KR101232872B1 - 스핑고신-1-포스페이트（ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ－１－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ） 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 스핑고신-1-포스페이트(sphingosine-1-phosphate) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 상기 조성물은 스핑고신-1-포스페이트 2 수용체를 통해 지방세포 분화 관련 조절인자들의 발현을 억제함으로써 지방세포의 분화를 현저히 저해하여 지질의 축적을 억제하는 효능을 가지므로, 비만 예방 또는 치료에 효과적인 의약품으로 유용하게 이용할 수 있다.

Description

스핑고신-1-포스페이트（ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ－１－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ） 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for preventing and treating obesity comprising sphingosine-1-phosphate}

본 발명은 스핑고신-1-포스페이트(sphingosine-1-phosphate) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

최근 경제성장과 생활방식의 변화에 따라 식습관에도 많은 변화가 있다. 특히, 바쁜 현대인들은 패스트푸드 등의 고열량 식이와 적은 운동량으로 인하여 체중 과다 및 비만이 증가하고 있다. 또한 현대인은 과로, 과음, 스트레스 등으로 인하여 체력이 저하되면서 비만은 점점 더 증가하고 있는 추세이다. 또한, 체중 과다 및 비만은 성인뿐만 아니라 어린이나 청소년들에서도 동맥경화, 고혈압, 고지혈증 또는 심장질환 등의 각종 성인병의 발병률을 증가시키는 한 요인이 되고 있다. 이와 같이 비만은 모든 연령층에 걸쳐 영향을 주고 있다.

세계보건기구(WHO)에 따르면, 현재 전 세계적으로 과체중 혹은 비만에 해당되는 사람들의 숫자는 12억 명에 이르며 미국의 경우 2000년 현재 성인인구의 약 65%가 과체중에 해당된다고 한다. 또한 미국의 경우 매년 약 30만 명이 비만과 관련된 질환으로 사망한다고 보고되고 있다.

비만이 여러 가지 질병에 미치는 영향은 매우 심각하여 전 세계 당뇨병 환자의 80%, 심장질환의 21%가 비만이 원인인 것으로 알려져 있다. 이외에도 자궁암, 신장암, 유방암 등 각종 암도 비만과 직간접적으로 연관되어 있으며 비만이나 과체중의 경우 수면무호흡증, 골관절염, 담석증 등의 발병률도 정상인보다 높다고 한다(Stein CJ, Colditz GA. The epidemic of obesity. J Clin Endocrinol Metab 2004; 89: 2522-2525. ; Kopelman PG. Obesity as a medical problem. Nature 2000 Apr 6; 404(6778): 635-43.). 이처럼 비만이 건강에 미치는 영향은 매우 심각하다고 할 수 있다.

사회 경제적인 측면에서도 비만으로 인한 손실은 매우 크다. 우리나라의 경우 2001년 ‘국민건강 영향조사’에 따르면 비만으로 인한 사회, 경제적 비용이 1조 17억원에 달한다고 한다. 이러한 액수는 비만 관련 질병으로 인한 총진료비와 조기사망, 입원 등으로 인한 생산성 손실을 합산한 것으로 국민의료비의 약 5%에 해당하는 높은 수치이다(보건복지부. 2001년도 국민건강영양조사. 한국보건사회연구원.). 또한, 2000년을 기준으로 전 세계적인 비만 치료제 시장은 약 13억 달러 규모였고, 2013년 경에는 약 80억 달러에 달할 것으로 전망되고 있다.

비만은 한 가지 원인으로 발생하는 질병이 아니라 유전적, 환경-사회적, 정신적인 여러 가지 요인들이 복합적으로 작용하여 발생하기 때문에 어느 한 가지 방법으로 치료하기는 어렵다. 즉, 비만은 에너지 소모량에 비해 에너지 섭취량이 많을 경우에 발생하기 때문에 비만치료는 결국 섭취하는 에너지보다 소비하는 에너지를 많게 하여 에너지 불균형을 교정하는 것이다. 현재 비만을 치료하기 위한 방법은 식사요법, 운동요법, 행동요법 등 생활 습관을 교정하는 방법과 약물치료 및 수술적 치료로 나눌 수 있다.

이중, 약물이나 수술적 치료에 앞서 생활습관을 교정하기 위한 적극적인 노력이 선행되어야 하지만 생활습관을 교정하는 일이 쉽지 않을 뿐 아니라 생활습관 교정만으로 감소시킬 수 있는 체중은 한계가 있다. 따라서 많은 경우에 생활습관 교정과 함께 약물치료가 필요하다.

이러한 비만의 약물 치료를 위해 매년 많은 항비만 제제들이 개발되고 있지만 현재 사용 가능한 비만 치료 약물은 많지 않으며, 대부분 소화나 식욕을 억제시키는 제제에 국한되어 있다. 소화나 식욕조절하는 제제의 경우, 습관성 때문에 향정신성 약물로 분류되며, 소화억제제 역시 설사 변비등의 부작용을 나타낸다. 현재 미국 FDA가 장기사용을 승인한 대표적 비만치료 약물은 노르에피네프린(norepinephrine)과 세로토닌(serotonin)의 재흡수를 억제하는 작용을 가진 시부트라민(sibutramine; Reductil?)과 췌장 및 소화기계에서 분비되는 리파제(lipase)를 억제하여 효과를 나타내는 오르리스타트(orlistat; Xenical)이 있다(Yanovski SZ, Yanovski JA. Obesity. N Engl J Med 2002; 346: 591-602.).

그러나 시부트라민(Sibutramine) 또한 혈압상승, 불면증, 구강건조, 어지러움 등의 부작용이 비교적 흔하고 심혈관질환, 조절되지 않는 고혈압을 가진 환자에게는 사용할 수 없는 단점이 있으며(박혜순. Sibutramine. 대한비만학회지 1998; 7(4): 270-3.), 오르리스타트(Orlistat)의 경우에는 설사, 지방변, 분실금 등의 부작용이 흔하고 한국인과 같이 지방섭취가 서양인에 비해 적은 경우에는 약물의 효과가 뚜렷하지 않다는 점으로 인해 사용이 제한되고 있다(김상만. Orlistat에 대한 연구. 대한비만학회지 1998; 7(4): 287-92.). 또한 두 가지 약물 모두 아직까지는 장기간 사용시의 안전성에 대한 연구가 더 필요한 상황이다.

따라서, 아직까지 비만 억제 효과가 좋고 장기 복용의 안전성이 확인된 비만 치료 약물이 아직은 존재하지 않기 때문에 이를 대체할 만한 비만 예방 및 치료제가 요구되는 실정이다. 또한, 비만 예방 및 치료를 위해서는 좀 더 명확한 비만 원인의 메커니즘 연구 역시 필요하다.

한편, 스핑고신-1-포스페이트(sphingosine-1-phosphate, 이하 S1P라고도 함)는 혈관신생촉진제, 선유화(fibrosis) 억제제, 탈수초성질환, 진행성 치매 또는 퇴행성 뇌 질환의 치료제, 면역억제효과, 암세포에서 아폽토시스를 유발시키는 효과, 스핑고신키나제의 세포 증식 촉진 활성을 억제함으로써 과증식성 질환(예컨대 암 또는 건선 등)을 치료하는 등의 효과를 가지는 것이 여러 연구를 통해 알려져 있지만, 지금까지 이의 비만 치료 용도 및 이에 대한 메카니즘에 대해서는 전혀 개시된 바 없다.

이에, 본 발명자는 비만 억제 효과가 높은 새로운 작용기전을 가진 약물을 개발하기 위해 연구를 수행한 결과, 상기 스핑고신-1-포스페이트가 스핑고신-1-포스페이트 수용체 2의 활성화 또는 발현 증가를 통해 지방세포 분화를 유도하는 인자들인 PPAR-gamma (peroxisome proliferator activated receptor-gamma)및 C/EBP (CCAAT-enhancer-binding proteins)의 발현을 감소시킴으로써 지방세포 분화를 억제시킨다는 새로운 메커니즘을 밝혀냈으며, 스핑고신-1-포스페이트가 상기 메커니즘을 통해 지방세포 내 지질의 축적을 월등히 억제하고 효과적으로 체중감소를 촉진시킬 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 스핑고신-1-포스페이트(sphingosine-1-phosphate) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 스핑고신-1-포스페이트를 유효성분으로 포함하는 비만 예방용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 스핑고신-1-포스페이트(sphingosine-1-phosphate, 이하 S1P라고도 함) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 스핑고신-1-포스페이트는 하기 화학식 1로 나타낼 수 있다.

[화학식 1]

본 발명의 상기 S1P는 지방전구세포의 분화를 억제하는 활성을 가지며, 이를 통해 지질 함량의 축적을 감소시키는 작용을 함으로써 비만을 예방 및 치료하는 효과를 가진다.

본 발명자는 상기 S1P의 지방전구세포 분화 억제 활성 메커니즘에 대한 연구를 한 결과, S1P가 지방세포의 분화과정에서 중요한 역할을 하는 전사인자 및 그 전사인자에 의해 조절되는 유전자들의 발현을 조절하며, 보다 구체적으로, 본 발명의 S1P는 지방세포 분화를 유도하는 인자들인 PPAR-gamma (peroxisome proliferator activated receptor-gamma)및 C/EBP (CCAAT-enhancer-binding proteins)의 mRAN 발현을 감소시키고, PPAR-gamma에 의해 조절되는 분화된 지방세포에 특이적인 유전자인 adiponectin의 mRNA 발현을 억제함으로써 지방세포분화기전을 효과적으로 억제한다는 것을 밝혔다. 또한 상기 조절은 스핑고신-1-포스페이트 수용체 1(sphingosine-1-phosphate receptor 1, 이하 S1P1이라고 함)이 아닌 스핑고신-1-포스페이트 수용체 2 (sphingosine-1-phosphate receptor 2, 이하 S1P2라고 함)를 통해 나타난다는 것을 최초로 밝혔다.

본 발명의 하나의 구체예에서, S1P가 지질 축적을 억제하는지 알아보기 위해 지방전구세포인 3T3-L1 세포에 S1P를 농도를 달리하여 처리한 후 분화를 유도한 결과, S1P를 처리하지 않고 분화를 유도한 세포에서는 지방이 축적된 반면에 S1P를 처리하고 분화를 유도한 세포에서는 지질 축적이 감소됨을 확인할 수 있었으며 (도 1 참조), 이러한 결과는 S1P가 지질분해 작용을 통해 감소시킨 것이 아니고 지방전구세포에서 지방세포로의 분화를 억제하여 지질 함량 축적을 감소시키는 것임을 알 수 있었다.

본 발명의 다른 하나의 구체예에서, 상기 S1P가 지방 세포 분화과정의 중요한 전사조절인자인 PPAR-gamma와 C/EBP의 mRAN 발현을 감소시키고 분화된 지방세포 특이적 유전자인 adiponectin의 mRNA 발현을 억제시키는 기전을 통해 지방전구세포에서 지방세포로의 분화를 억제함을 확인할 수 있었다 (도 2 참조).

본 발명의 또다른 구체예에서, 상기 S1P의 지방세포 분화 억제가 어떠한 수용체를 통해 나타나는 것인지 조사해 본 결과, S1P1 수용체 길항제를 처리한 경우는 분화가 유도된 지방세포의 지질 함유량의 유의미한 변화가 없는 반면, S1P2 수용체 길항제를 처리한 경우는 S1P로 감소되었던 지방세포 내 지질 함량이 대조군 수준으로 증가하는 것을 통해, S1P 지방세포 분화 억제는 S1P2 수용체를 통해 일어남을 확인할 수 있었다 (도 3 내지 도 5 참조). 뿐만 아니라, 3T3-L1 세포에 S1P를 처리한 경우, S1P2 수용체의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다 (도 6 참조).

상기한 바와 같이, 본 발명의 스핑고신-1-포스페이트는 지방세포 분화 관련 인자들의 발현을 조절함으로써 지방세포의 분화를 현저히 저해하고 지질의 축적을 억제하는 효능을 가진다.

본 발명에서, 상기 화학식 1로 표시되는 스핑고신-1-포스페이트의 약학적으로 허용가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 화학식 1의 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성 기의 염을 포함한다. 예를 들면, 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨 염이 포함되며, 아미노기의 기타 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄설포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트(토실레이트) 염이 있으며, 당해 기술분야에서 알려진 염의 제조방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어, “비만(obesity)”은 에너지 불균형에 의하여 과다한 체지방을 가진 상태(condition) 또는 질환(disease)을 의미한다. 본 발명의 스핑고신-1-포스페이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물을 투여함으로써, 몸무게를 감량할 수 있고, 지방 세포내 지질 함량 또는 중성지방을 감소시킬 수 있다.

상기 “예방”이란 상기 조성물의 투여로 비만을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 또한, 상기 “치료”란 상기 조성물의 투여로 비만의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

상기 S1P는 전체 약학적 조성물에서 0.001 내지 50중량%, 바람직하게는 0.01 내지 20중량% 포함될 수 있다. 또한, 상기 S1P는 전체 약학적 조성물에서 상기 약학적 조성물이 투여되는 개체의 1kg당 적정량이 투여될 수 있도록 함량을 조절할 수 있다. 예를 들어, 상기 투여되는 개체가 래트(Rat)인 경우 상기 S1P는 50mg/kg 내지 150mg/kg, 바람직하게는 80mg/kg 내지 120mg/kg의 함량으로 투여될 수 있도록 약학적 조성물에 포함되는 함량이 조절될 수 있다. 또한, 상기 투여되는 개체가 인간인 경우 상기 S1P는 0.0001 내지 500mg/kg, 바람직하게는 0.001 내지 500mg/kg, 보다 바람직하게는 0.001 내지 300mg/kg의 함량으로 투여될 수 있도록 약학적 조성물에 포함되는 함량이 조절될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약효를 증가시키지는 않으나 약학적 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 성분을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 비타민 B1, B2, B6, C, E, 니아신, 카르니친, 베타인, 엽산 판토텐산, 비오틴, 아연, 철, 칼슘, 크롬, 마그네슘 및 이들의 혼합물 등의 무기 또는 유기 첨가물들을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 단독 사용하거나 기존에 사용된 비만에 대한 예방 또는 치료 활성을 가지는 물질을 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하고 경구 또는 비경구용의 인체 또는 수의용으로 제형화될 수 있다. 본 발명의 조성물을 제제화하는 경우 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose) 및 젤라틴 등을 섞어 조제한다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘, 스티레이트, 탈크 같은 윤활제를 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물 및 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜 및 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 상기 약학적 조성물은 개체에 투여하여 비만을 예방 또는 치료할 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어, “개체”는 비만 또는 이의 직, 간접적 원인에 의해 유발된 질환을 가지고 있으며, 본 발명의 상기 약학적 조성물을 투여하여 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간을 포함한 말, 양, 돼지, 염소, 개 등의 포유동물을 의미한다.

본 발명에서 사용된 용어, “투여”는 어떠한 적절한 방법으로 개체에 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미한다. 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물이 표적 세포로 이동할 수 있도록 하는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 사용된 용어, “약제학적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 성별, 연령, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 제조 방법에 따라 제조된 화합물을 포함하는 조성물의 투여방법은 경구투여 또는 정맥투여가 바람직하다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 성별, 연령, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여 방법, 약제혼합 및 질환의 중증도에 따라 변화될 수 있다.

본 발명의 조성물은 비만 억제를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 스핑고신-1-포스페이트를 포함하는 비만 예방용 식품 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 스핑고신-1-포스페이트를 포함하는 식품 조성물은 비만 억제를 목적으로 건강식품에 첨가될 수 있다. 본 발명의 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

음료의 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 식품 조성물 100㎖ 당 일반적으로 약 0.001 내지 0.4g, 바람직하게는 약 0.002 내지 0.03g 이다.

상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 식품 조성물 100 중량부 당 0.001 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

상기에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명의 스핑고신-1-포스페이트는 지방세포 분화 관련 인자들의 발현을 조절함으로써 지방세포의 분화를 현저히 저해하고 지질의 축적을 억제하는 효능을 가지므로, 이를 포함하는 조성물은 비만 예방 또는 치료에 효과적인 의약품으로 유용하게 이용할 수 있다.

도 1에서 도 1a 및 도 1b는 S1P가 지질 축적을 억제하는지 확인하기 위해 지방전구세포인 3T3-L1세포에 S1P를 농도별(0, 0.1, 0.5, 1, 5, 10 μM)로 처리한 후, MDI 배지로 분화를 유도한 후 6일 후에 AdipoRed assay를 실시하여 세포 내의 지질 함량을 광학 현미경(X200)으로 관찰한 결과를 나타낸 것이고, 도 1c는 인슐린 배지로 배양하여 분화유도 후 유리되어 나온 글리세롤의 양을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 S1P가 지방세포분화과정에 있어서 중요한 역할들을 하는 전사인자 및 그 전사인자에 의해 조절되는 유전자들의 발현을 조절하는지를 알아보기 위해, Real time RT-PCR과 Western blotting을 실시하여, PPAR-γ의 mRNA 발현 결과(도 2a) 및 단백질의 발현 결과(2b), 및 C/EBPα와 adiponectin의 mRNA의 발현을 측정한 결과(도 2c 및 도 2d)를 나타낸 것이다.
도 3은 S1P가 어떠한 수용체를 통해 지방세포 분화 억제 효과를 나타내는지를 알아보기 위해, S1P1 수용체와 S1P2 수용체가 3T3-L1 세포에 존재하는지를 RT-PCR을 실시한 유전자 발현 결과(3a), SEW2871을 농도별(0, 0.1, 1, 10, 50 μM)로 처리하여 MDI 배지로 분화 유도 후 지질 함량을 AdipoRed Assay를 통해 확인한 결과(3b 및 3c), S1P1 수용체 길항제인 W146을 농도별(0, 0.01, 0.1, 1, 10 μM)로 처리하여 S1P1 수용체를 막고 S1P 10 μM을 처리 후, MDI 배지로 분화 유도 후 지질 함량을 AdipoRed Assasy를 실시하여 현미경과 분광광도계를 통해 측정한 결과(도 3d 및 3e)를 나타낸 것이다.
도 4는 S1P가 S1P2 수용체를 통해 일어나는 것인지를 확인하기 위해 3T3-L1 세포에 S1P2 수용체 길항제인 JTE013을 농도 의존적으로 (0, 0.02, 0.2, 2 μM) 처리한 후, S1P 10 μM 처리하고, MDI 배지로 분화 유도 후 AdipoRed assay로 지질 함량을 측정한 결과(도 4a 및 4b)를 나타낸 것이다.
도 5는 S1P에 의한 지방세포 분화 과정에 관여하는 전사인자 및 지방세포 특이적 유전자의 조절이 S1P2 수용체를 통해 일어나는 것인지를 확인하기 위해, S1P2 수용체 차단제를 3T3-L1 세포에 처리 후, PPAR-γ, C/EBPα 및 분화된 지방세포 특이적 유전자인 adiponectin의 발현 회복 여부를 Real time RT-PCR과 Western blotting을 통해 확인한 결과(도 5a, 5b, 5c, 및 5d)를 나타낸 것이다.
도 6은 S1P를 3T3-L1 세포에 처리시 S1P2 수용체의 발현이 증가하는 것을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 실시예를 통해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실험방법

세포 배양 및 분화 유도

본 실시예에 사용된 3T3-L1 세포는 분화 유도 전까지 10 % FBS(fetal bovine serum) 및 0.1 mg/ml 겐타마이신(gentamycin)이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)(Hyclone Laboratories, Logan, UT, USA) 배지를 사용하여 37 ℃, 5 % CO2 조건의 습식 인큐베이터(humidified incubator)에서 배양시켰다. 분화를 유도하기 위해 세포를 각각의 실험 조건에 맞게 6 wells 혹은 24 wells 혹은 96 wells plate에 2일간 confluent상태를 유지하여 배양한 후, MDI induction media (DMEM containing 10% fetal bovine serum, 0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), 1 μm dexamethasone and 1 μg/ml of insulin)로 배지를 바꾼 후 약물 처리(S1P (10 μM), SEW2871 (from 0.1 to 50 μM), W146 (from 0.01 to 10 μM) and JTE-013 (from 0.02 to 2 μM))하여 3일간 유지시켰다. 3일 후 인슐린 배지로 바꾼 후 AdipoRed assay와 Lipolysis assay를 실시하였다.

지질 함량 측정

지질 함량은 지질에 특이적으로 염색되는 형광 물질인 AdipoRed Assay Reagent로 염색시켜 측정하였다. 24 well plate에 3T3-L1 세포를 배양시켜 6일간 MDI 배지 혹은 약물을 처리한 후, 배지를 제거시키고 PBS로 washing한다. 300 μl PBS와 30 μl Adipored reagent를 넣어준 후 37℃, 10분간 배양시킨다. 이후 분광광도계로 형광값을 측정한다. (excitation at 485 nm and emission at 572 nm)

Adipolysis assay

중성지방 분해로 유리되어 나온 글리세롤의 양을 측정하여 지질 분해 작용 능력을 알아보는 실험으로써 Adipolysis Assay kit를 이용하여 측정하였다. 분화된 지방세포에서 S1P 혹은 양성대조군인 isoproterenol을 24시간 처리 후에 세포 상층액 (배양 배지)을 모아 free glycerol assay reagent를 섞어 15분간 실온에서 배양시킨다. 이후 분광광도계로 540nm에서 흡광도를 측정하여 유리된 글리세롤의 양을 측정한다.

qRT - PCR ( Quantitative Real - time PCR )

세포로부터 총 RNA의 분리는 Easy-spin™ total RNA extraction kit(iNtRON Biotechnology, Seoul, Korea)를 이용하여 추출하였다. 이후, cDNA의 합성은 TaKaRa Prime Script™ 1st strand cDNA synthesis kit(Takara Bio Inc., Tokyo, Japan)의 프로토콜에 따라 수행하였다. Quantitative PCR을 수행하기 위해, 총 20 μl 반응액에 SYBR green과 1μl의 유전자 프라이머를 첨가하였다. 상기 사용된 프라이머는 하기 표 1에 나타내었다.

프라이머 서열

Name	primer sequence
S1P1	forward 5'-GAAACTACACAACGGGAGCAACAG-3' (서열번호 1) reverse 5'-AAGCAGGAGCAGAGTGAAGACG-3' (서열번호 2)
S1P2	forward 5'-AACAGCAAGTTCCACTCAGCAATG-3' (서열번호 3) reverse 5'-GGCGGAGAGCGTGATGAAGG-3' (서열번호 4)
PPARγ	forward 5'-CGGAAGCCCTTTGGTGACTTTATG-3' (서열번호 5) reverse 5'-GCAGCAGGTTGTCTTGGATGTC-3' (서열번호 6)
C/EBP-α	forward 5'-CGGGAACGCAACAACATCGC-3' (서열번호 7) reverse 5'-TGTCCAGTTCACGGCTCAGC-3' (서열번호 8)
adiponectin	forward 5'-TGACGGCAGCACTGGCAAG-3' (서열번호 9) reverse 5'-TGATACTGGTCGTAGGTGAAGAGAAC-3'(서열번호 10)
β-actin	forward 5'-TGAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3' (서열번호 11) reverse 5'-GCTCGTTGCCAATAGTGATGACC-3' (서열번호 12)

iTaq SYBR green supermix(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)의 모든 반응은 CFX96 real-time PCR detection system(Bio-Rad Laboratories)에서 수행되었다.

Western blotting

세포를 용해버퍼(25 mM HEPES; pH 7.4, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM MgCl2, 0.1 mM DTT 및 protease inhibitor mixture)로 용해시켰다. 이후, 단백질을 10 ~ 15 % SDS gel에 전기영동으로 분획한 후, 이뮤노블롯팅(immunoblotting)을 수행하였다. 단백질 용해물의 Equal amounts를 10 ~ 15 % SDS-polyacrylamide gel위에 분획시킨 후, 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)에 전기영동으로 전이시켰다. Immunoreactivity는 HRP(horseradish peroxidase)-결합된 이차 항체(secondary antibodies) 및 ECL reagents의 연속적인 배양을 통해 검사하였다.

이뮤노블롯팅(immunoblotting)에 사용된 항체는 PPARγ (Santa Cruz Biotechnology) and ß-actin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 을 사용하였다.

통계학적 평가

수행한 실험의 모든 데이터는 means±SD(standard deviations)로 나타내었으며, Student's t-test 및 SAS statistical package의 ANOVA Duncan test를 이용하여 비교하였다. 이후 결과들을 *P < 0.05 또는 **P < 0.01의 값과 #P < 0.05, ##P < 0.01의 값에 대해 유의하다고 고려하였다.

결과

S1P 처리에 의한 지방세포로의 분화 억제

S1P가 지질 축적을 막는지 보기 위해 지방전구세포인 3T3-L1세포에 S1P를 농도별(0, 0.1, 0.5, 1, 5, 10 μM)로 처리한 후, MDI 배지로 분화를 유도하여 지질 축적이 이뤄지는지를 확인해 보았다. 3일간 MDI 배지로 분화 유도 후에 인슐린 배지로 교체하였다. S1P를 처리한 지방전구세포와 처리하지 않은 지방전구세포의 분화도 차이는 지질 함량의 차이를 통해 확인하였다. 분화 유도 시작 6일 후에 AdipoRed assay를 실시하여 세포 내의 지질 함량을 광학 현미경(X200)으로 관찰하였으며, 분광 광도계로 형광물질로 염색된 지질함량을 측정하여 대조군 세포(아무것도 처리하지 않은 세포)의 지질함량을 기준으로 S1P를 처리한 세포의 지질함량을 백분율로 나타내어 상대적 지질 함량을 나타내었다. 각 결과는 도 1a와 도 1b에 나타내었다. 도 1a, b에서 보이는 바와 같이 S1P를 처리하지 않고 MDI 배지로 분화를 유도한 세포에서는 세포 내 지방이 축적되어 있는 반면, S1P를 처리하고 MDI 배지로 분화를 유도한 세포에서는 처리 농도가 증가할수록 세포 내 지질 축적이 감소됨을 확인할 수 있다.

또한, S1P가 지방세포로의 분화 자체를 억제시켜 지질 함량 축적을 감소시킨 것인지 지질분해작용을 통해서 감소시킨 것인지를 확인하기 위해 분해되어 유리된 글리세롤의 양을 측정하는 실험을 실시하였다. 96 well plate에 3T3-L1세포들을 배양하여 MDI 배지로 3일 배양시키고, insulin 배지로 3일을 배양시켜 분화를 유도한 후, S1P를 농도별로 처리하여 배지 내의 유리되어 나온 글리세롤의 양을 측정하였다. 그 결과, 양성 대조군인 isoproterenol 처리에 따라 유리된 글리세롤의 양은 대조군에 비해 증가하였지만 S1P 처리에 따른 글리세롤의 양은 대조군과 비교하여 유의적 차이가 없었다.

S1P 에 의한 지방세포분화과정에서 중요한 역할을 하는 인자들의 조절

S1P가 지방세포분화과정에 있어서 중요한 역할들을 하는 전사인자 및 그 전사인자에 의해 조절되는 유전자들의 발현을 조절하는지를 알아보기 위해 Real time RT-PCR과 Western blotting을 실시하였다. 3T3-L1 세포에 S1P를 0, 1, 10 μM 처리한 후, MDI 배지로 분화를 유도하여 6일 후에 각 세포에서 PPAR-γ의 mRNA 및 단백질의 발현 및 C/EBPα, adiponectin의 mRNA의 발현을 측정하였다. PPAR-γ와 C/EBPα는 지방세포분화과정을 조절하는 주요 전사인자들이고, adiponectin은 PPAR-γ에 의해 조절되는 분화된 지방세포에 특이적 유전자이다. 상기 유전자 및 단백질 발현 결과는 각각 도 2a, 2b, 2c, 2d에 나타내었다.

도 2a, 2b에 나타낸 것과 같이, MDI 배지로 분화를 유도시킨 세포의 경우 대조군에 비해 PPAR-γ의 mRNA 발현이 증가하였고, S1P를 처리한 후 MDI 배지로 분화를 유도시킨 세포의 경우 MDI 배지로 분화가 유도된 지방세포에 비해 PPAR-γ 전사인자의 mRNA 발현이 농도가 증가함에 따라 억제됨을 확인하였고, 단백질의 발현량 역시 감소됨을 확인할 수 있다. 또한, C/EBPα, adiponectin역시 MDI 배지로 분화가 유도된 경우 증가하였지만, S1P를 처리하였을 경우 S1P 농도가 증가함에 따라 그 mRNA의 발현량이 억제됨을 확인하였다. 따라서 S1P는 지방전구세포에서 PPAR-γ, C/EBPα와 같은 전사인자를 조절함으로써 지방세포로의 분화과정을 억제함을 알 수 있다.

S1P 의 지방세포 분화 억제 효과에 있어서 S1P1 수용체의 역할

S1P가 어떠한 수용체를 통해 지방세포 분화 억제 효과를 나타내는지를 알아보기 위해 S1P 특이적 수용체들 가운데 S1P가 분화 작용에 영향을 미치는데 관련이 있다고 알려진 S1P1 수용체와 S1P2 수용체가 3T3-L1 세포에 존재하는지를 RT-PCR을 실시하여 상기 유전자의 발현 결과를 도 3a에 나타내었다. 두 개의 수용체 모두 존재하는 것을 확인하였고, 우선 S1P1 효현제인 SEW2871을 농도별(0, 0.1, 1, 10, 50 μM)로 처리하여 MDI 배지로 분화 유도 후 6일 뒤에 지질 함량을 AdipoRed Assay를 통해 확인하여 도 3b, 3c에 나타내었다. 또한, S1P1 수용체 길항제인 W146을 농도별(0, 0.01, 0.1, 1, 10 μM)로 처리하여 S1P1 수용체를 막고 S1P 10 μM을 처리 후, MDI 배지로 분화 유도 후 6일 뒤에 지질 함량을 AdipoRed Assasy를 실시하여 현미경과 분광광도계를 통해 측정한 결과를 도 3d, 3e에 나타내었다.

도 3b, 3c에 나타난 것과 같이, S1P1 수용체 효현제를 농도별로 처리하여도 분화가 유도된 지방세포의 지질 함유량이 감소되지 않음을 확인하였다. 또한, 도 3d, e를 보면, S1P 10 μM의 처리로 지방세포로의 분화를 억제시킨 S1P의 작용이 S1P1 수용체 길항제를 농도별로 처리하여도 그대로 일어남을 확인할 수 있었다. 이를 통해, S1P의 지방세포 분화 억제 작용은 S1P1 수용체를 통해 나타나는 작용이 아닌 것을 알 수 있다.

S1P2 수용체에 의해 매개된 S1P 의 지방세포 분화 억제 효과

S1P가 S1P2 수용체를 통해 지방세포 분화 억제 효과를 나타내는 것인지 확인하기 위해 S1P2 수용체 길항제를 사용하여 S1P2 수용체를 막아 S1P의 지방세포 분화 억제 효과가 차단되는지를 살펴보았다. 3T3-L1 세포에 S1P2 수용체 길항제인 JTE013을 농도 의존적으로 (0, 0.02, 0.2, 2 μM) 처리한 후, S1P 10 μM 처리하고, MDI 배지로 분화를 유도하였다. 분화 유도 후 3일째 인슐린 배지로 갈아주고 3일 후에 AdipoRed assay로 지질 함량을 측정하여 도 4a, 4b에 나타내었다.

도 4a, 4b에서 보는 바와 같이, 3T3-L1 세포에 처리한 S1P2 수용체 차단제는 처리한 농도가 증가함에 따라 S1P의 지방세포 분화 억제 작용을 차단하여 분화가 회복되어 S1P 처리로 60% 이상 감소되었던 지방세포 내의 지질 함량이 대조군 수준으로 증가되는 것을 확인하였다.

S1P2 수용체 억제제 처리에 의한 지방세포 분화 과정 관련 조절인자들의 발현 회복

지방세포 분화 과정에 있어 중요한 역할을 하는 전사인자 및 지방세포 특이적 유전자들이 S1P에 의해 조절되었는데 그 조절이 S1P2 수용체를 통해 일어나는 것인지를 확인하기 위해 S1P2 수용체 차단제를 0.2 μM 을 3T3-L1 세포에 처리 후, S1P에 의해 감소되었던 지방세포 분화 조절인자들인 PPAR-γ, C/EBPα 및 분화된 지방세포 특이적 유전자인 adiponectin의 발현이 회복되는지를 Real time RT-PCR과 Western blotting을 통해 확인하였다. 그 결과를 도 5a, 5b, 5c, 5d에 나타내었다.

도 5a, 5b, 5c, 5d에서 보는 바와 같이 MDI 배지로 분화를 유도시켰을 때 증가된 PPAR-γ, C/EBPα, adiponectin의 mRNA와 단백질 발현량이 S1P 처리로 인해 3배 가량 감소되었으나 S1P2 수용체를 JTE013 0.2 μM의 처리로 S1P2 수용체를 차단시켰을 경우 그 발현량이 MDI 배지로 분화를 유도시킨 대조군 수준으로 다시 회복되었음을 알 수 있었다.

상기 결과를 통해, S1P가 지방세포 분화 과정을 억제시키는 조절 작용을 가지며, 이러한 억제 작용은 S1P2 수용체를 통해 지방세포 분화 조절인자들을 조절하여 일어나는 것임을 알 수 있다.

S1P 처리시 S1P2 수용체의 발현 증가

S1P 처리가 3T3-L1 세포에서 S1P2 수용체에 영향을 주는지 알아보기 위해 S1P 처리 후의 S1P2 수용체의 단백질 발현량을 Western blotting을 통해 확인하였다. S1P 10 μM을 처리하고 MDI 배지로 분화를 유도시킨 지 24시간 후에 각 세포에서 S1P2 수용체의 단백질 발현을 S1P를 처리하지 않은 세포와 비교하여 도 6에 나타내었다. 도 6에서 나타나는 것과 같이, S1P를 처리하지 않은 세포와 비교하였을 때 S1P를 처리한 세포에서는 S1P2 수용체의 단백질 발현량이 증가함을 알 수 있었다. 이러한 결과로부터 실제로 S1P가 직접적으로 S1P2 수용체에 영향을 주는 것을 확인할 수 있었고, S1P가 S1P2 수용체의 발현량을 증가시켜 증가된 S1P2 수용체의 작용으로 인해 지방세포 분화 억제 작용을 나타내는 것으로 사료된다.

<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY <120> Pharmaceutical composition for preventing and treating obesity comprising sphingosine-1-phosphate <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for S1P1 <400> 1 gaaactacac aacgggagca acag 24 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for S1P1 <400> 2 aagcaggagc agagtgaaga cg 22 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for S1P2 <400> 3 aacagcaagt tccactcagc aatg 24 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for S1P2 <400> 4 ggcggagagc gtgatgaagg 20 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 5 cggaagccct ttggtgactt tatg 24 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 6 gcagcaggtt gtcttggatg tc 22 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 7 cgggaacgca acaacatcgc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 8 tgtccagttc acggctcagc 20 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for adiponectin <400> 9 tgacggcagc actggcaag 19 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for adiponectin <400> 10 tgatactggt cgtaggtgaa gagaac 26 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 11 tgagagggaa atcgtgcgtg ac 22 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 12 gctcgttgcc aatagtgatg acc 23

Claims (5)

1. 스핑고신-1-포스페이트 수용체 2(sphingosine-1-phosphate receptor 2) 발현 유도용 스핑고신-1-포스페이트를 유효성분으로 포함하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 스핑고신-1-포스페이트는 지방세포 분화 유도 인자인 PPAR-gamma (peroxisome proliferator activated receptor-gamma)및 C/EBP (CCAAT-enhancer-binding proteins)의 발현을 감소시키고, 분화된 지방세포 특이적인 유전자인 아디포넥틴(adiponectin)의 발현을 억제하는 활성을 갖는 것인, 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 스핑고신-1-포스페이트는 지방 세포로의 분화를 억제하는 것을 특징으로 하는, 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 스핑고신-1-포스페이트는 전체 조성물의 중량에서 0.001 내지 50 중량% 포함되는 것인 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물.
5. 스핑고신-1-포스페이트 수용체 2(sphingosine-1-phosphate receptor 2) 발현 유도용 스핑고신-1-포스페이트(sphingosine-1-phosphate)를 포함하는 비만 예방용 식품 조성물.

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