신속하게 제거하고, 뇌 조직 준비는 pH 7.2-7.4의 1mM 인산버퍼 상에 119mM NaCl, 26.2mM NaHCO3, 11mM 글루코스, 2.5mM KCl, 2.5mM CaCl2 및 1.3mM MgSO4를 함유하는 차갑고, 전산소화된 인공 뇌척수액(aCSF)에서 vibratome 절편 제작으로 시작되었다. 관상면의 뇌절편(300 μm)을 실온에서 적어도 1시간 동안 산소화된 인공 뇌척수액(aCSF)에 유지하였다. 기록을 위해, 뇌 슬라이스를 국부적으로 구성된 침수 기록 챔버(submersion recording chamber)로 옮기고, 32℃에서 산소화된 aCSF로 1mL/min 관류시켰다. 탄소 섬유 미세 전극을 전술한 바와 같이 제조하고(Martel, P.; Leo, D.; Fulton, S.; Berard, M.; Trudeau, L.E. Role of Kv1 potassium channels in regulating dopamine release and presynaptic D2 receptor function. PLoS ONE 2011, 6, e20402.), 기준 전극을 염소화된은 와이어로 제조하였다. 선조체(Str)에서 도파민 기록을 위해, 전극 전위를 400 V/s에서 Ag/AgCl에 대해 -0.4에서 1.2 V로 선형 스캔하고 다시 -0.4 V로 다시 스캐닝하였다. 스캐닝을 100 ms마다 반복하였다. 도파민 방출은 탄소 섬유 미세 전극으로부터 100-200 μm 떨어진 슬라이스 표면에 위치한 인접한 양극성 자극 전극(Plastics One, Roanoke, VA, USA)으로부터 1 펄스 자극(monophasic, 350 μA, 4-ms pulse width)에 의해 5 분마다 유발되었다. 탄소 섬유 미세 전극을 슬라이스 표면 아래 100㎛에 위치시켰다. 순환 전압계는 ChemClamp 전압 클램프 증폭기 (Dagan Corporation, Minneapolis, MN, USA)에 의해 100 ms마다 탄소 섬유 미세 전극에서 기록되었다. 볼타메트리(Voltammetry) 기록은 LabVIEW 기반 (National Instruments, Austin, TX, USA) 맞춤형 소프트웨어 (Demon Voltammetry)를 사용하여 수집 및 분석되었다.
<1-10> L-DOPA 적용
0.25% 아스코르브산을 함유하는 PBS에 용해된 L-DOPA(50 mg/kg; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) (25 mg/kg)를 마우스 단일 복강내 주사하였다. L-DOPA 투여 3시간 후, 로타로드 테스트(rotarod test)를 수행하였다.
<1-11> 신경세포, 성상세포 및 미세아교세포의 분리
1차 피질 뉴런 배양물을 이전에 기술된 바와 같이 16일령 배아 마우스로부터 제조하였다(Araki, W., et al., Overexpression of presenilin-2 enhances apoptotic death of cultured cortical neurons. Ann N Y Acad Sci, 2000. 920: p. 241-4./ Enokido, Y., et al., Basic fibroblast growth factor rescues CNS neurons from cell death caused by high oxygen atmosphere in culture. Brain Res, 1992. 599(2): p. 261-71.). 간략하게, 마우스 배아를 단두(decapitation)시키고, 뇌를 신속하게 제거하여 HBSS(Thermo Scientific, Waltham, MA)를 함유하는 배양 접시에 넣었다. 피질을 분리하여 원뿔형 튜브로 옮기고 HBSS(Thermo Scientific)에서 2회 세척하였다. 대뇌 피질 조직을 37℃에서 30분 동안 예열된 파파인(20 단위/ml) (Worthington Biochemical Corporation) 및 DNase I (0.005 %)에 의해 효소적으로 소화시켰다. 완전한 조직 균질화를 위해 조직을 1000 μL 및 200 μL 피펩 팁(pipette tips)으로 기계적으로 해리(마쇄)시켰다. 대뇌 피질 세포를 실온에서 10분 동안 800rpm에서 원심 분리하고, 수득된 세포를 2mM 글루타민 (Thermo Scientific), N2 보충제(Thermo Scientific), B27 보충제 (Thermo Scientific) 및 페니실린-스트렙토 마이신 (Thermo Scientific)를 함유하는 neurobasal media에 폴리-D-라이신 (Sigma-Aldrich)으로 코팅된 플레이트에 분주하였다. 배양배지는 처음에는 5일 및 이후 3 일마다 교체하였으며, 18일 동안 배양한 후 세포를 실험에 사용하였다.
McCarthy와 de Vellis의 방법으로 뇌로부터 성상세포와 미세아교세포 배양을 준비하였다(McCarthy, K.D. and J. de Vellis, Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol, 1980. 85(3): p. 890-902.). 간략하게는, 전체 뇌를 70-μm 스트레이너(strainer)에서 균질화하였다. 세포를 T75 배양 플라스크 또는 100mm 배양 접시에 분주하였다. 세포를 5% CO2를 함유한 가습된 분위기에서 37 ℃에서 성장시켰다. 배양 배지를 처음 5일 및 이후 2 일마다 교체하였으며, 14-21일 동안 배양한 세포를 사용하였다. 혼합된 신경교세포 배양물(glial cultures)을 250 rpm에서 4 시간 동안 진탕시켜 2 차 순수 성상세포 배양물을 수득한 후, 배양 배지를 버렸다. 트립신-EDTA(Life Technologies)를 사용하여 성상세포를 해리한 후 2000 rpm에서 30 분 동안 원심 분리를 진행하였다. 원심분리 후 수득한 성상세포를 10% 열-불활성화 소태아혈청 (FBS; Gibco) 및 페니실린-스트렙토 마이신 (Thermo Scientific)이 보충된 DMEM (Life Technologies)의 플레이트 상에 분주하였다. mild trypsinization solution(155mM NaCl, 2.9mM Na2HPO4-7H2O, 1mM KH2PO4, 0.2mM EDTA, 0.5mM CaCl2, 0.05 % 트립신 -EDTA (Ph 7.4))을 사용하여 순수한 미세아교세포 배양을 수행하였다. 간략하게, 5ml의 mild trypsinization solution 각각의 100mm 접시에 첨가하고 접시를 30분 내지 60분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 분리된 성상세포 층을 폐기하고 트립신-EDTA(Life Technologies)를 사용하여 미세아교세포를 분리한 다음 2000 rpm에서 30분 동안 원심분리 하였다. 원심분리 후 수득된 미세아교세포를 10% 열-불 활성화 FBS (Thermo Scientific) 및 페니실린-스트렙토 마이신 (Thermo Scientific)이 보충된 DMEM (Life Technologies)의 플레이트에 분주하였다.
<1-11> 통계분석
데이터의 분석 및 정량화는 SigmaPlot 13.0 (Systat Software, Point Richmond, CA, USA)으로 수행되었으며, 데이터는 평균±표준편차로 나타내었다. 일원 분산 분석을 사용하여 그룹 또는 시간에 따라 결과를 분석하였고, p <0.05 일 때 유의한 것으로 간주하였다. 유의성는 다음과 같이 표시된다: * p <0.05; ** p <0.01; *** p <0.001; N.S.는 유의성이 없음
2. 결과
<2-1> DRG2 녹아웃(KO) 생쥐에서 성장 지연 및 골격 결함
DRG2의 생리적 기능을 결정하기 위해, DRG2+/+(야생형(WT) 대조군) 및 DRG2+/-(이종접합성 돌연변이체) 마우스와 비교하여 DRG2-/-(동종접합성 돌연변이체) 마우스의 표현형에서의 변화를 먼저 관찰하였다. DRG2-/-마우스의 뇌 피질에서 DRG2 mRNA 및 단백질의 부재는 RT-PCR (도 1A 참조) 및 웨스턴블로팅 (도 1B 참조)에 의해 확인되었다. DRG2-/- 마우스는 DRG2+/+ 및 DRG2+/- 한배 새끼보다 출생시(1 일령) 유의하게 더 작은 것으로 나타났으며, 이러한 크기의 차이는 성체(12 주령)까지 지속되었다(도 1C 참조). 일관되게, DRG2-/- 마우스의 체중은 야생형(대조군) 마우스의 체중보다 상당히 작은 것을 확인할 수 있었다(도 1F 참조).
DRG2-/- 마우스의 작은 신체 크기가 골격 변화와 관련이 있는지 확인하기 위해, 본 실험에서는 마이크로컴퓨터단층촬영(CT)을 사용하여 출생 후 1일령 새끼로부터 뼈 조직을 분석하였다. 그 결과, DRG2+/- 마우스의 팔다리 뼈대(Appendicular Skeleton)에서 긴 뼈는 명백히 정상적인 골 밀도를 가진 것으로 나타났으나, DRG2-/- 마우스의 경우 야생형(대조군) 생쥐의 것보다 약 8 ~ 33% 더 짧은 것으로 나타났다. 또한, DRG2-/- 마우스는 두개골의 광물화가 현저히 감소된 것을 나타났으며, 대천문(anterior fontanel)에서 비골화한 영역이 증가한 것으로 나타났다(도 1E 참조). 다만, DRG2-/- 마우스가 두개골의 골화 감소를 나타내 었음에도 불구하고, 전체 뇌 크기, 전체 뇌 무게 또는 뇌 구조에서 유의미한 차이는 없었다(도 6D 및 6E 참조).
또한, 본 실험에서는 관찰된 생리학적 변화를 야기하는 성장 지연 현상을 확인하기 위해 출생 후의 생존율을 추가로 조사하였다. 그 결과, 도 1D에서 나타낸 바와 같이, DRG2-/- 마우스의 경우 야생형 대비 생존율이 유의하게 감소하는 것으로 나타났으며(p <0.001), 1년 후 DRG2-/- 마우스의 생존 속도는 야생형 마우스 속도의 20%에 불과한 반면, DRG2+/- 마우스는 생존에 유의한 변화를 나타내지 않았다(p> 0. 05).
<2-2> 마우스 뇌에서 DRG2 단백질의 지역 분포
본 실험에서는 DRG2 결핍에 의해 유도된 성장 지연이 뇌 기능에 어떻게 영향을 미치는지 확인하기 위해, 마우스 DRG2의 상세한 표현형 발현 패턴을 특성화하였다. DRG2는 특정 뇌 영역에서의 유전자 및 단백질 발현은 알려져 있지 않다. 따라서, 본 실험에서는 먼저 DRG2 단백질에 특이적인 항체를 사용하여 각 기관 조직을 염색하고 DRG2 단백질의 뇌-영역 특이성을 확인하였다. 그 결과, DRG2 단백질은 뇌, 폐 및 비장에서 강하게 발현되는 반면, 흉선, 간, 고환, 신장 및 폐에서는 약하게 발현되는 것으로 나타났다(도 2A 참조). 성체 마우스 뇌에서, DRG2 단백질은 주로 피질(CTX), 해마(HIP), 소뇌(CB) 및 중뇌의 흑질(SN)에서 발현되는 반면, 시상하부(HY)와 선조체(Str)에서는 적은 양의 단백질이 검출되었다(도 2B 참조). DRG2의 단백질 발현 수준은 높은 발현을 갖는 뇌 영역 사이에서 생후 발달 동안 유의미한 차이를 보이지 않았다(도 2C).
본 실험에서는 추가로 뇌에서의 DRG2의 기능을 결정하기 위해 인시츄 하이브리디제이션(In situ hybridization) 및 면역조직화학을 사용하여 성체 마우스 뇌에서 DRG2의 발현 패턴을 확인하였다. 그 결과, 인시츄 하이브리디제이션(In situ hybridization)은 마우스 뇌를 가로 질러 DRG2의 광범위한 발현을 나타내었지만, 시교차상핵(SCN)을 포함하여 DRG2 단백질에 대한 강한 신호는 웨스턴블롯팅에 의해 일관되게 검출되었다(도 2D 참조). 면역조직화학 분석에 따르면 DRG2 단백질의 발현 패턴은 DRG2 전사체의 발현 패턴과 유사하지만, 단백질 발현은 공간 수준에서 상이하였다: 부후구(accessory olfactory bulb), 피질(CTX), 해마(HIP), 중뇌의 흑질(SN), 소뇌(CB) 및 부완핵(parabrachial nucleus)은 높은 발현 수준을 보여주었으며, 반면에 시상하부(HYP), 중격의지핵(NAc), 시상(THs)에서 중간 정도의 발현이 관찰되었다. 확대된 이미지에서 나타난 바와 같이, DRG2 단백질은 핵 주위의 영역에서 그리고 소뇌의 푸르키네 신경세포체에서 주로 점으로 검출되었다. DRG2 단백질은 또한 대뇌 피질의 VI층, 해마(HIP)의 CA3(cornu ammonis 3), 흑색질 치밀부(substantia nigra pars compacta, SNc) 및 흑색질 그물부(substantia nigra pars reticulata)에서 높게 발현되었다(도 2E (a-i) 참조). 다음으로, 마우스 뇌의 관상면(coronal section)에서 DRG2 단백질 발현 패턴을 조사하였다. DRG2 단백질 발현은 1차 운동피질(somatomotor area) 및 1차 감각피질(somatosensory area), 팽대후부영역(retrosplenial area), 두정부 연합영역(parietal association area), 청각 영역, 시각 영역, 후각 피질(piriform area) 및 치상회(DG), cornu ammonis 1 (CA1)과 변연계에서 CA3, 및 해마 형성 동안의 내후각 영역의 모든 대뇌 피질 층에서 강하게 나타났다. DRG2 단백질은 또한 편도체의 기저내측핵(basomedial nucleus of the amygdala, BMAa), 시상(thalamus), 중뇌에서도 높게 발현되었다(도 2E (j-l) 참조).
마우스 뇌에서 DRG2 발현의 세포 특이성을 추가로 결정하기 위해, 본 실험에서는 DRG2의 발현과 세포-타입 특이적 마커(성상세포 마커 GFAP; 미세아교세포 마커 Iba1; 및 뉴런 마커 Tuj1)의 발현을 비교를 위한 면역조직화학 분석을 수행하였다. 그 결과, DRG2는 중뇌의 흑질(SN), 해마(HIP) 및 피질(CTX)과 같은 강한 발현을 갖는 뇌 영역에서 GFAP-양성 성상세포 또는 Iba1-양성 미세아교세포가 아닌 Tuj1-양성 뉴런과 고도로 공동국지화되었다(도 3A 및 도 6A, 6B 참조). 이것을 확인하기 위해, 뉴런, 성상세포 및 미세아교세포를 분리하고 웨스턴 블롯을 사용하여 이들 세포에서 DRG2의 발현을 분석하였다. 그 결과 DRG2 발현은 모든 유형의 세포로부터 검출되었지만, 뉴런(신경세포)에서의 DRG2 발현 수준은 성상세포 및 미세아교세포의 것보다 높았다(도 6C 참조).
또한, 본 실험에서는 DRG2가 흥분성 뉴런과 억제성 뉴런 간에 차등적으로 발현되는지 여부를 확인하였다. 해마(HIP)에서, DRG2 mRNA는 주로 치상회(DG) 및 Cornu Ammonis 영역(CA1 및 CA3)에서 발현되었다(도 3B 및 3C 참조). 본 실험에서는 수포성 글루타메이트 수송체 1 및 2와 같은 흥분성 뉴런 마커(각각 VGLUT1 및 VGLUT2) 및 억제성 뉴런 마커(GAD65 및 GAD67)에 대한 안티센스 프로브를 사용하여 이중 인시츄 하이브리디제이션(double in situ hybridization)를 수행하였다. 그 결과, VGLUT1은 주로 대뇌 피질, 해마(HIP) 및 소뇌(CB)에서 발현되는 반면, VGLUT2는 시상(THs) 및 시상하부(HYP)에서 우선적으로 발현되는 것으로 나타났다. 일관되게, DRG2의 경우 VGLUT1을 고도로 발현하는 해마(HIP)의 DG 및 CA1 영역에서 발현되지만 VGLUT2는 검출되지 않았다는 것을 발견하였다(도 3D 참조). DRG2는 GAD65 및 GAD67의 발현 수준이 해마(HIP)에서 매우 낮았음에도 불구하고, GAD65 및 GAD67과 함께 국지화되었다(도 3E 참조). 이러한 결과는 이중 인시츄 하이브리디제이션(double in situ hybridization)이 성공적이며 DRG2가 흥분성 뉴런뿐만 아니라 해마(HIP)의 억제성 뉴런과 함께 국지화되었음을 나타내는 것이다.
<2-3> DRG2 결핍은 마우스에서 운동 결핍을 유발하고 불안을 증가시킴
높은 DRG2 발현을 갖는 뇌 영역의 흥분성 및 억제성 뉴런에 대한 DRG2 결핍의 효과를 명확히 하기 위해, DRG2-/- 마우스를 사용하여 일련의 행동 테스트를 수행하였다. 본 실험에서는, 먼저 운동 협응(motor coordination) 및 전정 민감도(vestibular sensitivity)를 평가하는 음성 주지성(negative geotaxis) 테스트를 사용하였다. 이 시험에서, 마우스가 경사진 평면에서 머리 위쪽을 향한 위치로 방향을 재지정하는데 필요한 대기 시간이 기록하고, 머리 위쪽을 향한 위치로 방향을 재지정하지 못한 마우스의 시간은 60초로 기록하였다. 야생형 마우스의 경우 출생 후 4일째(P4) 새끼에서 방향 재설정의 초기 지연이 관찰되었지만, 모든 야생형(WT) 마우스는 출생 후 동안 60초 이내에 머리 위로 위치를 쉽게 재지정하였다. 대조적으로, DRG2-/- 마우스의 새끼는 출생 후 8일째(P8)까지 경사진 평면에 서 있지 못하여, 음성 주지성 테스트를 완료하지 못하였고, 출생 후 10일째(P10)에 상기 테스트를 완료할 수 있었다. 사후검정(Post Hoc Analysis)은 P4 (p = 0.002), P6 (p = 0.002) 및 P8(p = 0.015)에서 DRG2-/- 마우스와 야생형 대조군 마우스 사이에 유의한 차이를 보여주었다(도 4a 참조).
또한 다양한 연령대의 운동 협응(motor coordination) 및 운동 학습(motor learning) 기술을 조사하기 위해 로타로드 테스트(rotarod test)를 수행하였다. 고정 속도 버전의 로타로드 작업을 6주, 12주 및 40주령의 야생형 및 DRG2-/- 마우스에 적용하였다. 야생형 마우스(300 초)와 비교하여, 6 주령의 암컷 DRG2-/- 마우스는 운동 성능이 현저하게 감소하는 것으로 나타났다(243±22 초). 12주 또는 40주령의 암컷 DRG2-/- 마우스는 야생형 마우스 및 6주령 DRG2-/- 마우스 보다 훨씬 더 짧은 시간(각각 123±46 초 및 86±19 초) 동안 머물렀다(도 4b 참조). 로타로드 테스트에서 관찰된 40 주령 DRG2-/- 마우스를 제외한 DRG2-/- 마우스의 감소된 시간은 1주일 후에 반복된 테스트에 의해 개선되었다. 이러한 결과는 DRG2-/- 마우스가 운동 협응(motor coordination)에 결함이 있었지만 정상적인 운동 학습 기술을 가지고 있음을 시사하는 것이다. 다음으로 DRG2 결핍이 Y-maze 테스트를 이용하여 학습 및 메모리 동작에 영향을 미치는지 여부를 평가하였다. 그 결과, 수컷 및 암컷 DRG2-/- 젊은 (6 주령) 및 성체 (12 주령) 마우스에서 야생형 대비 alternation triplets(3개의 다른 구역에 차례로 들어간 경우)의 백분율, 총 통과 횟수 및 12주령에서 총 거리의 측면에서 유사한 성적을 보여주었다(그림 4c 참조). 이러한 데이터는 DRG2 결핍이 마우스의 메모리 성능에 영향을 미치지 않음을 시사한다.
또한, 십자형 높은 미로시험(Elevated Plus Maze(EPM) test)를 사용하여 DRG2-/- 마우스의 불안과 두려움 관련 행동을 평가하였다. 그 결과, 수컷 및 암컷 12 주령 DRG2-/- 마우스 둘 다 동일한 연령의 야생형 마우스보다 Open arm에서 상당히 적은 시간을 보내는 것으로 나타났는데(도 4d 참조), 이러한 결과는 DRG2 결핍이 마우스에서 불안-유사 행동을 증가시키는 것을 가리킨다.
<2-4> DRG2 결핍 마우스의 비정상적인 행동은 도파민 방출 변화에 의해 발생함
도파민성 뉴런은 그들의 축색 돌기를 선조체(Str) 내로 연장시키고 도파민을 분비하며, 이는 선조체(Str)에 발현된 도파민 수용체 D1 및 D2에 결합한다. 선조체의 도파민성 뉴런의 수 및 도파민 방출의 변화는 불안, 운동 협응, 보행 운동, 및 보상에 대한 민감도와 같은 선조체 관련 행동에 영향을 줄 수 있다. DRG2-/- 마우스에서 운동 협응 및 불안 행동의 변화를 확인하였는바, 본 실험에서는 DRG2 결핍이 도파민성 뉴런에서 결핍을 유발하는지 여부를 확인하였다. 이에, 본 발명자들은 도파민성 뉴런에서 DRG2의 발현 패턴을 분석하기 위해 하기 DRG2 및 티로신 하이드록실라제(TH)에 대한 안티센스 프로브를 사용하여 double in situ hybridization을 적용하였다(하기 표 1 참조). 복측피개영역(VTA) 및 중뇌의 흑질(SN)의 티로신 하이드록실라제(TH)-양성 뉴런에서 DRG2의 발현이 높은 수준으로 검출되었다(도 5a 참조). 개별 mRNA 전사체는 세포 내에서 밝은 점으로 나타났으며, DRG2 mRNA 점의 수는 TH-음성 세포(SN 및 VTA 영역에서 각각 3.2 ± 0.52 및 2.95 ± 0.64)보다 TH-양성 세포 (SN 및 VTA 영역에서 각각 11.85 ± 1.26 및 13.10 ± 0.84)에서 유의하게 더 높았다(도 5b 참조). 상기와 같은 결과를 통해, DRG2의 도파민 뉴런에서 역할을 제안할 수 있으며, DRG2 결핍이 도파민 뉴런 기능 장애를 일으킬 수 있음을 확인할 수 있었다.
흑색질 치밀부(SNc)에서 도파민을 생산하는 세포 사멸과 감소된 선조체 도파민 방출은 도파민 뉴런 기능 장애를 유발할 수 있다. 따라서 DRG2 결핍이 티로신 하이드록실라제(TH)-양성 뉴런의 집단 또는 선조체 도파민 방출의 변화를 유도하는지 여부를 결정하였다. 티로신 하이드록실라제(TH)-양성 뉴런을 항-TH 항체로 염색하고 호스라디쉬 퍼옥시다아제 복합체(horseradish peroxidase complex) 또는 Alexa Fluor 488/594와 접합된 2차 항체를 사용하여 검출하였다. 먼저, 티로신 하이드록실라제(TH) 강도 및 티로신 하이드록실라제(TH)-양성 뉴런을 정량화한 결과, 24개월령 야생형 및 DRG2-/- 마우스 사이의 SN, VTA, NAc 및 Str 영역에서 티로신 하이드록실라제(TH)-양성 뉴런의 강도 및 분포에 유의한 차이가 없는 것으로 나타났다(도 5c 및 도 7A, B 참조). 또한, DRG2 결핍은 티로신 하이드록실라제(TH)-양성 뉴런의 nistriatal 또는 mesolimbic 경로의 대상 영역에서 어떠한 변화도 유발하지 않았다(도 7C 참조). 상기와 같은 실험 결과는, DRG2 결핍이 도파민 뉴런 사멸에 영향을 미치지 않음을 시사한다.
다음으로 운동 거동의 조절에 수반되는 선조체의 모노아민 수준을 분석하였다. 그 결과, 선조체에서 도파민 함량(~29%, p = 0.0007), 3-메톡시티라민(3-MT) 수준 (~27%, p = 0.0062) 및 에피네프린 (EPI) 수준 (~24%, p = 0.0289)이 DRG2-/- 마우스에서 현저하게 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 그러나, 도파민 대사산물인 3,4-디하이드록시페닐아세트산(dihydroxyphenylacetic acid, DOPAC) 및 세로토닌(5-hydroxytryptamine, 5-HT)은 야생형 및 DRG2-/- 마우스 사이에 유의한 차이가 없는 것으로 나타났다(도 5d 참조). 상기와 같은 실험 결과를 통해, DRG2 결핍이 흑질-선조체 도파민작용성 기능장애(nigrostriatal dopaminergic dysfunction) 및 선조체에서 감소된 도파민 수준을 야기한 것으로 판단되었다.
다음으로 DRG2 결핍이 중뇌의 흑질(SN) 및 선조체(Str) 부위를 포함하는 마우스 뇌 슬라이스를 사용하여 연접전(presynaptic) 도파민 방출에 영향을 미치는지 여부를 실험하였다. 뇌 슬라이스를 양극성 자극 전극에 의해 자극하고, 탄소 섬유 기록 미세전극을 사용하여 도파민 방출을 측정하였다. DRG2-/- 마우스의 뇌 슬라이스에서 도파민 방출은 야생형 마우스의 뇌 슬라이스 보다 도파민 방출이 유의하게 낮은 것으로 측정되었다(도 5e 참조). 한편, 감소된 도파민 방출이 DRG2-/- 마우스에서 변경된 운동 협응 행동을 유발하는지 여부를 결정하기 위해, L-DOPA로 DRG2-/- 마우스를 처리하고 로타로드 테스트를 수행하였다. 무처리 또는 PBS 처리와 비교하여, L-DOPA의 투여는 로타로드 테스트에서 DRG2-/- 마우스의 운동 협응을 유의하게 증가시켰다(도 5f 참조). 실험 결과를 종합하면, DRG2 결핍이 흑질-선조체 도파민의 방출을 감소시키고, 이러한 도파민 방출 감소가 운동 협응 및 불안 행동을 일으키는 것을 시사한다.
| 프로브 명칭 | 카달로그 넘버 | 구입처 | |
| DRG2 | RNAscope®Probe- Mm-Drg2-O1 | 588531 | Advanced Cell Diagnostics, Hayward, CA, USA |
| 티로신 하이드록실라제(TH) | RNAscope®Probe- Mm-tyrosine hydroxylase (Th)-C2 | 317621 | Advanced Cell Diagnostics, Hayward, CA, USA |
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
DRG2: Developmentally regulated GTP-binding protein 2
Str: Striatum
VTA: Ventral tegmental area
SN: Substantia nigra
SNc: Substantia nigra pars compacta
SNr: Substantia pars reticulate
HIP: Hippocampu
CB: Cerebellum
CTX: Cerebral cortex
SCN: Suprachiasmatic nucleus
THs: Thalamus
PB: Parabrachial nucleus
HY or HYP: Hypothalamus
AOB: Accessory olfactory bulb
AUD: Auditory areas
BMA: Basomedial amygdala nuclear
CA1: Cornu ammonis1
CA3: Cornu ammonis3
DG: Dentate gyrus
CP: Caudate putamen
ENT: Entorhinal area
MB: Mid brain
Mo: Momatomotor area
NAc: Nucleus accumbens
Pir: Piriform cortex
PTLP: Posterior parietal association areas
RSP: Retrosplenial area
SS: Somatosensory area
SUB: Subiculum
VIS: Visual area
WB: Whole brain
PD: Parkinson’s disease
MT: Microtubule
Micro-CT: Micro-computerized tomography
AF: Aanterior fontanel
PM: Premaxillary-maxillary
DOPAC: 3,4-dihydroxyphenylaceti
3-MT: 3-methoxytyramine
HVA: Homovanillic acid
EPI: Epinephrine
5-HT: Serotonin
TH: Tyrosine hydroxylase
DA: Dopamine
L-DOPA: l-3,4-dihydroxyphenylalanine
KO: Knockout
Str: Striatum
VTA: Ventral tegmental area
SN: Substantia nigra
SNc: Substantia nigra pars compacta
SNr: Substantia pars reticulate
HIP: Hippocampu
CB: Cerebellum
CTX: Cerebral cortex
SCN: Suprachiasmatic nucleus
THs: Thalamus
PB: Parabrachial nucleus
HY or HYP: Hypothalamus
AOB: Accessory olfactory bulb
AUD: Auditory areas
BMA: Basomedial amygdala nuclear
CA1: Cornu ammonis1
CA3: Cornu ammonis3
DG: Dentate gyrus
CP: Caudate putamen
ENT: Entorhinal area
MB: Mid brain
Mo: Momatomotor area
NAc: Nucleus accumbens
Pir: Piriform cortex
PTLP: Posterior parietal association areas
RSP: Retrosplenial area
SS: Somatosensory area
SUB: Subiculum
VIS: Visual area
WB: Whole brain
PD: Parkinson’s disease
MT: Microtubule
Micro-CT: Micro-computerized tomography
AF: Aanterior fontanel
PM: Premaxillary-maxillary
DOPAC: 3,4-dihydroxyphenylaceti
3-MT: 3-methoxytyramine
HVA: Homovanillic acid
EPI: Epinephrine
5-HT: Serotonin
TH: Tyrosine hydroxylase
DA: Dopamine
L-DOPA: l-3,4-dihydroxyphenylalanine
KO: Knockout
<110> Korea Brain Research Institute
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DRG2 polynucleotide sequence
<400> 1
atggggatct tggagaaaat ctcggagatc gagaaggaga tcgctcgaac gcagaagaac 60
aaggccaccg agtaccacct gggcctgctg aaagcaaaac tggccaagta tcgggcccag 120
ctcctggaac catccaaatc cgcctcatcc aaaggagagg gctttgatgt catgaagtca 180
ggtgatgccc gtgtggcact gattggcttt ccctctgtgg gtaagtccac cttcttgagt 240
ctgatgacct ctacagccag cgaagctgcg tcctatgagt ttaccaccct gacgtgcatc 300
cctggggtca ttgaatacaa aggtgccaac atccagctct tggaccttcc tggaatcatt 360
gaaggagcag cacaaggccg aggccgtggc cggcaggtga ttgccgtagc acgcacagct 420
gatgtcgtcg tcatgatgct ggatgccacc aagggagatg tgcagaggtc cctgctggag 480
aaggagctgg agtctgtggg tattcgcctg aacaagcata agcccaacat ctatttcaag 540
cccaagaaag gtggtggcat ctcctttaac tcaacagtca cactgacaca atgctctgag 600
aagctggtgc agctcatcct acatgaatac aagatcttca acgccgaggt actcttccga 660
gaagactgct ctccagacga cttcatcgat gtgattgtgg gcaaccgggt gtatatgccc 720
tgcctctatg tgtataacaa aatcgaccag atctccatgg aagaagtaga ccgtttagct 780
cgaaagccca acagtgtagt tatcagttgc ggtatgaagt tgaacctcga ctacctgctg 840
gagatgctgt gggagtacct ggccctcacc tgcatttaca ccaagaagag aggacagaga 900
ccggacttca cagacgccat cattctccgg aaaggggcct ctgttgaaca cgtgtgccac 960
cgcatccatc ggtcactggc cagccagttc aagtacgcct tggtgtgggg taccagcacc 1020
aagtacagcc cacagcgggt aggcctgacc cacactatgg agcatgagga cgtcatccag 1080
attgtgaaga agtag 1095
Claims (10)
- 분석하고자 하는 대상 시료에서 DRG2 유전자의 발현량을 측정하여 정상 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 도파민 기능장애 질환의 진단을 위한 정보제공방법.
- 제1항에 있어서,
상기 대상 시료의 DRG2 유전자의 발현량이 정상 대조군 대비 감소된 경우 도파민 기능장애 질환으로 진단하는 것을 특징으로 하는 도파민 기능장애 질환의 진단을 위한 정보제공방법. - 제1항에 있어서,
상기 도파민 기능장애 질환은 운동장애, 우울증, 정서질환, 강박장애, 자폐증, 정신분열증, 주의력결핍과잉행장애, 알츠하이머병, 파킨슨병, 크로이츠펠트-야코프병, 치매 및 헌팅톤병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 도파민 기능장애 질환의 진단을 위한 정보제공방법. - a) 뇌 유래 신경세포에 분석하고자 하는 시험물질을 접촉시키는 단계;
b) 상기 시험물질을 접촉한 신경세포에서 DRG2의 발현 정도를 측정하는 단계; 및
c) 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 DRG2의 발현 정도가 증가한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는, 도파민 기능장애 질환을 예방 또는 치료하기 위한 후보물질 스크리닝 방법. - 제4항에 있어서,
상기 b) 단계의 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응 (reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응 (real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석 (radioimmunoassay;RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 면역침전분석법 (immunoprecipitation assay) 및 면역조직 화학적 분석(immunohistochemical analysis)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 도파민 기능장애 질환을 예방 또는 치료하기 위한 후보물질 스크리닝 방법. - DRG2 유전자를 녹아웃(Knock-out)시킨 도파민 기능장애 질환 동물 모델.
- 제6항에 있어서,
상기 동물 모델은 DRG2 유전자가 녹아웃(Knock-out)됨으로써 뇌의 선조체(Striatum)에서 도파민 방출이 감소되는 것을 특징으로 하는 도파민 기능장애 질환 동물 모델. - 제6항에 있어서,
상기 동물은 마우스, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 랫트, 소, 양, 돼지 및 염소로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 도파민 기능장애 질환 동물 모델. - 제6항에 있어서,
상기 도파민 기능장애 질환은 운동장애, 우울증, 정서질환, 강박장애, 자폐증, 정신분열증, 주의력결핍과잉행장애, 알츠하이머병, 파킨슨병, 크로이츠펠트-야코프병, 치매 및 헌팅톤병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 도파민 기능장애 질환 동물 모델. - ⅰ) 실험군으로서 제6항의 동물 모델에 시험물질을 투여하는 단계;
ⅱ) 상기 ⅰ)의 실험군과 시험물질을 처리하지 않은 대조군 동물 모델과의 운동협응(Motor coordination)을 측정하여 비교하는 단계; 및
ⅲ) 대조군과 비교하여 상기 ⅰ)의 실험군에서 운동협응(Motor coordination)이 개선되는 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는, 도파민 기능장애 질환을 예방 또는 치료하기 위한 후보물질 스크리닝 방법.
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| KR1020200109266A KR102478215B1 (ko) | 2020-08-28 | 2020-08-28 | Drg2 유전자의 도파민 방출 조절제로서의 용도 |
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| KR20100096010A (ko) * | 2009-02-23 | 2010-09-01 | 울산대학교 산학협력단 | Ｄｒｇ2 유전자의 신규한 용도 |
| KR20150002935A (ko) | 2013-06-27 | 2015-01-08 | 울산대학교 산학협력단 | Ｄｒｇ２ 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 철대사 이상질환의 예방 또는 치료용 조성물 |
| KR20190143417A (ko) * | 2019-08-22 | 2019-12-30 | 연세대학교 산학협력단 | 뇌 종양의 예후 예측 방법 |
-
2020
- 2020-08-28 KR KR1020200109266A patent/KR102478215B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| KR101303462B1 (ko) | 2009-02-23 | 2013-09-05 | 울산대학교 산학협력단 | Ｄｒｇ2 유전자의 신규한 용도 |
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| KR20190143417A (ko) * | 2019-08-22 | 2019-12-30 | 연세대학교 산학협력단 | 뇌 종양의 예후 예측 방법 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Genome Res,12(5): 713-728. (2002.05.) * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR102478215B1 (ko) | 2022-12-16 |
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