KR101925020B1 - Mkrn1의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는, 대사성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 MKRN1의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는, 대사성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 MKRN1은 AMPKα을 유비퀴틴화(ubiqutination)하는 E3-연결효소(E3-ligase)로서 역할을 하여 AMPK 단백질을 분해하므로, MKRN1 발현을 억제하면 AMPK 발현 및 활성 수준을 회복시킬 수 있다. 또한, MKRN1 발현을 넉아웃하고 고지방 식이로 비만, 당뇨 및 지방간을 유도한 마우스 모델에서 MKRN1 발현 넉아웃에 의해 비만, 당뇨 및 지방간에 대한 개선 효과를 나타낼 수 있으므로, 본 발명의 MKRN1의 발현 또는 활성 억제제를 대사성 질환 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로서 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 MKRN1의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는, 대사성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.
현대 사회에서 전 세계적으로 서구화된 식습관과 함께 비만이 21세기의 가장 위협적인 질병으로 대두되고 있으며, 비만으로 인한 당뇨, 고혈압, 고지혈증과 같은 대사성 질환을 통해 수명의 단축이 유도되고 있다. 미국의 경우, 2/3의 인구가 비만으로 진단되고 있으며, 선진국의 경우 점차 더 많은 비만 환자가 생길 것으로 예상된다. 현재, 전 세계적으로 약 14억 정도의 비만 환자가 있는 것으로 추정되어 비만을 치료하기 위해 미국에서는 연 3000억 달러의 비용이 소비되고 있는 것으로 보고된 바 있다.
대사성 질환 중 하나인 당뇨 역시, 점차 환자 수가 늘고있는 만성질환으로, 2030년 정도 전세계적으로 4억 4천만명의 환자가 있을 것으로 예상되고 있다. 이에 따라, 현재 비만 및 당뇨를 치료하기 위한 다양한 약물이 개발되었고, 시장에 출시되고 있으나 부작용으로 인해서 시장에서 퇴출되는 경우가 점차 보고되고 있다. 출시 전 단계로서, 약 200 개 이상의 약물이 임상 및 전임상의 파이프라인을 가지고 있으나, 역시 부작용이 보고됨에 따라 매우 적은 수의 약물만이 시장으로 진출하고 있다.
비만 치료제 또는 당뇨 치료제는 아직 출시되고 있는 약물이 적지만 점차 시장이 확장되어, 2021년 경 주요 선진국에서만 약 24억 달러 이상으로 확장될 것으로 예상되고 있다. 이처럼, 비만 치료제 또는 당뇨 치료제는 부작용이 적고 오래 복용할 수 있는 약물 개발의 성공이 절실한 상황이다.
AMPK는 당뇨치료의 주 타겟 단백질로 혈당조절, 비만, 지방간 형성에 매우 주요한 인자로 알려져 있으며 최근 대사관련 암과의 상관관계에 대한 보고가 이루어지고 있다. 이에 따라 AMPK 활성 조절제 또는 AMPK 활성을 조절할 수 있는 타겟 단백질을 대사성 질환의 치료제로서 제공하고자 하는 약물이 개발된 바 있다.
예를 들어, 당뇨 치료제인 metfomrin은 AMPK 활성제의 기능을 가지고 있으며 투여된 환자의 경우 대사성 질환의 호전과 암 등 관련 질병이 매우 감소하는 경향을 나타낼 수 있으나, 당뇨 완치 효과는 나타낼 수 없는 한계성이 있다. 현재 Metoformin 또는 이의 유도체를 이용 대사질병을 치료하고 있으나, 이 물질은 대사 관련 질병을 억제시킬 수 있는 AMPK를 직접 타겟하지 않으며 그 작용기작에 대한 정확한 기전이 알려지지 않고 있지 않아 부작용이 생길 우려가 있어, 새로운 기전 및 타겟을 대상으로 하는 대사성 질환 치료제의 개발이 요구되고 있다.
이에, 본 발명자들은 AMPK 활성 증진을 목표로 할 수 있는 새로운 타겟 단백질을 발굴하기 위해 노력한 결과, MKRN1 단백질은 AMPKα을 유비퀴틴화(ubiqutination)하는 E3-연결효소(E3-ligase)로서 역할을 하여 AMPK 단백질을 분해하므로, MKRN1 발현을 억제한 세포에서 AMPK 발현 및 활성 수준이 회복될 수 있음을 확인하였다. 또한, MKRN1 발현을 넉아웃하고 고지방 식이로 비만, 당뇨 및 지방간을 유도한 마우스 모델에서 MKRN1 발현 넉아웃에 의해 비만, 당뇨 및 지방간에 대한 개선 효과를 나타낼 수 있어, MKRN1의 발현 또는 활성 억제제를 대사성 질환 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로서 사용할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명자들은 MRKN1 발현 및 활성을 억제하는 비만 마우스 모델군에서 MKRN1 발현 억제에 따라 비만, 당뇨 및 지방간 개선 효과를 나타낼 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 대사성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 대사성 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 MKRN1의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는, 대사성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 MKRN1의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는, 대사성 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 MKRN1의 발현 또는 활성 억제제는 MKRN1을 암호화하는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 뉴클레오티드(antisense nucleotide), siRNA 및 shRNA로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 또다른 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 MKRN1의 발현 또는 활성 억제제는 AMPK의 발현 및 활성을 증진시키는 것일 수 있다.
본 발명의 또다른 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 대사성 질환은 비만, 제2형 당뇨, 이상지질혈증, 인슐린저항성, 간지방증(hepatic steatosis) 및 비알콜성 지방간(fatty liver)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
따라서, 본 발명은 MKRN1의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는, 대사성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 MKRN1은 AMPKα을 유비퀴틴화(ubiqutination)하는 E3-연결효소(E3-ligase)로서 역할을 하여 AMPK 단백질을 분해하므로, MKRN1 발현을 억제하면 AMPK 발현 및 활성 수준을 회복시킬 수 있다. 또한, MKRN1 발현을 넉아웃하고 고지방 식이로 비만, 당뇨 및 지방간을 유도한 마우스 모델에서 MKRN1 발현 넉아웃에 의해 비만, 당뇨 및 지방간에 대한 개선 효과를 나타낼 수 있으므로, 본 발명의 MKRN1의 발현 또는 활성 억제제를 대사성 질환 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 MKRN1을 억제하면 AMPK의 활성을 유도할 수 있어, 제 2당뇨, 지방간, 비만 등의 개선 효과를 유도시킬 수 있는 흐름을 나타내는 모식도이다.
도 2는 MKRN1과 AMPK α 서브유닛의 결합의 확인을 확인한 도이다:
도 2a는 MKRN1 발현이 억제된 세포에서 AMPK가 인산화되었음을 나타내고; 및
도 2b 내지 도 2e는 MKRN1 단백질과 AMPK 단백질의 상호결합을 나타낸다.
도 3은 AMPK 단백질의 분해 및 억제자로서 MKRN1의 역할을 확인한 도이다:
도 3a는 MKRN1을 넉다운한 세포에서 AMPK의 도메인 발현 수준을 나타내고;
도 3b는 MKRN1의 발현 농도에 따른 AMPK 도메인의 발현 수준 변화를 나타내며; 및
도 3c는 프로테아좀(proteasome) 억제제인 MG132를 처리하였을 때 MKRN1에 의한 AMPK 단백질 분해 정도의 변화의 확인을 나타낸다.
도 4는 MKRN1에 의한 AMPK의 폴리-유비퀴닌화를 확인한 도이다:
도 4a는 MKRN1 발현 여부에 따른 AMPKα 서브유닛에 대한 유비퀴틴 여부의 확인을 나타내며;
도 4b 및 도 4c는 시험관 내(In vitro) 수준에서 MKRN1이 AMPKα 단백질의 E3-ligase임을 확인한 결과를 나타내고; 및
도 4d는 프로테아좀 억제제인 MG132를 처리한 환경에서 MKRN1 억제시 AMPKα의 유비퀴틴화 감소를 나타낸다.
도 5는 MKRN1에 의해 AMPK 신호 경로가 억제됨을 확인한 도이다:
도 5a는 MKRN1 넉아웃 또는 넉다운에 의한 AMPK 단백질 발현 및 활성 수준 회복의 확인을 나타내며;
도 5b는 MKRN1 발현 억제에 따른 해당과정 조절 효과의 확인을 나타낸다.
도 6은 MKRN1 넉아웃 마우스에서 비만 억제 효과를 확인한 도이다:
도 6a는 MKRN1 억제 유무에 따른 고지방 섭취로 유발된 비만 마우스를 비교한 도이고;
도 6b는 MKRN1 억제 유무에 따른 비만 마우스 모델에서 체중 변화를 나타내며;
도 6c는 MKRN1 억제 유무에 따른 비만 마우스 모델에서 1일 먹이 섭취량을 나타내고; 및
도 6d는 MKRN1 억제 유무에 따른 비만 마우스 모델에서 혈중 렙틴 농도의 차이를 나타낸다.
도 7은 고지방 식이에 의한 지방조직 및 지방에 MKRN1 억제가 미치는 영향을 확인한 도이다:
도 7a는 MKRN1 억제 유무에 따른 비만 마우스 모델의 지방조직 형성을 micro CT 촬영으로 확인한 결과를 나타내며;
도 7b는 MKRN1 억제 유무에 따른 비만 마우스 모델의 지방조직의 무게 및 면적을 나타내고;
도 7c는 MKRN1 억제 유무에 따른 비만 마우스 모델의 지방조직 및 이를 H&E 염색(Hematoxylin and eosin staining)으로 관찰한 결과이며;
도 7d는 MKRN1 억제 유무에 따른 비만 마우스 모델의 갈색 지방 조직을 관찰한 결과를 나타내고;
도 7e는 MKRN1 억제 유무에 따른 비만 마우스 모델의 지방 조직 내 AMPK 단백질의 발현 및 인산화 수준을 나타내며; 및
도 7f는 MKRN1 억제 유무에 따른 비만 마우스 모델의 혈중 트리글리세라이드(triglyceride), 총 콜레스테롤 및 LDL 콜레스테롤의 농도의 확인을 나타낸다.
도 8은 MKRN1 넉아웃 마우스에서 당뇨 개선 효과를 확인한 도이다:
도 8a는 MKRN1 억제 유무에 따른 당뇨 마우스 모델의 혈당(plasma insulin) 차이를 나타내며; 및
도 8b는 MKRN1 억제 유무에 따른 당뇨 마우스 모델에서 GTT 확인을 나타낸다.
도 9는 지방간에 MKRN1이 미치는 영향을 확인한 도이다:
도 9a는 MKRN1 억제 유무에 따른 지방간 마우스 모델의 간 크기 및 중량 비교를 나타내며;
도 9b는 MKRN1 억제 유무에 따른 지방간 마우스 모델의 간세포 내 지방 축적의 비교를 나타내고;
도 9c는 MKRN1 억제 유무에 따른 지방간 마우스 모델의 간세포 내 중성 지방의 농도 비교를 나타내며;
도 9d는 MKRN1 억제 유무에 따른 지방간 마우스 모델에서 AMPK 발현 및 인산화 수준의 차이를 나타내고;
도 9e 및 도 9f는 MKRN1 억제 유무에 따른 지방간 마우스 모델에서 간기능 검사를 위해 AST 및 ALT 분석 결과를 나타낸다.
도 10은 간세포에서 MKRN1 KO가 AMPK 신호 경로에 미치는 영향을 확인한 도이다.
도 2는 MKRN1과 AMPK α 서브유닛의 결합의 확인을 확인한 도이다:
도 2a는 MKRN1 발현이 억제된 세포에서 AMPK가 인산화되었음을 나타내고; 및
도 2b 내지 도 2e는 MKRN1 단백질과 AMPK 단백질의 상호결합을 나타낸다.
도 3은 AMPK 단백질의 분해 및 억제자로서 MKRN1의 역할을 확인한 도이다:
도 3a는 MKRN1을 넉다운한 세포에서 AMPK의 도메인 발현 수준을 나타내고;
도 3b는 MKRN1의 발현 농도에 따른 AMPK 도메인의 발현 수준 변화를 나타내며; 및
도 3c는 프로테아좀(proteasome) 억제제인 MG132를 처리하였을 때 MKRN1에 의한 AMPK 단백질 분해 정도의 변화의 확인을 나타낸다.
도 4는 MKRN1에 의한 AMPK의 폴리-유비퀴닌화를 확인한 도이다:
도 4a는 MKRN1 발현 여부에 따른 AMPKα 서브유닛에 대한 유비퀴틴 여부의 확인을 나타내며;
도 4b 및 도 4c는 시험관 내(In vitro) 수준에서 MKRN1이 AMPKα 단백질의 E3-ligase임을 확인한 결과를 나타내고; 및
도 4d는 프로테아좀 억제제인 MG132를 처리한 환경에서 MKRN1 억제시 AMPKα의 유비퀴틴화 감소를 나타낸다.
도 5는 MKRN1에 의해 AMPK 신호 경로가 억제됨을 확인한 도이다:
도 5a는 MKRN1 넉아웃 또는 넉다운에 의한 AMPK 단백질 발현 및 활성 수준 회복의 확인을 나타내며;
도 5b는 MKRN1 발현 억제에 따른 해당과정 조절 효과의 확인을 나타낸다.
도 6은 MKRN1 넉아웃 마우스에서 비만 억제 효과를 확인한 도이다:
도 6a는 MKRN1 억제 유무에 따른 고지방 섭취로 유발된 비만 마우스를 비교한 도이고;
도 6b는 MKRN1 억제 유무에 따른 비만 마우스 모델에서 체중 변화를 나타내며;
도 6c는 MKRN1 억제 유무에 따른 비만 마우스 모델에서 1일 먹이 섭취량을 나타내고; 및
도 6d는 MKRN1 억제 유무에 따른 비만 마우스 모델에서 혈중 렙틴 농도의 차이를 나타낸다.
도 7은 고지방 식이에 의한 지방조직 및 지방에 MKRN1 억제가 미치는 영향을 확인한 도이다:
도 7a는 MKRN1 억제 유무에 따른 비만 마우스 모델의 지방조직 형성을 micro CT 촬영으로 확인한 결과를 나타내며;
도 7b는 MKRN1 억제 유무에 따른 비만 마우스 모델의 지방조직의 무게 및 면적을 나타내고;
도 7c는 MKRN1 억제 유무에 따른 비만 마우스 모델의 지방조직 및 이를 H&E 염색(Hematoxylin and eosin staining)으로 관찰한 결과이며;
도 7d는 MKRN1 억제 유무에 따른 비만 마우스 모델의 갈색 지방 조직을 관찰한 결과를 나타내고;
도 7e는 MKRN1 억제 유무에 따른 비만 마우스 모델의 지방 조직 내 AMPK 단백질의 발현 및 인산화 수준을 나타내며; 및
도 7f는 MKRN1 억제 유무에 따른 비만 마우스 모델의 혈중 트리글리세라이드(triglyceride), 총 콜레스테롤 및 LDL 콜레스테롤의 농도의 확인을 나타낸다.
도 8은 MKRN1 넉아웃 마우스에서 당뇨 개선 효과를 확인한 도이다:
도 8a는 MKRN1 억제 유무에 따른 당뇨 마우스 모델의 혈당(plasma insulin) 차이를 나타내며; 및
도 8b는 MKRN1 억제 유무에 따른 당뇨 마우스 모델에서 GTT 확인을 나타낸다.
도 9는 지방간에 MKRN1이 미치는 영향을 확인한 도이다:
도 9a는 MKRN1 억제 유무에 따른 지방간 마우스 모델의 간 크기 및 중량 비교를 나타내며;
도 9b는 MKRN1 억제 유무에 따른 지방간 마우스 모델의 간세포 내 지방 축적의 비교를 나타내고;
도 9c는 MKRN1 억제 유무에 따른 지방간 마우스 모델의 간세포 내 중성 지방의 농도 비교를 나타내며;
도 9d는 MKRN1 억제 유무에 따른 지방간 마우스 모델에서 AMPK 발현 및 인산화 수준의 차이를 나타내고;
도 9e 및 도 9f는 MKRN1 억제 유무에 따른 지방간 마우스 모델에서 간기능 검사를 위해 AST 및 ALT 분석 결과를 나타낸다.
도 10은 간세포에서 MKRN1 KO가 AMPK 신호 경로에 미치는 영향을 확인한 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
상술한 바와 같이, 효과적인 당뇨 및 비만의 치료제에 대한 요구는 점차 증가하고 있음에도 불구하고, 관련 기작 및 타겟이 완전히 밝혀지지 않은 약물의 경우 치료 효과가 나타나지 않을 뿐 아니라, 부작용의 우려가 있으므로 새로운 대사성 질환의 타겟 및 치료제에 대한 연구가 계속되고 있으나, 효과적인 치료제에 대하여 아직까지 보고된 바 없다.
본 발명의 MKRN1은 AMPKα을 유비퀴틴화(ubiqutination)하는 E3-연결효소(E3-ligase)로서 역할을 하여 AMPK 단백질을 분해하므로, MKRN1 발현을 억제하면 AMPK 발현 및 활성 수준을 회복시킬 수 있다. 또한, MKRN1 발현을 넉아웃하고 고지방 식이로 비만, 당뇨 및 지방간을 유도한 마우스 모델에서 MKRN1 발현 넉아웃에 의해 비만, 당뇨 및 지방간에 대한 개선 효과를 나타낼 수 있으므로, 본 발명의 MKRN1의 발현 또는 활성 억제제를 대사성 질환 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로서 유용하게 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 MKRN1의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는, 대사성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 "MKRN1의 발현 또는 활성 억제제"는 MKRN1을 암호화하는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 뉴클레오티드(antisense nucleotide), siRNA 및 shRNA로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 siRNA는 서열목록 1 또는 서열목록 2로 기재되는 염기서열로 구성되는 뉴클레오티드인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, 화학적 합성, 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의한 요구되는 뉴클레오타이드 서열의 증폭, 또는 재조합 합성에 의해 이미 존재하는 siRNA를 정제하는 등 당업계에 siRNA 제조 방법으로서 공지된 방법으로 제조된 것이라면 어떤 것을 사용하여도 좋다.
본 발명의 "MKRN1의 발현 또는 활성 억제제"는 AMPK의 발현 및 활성을 증진시키는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, AMPK의 활성 증진은 AMPK의 인산화 수준 증가를 의미하는 것이 보다 바람직한 의미로서 이해될 수 있다.
본 발명의 "대사성 질환"은 비만, 제2형 당뇨, 이상지질혈증, 인슐린저항성, 간지방증(hepatic steatosis) 및 비알콜성 지방간(fatty liver)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하며, 구체적으로 비만, 제 2형 당뇨 또는 간 지방증인 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에 있어서, 본 발명자들은 MKRN1에 의한 AMPK 분해 조절 과정의 확인한 결과, MKRN1이 AMPK이 세포 내에서 상호 결합된 상태로 존재하며(도 2), MKRN1이 AMPK를 분해하여 활성화되지 않도록 조절하는 것을 확인하였다(도 3a). 이러한 분해는, MKRN1이 AMPK를 유비퀴틴화하는 E3-연결효소로서 작용하여, MKRN1은 AMPKα 단백질과 특이적으로 결합하여 프로테아좀을 통한 분해를 유도함을 확인하였다(도 3 및 도 4). 이에 따라, MKRN1이 AMPK의 발현 및 인산화 수준이 감소하도록 조절하므로, 이후 관련된 AMPK 신호 경로 및 해당과정이 억제되는 방향으로 조절되는 것을 확인하였다(도 5).
또한, 본 발명자들은 MKRN1이 AMPK의 발현 및 활성을 억제하므로 MKRN1이 대사성 질환에 미치는 영향을 확인하기 위하여 고지방 식이를 통한 비만, 당뇨 및 지방간 마우스 모델을 제작하였다. MKRN1+/+(WT) 마우스군 및 MKRN1-/-(KO) 마우스군을 16 주간 사육하고 MKRN1 억제에 따른 비만, 당뇨 및 지방간 개선 효과를 확인한 결과, MKRN1 넉아웃된 마우스군에서 유의적인 식이량의 차이는 나타나지 않았지만 몸무게, 지방량 및 혈중 내 중성지방과 콜레스테롤 수치가 감소하는 것을 통해, 비만 개선 효과를 나타내는 것을 확인하였다(도 7). 또한, MKRN1 넉아웃된 마우스군에서 고인슐린혈증이 유의적으로 완화되는 것을 통해, 당뇨 완화 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다(도 8). 아울러, MKRN1 넉아웃된 마우스군에서 간 조직의 크기 및 무게가 감소하고 지방 축적이 완화되었으며, 간세포 내 지방 축적의 감소 및 간기능 개선 효과이 나타나는 것을 확인하였다(도 9 및 도 10).
따라서, 본 발명의 MKRN1은 AMPKα을 유비퀴틴화하는 E3-연결효소로서 역할을 하여 AMPK 단백질을 분해하므로, MKRN1 발현을 억제하면 AMPK 발현 및 활성 수준을 회복시킬 수 있다. 또한, MKRN1 발현을 넉아웃하고 고지방 식이로 비만, 당뇨 및 지방간을 유도한 마우스 모델에서 MKRN1 발현 넉아웃에 의해 비만, 당뇨 및 지방간에 대한 개선 효과를 나타낼 수 있으므로, 본 발명의 MKRN1의 발현 또는 활성 억제제를 대사성 질환 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로서 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 siRNA는 상기 표적서열에 상동인 독립적인 센스 RNA 가닥 및 이에 상보적인 안티센스 RNA 가닥을 포함하거나 상기 센스 RNA 가닥 및 안티센스 RNA 가닥이 루프에 의해 연결된 스템-루프 구조의 단일 RNA 가닥일 수 있으며,
상기 siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고, 스템-루프(stem-loop)의 구조를 이루는 헤어핀 구조를 가질 수 있는데, 이를 특히 shRNA(short hairpin RNA)라 지칭한다. 한편, 상기 이중사슬 또는 스템 부위는 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수도 있다. 전체 길이는 10 내지 80 염기, 바람직하게는 15 내지 60 염기, 더욱 바람직하게는 20 내지 40 염기이다. 또한, 상기 루프 영역은 서열에 특별한 의미가 없으며, 단지 센스서열과 안티센스서열을 적당한 간격으로 연결하기 위하여 3-10 정도의 염기를 가지고 있으면 한정되지 않고 사용할 수 있다.
siRNA 말단 구조는 평활(blunt)말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3' 말단 돌출한 구조(protruding structure)와 5' 말단 쪽이 돌출한 구조가 모두 가능하고 돌출하는 염기 수는 한정되지 않는다. 예를 들어, 염기 수로는 1 내지 8 염기, 바람직하게는 2 내지 6 염기로 할 수 있다. 또한, siRNA는 표적유전자의 발현억제 효과를 유지할 수 있는 범위에서 예를 들어, 한쪽 말단의 돌출 부분에 저분자 RNA(예를 들어, tRNA, rRNA, 바이러스 RNA와 같은 천연의 RNA분자 또는 인공의 RNA분자)를 포함할 수 있다. siRNA 말단구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요는 없고, 이중사슬 RNA의 일방의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스템 루프형 구조일 수도 있다. 링커의 길이는 스템 부분의 쌍을 이루는 데 지장이 없는 길이면 특별히 한정되지 않는다.
본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 상기 조성물을 제형화할 경우에는 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 충진제, 증량제, 결합제, 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 습윤제, 붕해제 또는 계면활성제, 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분(옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분 등 포함), 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 덱스트로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 말티톨, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 예컨대, 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다.
또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 또는 보존제 등이 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있으며, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제 또는 좌제 등이 포함된다. 비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여시 피부외용; 복강내, 직장, 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사하는 주사제; 경피 투여제; 또는 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법에 따라 제형화할 수 있다.
상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS (phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 즉, 본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량으로는, 비경구 투여 시 곡류 추출물을 기준으로 하루에 체중 1 kg당 바람직하게 0.01 내지 50 mg, 더 바람직하게는 0.1 내지 30 mg의 양으로 투여되도록, 그리고 경구 투여 시는 본 발명의 조성물을 기준으로 하루에 체중 1 kg당 바람직하게 0.01 내지 100 mg, 더 바람직하게는 0.01 내지 10 mg의 양으로 투여되도록 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 MKRN1의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는, 대사성 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 "MKRN1의 발현 또는 활성 억제제"는 MKRN1을 암호화하는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 뉴클레오티드(antisense nucleotide), siRNA 및 shRNA로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 siRNA는 서열목록 1 또는 서열목록 2로 기재되는 염기서열로 구성되는 뉴클레오티드인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, 화학적 합성, 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의한 요구되는 뉴클레오타이드 서열의 증폭, 또는 재조합 합성에 의해 이미 존재하는 siRNA를 정제하는 등 당업계에 siRNA 제조 방법으로서 공지된 방법으로 제조된 것이라면 어떤 것을 사용하여도 좋다.
본 발명의 "MKRN1의 발현 또는 활성 억제제"는 AMPK의 발현 및 활성을 증진시키는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, AMPK의 활성 증진은 AMPK의 인산화 수준 증가를 의미하는 것이 보다 바람직한 의미로서 이해될 수 있다.
본 발명의 "대사성 질환"은 비만, 제2형 당뇨, 이상지질혈증, 인슐린저항성, 간지방증(hepatic steatosis) 및 비알콜성 지방간(fatty liver)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하며, 구체적으로 비만, 제 2형 당뇨 또는 간 지방증인 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 MKRN1은 AMPKα을 유비퀴틴화(ubiqutination)하는 E3-연결효소(E3-ligase)로서 역할을 하여 AMPK 단백질을 분해하므로, MKRN1 발현을 억제하면 AMPK 발현 및 활성 수준을 회복시킬 수 있다. 또한, MKRN1 발현을 넉아웃하고 고지방 식이로 비만, 당뇨 및 지방간을 유도한 마우스 모델에서 MKRN1 발현 넉아웃에 의해 비만, 당뇨 및 지방간에 대한 개선 효과를 나타낼 수 있으므로, 본 발명의 MKRN1의 발현 또는 활성 억제제를 대사성 질환 예방 및 개선용 건강기능식품의 유효성분으로서 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 일반 식품으로는 이에 한정되지 않지만 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게이트, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물 유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 조성물을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 영양보조제로는 이에 한정되지 않지만 캡슐, 타블렛, 환 등에 본 발명의 조성물을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 건강기능식품으로는 이에 한정되지 않지만 예를 들면, 본 발명의 조성물 자체를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용(건강음료)할 수 있도록 액상화, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물과 대사성 질병의 예방 및 개선 효과가 있다고 알려진 공지의 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.
본 발명의 조성물을 건강음료로 이용하는 경우, 상기 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL 당 일반적으로 약 0.01 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 0.03 g 이다.
또한, 본 발명의 조성물은 대사성 질환의 예방 및 개선용 식품 조성물의 유효성분으로 함유될 수 있는데, 그 양은 대사성 질환의 예방 및 개선 작용을 달성하기에 유효한 양으로 특별히 한정되는 것은 아니나, 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내지 100 중량%인 것이 바람직하다. 본 발명의 식품 조성물은 대사성 질환의 예방 및 개선에 효과가 있는 것으로 알려진 다른 활성 성분과 함께 혼합하여 제조될 수 있다.
상기 외에 본 발명의 건강식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강식품은 천연 과일주스, 과일주스 음료, 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
MKRN1에
의한
AMPK
분해 조절 과정의 확인
<1-1>
MKRN1
및
AMPK의
상호 결합 확인
본 발명의 MKRN1이 AMPK의 활성에 미치는 영향을 확인하기 위해, 먼저 MKRN1과 AMPK 간의 관계를 확인하였다.
구체적으로, MKRN1의 발현을 억제하기 위한 MKRN1 siRNA(Qiagen-Xeragon 사, CA)로 HeLa 세포를 형질전환하여 MKRN1이 저해된 세포를 제조하고 배양하였다. 배양 후, 세포를 수득하여 phospho kinase assay kit(R&D Systems, ARY003)를 사용하여, MKRN1 발현 정상 대조군(siControl)과 비교하였을 때 인산화 수준이 유의적으로 증가한 단백질군을 선별하였다.
그 결과, 도 2a에서 나타난 바와 같이 MKRN1이 저해된 세포에서는 AMPK의 인산화 수준이 증가한 것을 확인하여, 이를 통해 MKRN1이 저해되었을 때 AMPK가 활성화됨을 확인하였다(도 2a).
또한, MKRN1 저해에 따라 AMPK가 활성화됨을 확인하였으므로 이러한 AMPK의 활성화가 MKRN1과의 결합에 의한 것인지 확인하기 위하여, MKRN1 및 AMPK의 결합 여부를 확인하였다.
구체적으로, HA이 태그된 MKRN1 발현을 위한 HA-MKRN1 벡터 및/또는 FLAG가 태그된 AMPK 발현을 위한 FLAG-AMPK 벡터로 293T 암세포주를 형질전환하고 배양하였다. 배양 후, 세포를 수득하고 파쇄하여 전세포 추출물(WCL)을 얻은 다음, 항-HA 항체 또는 항-FLAG 항체를 사용하여 면역침강을 수행하였다. 그런 다음, 전세포 추출물 또는 면역침강한 추출물을 시료로 하여 면역블럿팅을 수행하였다. 상기 면역블럿팅을 위하여, 1차 항체로서 항-AMPKα1 항체, 항-AMPKα2 항체 또는 항-MKRN1 항체를 사용하였고, 2차 항체로서 항-마우스 IgG 항체를 사용하였다. MKRN1의 활성 여부에 따른 결과를 확인하기 위한 음성 대조군으로는 MKRN1의 H307E 변이체를 대상으로 하여 동일한 실험을 수행하였다.
그 결과, 도 2b 내지 도 2e에서 나타난 바와 같이 면역침강법(Immunoprecipitation)을 통해 MKRN1이 과발현된 세포에서 MKRN1은 AMPK 단백질과 결합한 형태로 세포질 내에 존재하는 것을 확인하였다(도 2b 내지 도 2e).
<1-2>
MKRN1에
의한
AMPK
분해 촉진의 확인
MKRN1이 세포 내에서 AMPK와 결합한 형태로 존재하며 MKRN1이 억제된 세포에서 AMPK가 활성화됨을 확인하였으므로, MKRN1이 AMPK를 분해하여 활성화되지 않도록 하는지 여부를 확인하였다.
구체적으로, MKRN1의 발현을 억제하기 위한 MKRN1 siRNA #6(서열번호 1: 5′-CGGGATCCTCTCCAACTGCAA-3') 또는 #7(서열번호 2: 5′-CAGGCGAAGCTGAGTCAAG-3′)로 HeLa 세포를 형질전환하여 MKRN1이 저해된 세포를 제조하고 배양하였다. 배양 후, 세포를 수득하고 파쇄하여 전세포 추출물(WCL)을 얻은 다음, 면역블럿팅을 수행하였다. 상기 면역블럿팅을 위하여, 1차 항체로서 항-AMPKα1 항체, 항-AMPKβ1 항체, 항-AMPKγ1 항체 또는 항-MKRN1 항체를 사용하였고, 2차 항체로서 항-마우스 IgG 항체를 사용하였다. 세포 추출물 내 단백질의 발현을 비교하기 위한 대조군으로 actin을 대상으로 선정하였다. 정상 대조군(control)로는 siRNA를 형질전환하지 않은 HeLa 세포를 사용하였다.
그 결과, 도 3a에서 나타난 바와 같이 siRNA를 사용하여 MKRN1의 발현을 넉다운한 세포에서 정상 대조군에 비해 AMPKα 서브유닛의 발현 수준이 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다(도 3a).
<1-3>
AMPK
단백질의 분해 및 억제자로서
MKRN1의
역할 확인
MKRN1이 AMPK를 분해함에 있어서 MKRN1의 역할을 보다 구체적으로 확인하였다. 특히, 돌연변이나 전사 후 손상 등에 의해서 생겨난 필수 단백질를 신속하게 분해하는 프로테아좀(proteasome)의 복합체 중, MKRN1이 분해할 기질을 유비퀴틴화(ubiqutination)하는 E3-연결효소(E3 ligase)로서 역할을 할 수 있는지 여부를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <1-2>에서 사용한 HA-MKRN1 벡터를 농도별로 각각 사용하여 HeLa 세포주를 형질전환하고, AMPKα1-FLAG 벡터, AMPKα2-FLAG 벡터, AMPKβ1-FLAG 벡터 또는 AMPKγ1-FLAG 벡터로 추가 형질전환하여 배양하였다. 배양 후, 각각의 세포를 수득하고 파쇄하여 전세포 추출물(WCL)을 얻은 다음, 항-FLAG 항체를 사용하여 면역침강을 수행하였다. 그런 다음, 전세포 추출물 또는 면역침강한 추출물을 시료로 하여 면역블럿팅을 수행하였다. 상기 면역블럿팅을 위하여, 1차 항체로서 항-AMPKα1 항체, 항-AMPKα2 항체, 항-AMPKβ1, 항-AMPKγ1 또는 항-MKRN1 항체를 사용하였고, 2차 항체로서 항-마우스 IgG 항체를 사용하였다. 세포 추출물 내 단백질의 발현을 비교하기 위한 대조군으로 GFP를 대상으로 선정하였다.
그 결과, 도 3b에서 나타난 바와 같이 세포주에서 농도별로 발현한 MKRN1 단백질이 AMPK의 3 가지 도메인 중 α 도메인의 발현 수준을 유의적으로 억제함을 확인하였고, 이를 통해 본 발명의 MKRN1은 AMPKα 단백질의 E3-ligase임을 확인하였다(도 3b).
또한, MKRN1에 의한 AMPKα 단백질의 분해가 세포내 프로테아좀을 통한 전형적인 단백질 분해 과정으 거치는지 확인하기 위해 프로테아좀의 억제제인 MG132를 처리한 환경에서 MKRN1에 의한 AMPKα 단백질 분해 여부를 확인하였다.
구체적으로, HA-MKRN1 벡터 및/또는, AMPKα1-FLAG 벡터 또는 AMPKα2-FLAG 벡터로 HeLa 세포를 형질전환하고, 10 ㎍/㎖ MG132를 포함하는 배양 배지에서 형질전환한 세포를 4 시간 동안 배양하였다. 배양 후, 세포를 수득하고 파쇄하여 전세포 추출물(WCL)을 얻은 다음, 면역블럿팅을 수행하였다. 상기 면역블럿팅을 위하여, 1차 항체로서 항-AMPKα1 항체, 항-AMPKα2 항체 또는 항-MKRN1 항체를 사용하였고, 2차 항체로서 항-마우스 IgG 항체를 사용하였다.
그 결과, 도 3c에서 나타난 바와 같이 MKRN1에 의한 AMPKα 단백질의 분해가 MG132에 의해 차단되는 것을 확인함으로써, MKRN1은 AMPKα 단백질과 특이적으로 결합하여 프로테아좀을 통한 분해로 유도함을 확인하였다(도 3c).
<1-4>
AMPK의
유비퀴틴화를
유도하는 E3-연결효소로서
MKRN1의
역할 확인
MKRN1에 의한 AMPKα 단백질의 프로테아좀 분해를 확인함으로써, MKRN1이 AMPKα 단백질을 "폴리-유비퀴틴화(poly-ubiqutination)"/"프로테아좀"기작을 통해 분해할 수 있음을 예상하고, AMPKα 단백질의 폴리-유비퀴틴화를 통한 분해를 MKRN1이 이끌 수 있는지 확인하였다.
구체적으로, MKRN1 발현 벡터, FLAG-AMPK 벡터 및/또는 HA로 태그된 유비퀴틴(Ub, Ubiquitin)을 발현하기 위한 HA-Ub 벡터로 HeLa세포를 형질전환하고 10 ㎍/㎖ MG132를 포함하는 배양 배지에서 형질전환한 세포를 4 시간 동안 배양하였다. 배양 후, 세포를 수득하고 파쇄하여 전세포 추출물을 얻은 다음, 항-FLAG 항체를 사용하여 면역침강을 수행하였다. 그런 다음, 면역침강한 추출물을 시료로 하여 면역블럿팅을 수행하였다. 상기 면역블럿팅을 위하여, 1차 항체로서 항-HA 항체를 사용하였고, 2차 항체로서 horseradish peroxidase가 결합된 항-마우스 IgG 항체를 사용하였다. 또한, 상기 전세포 추출물(WCL)을 대상으로 면역블럿팅을 수행하여, 세포 내 AMPK 도메인 발현을 함께 확인하였다.
그 결과, 도 4a에서 나타난 바와 같이 MKRN1, Hb 및 AMPK를 모두 발현한 세포의 경우에서 MKRN1을 발현하지 않은 세포보다 AMPKα 단백질에 특이적인 유비퀴틴화가 나타나는 것을 확인하여, MKRN1이 AMPKα 서브유닛에 대하여 유비퀴틴 연결효소로 작용함을 확인하였다(도 4a).
또한, MKRN1이 AMPK을 유비퀴틴화하는 E3-ligase임을 확인하였으므로, 이를 시험관 내(In vitro) 수준에서 다시 한번 확인하였다.
구체적으로, GST-MKRN1(WT) 또는 GST-MKRN1의 H307E 변이체를 발현하는 발현 벡터 및/또는 GST-AMPKα1을 발현하는 벡터를 대장균에 형질전환하고, 세포를 배양하였다. 배양 후, 세포를 수득하고 파쇄하여 전세포 추출물을 얻은 다음, 글루타치온-세파로즈(glutathione-sepharose)를 이용하여 GST가 결합된 단백질을 분리하였다. 분리한 단백질은 250 ng의 E2(UbcH5c, E2-627, Boston Biochem) 및 5μg의 유비퀴틴(U-100H, Boston Biochem)과 함께 20 ㎕의 반응 버퍼(40mM Tris, 50mM NaCl, 5mM MgCl2, 2mM ATP, 1mM dithiothreitol, pH 7.6)에 첨가하여 37 ℃에서 3 시간 동안 반응을 유도하였다. 반응 종료 후, 단백질 용액을 사용하여 면역블럿팅을 수행하였다. 상기 면역블럿팅을 위하여, 1차 항체로서 항-AMPKα1 항체 또는 항-AMPKα2 항체를 사용하였고, 2차 항체로서 horseradish peroxidase가 결합된 항-마우스 IgG 항체를 사용하였다.
그 결과, 도 4b 및 3c에서 나타난 바와 같이 MKRN1이 AMPKα 단백질의 E3-ligase로 작용할 수 있음을 확인하였다(도 4b 및 도 4c).
추가로, 세포 내부의(endogenous) AMPK 단백질의 유비퀴틴화에 MKRN1이 어느 정도 작용하는지 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <1-1>에서 제조한 siRNA로 MKRN1이 저해된 세포를 10 ㎍/㎖ MG132를 포함하는 배양 배지에 접종하여 4 시간 동안 배양하였다. 배양 후, 세포를 수득하고 파쇄하여 전세포 추출물을 얻은 다음, 면역블럿팅을 수행하였다. 상기 면역블럿팅을 위하여, 1차 항체로서 항-Ub 항체를 사용하였고, 2차 항체로서 horseradish peroxidase가 결합된 항-마우스 IgG 항체를 사용하였다. 또한, 상기 전세포 추출물(WCL)을 대상으로 면역블럿팅을 수행하여, 세포 내 AMPK 도메인 발현을 함께 확인하였다.
그 결과, 도 4d에서 나타난 바와 같이 AMPK의 폴리-유비퀴틴화가 MKRN1이 없는 경우에서는 거의 나타나지 못하는 것을 확인하여, 이를 통해 MKRN1이 AMPKα 서브유닛의 강력한 E3-ligase로서 작용하는 것을 확인하였다(도 4d).
<1-5>
AMPK
신호전달에 대한 억제자로서
MKRN1의
역할 확인
MKRN1이 AMPK 신호전달에 미치는 영향을 확인하기 위해, MKRN1 넉아웃 마우스 유래의 세포 및 MKRN1 넉다운 세포주에서 AMPK 단백질의 발현 수준 및 활성을 확인하였다.
구체적으로, MKRN1의 발현을 억제하기 위한 MKRN1 siRNA #6 또는 #7로 마우스 배아 유래의 섬유아세포주(Mouse embryonic fibroblast, MEF), HepG2 또는 Hep3B 세포주를 형질전환하여 MKRN1이 저해된 세포를 제조하고 배양하였다. 배양 후, 세포를 수득하고 파쇄하여 전세포 추출물(WCL)을 얻은 다음, 면역블럿팅을 수행하였다. 상기 면역블럿팅을 위하여, 1차 항체로서 항-AMPKα 항체, 항-pAMPKα 항체, 항-ACC 항체, 항-pACC 항체 또는 항-MKRN1 항체를 사용하였고, 2차 항체로서 항-마우스 IgG 항체를 사용하였다. 세포 추출물 내 단백질의 발현을 비교하기 위한 대조군으로 actin을 대상으로 선정하였다. 정상 대조군(control)로는 siRNA를 형질전환하지 않은 MEF, HepG2 또는 Hep3B 세포를 사용하였다.
그 결과, 도 5a에서 나타난 바와 같이 넉아웃 또는 넉다운을 통하여 MKRN1 발현을 억제하는 경우 AMPK 단백질의 발현 수준이 유의적으로 증가하는 것을 확인하였고, 이에 따라 인산화된 AMPK(phospho-AMPK)의 수준이 함께 증가하는 것을 확인하였다(도 5a). 또한, AMPK에 의해 조절되는 신호 경로의 하위 분자인 ACC(Acetyl-CoA carboxylase)의 발현 및 인산화 수준도 증가하는 것을 확인하여, 이를 통해 MKRN1의 억제 만으로도 세포 내 AMPK 신호 경로의 활성화가 가능한 것으로 확인하였다(도 5a).
<1-6>
MKRN1
발현 억제에 따른 해당과정 조절 효과 확인
기존 다양한 보고를 통해 세포 내 AMPK 신호 경로의 활성화를 통해 당 대사 및 지질 대사를 조절하고, 결과적으로 세포의 에너지 대사를 조절할 수 있음 알려져 있다. 자세히는, AMPK 신호 경로의 활성을 통해 다양한 하위 경로 분자의 인산화를 통해 당, 지질의 소비 및 분해를 촉진하고, 세포 내에서 당과 지질로부터 글리코겐 또는 지방으로의 축적을 억제할 수 있음이 알려져 있다. 이에 따라, MKRN1이 이와 같은 에너지 대사에 어떤 영향을 미치는지 확인하기 위해 세포의 당 흡수(glucose uptake) 정도 및 젖산(lactate) 분비 정도를 확인하여, MKRN1이 해당과정(glycolysis) 조절 작용에 미치는 영향을 확인하였다.
구체적으로, MKRN1의 발현을 억제하기 위한 MKRN1 siRNA #6 또는 #7 및 siAMPKα로 Hep2G 세포를 형질전환하여 MKRN1이 저해된 세포를 제조하고 10 mg 포도당을 포함하는 배지에서 배양하였다. 배양 후, 세포를 수득하여 계수하고, 배지 내 포도당 및 젖산(Lactate)의 농도를 정량하여, 세포의 포도당 흡수 및 젖산 분비 수준을 정상 대조군과 비교하였다. 또한, 수득한 세포를 파쇄하여 전세포 추출물(WCL)을 얻은 다음, 면역블럿팅을 수행하였다. 상기 면역블럿팅을 위하여, 1차 항체로서 항-AMPKα1 항체 또는 항-AMPKα2 항체를 사용하였고, 2차 항체로서 항-마우스 IgG 항체를 사용하였다. 세포 추출물 내 단백질의 발현을 비교하기 위한 대조군으로 actin을 대상으로 선정하였다.
그 결과, 도 5b에서 나타난 바와 같이 MKRN1 KO 세포에서 해당과정의 활성이 증가하여 정상 대조군에 비해 배지 내 잔존 포도당 농도 및 배지로 분비되는 젖산의 농도가 유의적으로 감소하는 것을 확인하였고, 이를 MKRN1의 억제시 활성화된 AMPK에 의한 조절로 인한 결과임을 확인하였다(도 5b).
또한, 이를 확인하기 위해 MKRN1 KO 세포에서 AMPKα 단백질을 넉다운하여 AMPK의 활성을 억제한 후 당 대사를 확인하였을 때, MKRN1 넉아웃으로 증가되었던 포도당 흡수 및 젖산 분비 능력 모두가 다시 감소하는 것을 확인하였다(도 5b). 이를 통해, MKRN1이 세포의 에너지 대사를 조절할 수 있는 새로운 인자이며, 이는 AMPK의 E3-ligase로서 AMPK를 분해하는 기작을 통해 이루어질 수 있음을 확인하였다.
MKRN1
넉아웃
마우스에서 비만 억제 효과의 확인
<2-1> 고지방
식이에
의한 비만에
MKRN1
억제가 미치는 영향 확인
MKRN1이 대사질환에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 먼저 고지방 식이(high fat dieted, HFD)를 통한 비만 마우스 모델에서 MKRN1 억제를 통해 비만 억제 효과를 나타낼 수 있는지 여부를 확인하였다.
구체적으로, MKRN1+/+ (WT)의 C57/BL6 마우스 및 MKRN1-/- (KO)의 C57/BL6 마우스를 제작하고, 6 주령부터 고지방(60%) 사료를 자유 급여하여 16 주 동안 동일한 환경에서 사육하면서 MKRN1+/+ (WT) 비만 마우스 모델군 및 MKRN1-/- (KO) 비만 마우스 모델군을 제작하였다. 고지방 사료 급여 개시일로부터 마우스 모델군의 체중 및 1일 평균 급여량을 확인하였다. 또한, 사육 개시 16 주 후, 마우스 모델군으로부터 혈액을 수득하여 혈중 렙틴 농도를 확인하였다.
그 결과, 도 6에서 나타난 바와 같이 MKRN1+/+(WT) 비만 마우스군 및 MKRN1-/-(KO) 비만에서 식이량에는 유의적인 차이를 나타내지 않았고(도 6c), 먹이 섭취를 조절하는 인자인 렙틴의 혈중 농도 또한 유의적인 차이를 나타내지 않았으나(도 6d), MKRN1+/+(WT) 비만 마우스군에서는 HFD로 유도된 비만으로 증가하는 반면, 이에 비해 MKRN1-/-(KO) 비만 마우스군에서는 비만으로 증가되는 무게 및 지방량이 크게 완화되는 것을 확인하였다(도 6a 및 도 6b). 이를 통해, MKRN1 넉아웃으로 활성화된 AMPK 신호 경로에 의해 HFD로 유도된 비만의 억제가 효과적으로 나타나는 것을 확인하였다.
<2-2> 고지방
식이에
의한 지방조직 및 지방에
MKRN1
억제가 미치는 영향 확인
MKRN1의 억제는 HFD로 인한 비만 마우스 모델에서 식이량에는 유의적인 차이가 없었으나 체중의 감소 효과를 나타냄을 확인하였으므로, HFD를 통한 비만 및 지방조직의 변화를 확인하여 MKRN1의 역할을 보다 구체적으로 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <2-1>에서 제작한 MKRN1+/+ (WT) 비만 마우스 모델군 및 MKRN1-/- (KO) 비만 마우스 모델군의 16 주 동안의 사육이 종료된 후, 각각의 마우스 모델군에 대하여 micro CT 촬영하여 체내 지방 조직을 확인하였다. 또한, 상기 각각의 마우스 모델군을 희생하여 지방 조직을 수득하고, 지방조직의 무게 및 면적을 측정하였다. 또한, 희생한 마우스 모델군의 지방 조직으로부터 갈색 지방 조직(brown adipose tissue, BAT)의 여부를 관찰하고 이를 H&E 염색하여 관찰하였다. 아울러, 희생한 마우스 모델군의 혈액 시료 내 트리글리세라이드 농도, 총 콜레스테롤 농도 및 LDL 콜레스테롤의 농도를 분석하여 이를 비교하였다.
그 결과, 도 7에서 나타난 바와 같이, MKRN1-/-(KO) 비만 마우스군에서 지방 조직의 크기가 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 7a 내지 6c). 또한, BAT의 경우 갈색을 진하게 보일수록 열소모를 통해 지방을 태우는 역할을 잘 할 수 있는 것으로 알려져 있는데, HFD시 BAT에 지방이 축적되어 크기가 커지고 갈색이 옅어지며 비만으로 가는 현상을 보이나, 갈색 지방 조직(BAT)을 관찰하였을 때 MKRN1 KO 마우스군의 경우 BAT의 지방 축적이 저해되고 갈색이 잘 유지되어 MKRN1-/- (KO) 마우스가 HFD에 의한 비만에 큰 저항성을 가지는 것을 확인하였다(도 7d).
뿐만 아니라, 비만 마우스 모델의 지방조직에서 MKRN1 KO로 인해 MKRN1 정상 발현의 비만 마우스에 비해 AMPK의 단백질 수준 및 인산화 수준이 유의적으로 증가하는 것을 확인하였으며(도 7e), MKRN-/- (KO) 마우스에서 혈중 내 중성 지방 및 콜레스테롤 수치를 유의적으로 감소시킬 수 있음을 확인하여, 2차적인 대사질환을 예방할 수 있는 효과를 가져올 수 있음을 확인하였다(도 7f).
MKRN1
넉아웃
마우스에서 당뇨 개선 효과의 확인
MKRN1이 대사질환에 미치는 영향을 확인하기 위하여, HFD를 통한 제 2형 당뇨병(insulin 저항성 획득) 모델에서 MKRN1 억제를 통해 당뇨 개선 효과를 나타낼 수 있는지 여부를 확인하였다.
구체적으로, MKRN1+/+ (WT)의 C57/BL6 마우스 및 MKRN1-/- (KO)의 C57/BL6 마우스를 제작하고, 6 주령부터 고지방(60%) 사료를 자유 급여하여 16 주 동안 동일한 환경에서 사육하면서 MKRN1+/+ (WT) 당뇨 마우스 모델군 및 MKRN1-/- (KO) 당뇨 마우스 모델군을 제작하였다. 사육 개시 16 주 후, 각각의 당뇨 마우스 모델군으로부터 혈액을 수득하여 혈당을 측정하였다. 또한, 각각의 당뇨 마우스 모델군을 16 시간 동안 금식(fasting)시키면서, 금식 개시 0, 15, 30, 60 및 120 분에 혈당을 측정하여 GTT(glucose tolerance test)를 수행하였다.
그 결과, 도 8에서 나타난 바와 같이, MKRN1+/+(WT) 당뇨 마우스군에 비해 MKRN1-/-(KO) 당뇨 마우스군에서 HFD로 유도되는 고인슐린혈증(hyper-insulinemia)가 유의적으로 완화되는 것을 확인하였다(도 8a). 또한, MKRN1+/+(WT) 당뇨 마우스군에 비해 MKRN1-/-(KO) 당뇨 마우스군에서 당뇨 질환이 유의적으로 완화되는 것을 확인하였다(도 8b). 이를 통해, MKRN1의 AMPK 신호 전달 조절이 대표적인 대사질환에 큰 영향을 미칠 수 있음을 확인하였다.
MKRN1
넉아웃
마우스에서 지방간 개선 효과의 확인
<4-1> 지방간에
MKRN1이
미치는 영향의 확인
MKRN1이 대사질환에 미치는 영향을 확인하기 위하여, HFD를 통한 지방간 모델에서 MKRN1 억제를 통해 지방간 개선 효과를 나타낼 수 있는지 여부를 확인하였다.
구체적으로, MKRN1+/+ (WT)의 C57/BL6 마우스 및 MKRN1-/- (KO)의 C57/BL6 마우스를 제작하고, 6 주령부터 고지방(60%) 사료를 자유 급여하여 16 주 동안 동일한 환경에서 사육하면서 MKRN1+/+ (WT) 지방간 마우스 모델군 및 MKRN1-/- (KO) 지방간 마우스 모델군을 제작하였다. 사육 개시 16 주 후, 각각의 당뇨 마우스 모델군을 희생하여 간 조직을 수득하고 크기 및 무게를 측정하였다. 또한, 간 조직의 간세포 내 지방 축적을 확인한 다음, 간 조직을 가수분해하여 간 가수분해물(liver lysate) 시료를 수득하였다. 간 가수분해물 시료 내 총 콜레스테롤 수준을 확인하였고, 이를 웨스턴블럿하여 AMPKα 발현 및 인산화 수준을 확인하였다. 아울러, 간 가수분해물 시료를 사용하여 간기능 검사 AST 및 ALT를 수행하였다.
그 결과, 도 9에서 나타난 바와 같이 MKRN1+/+(WT) 지방간 마우스군에서 수득한 간은 크기 및 무게가 증가하고, 간에 지방이 축적되면서 일반적인 간의 색보다 옅고 하얀색을 띄는, 전형적인 지방간의 표현형을 나타내는 것을 확인하였다. 이에 비해, MKRN1-/-(KO) 지방간 마우스군으로부터 수득한 간은 간의 크기가 현저하게 작아지고 무게 역시 정상 수준으로 회복되는 것을 확인하였고, 간의 색 역시 건강한 상태의 색을 유지하고 있어, MKRN1 KO가 HFD에 의한 지방간을 억제할 수 있음을 확인하였다(도 9a).
또한, 조직학적으로 H&E 염색을 통해 확인한 결과 MKRN1+/+(WT) 지방간 마우스군에 비해 MKRN1-/-(KO) 지방간 마우스군의 간세포 내에는 지방의 축적이 감소되었고(도 9b), 중성 지방의 농도 역시 감소하는 것을 확인하였으며(도 9c), AMPK 단백질의 발현 및 인산화 수준이 증가되는 것을 확인하여(도 9d), 이를 통해 MKRN1 KO가 지방간을 강력하게 저해할 수 있음을 확인하였다.
뿐만 아니라, 지방간이 오래 지속되면 간의 기능저하로 인한 간 손상이 동반될 수 있어 AST 및 ALT 간 기능 검사를 수행한 결과, MKRN1-/-(KO) 지방간 마우스군에서 지방간이 억제된 결과로 지방간을 통한 간손상 역시 유의적으로 완화되는 것을 확인하여(도 9e 및 도 9f), MKRN1의 억제가 AMPK의 활성을 유도하고 고지방 식이에 의한 지방간을 크게 억제함을 확인하였다.
<4-2> 간세포(
hepatocyte
)에서
MKRN1
KO가
AMPK
신호 경로에 미치는 영향의 확인
MKRN1-/-(KO) 지방간 마우스군의 간세포에서 AMPK 신호 경로의 활성화가 나타나고 이를 통해 에너지 대사가 조절되고 있는지 확인하기 위해, AMPK 신호 전달의 타겟 유전자로서 알려진 유전자군의 발현 정도를 측정하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <4-1>에서 수행한 바와 같이, 지방군 마우스 모델을 제조하고 이로부터 분리한 간 조직을 가수분해하여 간 가수분해물 시료를 제조하였다. 그런 다음, 이로부터 세포 내 전체 mRNA를 분리추출한 후 역전사 PCR(RT-PCR)로 cDNA를 합성하였다. 그런 다음, 합성한 cDNA 시료를 주형으로 하고 AMPK 신호 전달의 타겟 유전자인 SREBP1, chREBP, ACC1, ACC2, FASN, SCD1, PPARα, FADS1, FADS2, HMGCR, PGC1α, PEPCK, G6Pase 또는 TNF의 유전자를 증폭하기 위한 각각의 프라이머를 사용하여 real-time PCR을 수행하여 상기 타겟 유전자의 발현 수준을 정량하였다. 정량한 유전자의 발현 수준은 MKRN1+/+(WT) 지방간 마우스군에서의 유전자 발현 수준을 기준으로 하여 상대적인 발현 수준으로서 나타내었다.
그 결과, 도 10에서 나타난 바와 같이 MKRN1-/-(KO) 지방간 마우스군의 간세포 내에서 AMPK 활성에 의해 저해되는 것으로 알려진 지방 합성의 관련 조절자인 SREBP1c 및 chREBP의 유전자 발현 수준이 감소하였으며, AMPK 활성에 의해 저해되는 당대사 조절 물질인 PGC1 alpha, PEPCK 및 G6Pase의 유전자 발현 수준 역시 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 10). 이를 통해, MKRN1 KO가 AMPK의 활성을 이끌어 지방 합성을 저해하고, 당뇨 및 지방간의 형성을 억제함을 확인하였다.
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation. Yonsei University
<120> Pharmaceutical composition for metabolic disease comprising
expression or activity inhibitor of MKRN1 as an active ingredient
<130> 1060555
<160> 2
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MKRN1 siRNA #6
<400> 1
cgggatcctc tccaactgca a 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MKRN1 siRNA #7
<400> 2
caggcgaagc tgagtcaag 19
Claims (8)
- MKRN1의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는, 대사성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물로서,
상기 MKRN1의 발현 또는 활성 억제제는 MKRN1을 암호화하는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 뉴클레오티드(antisense nucleotide), siRNA 및 shRNA로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이고,
상기 대사성 질환은 비만, 제2형 당뇨, 이상지질혈증, 인슐린저항성, 간지방증(hepatic steatosis) 및 비알콜성 지방간(fatty liver)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 대사성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
- 삭제
- 제 1항에 있어서, 상기 MKRN1의 발현 또는 활성 억제제는 AMPK의 발현 및 활성을 증진시키는 것을 특징으로 하는, 대사성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
- 삭제
- MKRN1의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는, 대사성 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품으로서,
상기 MKRN1의 발현 또는 활성 억제제는 MKRN1을 암호화하는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 뉴클레오티드(antisense nucleotide), siRNA 및 shRNA로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이고,
상기 대사성 질환은 비만, 제2형 당뇨, 이상지질혈증, 인슐린저항성, 간지방증(hepatic steatosis) 및 비알콜성 지방간(fatty liver)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 대사성 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품.
- 삭제
- 제 5항에 있어서, 상기 MKRN1의 발현 또는 활성 억제제는 AMPK의 발현 및 활성을 증진시키는 것을 특징으로 하는, 대사성 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품.
- 삭제
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