KR102307548B1 - Htr2a 길항제를 유효성분으로 포함하는 지방간의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Htr2a 길항제를 유효성분으로 포함하는 지방간의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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Abstract

HTR2A 억제제를 유효성분으로 포함하는 지방간의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 등에 관한 것이다. 본 발명의 HTR2A 억제제는 고지방식이에 의해 유도되는 지방간 생성을 억제하고, 간세포 내 지방생성과 관련된 유전자들의 발현을 억제하므로 지방간의 예방 또는 치료용 조성물 등의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

HTR2A 길항제를 유효성분으로 포함하는 지방간의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical Composition For Preventing Or Treating Fatty Liver Comprising HTR2A Antigonist}
본 발명은 HTR2A 길항제를 유효성분으로 포함하는 지방간의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 등에 관한 것이다.
지방간은 간 세포에 중성지방이 축적되는 질병으로, 비만, 대사증후군과 같은 에너지 과잉 상태나 과다한 알코올의 섭취에 의해 발생한다. 지방간이 지속되면 지방간염, 간경화 및 간암 까지도 이어지는 일련의 질환을 유발할 수 있다. 최근 과다한 열량을 섭취하는 식습관과 음주문화, 운동 부족으로 인하여 서구 선진국뿐만 아니라 우리나라에서도 비만인구와 지방간 인구가 급증하고 있으며 이는 심각한 사회문제로 대두 되고 있다.
지방간은 간에서 일어나는 지방대사 경로를 통하여 간에서 축적되는 지방의 양이 간에서 대사되는 지방의 양을 초과하게 되는 경우 발병한다. 혈중으로부터 간으로 유입되는 지방의 흡수 증가, 간에서 만들어내는 지방 신생의 증가, 간에서 합성하는 중성 지방의 증가, 간에서 소비되는 지방 산화의 감소, 간에서 혈중으로 지방을 내보내는 초저밀도 지단백(VLDL, very low desity lipoprotein)의 감소 등이 지방간의 병태생리에서 보이는 내용들이다.
지방간의 예방 및 치료를 위한 방법으로 식이 조절 및 알코올 섭취 제한 등 대사적인 위험인자를 조절하는 방법이 사용되고 있으나, 아직까지 지방간 자체에 대한 치료법은 부족한 상황이다. 따라서 현재 전 세계적으로 새로운 지방간 치료제의 개발을 위한 다각적인 측면의 연구가 진행되고 있다. 지방간의 예방 또는 치료용 약물은 상술한 간의 지방대사 경로들의 조절을 통해 지방의 축적보다 지방의 감소를 유도하는 기전으로 작용할 수 있다.
본 발명자들은 항지방간 활성을 갖는 물질을 개발하기 위해 노력한 결과, 본 발명의 사포그렐레이트, 케탄세린 등을 포함하는 HTR2A 길항제가 유의적인 지방간 개선 효과를 나타내는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 HTR2A(5-hydroxytrptamine receptor 2A) 억제제를 유효성분으로 포함하는 지방간의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 HTR2A(5-hydroxytrptamine receptor 2A) 억제제를 유효성분으로 포함하는 지방간의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 다음 단계를 포함하는 지방간의 예방 또는 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공하는데 있다:
(a) HTR2A(5-hydroxytrptamine receptor 2A) 유전자 또는 단백질을 포함하는 분리된 세포에 시험물질을 접촉하는 단계; 및
(b) 상기 HTR2A 유전자의 발현량, 또는 HTR2A 단백질의 양 또는 활성을 측정하는 단계:
상기 HTR2A 유전자의 발현량, 또는 HTR2A 단백질의 양 또는 활성이 상기 시험물질을 접촉하지 않은 세포와 비교하여 하향조절되는 경우, 상기 시험물질을 지방간의 예방 또는 치료제 후보물질로 판정한다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 HTR2A(5-hydroxytrptamine receptor 2A) 억제제를 유효성분으로 포함하는 지방간의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에서, 용어 “지방간(fatty liver)”은 정상 간에서 지방이 차지하는 비율(5%)보다 많은 양의 지방이 간에 축적된 증상을 의미한다. 상기 지방간은 크게 과음으로 인한 알코올성 지방간과 비만, 당뇨병, 고지혈증 또는 약물 등으로 인한 비알코올성 지방간으로 분류될 수 있다. 알코올성 지방간은 알코올을 많이 섭취하게 되면 간에서 지방 합성이 촉진되고 정상적인 에너지 대사가 이루어지지 않아 발생하고, 비알코올성 지방간은 알코올 이외의 원인으로 인하여 발생하며, 상기 비알코올성 지방간은 지방 대사의 이상을 초래하는 성인병에 동반되는 경우가 빈번한 것으로 알려져 있다.
본 명세서에서 용어 “알코올성 지방간”이란, 과다한 알코올의 섭취(과음)에 의하여 간세포에 지방이 축적된 상태를 말한다.
본 발명에서 용어 "비알코올성 지방간"이란, 알코올 이외의 원인으로 인하여 발생하는 지방간을 의미한다. 이는 전체 지방간의 57%를 차지하고, 대체로 지방 대사의 이상을 초래하는 성인병에 동반되는 경우가 빈번한 것으로 알려져 있다. 이러한 성인병에 동반되는 원인 중 하나는 과도한 탄수화물의 섭취 및 이로 인하여 발생하는 비만인 것으로 알려져 있으며, 실제로 비알코올성 지방간이 발병된 환자의 75%가 비만환자라고 보고된 바 있다.
본 명세서에서, 용어 “HTR2A(5-hydroxytrptamine receptor 2A, 또는 5-HT2A 수용체)”는 세로토닌 수용체 군에 속하며 G 단백질 결합 수용체 (G protein-coupled receptor, GPCR) 인 5-HT2 수용체의 아형 중 하나이다. HTR2A는 LSD와 같은 세로토닌성 환각제의 표적으로서의 중요성 때문에 처음으로 주목 받았고, 나중에는 많은 항 정신병 약물, 특히 비정형 약물의 작용을 중재하는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 상기 HTR2A와 지방간과의 관련성에 대해서는 아직까지 알려진 바가 없다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 지방간의 예방 또는 치료는 HTR2A의 억제제 의해 달성된다.
상기 HTR2A의 억제는 다양한 방식으로 할 수 있다.
본 명세서에서 용어, “억제제”는 길항제(antagonist)일 수 있다. 길항제란 어떤 생체작용물질의 수용체와의 결합에 길항적으로 작용하지만, 자신은 각 수용체를 통한 생리작용을 나타내지 않는 물질을 말하며, 길항제, 차단제(blocking agent), 저해제(inhibitor) 등이 이에 해당한다. 본 명세서에서 상기 길항제는 수용체에 대한 역 작용제(inverse agonist)를 포함한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 HTR2A 길항제는 사포그렐레이트(Sarpogrelate), 5-I-R91150, 5-MeO-NBpBrT, 아다탄세린(Adatanserin), 알탄세린(Altanserin), AMDA(9-Aminomethyl-9,10-dihydroanthracene), 암페로자이드(Amperozide), 아세나핀(Asenapine), BL-1020, 시난세린(Cinanserin), 클로자핀(Clozapine), 데람시클란(Deramciclane), 파난세린(Fananserin), 플리반세린(Flibanserin), 글레만세린(Glemanserin), 이페란세린Iferanserin), 케탄세린(Ketanserin), KML-010, 리단세린(Lidanserin), 루바조돈(Lubazodone), 루마테페론(Lumateperone), LY-367,265, 메디폭사민(Medifoxamine), 메피프라졸(Mepiprazole), MIN-101, 나프티드로퓨릴(Naftidrofuryl), 네파조돈(Nefazodone), 올란자핀(Olanzapine), 페녹시벤자민(Phenoxybenzamine), 피팜페론(Pipamperone), 프루반세린(Pruvanserin), 라우월신(Rauwolscine), 쿠에티아핀(Quetiapine), 리스페리돈(Risperidone), 리탄세린(Ritanserin), 세토페론(Setoperone), 스피페론(Spiperone), 볼리난세린(Volinanserin), 및 자일라미딘(Xylamidine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 가장 구체적인 구현예에 따르면, 상기 HTR2A 길항제는 케탄세린(Ketanserin)이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 HTR2A 길항제는 HTR2A 발현억제제일 수 있다. 상기 발현억제제는 HTR2A 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및 리보자임으로 이루어진 군으로부터 선택된 HTR2A 발현억제제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 "안티센스 올리고뉴클레오타이드”란 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 안티센스 서열은 HTR2A mRNA(예컨대, GenBank Accession Nos. NM_000621.4 및 NM_001165947.2)에 상보적이고 HTR2A mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하고, HTR2A mRNA의 번역, 세포질내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 핵산의 길이는 6 내지 100 염기이고, 구체적으로는 8 내지 60 염기이며, 보다 구체적으로는 10 내지 40 염기이다.
상기 안티센스 핵산은 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5(3):343-55(1995)). 핵산 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 핵산은 하나 이상의 치환된 당 모이어티(sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 핵산은 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴, 6-메틸아데닌, 5-me 피리미딘(특히 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6 (6-아미노헥실)아데닌, 2,6-디아미노퓨린 등이 있다. 또한 본 발명의 안티센스 핵산은 상기 안티센스 핵산의 활성 및 세포 흡착성을 향상시키는 하나 이상의 모이어티(moiety) 또는 컨쥬게이트(conjugate)와 화학적으로 결합될 수 있다. 콜레스테롤 모이어티, 콜레스테릴 모이어티, 콜릭산, 티오에테르, 티오콜레스테롤, 지방성 사슬, 인지질, 폴리아민, 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 아다맨탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 옥타데실아민, 헥실아미노-카르보닐-옥시콜에스테롤 모이어티 등의 지용성 모이어티 등이 있고 이에 제한되지는 않는다. 지용성 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드와 제조 방법은 본 발명의 기술 분야에서 이미 잘 알려져 있다(미국특허 제5,138,045호, 제5,218,105호 및 제5,459,255호). 상기 변형된 핵산은 뉴클레아제에 대한 안정성을 증가시키고 안티센스 핵산과 표적 mRNA와의 결합 친화력을 증가시킬 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드의 경우 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 한 예는 RNA 중합효소 I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 인식부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 이런 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 이용될 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 디자인은, GenBank에 공지된 HTR2A mRNA의 뉴클레오타이드 서열을 참조하여 당업계에 공지된 방법에 따라 쉽게 제작할 수 있다 (Weiss, B. (ed.): Antisense Oligodeoxynucleotides and Antisense RNA : Novel Pharmacological and Therapeutic Agents, CRC Press, Boca Raton, FL, 1997; Weiss, B., et al., Antisense RNA gene therapy for studying and modulating biological processes. Cell. Mol. Life Sci., 55:334-358(1999).
본 명세서에서 용어 "siRNA”는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다(참조: WO 00/44895, WO 01/36646, WO 99/32619, WO 01/29058, WO 99/07409 및 WO 00/44914). siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운 방법으로서 또는 유전자치료 방법으로 제공된다. siRNA는 식물, 벌레, 초파리 및 기생충에서 처음으로 발견되었으나, 최근에 siRNA를 개발/이용하여 포유류 세포연구에 응용되었다.
본 발명에서 siRNA 분자가 이용되는 경우, 센스 가닥(HTR2A mRNA 서열에 상응하는(corresponding) 서열)과 안티센스 가닥(HTR2A mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있으며, 또는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다. siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 더욱 바람직하게는 20 내지 70 염기이다.
siRNA 말단 구조는 HTR2A 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다.
본 발명에서 siRNA 분자는, 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오타이드 서열(예컨대, 약 5-15 nt)이 삽입된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며, 전체적으로는 스템-앤드-루프 구조를 형성하게 된다. 이 스템-앤드-루프 구조는 인 비트로 또는 인 비보에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성의 siRNA 분자를 생성한다.
본 발명에서 용어 "예방"은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 상기 지방간의 발병을 억제시키거나 발병을 지연하는 모든 행위를 말하며, "치료"란 상기 조성물의 투여로 지방간을 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 지방간의 예방 또는 치료용 조성물은 지방간이 발생할 가능성이 있거나 또는 발생된 개체에 투여함으로써 지방간의 발병을 억제하거나 호전시키는데 사용될 수 있다.
본 발명의 HTR2A 길항제를 유효성분으로 포함하는 조성물 및 치료방법은 인간뿐만 아니라 지방간과 관련된 모든 질병이 발병할 수 있는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이 등의 포유동물에게도 사용될 수 있다.
본 발명의 상기 HTR2A 길항제를 포함하는 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 상기 HTR2A 길항제를 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 유효성분의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 연령, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 유효성분은 0.0001 ~ 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 ~ 100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 조성물에서 본 발명의 유효성분은 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 ~ 10 중량%, 바람직하게는 0.001 ~ 1 중량%의 양으로 존재하여야 한다.
또한, 본 발명의 유효성분의 약제학적 투여 형태는 이들의 약제학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약제학적 활성 유효성분과 결합하거나 적당한 집합으로 사용될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 마우스, 랫트, 소, 말, 돼지 등의 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 복강, 직장 또는 정맥, 동맥, 근육, 흡입, 경피, 피하, 피내, 자궁 내, 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 HTR2A 억제제를 유효성분으로 포함하는 지방간의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 HTR2A 억제제는 사포그렐레이트(Sarpogrelate), 5-I-R91150, 5-MeO-NBpBrT, 아다탄세린(Adatanserin), 알탄세린(Altanserin), AMDA(9-Aminomethyl-9,10-dihydroanthracene), 암페로자이드(Amperozide), 아세나핀(Asenapine), BL-1020, 시난세린(Cinanserin), 클로자핀(Clozapine), 데람시클란(Deramciclane), 파난세린(Fananserin), 플리반세린(Flibanserin), 글레만세린(Glemanserin), 이페란세린Iferanserin), 케탄세린(Ketanserin), KML-010, 리단세린(Lidanserin), 루바조돈(Lubazodone), 루마테페론(Lumateperone), LY-367,265, 메디폭사민(Medifoxamine), 메피프라졸(Mepiprazole), MIN-101, 나프티드로퓨릴(Naftidrofuryl), 네파조돈(Nefazodone), 올란자핀(Olanzapine), 페녹시벤자민(Phenoxybenzamine), 피팜페론(Pipamperone), 프루반세린(Pruvanserin), 라우월신(Rauwolscine), 쿠에티아핀(Quetiapine), 리스페리돈(Risperidone), 리탄세린(Ritanserin), 세토페론(Setoperone), 스피페론(Spiperone), 볼리난세린(Volinanserin), 및 자일라미딘(Xylamidine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 HTR2A 길항제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 식품 조성물은 지방간을 예방 또는 개선하는 기능을 가진다.
본 발명의 상기 지방간의 예방 또는 개선용 식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다.
상기 식품 조성물에는 HTR2A 억제제 이외에도 지방간의 개선에 방해가 되지 않는 다른 성분을 추가적으로 포함할 수 있으며, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 통상의 식품과 같이 여러 가지 생약 추출물, 식품학적으로 허용가능한 식품보조첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상기 "식품보조첨가제"란 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)도 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에는 건강기능성 식품이 포함될 수 있다. 본 발명에서 용어 "건강기능성 식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 기능성이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다.
본 발명의 건강기능성 식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나다.
유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품의 제조 시에 본 발명의 HTR2A 길항제는 원료 조성물 중 1 ~ 10 중량 %, 바람직하게는 5 ~ 10 중량 %의 용량으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하의 용량으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 명세서에서 용어, "개선"은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 지방간의 병증이 호전 내지 완화되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 중성지방 양의 감소, 지방신생의 감소, 간내 지방량의 감소 등, 지방간의 증상을 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 실시예에서, 본 발명자들은 지방간의 병태생리와 세로토닌의 관계를 확인하기 위하여 지방간 유도 마우스 모델에서 세로토닌 합성 효소인 Tph1 (Tryptophan hydoxylas 1)의 발현을 확인한 결과, 고지방 식이나 에탄올 섭취에 의해 세로토닌 합성의 주된 장소인 장 조직에서의 Tph1 발현이 증가함을 확인하였다 (도 1 참조 및 도 2 참조).
또한, 증가된 세로토닌과 지방간의 상관관계를 분석하기 위하여 장 조직 특이적으로 Tph1 이 제거된 마우스 (Tph1 gut-specific knockout, 이하 Tph1 GKO)를 제작하여 지방간을 유도한 결과, 고지방식이에 의한 지방간 변화가 개선됨을 확인하였다 (도 3 참조).
또한 해당 마우스의 간 조직에서 중성지방을 정량한 결과 wild type 마우스에 비해 유의한 감소를 확인하였다 (도 4 참조).
나아가, Tph1 GKO 마우스에서 고지방식이에 의한 지방간 변화가 개선되는 이유를 찾기 위하여 간의 지방대사와 관련된 유전자들의 발현 양상을 조사한 결과, 지방신생성 (de novo lipogenesis)을 담당하는 Fasn, Acly, Me1, Scd1 및 중성지방합성을 담당하는 Gpam, Lpin1, Mogat1 의 발현이 감소됨을 확인하였다(도 5 참조). 또한 이러한 변화가 지방생성의 주된 유전자 발현 전사 인자인 Srebp1c 의 감소에 의한 것임을 확인하였다(도 5 참조).
Tph1 GKO 마우스의 고지방식이에 의한 지방간 개선 효과가 알코올성 지방간에도 적용되는지를 확인하기 위해 해당 마우스에 에탄올 식이를 시행한 결과 역시 지방간이 개선됨을 확인하였다(도 6 참조). 또한 해당 마우스의 간 조직에서 중성지방을 정량한 결과 wild type 마우스에 비해 유의한 감소를 확인하였다(도 7 참조).
Tph1 GKO 마우스에서 에탄올에 의한 지방간 개선은 간에서 지방산 산화를 담당하는 Cpt1a 의 발현 증가, 지방산을 세포내로 들여오는 Cd36 의 발현 감소, 세포내 중성지방을 합성하는 Lpin1 발현의 감소에 의한 것으로 확인되었다(도 8 참조).
이상의 Tph1 GKO 마우스가 보이는 알코올성 및 비알코올성 지방간에 대한 개선효과가 직접적인 세로토닌 신호전달 과정과 연관되어 있는지를 확인하기 위하여 간 조직의 유전자 발현을 조사한 결과 세로토닌 수용체들과 세로토닌의 재흡수 및 대사를 담당하는 유전자들의 발현이 확인되었다 (도 9 참조).
그 중 세로토닌 수용체 HTR2A를 대상으로 하여 해당 수용체 특이적 길항제인 케탄세린을 투여하면서 고지방식이에 의한 지방간 변화를 조사하였다. 그 결과, 고지방식이와 함께 케탄세린을 투여하면 체중 증가가 감소되는 효과를 확인할 수 있었다(도 10 참조). 또한 포도당 및 인슐린 감수성 검사에서 케탄세린에 의해 내당능, 인슐린 저항성이 개선됨을 확인하였다 (도 11 참조). 이와 함께 고지방식이에 의한 지방간 변화가 케탄세린을 투여한 군에서 개선됨을 관찰하였고 (도 12 참조) 간 조직 내 중성지방의 양이 유의하게 감소됨을 확인하였다 (도 13 참조).
이상의 본 발명의 케탄세린에 의한 결과들이 직접적으로 간 세포에 작용해서 나타난 것인지를 확인하기 위하여 마우스의 간세포를 초대 배양하여 케탄세린을 직접 투여한 결과 지방 생성에 관련된 유전자들의 발현 감소를 확인하였고 (도 14 참조), 반대로 케탄세린의 목적 수용체인 HTR2A 에 대한 작용제(agonist)를 투여하면 그 반대의 결과가 나타나는 것을 확인하였다(도 15 참조).
따라서, 간으로 작용하는 세로토닌을 억제하면 지방생성의 주된 유전자 발현 전사 인자인 Srebp1c 의 발현이 억제되어, 그로 인한 지방 생성 관련 유전자들의 발현을 억제시키고 이를 통해 알코올성 및 비알코올성 지방간의 개선 및 중성지방의 감소를 확인하였고, 이를 매개하는 세로토닌 수용체가 HTR2A 임을 확인함으로써 본 발명의 케탄세린을 지방간의 예방 또는 치료용 조성물로 유용하게 사용할 수 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명의 케탄세린은 간 세포에서 지방생성에 관여하는 Acly, Me1 의 발현을 억제하였으며, 이와 반대로 케탄세린의 목적 수용체인 HTR2A 에 대한 작용제에 의해 Acaca, Fasn 의 발현 증가를 확인함으로써, 상기 케탄세린을 간 지방대사 조절용 조성물에 유용하게 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 실시예에 따르면, 간조직 특이적 HTR2A 제거 마우스(Htr2a LKO)에서 간 내 지방 축적이 감소되어 지방간이 개선됨을 확인하였으며(도 17a 내지 도 17c 참조), 간 조직 내 중성지방(hepatic triglyceride)의 양도 사포그렐레이트 투여군에서 유의하게 감소되는 것을 확인하였으므로(도 18 참조) 상기 HTR2A 유전자는 지방간의 발병과 관련된 유전자임을 확인하였으며, 본 발명의 HTR2A 길항제는 지방간의 예방 또는 치료용 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 실시예에 따르면, 간 조직 특이적 Htr2a 제거 마우스(Htr2a LKO)에서 지방신생 및 중성지방 합성과 관련된 유전자의 발현량이 감소하고, 지방산 흡수와 관련된 유전자의 발현량이 감소되므로, HTR2A 유전자는 지방간의 발병과 관련된 유전자임이 확인되었으며, 본 발명의 HTR2A 길항제는 지방간의 예방 또는 치료용 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 실시예에 다르면, 고지방식이를 섭취한 마우스 군에 본 발명의 HTR2A 안타고니스트의 일종인 사포그렐레이트을 투여하였을 때, 비히클만 투여한 군과 비교하여 체중증가가 유의하게 감소되었으며(도 23), 간 조직 내 지방의 축적은 감소되었으며(도 24a 및 도 24b), 간 조직 내 중성지방(hepatic triglyceride) 또한 감소되었다. 따라서, 본 발명에서 HTR2A의 일종인 케탄세린 및 사포그렐레이트를 통하여 확인한 바와 같이, HTR2A 억제제는 지방간이 발병과 관련된 유전자인 HTR2A 유전자의 발현을 억제하거나(발현억제), 또는 HTR2A 수용체의 작용을 길항함으로서(수용체 길항제), 지방간의 예방 또는 치료용 조성물로써 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 지방간의 예방 또는 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) HTR2A(5-hydroxytrptamine receptor 2A) 유전자 또는 단백질을 포함하는 분리된 세포에 시험물질을 접촉하는 단계; 및
(b) 상기 HTR2A 유전자의 발현량, 또는 HTR2A 단백질의 양 또는 활성을 측정하는 단계:
상기 HTR2A 유전자의 발현량, 또는 HTR2A 단백질의 양 또는 활성이 상기 시험물질을 접촉하지 않은 세포와 비교하여 하향조절되는 경우, 상기 시험물질을 지방간의 예방 또는 치료제 후보물질로 판정한다.
본 발명의 지방간의 예방 또는 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 각각의 단계로 상세하게 설명하면 다음과 같다:
단계 (a): HTR2A(5-hydroxytrptamine receptor 2A) 유전자 또는 단백질을 포함하는 분리된 세포에 시험물질을 접촉
본 발명에 따르면, HTR2A 유전자 또는 단백질을 포함하는 세포에 시험물질을 접촉시킨다.
상기 세포는 다양하게 준비될 수 있으나, 구체적으로는 간세포이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 마우스의 간세포를 분리하여 이용하였다.
본 발명의 스크리닝 방법을 언급하여 사용되는 용어 “시험물질”은 HTR2A 유전자의 발현량, 또는 HTR2A 단백질의 양 또는 활성에 영향을 미치는지 여부를 확인하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시험물질은 구체적으로는 추출물, 화합물, 안티센스 뉴클레오타이드, 및 단백질을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
단계 (b): HTR2A 유전자의 발현량, 또는 HTR2A 단백질의 양 또는 활성을 측정
이어서, 시험물질을 접촉한 세포에서 HTR2A 유전자의 발현량, 또는 HTR2A 단백질의 양 또는 활성이 상기 시험물질을 접촉하지 않은 세포와 비교하여 하향조절되는 경우, 상기 시험물질을 지방간의 예방 또는 치료제의 후보물질로서 판정한다.
HTR2A 유전자의 발현량 변화의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, RT-PCR(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), 노던 블롯팅(Peter B. Kaufma et al., Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, 102-108, CRC press), cDNA 마이크로어레이를 이용한 혼성화 반응(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)) 또는 인 시투(in situ) 혼성화 반응 (Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001))을 이용하여 실시할 수 있다.
RT-PCR 프로토콜에 따라 실시하는 경우에는 우선, 시료를 처리한 세포에서 총 RNA를 분리한 다음, 올리고 dT 프라이머 및 역전사효소를 이용하여 제1쇄 cDNA를 제조한다. 이어, 제1쇄 cDNA를 주형으로 이용하고, HTR2A 유전자-특이적 프라이머 세트를 이용하여 PCR 반응을 실시한다. 그런 다음, PCR 증폭 산물을 전기영동하고, 형성된 밴드를 분석하여 HTR2A 유전자의 발현량 변화를 측정한다.
HTR2A 단백질의 양의 변화는 당업계에 공지된 다양한 면역분석 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, HTR2A 단백질의 양의 변화는 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA(enzymelinked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 그리고 샌드위치 분석을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 스크리닝 방법을 통해 판정된 지방간의 예방 또는 치료제 후보물질은 지방간을 예방 또는 치료하는데 이용될 수 있다.
본 발명은 HTR2A(5-hydroxytrptamine receptor 2A) 억제제를 유효성분으로 포함하는 지방간의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 HTR2A 억제제를 유효성분으로 포함하는 지방간의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 지방간의 예방 또는 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다
본 발명의 HTR2A 억제제는 고지방식이에 의해 유도되는 지방간 생성을 억제하고, 간세포 내 지방생성과 관련된 유전자들의 발현을 억제하므로 지방간의 예방 또는 치료용 조성물 등의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1는 마우스의 장조직에서 고지방식이에 의해 세로토닌 합성의 속도결정단계 효소인 tryptophan hydroxylase 1 (Tph1) 의 발현이 증가하는 것을 나타낸 도이다.
도 2은 마우스의 장조직에서 에탄올 섭취에 의해 세로토닌 합성의 속도결정단계 효소인 Tph1 의 발현이 증가하는 것을 나타낸 도이다.
도 3는 장조직 특이적으로 Tph1 이 제거된 마우스에서 고지방식이에 의한 지방간 변화가 개선됨을 나타낸 도이다.
도 4는 장조직 특이적으로 Tph1 이 제거된 마우스에서 고지방식이에 의한 간 조직 내 중성지방의 증가가 억제됨을 나타낸 도이다.
도 5은 장조직 특이적으로 Tph1 이 제거된 마우스에서 고지방식이에 의한 간의 지방대사와 관련된 유전자들의 발현 변화를 나타낸 도이다.
도 6은 장조직 특이적으로 Tph1 이 제거된 마우스에서 에탄올 식이에 의한 지방간 변화가 개선됨을 타나낸 도이다.
도 7은 장조직 특이적으로 Tph1 이 제거된 마우스에서 에탄올 식이에 의한 간 조직 내 중성지방이 감소됨을 나타낸 도이다.
도 8는 장조직 특이적으로 Tph1 이 제거된 마우스에서 에탄올 식이에 의한 간의 지방대사와 관련된 유전자들의 발현 변화를 나타낸 도이다.
도 9은 마우스의 간조직에서 세로토닌 수용체 및 세로토닌 대사 효소들의 발현을 나타낸 도이다.
도 10은 고지방식이를 섭취한 마우스 군에 ketanserin을 투여하였을 때, 체중 변화를 나타낸 도이다.
도 11은 마우스 군에 ketanserin을 투여하였을 때, 포도당 및 인슐린 감수성의 증가를 나타낸 도이다.
도 12은 고지방식이를 섭취한 마우스 군에 본 발명의 HTR2A 안타고니스트의 일종인 ketanserin을 투여하였을 때, 간 조직 내 지방 축적의 감소를 H&E 조직 염색결과로 나타낸 도이다.
도 13은 고지방식이를 섭취한 마우스 군에 본 발명의 HTR2A 안타고니스트의 일종인 ketanserin을 투여하였을 때, 간 조직 내 중성지방(hepatic triglyceride)의 감소를 나타낸 도이다.
도 14는 마우스의 간 세포에 ketanserin을 투여하였을 때, 지방 생성과 관련된 유전자들의 발현 감소를 나타낸 도이다.
도 15는 마우스의 간 세포에 HTR2A 작용제를 투여하였을 때, 지방 생성과 관련된 유전자들의 발현 증가를 나타낸 도이다.
도 16a는 Htr2a floxed 마우스를 제조하기 위한 벡터 디자인을 나타낸 도이고, 도 16b는 Htr2a floxed 마우스와 Alb-Cre 마우스를 교배하여 Htr2a LKO 마우스를 제작하는 방법을 나타낸 모식도이며, 도 16c는 제작된 Htr2a LKO 마우스의 넉아웃을 확인하기 위한 RT-PCR 결과이다.
도 17은 간 조직 특이적 Htr2a 유전자 넉아웃 마우스(Htr2a Liver Knock Out mouse, Htr2a LKO)와 야생형 마우스를 정상식이군(SCD, standard chow diet)과, 고지방식이군(HFD, high fat diet)으로 나누어 사육한 후의 육안(도 17a) 및 현미경적 소견(도 17b 및 도 17c)을 나타낸 도이다.
도 18은 간 조직 특이적 Htr2a 제거 마우스(Htr2a LKO)에서의 간 내 중성지방량 변화를 확인한 결과이다.
도 19a는 간 조직 특이적 Htr2a 제거 마우스(Htr2a LKO)의 체중 변화를 확인한 도이고, 도 19b는 체중에 대한 기관별 중량비의 변화를 확인한 도이다.
도 20은 간 조직 특이적 Htr2a 제거 마우스(Htr2a LKO)의 내당능 및 인슐린 저항성에 대한 변화를 확인한 도이다(도 20b).
도 21은 간 조직 특이적 Htr2a 제거 마우스(Htr2a LKO)의 혈장 내 지질 프로파일(총 콜레스테롤, 지방산, 중성지방, HDL 콜레스테롤 수준)을 비교하여 나타낸 도이다.
도 22는 간 조직 특이적 Htr2a 제거 마우스(Htr2a LKO)의 지방대사와 관련된 유전자의 발현량 변화를 비교하여 나타낸 도이다.
도 23은 고지방식이를 섭취한 마우스 군에 본 발명의 HTR2A 안타고니스트의 일종인 사포그렐레이트을 투여하였을 때, 체중 변화를 나타낸 도이다.
도 24는 고지방식이를 섭취한 마우스 군에 본 발명의 HTR2A 안타고니스트의 일종인 사포그렐레이트을 투여하였을 때, 간 조직 내 지방 축적의 감소를 H&E 조직 염색결과로 나타낸 도이다(도 24a: 10x; 도 24b: 20x).
도 25는 고지방식이를 섭취한 마우스 군에 본 발명의 HTR2A 안타고니스트의 일종인 사포그렐레이트을 투여하였을 때, 간 조직 내 중성지방(hepatic triglyceride)의 감소를 나타낸 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다
실시예
실시예 1: 실험동물
1-1. 실험 동물 사육
7주령 된 수컷 흰쥐(C57BL/6)를 ㈜중앙실험동물에서 분양받아 사용하였다. 8주령이 되었을 때 5마리씩 두 개의 식이군(NCD군: normal chow diet, HFD군: high-fat diet)으로 나누어 실험에 사용하였다. NCD군은 일반식이를, HFD군은 60% 고지방식이를 급여하였다. 사육장의 온도는 23℃로 유지하였으며, 식이와 식수는 12주간 자유롭게 먹도록 하였다.
에탄올 식이를 시행하기 위해서 10주령이 된 마우스들을 두 개의 식이군 (NCD군, 에탄올 식이군)으로 나누어 실험에 사용하였다. 일반 식이를 하면서, NCD 군에는 증류수를, 에탄올군은 선행문헌 (Zhou et al., 2003, Exp. Biol. Med. 227: 214-222; Kao et al., 2012, Hepatology. 56: 594-604) 의 방법대로 에탄올을 투여하였다.
케탄세린(ketanserin, Sigma) 투여를 시행하기 위해서 12주령이 된 마우스들을 두 개의 치료군 (대조군, ketanserin군) 으로 나누어 실험에 사용하였다. 일반식이 또는 고지방식이를 하면서 케탄세린군에는 PBS(phosphate-buffered saline)에 녹인 케탄세린을 마우스 체중 1 kg 당 1 mg을, 대조군에는 동량의 PBS를 매일 복강 주사하였다.
1-2. 조직 적출
마우스에 졸레틸(Zoletil®, Virbac)을 복강주사 하여 마취시킨 후, 복강을 절개하여 장, 간을 적출하였다.
실시예 2: 장 조직에서 세로토닌 합성 효소 Tph1(Tryptophan hydroxylase 1)의 발현 확인
실시예 1-1에 기재된 조건의 NCD군, HFD군, 및 에탄올 식이군에 대하여, 실시예 1-2에 기재된 방법으로 장 조직을 적출하였다. 적출한 장 조직으로부터 Trizol reagent(Invitrogen)를 이용하여 RNA를 분리하고 spectrophotometer를 이용하여 RNA를 정량하였다. 분리된 총 RNA 중 1 μg을 QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen)을 이용하여 cDNA를 합성하고, Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems)를 이용하여 realtime PCR을 수행하였다. 유전자의 발현량은 Actb(Actin, beta)를 내부 대조군으로 이용하여 표준화하였다. PCR에 사용된 프라이머는 Primer-blast (www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)를 이용하여 제작하였으며 하기 표 1에 기재된 서열을 사용하였다.
유전자 Forward primer Reverse primer
Actb GGTACCACCATGTACCCAGG GAAAGGGTGTAAAACGCAGC
Tph1 ACCATGATTGAAGACAACAAGGAG TCAACTGTTCTCGGCTGATG
그 결과, 고지방 식이(HFD군)와 에탄올 식이(EtOH) 모두에서 대조군에 비해 장 조직에서 세로토닌 합성 효소인 Tph1의 발현이 유의하게 증가됨을 확인하였다(도 1 및 도 2 참조). 따라서, 고지방 식이와 에탄올 식이는 장조직 내 세로토닌 합성 효소인 Tph1의 발현을 증가시키는 것을 알 수 있었다.
실시예 3: 장 조직 특이 Tph1 제거 마우스(Tph1 GKO)의 지방간 변화 확인
3-1. 장 조직 특이적으로 Tph1 유전자가 제거된 마우스의 제작
장 조직 특이적으로 Tph1 유전자가 제거된 마우스 (Tph1 gut-specific knockout, Tph1 GKO)는 선행문헌 (Sumara et al., 2012, Cell Metab. 16: 588-600) 의 방법대로 Tph1 floxed 마우스와 Villin-Cre 마우스를 교배하여 제작하였다.
3-2. 장 조직 특이 Tph1 제거 마우스(Tph1 GKO) 간 조직의 현미경적 소견
실시예 3-1에서 제조한 장조직 특이 Tph1 제거 마우스(Tph1 GKO)의 간 조직을 현미경으로 관찰하기 위하여, 실시예 1-2에 기재된 방법으로 간을 적출하여 10% 중성 포르말린 용액에 고정시킨 다음, 파라핀으로 포매하고, 5 μm 두께로 절단하여 슬라이드에 접착시켰다. 이후 탈파라핀 및 함수과정을 거쳐 헤마톡실린 및 에오신 (Hematoxylin & Eosin)으로 염색하였다.
그 결과 장 조직 특이적으로 Tph1 이 제거된 마우스 (Tph1 GKO)에서 고지방식이에 의한 지방간 변화가 개선됨을 확인하였다(도 3 참조). Tph1 GKO 마우스에 에탄올 식이를 시행한 결과에서도 역시 지방간이 개선됨을 확인하였다(도 6 참조). 따라서, 세로토닌의 감소가 지방간의 개선과 관련성이 있음을 알 수 있었다.
3-3. 장 조직 특이 Tph1 제거 마우스(Tph1 GKO) 간 조직 내 중성지방의 정량
실시예 3-1에서 제조한 장조직 특이 Tph1 제거 마우스(Tph1 GKO)의 간 조직 내 중성지방을 정량하기 위하여, 실시예 1-2에 기재된 방법으로 간을 적출한 다음, 5% NP-40 용액에서 분쇄한 후 가열하여 지질 성분을 모두 녹여내었다. Triglyceride Reagent (Sigma)를 이용하여 중성지방을 Glycerol로 분해시킨 후 Glycerol Reagent (Sigma)를 이용하여 Glycerol의 양을 발색반응으로 정량하였다. 중성지방량을 조직의 단백질량으로 보정하기 위하여 BCA Protein Assay Kit (Pierce)로 단백질량을 측정하였다.
그 결과 Tph1 GKO 마우스에서 고지방식이나 에탄올 식이 양쪽 모두에서 중성지방량이 감소됨을 확인하였다 (도 4 및 도 7 참조). 따라서, 세로토닌의 감소가 간 내 중성지방의 감소와도 관련이 있음을 알 수 있었다.
실시예 4: 장 조직 특이 Tph1 제거 마우스(Tph1 GKO) 간 조직에서 지방 대사 관련 유전자 발현 변화 확인
장조직 특이 Tph1 제거 마우스(Tph1 GKO)와 일반 마우스(WT)의 간 조직 내 지방 대사 관련 유전자의 발현 정도를 비교하기 위하여, 실시예 1-2에 기재된 방법으로 적출한 간 조직으로부터, 실시예 2에 기재된 방법으로 RNA를 추출하고 cDNA를 합성하여 realtime PCR을 시행하였다. PCR 에 사용된 primer는 하기 표 2에 기재된 서열을 사용하였다.
유전자 Forward primer Reverse primer
Actb GGTACCACCATGTACCCAGG GAAAGGGTGTAAAACGCAGC
Acaca CAGTAACCTGGTGAAGCTGGA GCCAGACATGCTGGATCTCAT
Fasn AAGCGGTCTGGAAAGCTGAA AGGCTGGGTTGATACCTCCA
Acly CCCTCTTCAGCCGACATACC CTGCTTGTGATCCCCAGTGA
Me1 GACCCGCATCTCAACAAGGA CAGGAGATACCTGTCGAAGTCA
Scd1 AGAGTCAGGAGGGCAGGTTT GAACTGGAGATCTCTTGGAGCA
Gpam CCACAGAGCTGGGAAAGGTT GTGCCTTGTGTGCGTTTCAT
Agpat GCGCAATGTCGAGAACATGA TCATTCCAAGCAGGTCGAGG
Lpin1 CATACAAAGGCAGCCACACG CGGGGTTCAGTCCCTTGTAG
Mogat1 TTGACCCATGGTGCCAGTTT GTGGCAAGGCTACTCCCATT
Dgat1 GGATCTGAGGTGCCATCGTC ATCAGCATCACCACACACCA
Dgat2 CATCATCGTGGTGGGAGGTG TGGGAACCAGATCAGCTCCAT
Cd36 TGGCCAAGCTATTGCGACAT ACACAGCGTAGATAGACCTGC
Cpt1a AGCTCGCACATTACAAGGACA CCAGCACAAAGTTGCAGGAC
Mtp TGCTTCCGTTAAAGGTCACACA CTTGCGGTTTTCCTTTGCCC
Apob TACTTCCACCCACAGTCCCCT CCTTAGAAGCCTTGGGCACAT
Pparg GGTGTGATCTTAACTGCCGGA GCCCAAACCTGATGGCATTG
Ppargc1a GCCCAGGTACGACAGCTATG ACGGCGCTCTTCAATTGCTT
Nr1h3 GCAGGACCAGCTCCAAGTAG CCCTTCTCAGTCTGCTCCAC
Mlxipl AAGTTGCTATGCCGGGACAA ATGACAGCCTCAGGTTTCCG
Srebp1c GGAGCCATGGATTGCACATT GGCCCGGGAAGTCACTGT
Esrrg GTCTTGACAGAGTGCGTGGA TTCAGCCACCAACAAATGCG
Tph1 GKO 마우스에 고지방식이를 적용시킨 결과, 지방신생성 (de novo lipogenesis)을 담당하는 Fasn, Acly, Me1, Scd1 및 중성지방합성을 담당하는 Gpam, Lpin1, Mogat1의 발현이 감소됨을 확인하였다(도 5 참조). 또한, 이러한 변화는 지방생성의 주된 유전자 발현 전사 인자인 Srebp1c의 감소에 의한 것임을 확인하였다(도 5 참조).
또한, Tph1 GKO 마우스에 에탄올 식이를 적용시킨 결과, 지방간 개선은 간에서 지방산 산화를 담당하는 Cpt1a 의 발현 증가, 지방산을 세포내로 들여오는 Cd36 의 발현 감소, 세포내 중성지방을 합성하는 Lpin1 발현의 감소에 의한 것으로 확인하였다(도 8 참조).
실시예 5: 장 조직 특이 Tph1 제거 마우스(Tph1 GKO) 간 조직 내 세로토닌 수용체의 합성 및 대사 효소 발현 변화 확인
장 조직 특이 Tph1 제거 마우스(Tph1 GKO)와 일반 마우스(WT)의 간 조직 내 세로토닌 수용체, 세로토닌의 합성 및 대사효소와 관련된 유전자의 발현 정도를 비교하기 위하여, 상기 실시예 1-2에 기재된 방법으로 적출한 간 조직으로부터, 실시예 2에 기재된 방법으로 RNA를 추출하고 cDNA를 합성하여 end-point PCR을 시행하였다. PCR 에 사용된 primer는 하기 표 3에 기재된 서열을 사용하였다.
유전자 Forward primer Reverse primer
Actb GGTACCACCATGTACCCAGG GAAAGGGTGTAAAACGCAGC
Htr1a TCAGCTACCAAGTGATCACCTCT GTCCACTTGTTGAGCACCTG
Htr1b TGCTCCTCATCGCCCTCTATG CTAGCGGCCATGAGTTTCTTCTT
Htr1d CCTCCAACAGATCCCTGAATG CAGAGCAATGACACAGAGATGCA
Htr1f TGTGAGAGAGAGCTGGATTATGG TAGTTCCTTGGTGCCTCCAGAA
HTR2A AGCTGCAGAATGCCACCAACTAT GGGATTGGCATGGATATACCTAC
Htr2b AAATAAGCCACCTCAACGCCT TCCCGAAATGTCTTATTGAAGAG
Htr2c TTCTTAATGTCCCTAGCCATTGC GCAATCTTCATGATGGCCTTAGT
Htr3a AAATCAGGGCGAGTGGGAGCTG GACACGATGATGAGGAAGACTG
Htr3b CGTGTGGTACCGAGAGGTTT GGATGGGCTTGTGGTTTCTA
Htr4 ATGGACAAACTTGATGCTAATGTGA TCACCAGCACCGAAACCAGCA
Htr5a GATTGACTTCAGTGGGCTCG AAAGTCAGGACTAGCACTCG
Htr5b GGAGCCTTCTACCTGCCTCT ATGAGCTCCGTCAGGAAGAA
Htr6 CCTCACATGGCTGGGATACT ATCTGAGTTGGGTGGCAGAG
Htr7 CTCGGTGTGCTTTGTCAAGA TTGGCCATACATTTCCCATT
Tph1 ACCATGATTGAAGACAACAAGGAG TCAACTGTTCTCGGCTGATG
Tph2 GCCATGCAGCCCGCAATGATGATG CAACTGCTGTCTTGCTGCTC
Slc6a4 CGCAGTTCCCAGTACAAGC CGTGAAGGAGGAGATGAGG
Maoa GCGGTACAAGGGTCTGTTCC CAGCCAATCCTGAGATGCCG
Maob GGGCGGCATCTCAGGTATGG AAGTCCTGCCTCCTACACGG
그 결과, 세로토닌 수용체들 중 Htr1a, Htr1d, HTR2A, Htr2b, Htr3a, Htr4, Htr7 및 세로토닌 재흡수를 담당하는 Slc6a4, 세로토닌 분해를 담당하는 Maoa, Maob 의 발현이 확인되었다(도 9 참조).
그 중, 세로토닌 수용체 HTR2A를 대상으로 하여 해당 수용체 특이적 길항제인 케탄세린을 투여하면서 고지방식이에 의한 지방간 변화를 조사하였다. 그 결과, 고지방식이와 함께 케탄세린을 투여하면 체중 증가가 감소되는 것을 확인할 수 있었다(도 10 참조).
실시예 6: 본 발명의 케탄세린 투여에 의한 마우스의 내당능 및 인슐린 저항성의 개선 효과
본 발명의 케탄세린 투여에 의한 마우스의 내당능 및 인슐린 저항성 개선 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1-1에 기재된 방법에 따라 i) 일반식이군, ii) 일반식이 및 케탄세린 투여군, iii) 고지방 식이군, iv) 고지방 식이 및 케탄세린 투여군으로 나누어 사육한 다음, 마우스의 미정맥으로부터 혈액을 채취하여 혈당을 측정하였다.
내당능은 절식 후 포도당 용액을 체중 kg 당 2g씩 복강 내로 투여하고 0, 15, 30, 45, 60, 90, 120분 경과 후에 혈당을 측정하였다.
인슐린 저항성은 절식 후 인슐린 용액을 체중 kg 당 0.75 U 씩 복강 내로 투여하고 0, 15, 30, 45, 60, 90, 120분 경과 후에 혈당을 측정하였다.
그 결과, iv) 케탄세린을 투여하는 경우 고지방 식이를 섭취한 마우스 군에서 내당능 장애와 인슐린 저항성이 개선되는 것을 확인하였다(도 11 참조).
실시예 7: 본 발명의 케탄세린 투여에 의한 지방간의 개선 효과
본 발명의 케탄세린 투여에 의한 마우스의 지방간 개선 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1-1에 기재된 방법으로 i) 일반식이군, ii) 일반식이 및 케탄세린 투여군, iii) 고지방 식이군, iv) 고지방 식이 및 케탄세린 투여군으로 나누어 사육한 다음, 상기 실시예 3-2 및 3-3에 기재된 방법으로 간 조직을 H&E 염색하여 현미경으로 관찰하고, 중성지방량을 정량하였다. 케탄세린은 위내투여 하였다.
그 결과, iv) 고지방 식이에 의한 간 내 지방의 축적이 케탄세린을 투여한 군에서 감소되어 지방간이 개선됨을 확인하였고(도 12 참조), 간 조직 내 중성지방의 양 또한 유의하게 감소됨을 확인하였다(도 13 참조).
실시예 8: 본 발명의 케탄세린에 의한 간세포의 지방대사 효소 변화 조사
본 발명의 케탄세린에 의한 결과들이 직접적으로 간 세포에 작용해서 나타난 것인지를 확인하기 위하여 마우스의 간세포를 초대 배양하여 HTR2A 길항제인 케탄세린과 HTR2A 작용제인 DOI(1-(2,5-dimethoxy-4-iodophenyl)-2-aminopropane)를 각각 투여하고 지방 생성에 관련된 유전자들의 발현 정도를 측정하였다.
구체적으로 마우스의 간세포를 초대 배양하기 위하여 선행문헌 (Klaunig et al., 1981, In Vitro. 17: 913-925; Li et al., 2010, Methods Mol Biol. 633: 185-196)에서 설명한 2단계 관류 방법을 통해 마우스의 간세포를 분리하였다. 상기 간세포는 1% 항생제-항사상균제(antibiotic-antimycotic) 용액(Invitrogen, Carlsbad, CA) 및 10% 우아혈청(bovine calf serum)(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 포함하는 고농도 포도당(high glucose) DMEM 생장 배지, 5% 이산화탄소의 습한 대기 및 37℃ 온도 조건에서 배양하였다.
HTR2A 길항제인 케탄세린 또는 HTR2A 작용제인 DOI는 각각 1 μM 의 농도가 되도록 처리하여, 24시간 후 상기 <실시예 2>와 같은 방법으로 RNA를 추출하여 cDNA를 합성 후 realtime PCR을 시행하였다. PCR 에 사용된 primer 는 상기 표 2와 같았다.
결과는 도 14 및 도 15에 나타내었다.
도 14에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 HTR2A 길항제인 케탄세린 처리시, 지방 생성에 관련된 유전자들의 발현 감소가 나타났다. 반면, 도 15에 나타낸 바와 같이, 케탄세린의 목적 수용체인 HTR2A의 작용제인 DOI를 투여한 결과, 지방 생성에 관련된 유전자들의 발현 증가가 나타났다.
실시예 9: 본 발명의 간조직 특이 Htr2a 제거 마우스(Htr2a LKO)의 지방간 변화 확인
9-1. 간 조직 특이적으로 Htr2a 유전자가 제거된 마우스의 제작
간 조직 특이적으로 Htr2a 유전자가 제거된 마우스 (Htr2a liver-specific knockout, Htr2a LKO)는 Htr2a floxed 마우스와 Alb-Cre 마우스를 교배하여 제작하였다(도 16a 및 도 16b 참조). 제작한 Htr2a LKO mouse의 간 조직을 채취하여 Htr2a 유전자에 대한 RT-PCR을 시행하여 넉아웃이 잘 이루어졌음을 확인하였다(도 16c 참조).
9-2. 실험동물의 사육
간 조직 특이적으로 Htr2a 유전자가 제거된 마우스 (Htr2a liver-specific knockout, Htr2a LKO)에서의 고지방 식이에 따른 표현형을 관찰하기 위하여, 각각 야생형(WT, wild type)과 Htr2a LKO 마우스에 대해서 정상식이군(SCD, standar chow diet)과 고지방식이군(HFD, high fat diet)으로 나누었다. i) 정상식이군은 4-20주간 정상식이를 먹였고, ii) 고지방식이군은 4주-12주간은 정상식이를 먹이고, 13주-20주간은 고지방식이를 먹였다.
9-3. 간 조직 특이 Htr2a 제거 마우스(Htr2a LKO) 간 조직의 육안 및 현미경적 소견
실시예 9-1에서 제조한 간 조직 특이 Htr2a 제거 마우스(Htr2a LKO)와 야생형 마우스(WT)를 실시예 9-2에 기재된 방법으로 사육한 뒤, 실시예 1-2에 기재된 방법으로 간을 적출하였다. 고지방식이를 먹인 Htr2a LKO 마우스와 고지방식이를 먹인 야생형 대조군 마우스(WT)의 간조직을 육안상 비교한 결과, Htr2a LKO 마우스의 간이 더 작은 것을 확인할 수 있었다(도 17a). 또한 조직학적 차이를 확인하기 위해 적출한 간을 10% 중성 포르말린 용액에 고정시킨 다음, 파라핀으로 포매하고, 5 μm 두께로 절단하여 슬라이드에 접착시켰다. 이후 탈파라핀 및 함수과정을 거쳐 헤마톡실린 및 에오신 (Hematoxylin & Eosin)으로 염색하였다. 그 결과 간 조직 특이적으로 Htr2a 이 제거된 마우스 (Htr2a LKO)에서 고지방식이에 의한 지방 내 간축적이 감소됨을 확인하였다(도 17b 및 도 17c 참조). 따라서, 본 발명의 Htr2a 수용체의 발현억제가 지방간의 개선 효과가 있음을 알 수 있었다.
9-4. 간 조직 특이 Htr2a 제거 마우스(Htr2a LKO) 간 조직 내 중성지방의 정량
실시예 9-1에서 제조한 간 조직 특이 Htr2a 제거 마우스(Htr2a LKO)의 간 조직 내 중성지방을 정량하기 위하여, 실시예 1-2에 기재된 방법으로 간을 적출한 다음, 5% NP-40 용액에서 분쇄한 후 가열하여 지질 성분을 모두 녹여내었다. Triglyceride Reagent (Sigma)를 이용하여 중성지방을 Glycerol로 분해시킨 후 Glycerol Reagent (Sigma)를 이용하여 Glycerol의 양을 발색반응으로 정량하였다. 중성지방량을 조직의 단백질량으로 보정하기 위하여 BCA Protein Assay Kit (Pierce)로 단백질량을 측정하였다.
그 결과 간 조직 특이 Htr2a 제거 마우스(Htr2a LKO)에서 일반 식이 및 고지방식이에서 간 내 중성지방량이 감소됨을 확인하였다 (도 18 참조). 따라서, 본 발명의 Htr2a 수용체의 발현 억제가 간 내 중성지방의 감소와도 관련이 있음을 알 수 있었다.
9-5. 간 조직 특이 Htr2a 제거 마우스(Htr2a LKO)의 체중 및 기관별 중량 확인
간 조직 특이적으로 Htr2a 유전자가 제거된 마우스 (Htr2a liver-specific knockout, Htr2a LKO)와 야생형(WT, wild type) 마우스의 대사 프로파일을 확인하기 위하여, 각각의 마우스들을 정상식이군과 고지방식이군으로 나누어서 사료를 급이하고, 4주-20주간 체중을 측정하였다. 또한, 체중에 대한 간을 제외한 다른 조직(eWAT, epididymal white adipose tissue; iWAT, inguinal white adipose tissue; BAT, brown adipose tissue; Quadriceps; kidney)의 중량을 측정하였다. 그 결과, 정상식이군과 고지방식이군 모두에서 야생형 마우스(WT)와 Htr2a LKO 마우스 간의 체중 차이는 나타나지 않았으며, 체중에 대한 기관별 중량비도 차이가 없었다(도 19 참조).
9-6. 간 조직 특이 Htr2a 제거 마우스(Htr2a LKO)의 내당능 및 인슐린 저항성의 변화 확인
본 발명의 간 조직 특이적으로 Htr2a 유전자가 제거된 마우스 (Htr2a liver-specific knockout, Htr2a LKO)에서의 내당능 및 인슐린 저항성 개선 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 9-2에 기재된 방법에 따라 i) 일반 식이 야생형 마우스군, ii) 고지방 식이 야생형 마우스군, iii) 일반 식이 Htr2a LKO군, iv) 고지방 식이 Htr2a LKO군으로 나누어 사육한 다음, 마우스의 미정맥으로부터 혈액을 채취하여 혈당을 측정하였다. 내당능은 절식 후 포도당 용액을 체중 kg 당 2g씩 복강 내로 투여하고 0, 15, 30, 60, 90, 120분 경과 후에 혈당을 측정하였다(18주령). 인슐린 저항성은 절식 후 인슐린 용액을 체중 kg 당 0.75 U 또는 1 U 씩 복강 내로 투여하고 0, 15, 30, 60, 90, 120분 경과 후에 혈당을 측정하였다(19주령). 그 결과, 정상식이군과 고지방식이군 모두에서 야생형 마우스와 Htr2a LKO 마우스 간의 내당능(도 20a) 및 인슐린 저항성에서는 차이가 없음을 확인하였다(도 20b).
9-7. 간 조직 특이 Htr2a 제거 마우스(Htr2a LKO)의 혈장내 지질 프로파일의 변화 확인
본 발명의 간 조직 특이적으로 Htr2a 유전자가 제거된 마우스 (Htr2a liver-specific knockout, Htr2a LKO)에서의 혈장 내 지질 수준에 미치는 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 9-2에 기재된 방법에 따라 i) 일반 식이 야생형 마우스군, ii) 고지방 식이 야생형 마우스군, iii) 일반 식이 Htr2a LKO군, iv) 고지방 식이 Htr2a LKO군으로 나누어 사육한 다음, 마우스의 미정맥으로부터 혈액을 채취하여 혈당을 측정하였다. 그 결과, 정상식이군과 고지방식이군 모두에서 야생형 마우스와 Htr2a LKO 마우스 간의 총 콜레스테롤, 지방산, 중성지방, HDL 콜레스테롤 수준의 차이가 없음을 확인하였다(도 21).
실시예 10: 간 조직 특이 Htr2a 제거 마우스(Htr2a LKO)의 간 조직에서 지방 대사 관련 유전자 발현 변화 확인
간조직 특이 Htr2a 제거 마우스(Htr2a LKO)와 일반 마우스(WT)의 간 조직 내 지방 대사 관련 유전자의 발현 정도를 비교하기 위하여, 실시예 1-2에 기재된 방법으로 적출한 간 조직으로부터, 실시예 2에 기재된 방법으로 RNA를 추출하고 cDNA를 합성하여 realtime PCR을 시행하였다. PCR 에 사용된 primer는 상기 실시예 4의 표 2에 기재된 서열을 사용하였다. Htr2a LKO 마우스에 고지방식이를 적용시킨 결과, 지방신생성(de novo lipogenesis) 및 중성지방합성(TG syntheis)과 관련된 유전자(Srebp1c, Fasn, Gpam, Agpat1, Mogat1) 및 지방산 흡수(Fatty acid uptake)와 관련된 유전자(Cd36)의 발현이 감소됨을 확인하였다(도 22a 내지 도 22c 참조).
실시예 11: 본 발명의 사포그렐레이트 투여에 의한 지방간의 개선 효과
본 발명의 사포그렐레이트 투여에 의한 마우스의 지방간 개선 효과를 확인하기 위하여, C57BL6/J 마우스에 12주령부터 20주령까지 i) 일반식이+비히클(vehicle, phosphate buffered saline) ii) 일반식이+사포그렐레이트(sarpogrelate hydrochloride) 투여군, iii) 고지방 식이+비히클, iv) 고지방 식이+사포그렐레이트 투여군으로 나누어 사육한 다음, 체중을 계량하고, 상기 실시예 3-2 및 3-3에 기재된 방법으로 간 조직을 H&E 염색하여 현미경으로 관찰하였으며, 중성지방량을 정량하였다. 상기 사포그렐레이트는 30 mg/kg/day 로 위내 투여(intragastric injection) 하였다.
그 결과, 일반식이를 먹인 군에서는 i) 비히클 투여 군과 ii) 사포그렐레이트 투여 군 사이에 유의한 체중차이는 관찰되지 않았으나, 고지방 식이를 먹인 군에서는 iii) 비히클 투여 군에서 체중이 증가하였고, iv) 사포그렐레이트 투여 군에서는 체중증가가 유의하게 감소되는 것을 확인하였다(도 23 참조).
또한, 간 조직을 적출하여 H&E 염색한 결과에서도 일반식이를 먹인 군에서는 간 내 지방의 축적 정도에서 차이가 없었으나, 고지방 식이를 먹인 군에서는 iv) 사포그렐레이트를 투여한 군에서 간 내 지방 축적이 감소되어 지방간이 개선됨을 확인하였다(도 24a 및 도 24b 참조).
간 조직 내 중성지방(hepatic triglyceride)의 양도 체중 및 간 조직 결과와 마찬가지로 사포그렐레이트 투여군에서 유의하게 감소되는 것을 확인하였다(도 25 참조).
<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Pharmaceutical Composition For Preventing Or Treating Fatty Liver Comprising HTR2A Antigonist <130> PN160472P <150> KR 10-2017-0037833 <151> 2017-03-24 <160> 82 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Actb <400> 1 ggtaccacca tgtacccagg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Actb <400> 2 gaaagggtgt aaaacgcagc 20 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Tph1 <400> 3 accatgattg aagacaacaa ggag 24 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Tph1 <400> 4 tcaactgttc tcggctgatg 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Acaca <400> 5 cagtaacctg gtgaagctgg a 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Acaca <400> 6 gccagacatg ctggatctca t 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Fasn <400> 7 aagcggtctg gaaagctgaa 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Fasn <400> 8 aggctgggtt gatacctcca 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Acly <400> 9 ccctcttcag ccgacatacc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Acly <400> 10 ctgcttgtga tccccagtga 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Me1 <400> 11 gacccgcatc tcaacaagga 20 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Me1 <400> 12 caggagatac ctgtcgaagt ca 22 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Scd1 <400> 13 agagtcagga gggcaggttt 20 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Scd1 <400> 14 gaactggaga tctcttggag ca 22 <210> 15 <211> 20 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22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Mtp <400> 31 tgcttccgtt aaaggtcaca ca 22 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Mtp <400> 32 cttgcggttt tcctttgccc 20 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Apob <400> 33 tacttccacc cacagtcccc t 21 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Apob <400> 34 ccttagaagc cttgggcaca t 21 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Pparg <400> 35 ggtgtgatct taactgccgg a 21 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Pparg <400> 36 gcccaaacct gatggcattg 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Ppargc1a <400> 37 gcccaggtac gacagctatg 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Ppargc1a <400> 38 acggcgctct tcaattgctt 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Nr1h3 <400> 39 gcaggaccag ctccaagtag 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Nr1h3 <400> 40 cccttctcag tctgctccac 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Mlxipl <400> 41 aagttgctat gccgggacaa 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Mlxipl <400> 42 atgacagcct caggtttccg 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Srebp1c <400> 43 ggagccatgg attgcacatt 20 <210> 44 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Srebp1c <400> 44 ggcccgggaa gtcactgt 18 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Esrrg <400> 45 gtcttgacag agtgcgtgga 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Esrrg <400> 46 ttcagccacc aacaaatgcg 20 <210> 47 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Htr1a <400> 47 tcagctacca agtgatcacc tct 23 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Htr1a <400> 48 gtccacttgt tgagcacctg 20 <210> 49 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Htr1b <400> 49 tgctcctcat cgccctctat g 21 <210> 50 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Htr1b <400> 50 ctagcggcca tgagtttctt ctt 23 <210> 51 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Htr1d <400> 51 cctccaacag atccctgaat g 21 <210> 52 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Htr1d <400> 52 cagagcaatg acacagagat gca 23 <210> 53 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Htr1f <400> 53 tgtgagagag agctggatta tgg 23 <210> 54 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Htr1f <400> 54 tagttccttg gtgcctccag aa 22 <210> 55 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Htr2a <400> 55 agctgcagaa tgccaccaac tat 23 <210> 56 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Htr2a <400> 56 gggattggca tggatatacc tac 23 <210> 57 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Htr2b <400> 57 aaataagcca cctcaacgcc t 21 <210> 58 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Htr2b <400> 58 tcccgaaatg tcttattgaa gag 23 <210> 59 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Htr2c <400> 59 ttcttaatgt ccctagccat tgc 23 <210> 60 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Htr2c <400> 60 gcaatcttca tgatggcctt agt 23 <210> 61 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Htr3a <400> 61 aaatcagggc gagtgggagc tg 22 <210> 62 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Htr3a <400> 62 gacacgatga tgaggaagac tg 22 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Htr3b <400> 63 cgtgtggtac cgagaggttt 20 <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Htr3b <400> 64 ggatgggctt gtggtttcta 20 <210> 65 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Htr4 <400> 65 atggacaaac ttgatgctaa tgtga 25 <210> 66 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Htr4 <400> 66 tcaccagcac cgaaaccagc a 21 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Htr5a <400> 67 gattgacttc agtgggctcg 20 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Htr5a <400> 68 aaagtcagga ctagcactcg 20 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Htr5b <400> 69 ggagccttct acctgcctct 20 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Htr5b <400> 70 atgagctccg tcaggaagaa 20 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Htr6 <400> 71 cctcacatgg ctgggatact 20 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Htr6 <400> 72 atctgagttg ggtggcagag 20 <210> 73 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Htr7 <400> 73 ctcggtgtgc tttgtcaaga 20 <210> 74 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Htr7 <400> 74 ttggccatac atttcccatt 20 <210> 75 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Tph2 <400> 75 gccatgcagc ccgcaatgat gatg 24 <210> 76 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Tph2 <400> 76 caactgctgt cttgctgctc 20 <210> 77 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Slc6a4 <400> 77 cgcagttccc agtacaagc 19 <210> 78 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Slc6a4 <400> 78 cgtgaaggag gagatgagg 19 <210> 79 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Maoa <400> 79 gcggtacaag ggtctgttcc 20 <210> 80 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Maoa <400> 80 cagccaatcc tgagatgccg 20 <210> 81 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Maob <400> 81 gggcggcatc tcaggtatgg 20 <210> 82 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Maob <400> 82 aagtcctgcc tcctacacgg 20

Claims (2)

  1. 케탄세린(Ketanserin), 또는 사포그렐레이트(Sarpogrelate) 중 선택된 5-HTR2A(5-hydroxytrptamine receptor 2A) 억제제를 유효성분으로 포함하는 식이에 의한 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  2. 케탄세린(Ketanserin), 또는 사포그렐레이트(Sarpogrelate) 중 선택된 5-HTR2A(5-hydroxytrptamine receptor 2A) 억제제를 유효성분으로 포함하는 식이에 의한 비알코올성 지방간의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
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