JP5799082B2

JP5799082B2 - 眞黄精又は黄精抽出物の新規な用途

Info

Publication number: JP5799082B2
Application number: JP2013503700A
Authority: JP
Inventors: ヒョクサンクォン，; ジョンヒコ，; ジョンスヨー，; ジョンミンユン，; ヒョンスチャン，; スンウイェン，; ジェフンカン，
Original assignee: イルドンファームカンパニーリミテッド
Priority date: 2010-04-09
Filing date: 2011-04-08
Publication date: 2015-10-21
Anticipated expiration: 2031-04-08
Also published as: WO2011126342A3; KR101018531B1; JP2013523810A; WO2011126342A2; CN102844042A

Description

本出願は2010年04月09日付で出願された大韓民国特許出願第10-2010-0032921号及び2010年10月01日付で出願された大韓民国特許出願第10-2010-0095987号を優先権として主張し、前記明細書全体は本発明の参考文献である。

本発明は眞黄精（Polygonoatum falcatum)又は黄精（Polygonoatum sibiricum）抽出物の新規な用途に関するものにして、さらに、詳しくは細胞内SIRT1蛋白質を高い水準に維持させ、体重、腹部脂肪及び糖耐性度を減少させる眞黄精又は黄精を有効成分として含む肥満、肥満合併症又は代謝症候群の予防及び治療用薬学的又は食品組成物、前記抽出物の肥満、肥満合併症又は代謝症候群の予防及び治療用途及び治療方法に関する。

肥満は代表的な成人型代謝性疾患であって、医学発達と生活水準の向上による平均寿命の延長と都市中心の生活人口増加による運動量減少により、その比率が大きく増加している。因みに高血圧、脂質代謝異常及びインシュリン抵抗性増加による高血糖症が急増する趨勢にあって、これにより第２型糖尿病及びこれの合併症、動脈硬化による心筋梗塞、脳卒中等の致命的疾患を有する患者数が増加する傾向にある。

代謝症候群は各種の心血管疾患と第２型糖尿病の危険要因等が互いに群集をなす現象を一つの疾患群に概念化させたものである。インシュリン抵抗性及びこれと関連した複雑で多様な多くの代謝異常と臨床の様相を全て包括して説明できる有用な概念である。代謝症候群を有する場合、心血管疾患又は第２型糖尿病の発病危険度が増加する。この症状は古くから知られてきたが、1988年Reavenはこのような症状らの共通的な原因が体内のインシュリン作用がスムーズでないインシュリン抵抗性であることを主張し、エックス（Ｘ）症候群、インシュリン抵抗性症候群と命名した。1998年世界保健機構はインシュリン抵抗性がこの症状等の全ての要素を全部説明できるとの確証がないので“インシュリン抵抗性症候群”と言う用語の代わりに“代謝症候群”と呼称することにした。

代謝症候群の原因は体内にインシュリンがあっても、抵抗性によって高血糖は改善されないまま、インシュリン濃度だけが高くなることにある。血糖を下げるために過量分泌されたインシュリンが血糖を正常に調節しきれず、かえって血管細胞増殖を誘導して血管壁を厚くするか、又は腎臓からナトリウムの再吸収を促進して血圧を高めるか、又は脂肪分解を促進して血液内の中性脂肪を高めると同時に高密度コレステロール(HDL-cholesterol)を下げて、同時に内臓に脂肪成分の貯蔵を促進させる等の総体的な作用により発病するようになり、血糖代謝異常による糖尿病、脂質代謝異常による中性脂肪増加、高密度コレステロール、ナトリウム成分増加による高血圧、尿酸増加による通風等がこれに属する。このようなインシュリン抵抗性が生ずる理由は未だに確実に究明されてはいないが、影響を及ぼす最も大きい因子には腹部肥満であることが知られており、過度なストレスと老化もその原因として知られている。さらに、過去にはインシュリン抵抗性を代謝症候群の単一病因として考えてきたが、最近ではインシュリン抵抗性以外に肥満と脂肪細胞の障碍、さらに、代謝症候群の各因子等の複合的な作用を追加して３種の主要病因として推定している。

代謝症候群の判定は下記のような基準による。2001年に公表された米国NCEP(NationalCholesterol Education Program)の基準によれば、腰回りが男性40インチ(102cm)、女性35インチ(88cm)以上の腹部肥満、中性脂肪(triglycerides)150mg/dL以上、HDLコレステロールが男性40mg/dL、女性50mg/dL以下、血圧130/85mmHg以上、空腹血糖(fasting glucose)が110mg/dL以上等の５種の危険因子の内、一人の患者が３つ以上を示す場合、代謝症候群として判定するようになる。東洋人の場合、腰回りが男性90cm、女性80cm以上の場合、腹部肥満に多少調整されていて、この規定を適用すると韓国人は全体人口の25%程度が代謝症候群症状を示すとの最近の研究報告もある。

代謝症候群は人口の高齢化と環境変化によって発病率と罹病率が急増しており、これに伴う死亡率も極めて高いばかりでなく、合併症発病率も極めて高く経済的、社会的に莫大な損失を引き起こしているが、現在使用されている薬剤は大部分が効能も低く、長期服用の際副作用の発生率が高く、生そのものの質向上の面でも治療薬剤の開発が急を要する実情である。

現在、米国、ヨーロッパ及び日本を含む西欧での肥満人口は３億名以上と推算され、開発途上国でも年間約１％以上増加していて、全世界的で肥満人口の比率が高まりつつある趨勢である。世界保健機構（ＷＨＯ）すらも“治療が必要な疾病”に定義している肥満は、米国の場合、喫煙に次いで間接的な死亡原因の２位を占めており、これにより毎年1,100億ドル以上の費用が支出され、経済的負担が高く社会的にも深刻性が極めて大きくなりつつある。

肥満治療剤と関連された全世界の特許出願は1999年以降2004年まで増加勢を示し、特に、米国の場合、この時期に急激に増加する趨勢であったが、2005年を基点に漸次減少の傾向を示しているが、これは実質的な肥満治療剤の開発が可視化されていないのと関連がある。肥満関連特許の約90%が食欲抑制、食餌調節及び脂肪の代謝と関連したものではあるが、最近に至って脂肪増殖の調節及びエネルギー代謝と関連した特許の占有率が漸次増加する傾向で、これはゼニカルやリダクチルのような既存の肥満治療剤の限界と、これを改善するための新たなメカニズムの肥満治療剤開発の必要性が認められ始めたからである。

SIRT1は酵母から寿命延長効果を誘導するものとして知られたSirtuins(Sir2-related enzymes)蛋白質の哺乳類同族体(〜110kD)でＮＡＤ+をcofactorで要求するclass・のヒストン脱アセチル酵素(histone deacetylase)類に属する。今まで動物から発見されたSirtuinsではSIRT1からSIRT7まで総７種があり、これらは作用する位置と機能から互いに差があり、この内でSIRT1は核で活性化され代謝、炎症反応及び退行性脳疾患と関連した多様な基質の活性を調節する。

食餌制限の際、生体内の肝、脂肪、膵臓等多様な組織からSIRT1の発現及び活性が増加すると、PPARγ、FOXO1等のtranscription factorとUCP1、UCP2、UCP3、等のミトコンドリア(Mitochondria)のエネルギー代謝に関連した蛋白質等の直接的な脱アセチル化、又はp300、NcoR、PGC1α等、補助調節子(coreguiator)の脱アセチル化による間接的な活性調節で肝では当該作用を阻止し脂肪組織では、脂肪の蓄積を減少させ、膵臓ではインシュリン感受性を増加させるばかりでなく、筋肉組織からエネルギー代謝を増進させることによる体重減少を引き起こすことになる。

肥満人口が急増する現状況で治療剤の需要が減少する現象が起こっており、これは既存の薬剤に対する副作用と効能に対する不満であることを勘案するに、これを克服できる新たなメカニズムの肥満治療剤開発が切実な状況である。

従って、生体内で小食などの食餌制限によるSIRT1の発現及び活性増加を代替できる薬剤を開発すれば新規な肥満、肥満合併症治療剤に活用が可能である。

本発明者等はSIRT1の活性を増加させる天然物質に対して研究を重ねていく内に、本発明の眞黄精又は黄精抽出物がSIRT1の活性を増加させ、肥満と肥満合併症又は代謝症候群に効果があることを見出し本発明を完成した。

従って、本発明の目的は眞黄精又は黄精であるアマドコロ（甘野老）属植物抽出物の新規な用途を提供することである。

前記の目的を達成するために、本発明は眞黄精又は黄精抽出物を有効成分として含有する肥満、肥満合併症及び代謝症候群からなる群より選ばれた一つ以上の疾患の予防及び治療用薬学的組成物を提供する。

本発明の他の目的を達成するために、本発明は眞黄精又は黄精抽出物を有効成分として含有する肥満、肥満合併症及び代謝症候群からなる群より選ばれた一つ以上の疾患の予防及び緩和用食品組成物を提供する。

本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は肥満、肥満合併症及び代謝症候群からなる群より選ばれた一つ以上の疾患の予防及び治療用製剤を製造するための眞黄精又は黄精であるアマドコロ属植物抽出物の用途を提供する。

本発明のさらに、他の目的を達成するために、本発明は眞黄精又は黄精であるアマドコロ属植物の抽出物をこれを必要とする個体に有効量で投与することを特徴とする肥満、肥満合併症及び代謝症候群からなる群より選ばれた一つ以上の疾患の予防及び治療方法を提供する。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明の組成物は眞黄精又は黄精の抽出物を有効成分として含み、肥満、肥満合併症及び代謝症候群からなる群より選ばれた一つ以上の疾患の予防及び治療の目的に使用できる。

特に、本発明の組成物は眞黄精(Polygonatum falcatum)又は黄精(Polygonatum sibiricum)の抽出物、より好ましくは眞黄精又は黄精の根茎部位の抽出物を有効成分にすることができる。本発明で黄精に記載したポリゴナチゥムシビリクム(Polygonatum sibiricum)は黄精(Polygonatum sibiricum Delar)、鳴子ユリ(Polygonatum sibiricum Redout)又は黄精(Polygonatum sibiricum Redt)とも呼称され、本発明の黄精はこれら全てを含む。一方、本発明の抽出物は黄精抽出物でもある。本発明での黄精は眞黄精又は黄精の根茎部分に該当するもので、より好ましくは本発明での黄精は眞黄精と呼称される眞黄精(Polygonatum falcatum)の根茎に該当するものである。

本発明の眞黄精又は黄精の抽出物は公知の溶媒抽出法により抽出できる。例えば、眞黄精又は黄精から水、エタノール、酒精、メタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノールのような炭素数１乃至６個のアルコール、アセトン、エーテル、クロロホルム、エチルアセテート、メチレンクロライド、ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル、ジエチルエーテル、ベンゼンのような有機溶媒の中で選ばれた、いずれか一つ又はこれらの混合溶媒を利用して抽出できる。好ましくはエタノール、酒精、アセトン、エチルアセテート又はメチレンクロライドからなる群より選ばれた一つ以上の溶媒を使用するか、又はこれら溶媒をその他の公知された溶媒と混合して抽出したものでもある。

本発明の眞黄精又は黄精抽出物は溶媒抽出法により、抽出された抽出物をそのまま使用することができ、又は不純物を除去して活性成分の濃度を高めるために、公知の方法で分画することができる。分画の効率のために抽出物を減圧濃縮することができ、分画のための溶媒には水、エタノール、酒精及びメタノールのような炭素数１乃至６個のアルコール、エチルアセテート、メチレンクロライド、ジクロロメタン、クロロホルム、ｎ−ヘキサン（ｎ−Hexane）、ジエチルエーテル、アセトン、ベンゼンのような有機溶媒の中で選ばれた、いずれか一つ又はこれらの混合溶媒を使用することができ、好ましくは水、ｎ−ブタノール、エタノール及びエチルアセテートの中から選ばれたいずれか一つ又はこれらの混合溶媒で分画することができる。分画物はそのまま使用されるか又は再分画することができて、再分画する場合、好ましくはエチルアセテートを使用することができる。特に、抽出工程をより経済的に行うためには、単一又は混合溶媒で１回抽出することが好ましいが、水、エタノール、酒精及びメタノールのような炭素数１乃至６個のアルコール、エチルアセテート、メチレンクロライド、ジクロロメタン、クロロホルム、ｎ−ヘキサン、ジエチルエーテル、アセトン、ベンゼンのような有機溶媒の中で選ばれたいずれか一つ又はこれらの混合溶媒を使用するのが好ましい。さらに、好ましくは、エタノール、酒精、アセトン、エチルアセテート及びメチレンクロライドを使用することができる。特に、酒精を抽出溶媒に使用する際、抽出物の分離過程を短縮することができて最も好ましい。

本発明の一実施例では10gのそれぞれの試料を細切した後、30mlの100%メタノールに浸漬して常温で24時間ずつ３回繰返し抽出した抽出溶媒を、ろ過装置でろ過して減圧装置でメタノールを除去してメタノール抽出液を収得した。前記過程により収得したメタノール抽出物にエチルアセテートと水をそれぞれ20mlずつ添加して混合した後、上層を濃縮してエチルアセテート抽出物を収得した。製造された分画物のSIRT1の発現増加効能を測定した結果、本発明のエチルアセテート分画物からSIRT1の発現が高く示されることを確認した（実施例１参照）。本発明のさらに他の一実施例では各試料を80%エタノールに直接浸漬して抽出した抽出溶液からも高いSIRT1の発現を確認した（実施例５参照）。

本発明の組成物は肥満、肥満合併症又は代謝症候群を予防及び治療する効能が優れている。

肥満は過多な体脂肪を有する状態を意味する。肥満合併症は長期間の肥満状態の結果から表われる代謝症候群を示し、代謝症候群は高中性脂肪血症、高コレステロール血症、高血圧、糖代謝異常、血液凝固異常及び肥満のような危険因子が共に表われる症候群を意味する。

本発明のこのような効能は生体内、生体外の実験を通じて立証された。

一方、本発明の組成物は生体内SIRT1の水準を増加させる効能がある。SIRT1は酵母から寿命延長効果を誘導するものとして知られたSirtuins(Sir2-related enzymes)蛋白質の哺乳動物同族体(〜110kD)でＮＡＤ+を補助因子として要求するclass・のヒストン脱アセチル酵素類に属する。

本発明の一実施例では本発明の組成物によるSIRT1の水準増加効能を生体内実験を通じて確認した。本発明の組成物を投与したマウスと対照群マウス等から筋肉、肝及び脂肪細胞よりSIRT1蛋白質の量を測定した結果、脂肪と筋肉でSIRT1の量を増加させることを確認した（実施例２参照）。

さらに、本発明の一実施例ではマウスに高脂肪肥満飼料を与えて肥満モデルを作製して本発明の組成物を投与した後、体重と腹部脂肪の変化を観察した。その結果、本発明の組成物を投与した群は肥満飼料のみを投与した群に比べて飼料摂取量では差がなかったにも拘らず体重が減少し、腹部脂肪の大きさも減少して脂肪の量も減少したことを確認した。さらに、インシュリン抵抗性による糖耐性度、血中総コレステロール、中性脂肪、遊離脂肪酸数値と組織内代謝症候群と関連した指標を測定した。その結果、本発明の組成物により糖耐性度が最高60%以上改善され（実施例６参照）、コレステロール、中性脂肪と遊離脂肪酸の場合、それぞれ最高27.8、27.0、38.2%以上減少したことを確認した（実施例３参照）。

本発明の組成物は肥満、肥満合併症及び代謝症候群の予防及び治療に卓越な効能があることを確認した。

本発明の組成物は上述したような効能を示すばかりでなく、生薬抽出物を有効成分として含有していることから人体に対する副作用が化学的合成医薬より極めて少ない。

従って、本発明の眞黄精又は黄精抽出物は脂肪細胞の分化を阻害して、SIRT1を高い水準に維持し、高脂肪食が肥満誘導マウスから腹部脂肪を減少させ、体重を顕著に減少させ、肥満、肥満合併症又は代謝症候群を予防及び治療する効果のあることが分かる。

従って、本発明は眞黄精又は黄精抽出物を有効成分として含有する肥満、肥満合併症又は代謝症候群の予防及び治療用薬学的組成物を提供する。

本発明に伴う薬学的組成物は薬学的に有効な量の眞黄精又は黄精抽出物を、単独で含むか又は一つ以上の薬学的に許容される担体を追加して含み得る。本発明の薬学的組成物は単一投与量で患者に投与することができ、多重投与量が長期間投与される分割治療方法により投与することもできる。前記にて薬学的に有効な量とは、陰性対照群に比べてそれ以上の反応を示す量を意味し、好ましくは肥満を治療又は予防するに十分な量を意味する。本発明に伴う眞黄精又は黄精抽出物の有効な量では、0.001乃至1000mg/day/kg体重であり、これに限定されるものではない。しかしながら、前記薬学的に有効な量は疾患及びこれの重症度、患者の年齢、体重、健康状態、性別、投与経路及び治療期間等のような多くの因子により適切に変化できる。

本発明の組成物は前記薬学的に許容される担体と共に当業界に公知の方法で、投与経路により多様に剤形化できる。投与経路はこれに限定はされないが、経口的又は非経口的に投与できる。非経口的投与経路には例えば、経皮、鼻腔、腹腔、筋肉、皮下又は静脈等の多くの経路が含まれる。

本発明の薬学的組成物を経口投与する場合、本発明の薬学的組成物は適合した経口投与用担体と共に、当業界に公知の方法により粉末、顆粒、錠剤、丸剤、糖衣錠剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、懸濁液、ウェハー等の形態で剤形化できる。適合した担体の例には、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール及びマルチトール等を含む糖類と、トウモロコシ澱粉、小麦澱粉、米澱粉及び馬鈴薯澱粉等を含む澱粉類、セルロース、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチールセルロース及びヒドロキシプロピルメチールセルロース等を含むセルロース類、ゼラチン、ポリビニールピロリドン等のような充填剤が含まれる。さらに、場合によっては、架橋結合ポリビニールピロリドン、寒天、アルギン酸又はナトリウムアルギネート等を崩解剤として添加することができる。前記薬学的組成物は抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤及び防腐剤等を追加して含め得る。

さらに、非経口的に投与する場合、本発明の薬学的組成物は、適合した非経口用担体と共に注射剤、経皮投与剤及び鼻孔吸い込み剤の形態で当業界に公知の方法により、剤形化することができる。前記注射剤の場合には必ず滅菌してバクテリア及び眞菌のような微生物の汚染から保護されなければならない。注射剤の場合、適合した担体の例には、これに限定はされないが、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール等）、これらの混合物及び／又は植物油を含む溶媒又は分散媒質でもある。より好ましくは適合した担体にはヘンクス溶液、リンゲル溶液、トリエタノールアミンが含有されたPBS(phosphate buffered asline)又は注射用滅菌水、10%エタノール、40%プロピレングリコール及び5%デキストロースのような等張溶液等を使用できる。前記注射剤を微生物の汚染から保護するためには、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等のような多様な抗菌剤及び抗眞菌剤を追加して含め得る。さらに、前記注射剤は大部分の場合、糖又はナトリウムクロライドのような等張化剤を追加して含め得る。経皮投与剤の場合、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、外用液剤、パスター剤、リニメント剤、エアロー剤等の形態が含まれる。前記において“経皮投与”とは、薬学的組成物を局所的に皮膚に投与して薬学的組成物に含有された有効量の活性成分が皮膚内に伝達されることを意味する。

これらの剤形は生薬化学に一般的に広く知られた処方箋の文献（Remington’s Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania）に記述されている。

吸い込み投与剤の場合、本発明により使用される化合物は適合した推進剤、例えば、ジクロロフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、又は他の適合した気体を使用して、加圧パック又は煙霧器からエアロゾルスプレー形態で便利に伝達することができる。加圧エアロゾルの場合、投薬単位は計量された量を伝達する弁を提供して決定できる。例えば、吸込み器又は吹き込み器に使用されるゼラチンカプセル及びカートリッジは、化合物、及びラクトース又は澱粉のような適合した粉末基剤の粉末混合物を含有するように剤形化することができる。

その他の薬学的に許容される担体には下記文献に記載されているものを参考にすることができる（Remington’s Pharmaceutical Science, 19th Edition, 1995, Mack
Publishing Company, Easton, Pennsylvania）。好ましくは本発明に伴う薬学的組成物0.001〜99.999重量％及び薬学的に許容される担体99.999〜0.001重量％を含むことができる。

本発明の薬学的組成物は肥満、肥満合併症又は代謝症候群を予防及び治療する効果を有する公知の化合物と併行して投与できる。

本発明に伴う眞黄精又は黄精抽出物は肥満、肥満合併症又は代謝症候群を改善するための目的で食品組成物の形態で提供することができる。本発明の食品組成物は機能性食品、栄養補助剤、健康食品及び食品添加剤等の全ての形態を含む。前記類型の食品組成物は当業界に公知の方法により、多様な形態で製造することができる。

例えば、健康食品には、本発明の眞黄精又は黄精抽出物そのものをお茶、ジュース及びドリンクの形態で製造して飲用に供するか、又は顆粒化、カプセル化及び粉末化して摂取することができる。さらに、本発明の眞黄精又は黄精抽出物と肥満、肥満合併症又は代謝症候群の改善効果があるとして知られた、公知の物質又は活性成分と共に混合して組成物の形態で製造することができる。

さらに、機能性食品には飲料（アルコール性飲料を含む）、果実及びその加工食品（例：果実缶詰、瓶詰、ジャム、マーマレード等）、魚類、肉類及びその加工食品（例：ハム、ソーセージコーンビーフ等）、パン類及び麺類（例：うどん、そば、ラーメン、スパゲッティ、マカロニ等）、果汁、各種ドリンク、クッキー、飴、乳製品（例：バター、チーズ等）、食用植物油脂、マーガリン、植物性蛋白質、レトルト食品、冷凍食品、各種調味料（例：味噌、醤油、ソース等）等に本発明の眞黄精又は黄精抽出物を添加して製造することができる。

本発明の食品組成物の内、前記眞黄精又は黄精抽出物の好ましい含量は、これに限定はされないが、本発明に伴う食品組成物中0.001〜99.999重量％とすることができる。

さらに、本発明の眞黄精又は黄精抽出物を食品添加剤の形態で使用するためには粉末又は濃縮液の形態で製造して使用することができる。

さらに、本発明は肥満、肥満合併症及び代謝症候群からなる群より選ばれた一つ以上の疾患の予防及び治療用製剤を製造するための眞黄精又は黄精である、アマドコロ属植物抽出物の新規な用途及び眞黄精又は黄精であるアマドコロ属植物抽出物を、これを必要とする個体に有効量で投与することを特徴とする肥満、肥満合併症及び代謝症候群からなる群より選ばれた一つ以上の疾患の予防及び治療方法に関するものである。

本発明で“有効な量”とは、本発明の組成物又は製剤が、投与対象である個体内で薬剤が伝達されるか、又は肥満、肥満合併症及び代謝症候群の予防及び治療する効果を表す量を意味し、前記“個体”とは、動物、好ましくは哺乳動物、特にヒトを含む動物でもあって、動物から由来した細胞、組織、器官等でもある。前記個体は治療が必要な患者でもある。

前記検討したところ、本発明は眞黄精又は黄精抽出物の新規な用途に関するものにして、眞黄精又は黄精抽出物はSIRT1を高い水準に維持して体重、腹部脂肪及び糖耐性度を減少させ、肥満、肥満合併症又は代謝症候群の予防及び治療に有用に使用することができる。

図１ＡはHEK293細胞株にアマドコロ属に属する生薬のエチルアセテート抽出物を処理して、SIRT1蛋白質発現の変化をウェスタンブロットで測定した結果であり、図１Ｂは眞黄精又は黄精を、より広い範囲の濃度でSIRT1蛋白質発現を測定した結果である（Ｃ：陰性対照群；ID1216:黄精エチルアセテート抽出物；ID1215:眞黄精エチルアセテート抽出物；ID1214:黄精エチルアセテート抽出物；ID1213:鳴子ユリエチルアセテート抽出物）。

図２は眞黄精エチルアセテート抽出物と黄精エチルアセテート抽出物投与による、マウスの各組織内SIRT1発現増加の可否を測定したウェスタンブロットの結果から、肝、脂肪と筋肉組織の順でSIRT1の発現を測定したものである（Vehicle:陰性対照群）。

図３は肥満誘導動物モデルから本発明組成物の抗肥満効果を試験した結果の内、マウスの体重を時間別に測定したものである。数値は9〜10匹のマウスの平均標準偏差値であり、＊はp<0.05、＊＊はp<0.01で高脂肪食餌と比較したとき、有意であることを意味する（□：正常食餌；■：高脂肪食餌；▲：高脂肪食餌＋シブトラミン(sibutramine)(100mg/kg飼料)；●：高脂肪食餌＋ID1216(5000mg/kg飼料)；◆：高脂肪食餌＋ID1215(5000mg/kg飼料))。

図４は肥満誘導動物モデルから本発明組成物の抗肥満効果を試験した結果であり、肝と脂肪組織の重さを測定したグラフである。数値は9〜10匹の，マウスの平均標準偏差値であって、＊はp<0.05、＊＊はp<0.01で高脂肪食餌と比較したとき、有意であることを意味する（ND：正常食餌群；HF：高脂肪食餌群；シブトラミン：高脂肪食餌＋シブトラミン(100mg/kg飼料)；ID1216：高脂肪食餌＋黄精エチルアセテート抽出物(5000mg/kg飼料);ID1215：高脂肪食餌＋眞黄精エチルアセテート抽出物(5000mg/kg飼料))。

図５は肥満誘導動物モデルから血中脂質濃度を測定した結果である。図５Ａは血中コレステロールを、図５Ｂは血中中性脂肪を、図５Ｃは血中遊離脂肪酸濃度を高脂肪食餌群と比較した図である（ND:正常食餌群；HF：高脂肪食餌群；シブトラミン：高脂肪食餌＋シブトラミン(100mg/kg飼料);ID1216：高脂肪食餌＋黄精エチルアセテート抽出物(5000mg/kg飼料);ID1215：高脂肪食餌＋眞黄精エチルアセテート抽出物(5000mg/kg飼料))。図６はHEK293細胞株に眞黄精又は黄精のエタノール抽出物とエチルアセテート抽出物をそれぞれ処理して、SIRT1蛋白質発現変化をウェスタンブロットで測定した結果である（Ｃ：陰性対照群；ID1216:黄精エチルアセテート抽出物；ID1215:眞黄精エチルアセテート抽出物；ID1216B:黄精80%エタノール抽出物；ID1215B:眞黄精80%エタノール抽出物）。

図７は肥満誘導動物モデルから本発明組成物の抗肥満効果を試験した結果の内、マウスの体重を時間別に測定したものである。数値は８匹の，マウスの平均標準偏差値であって、＊はp<0.05、＊＊はp<0.01で高脂肪食餌と比較したとき、有意であることを意味する（□：正常食餌；■：高脂肪食餌；◆：高脂肪食餌＋ID1215B(250mg/kg);▲：高脂肪食餌＋ID1215B(500mg/kg;●高脂肪食餌＋ID1215B(750mg/kg))。

図８は肥満誘導動物モデルから本発明組成物の抗肥満効果を試験した結果であって、肝と脂肪組織の重さを測定したグラフである。数値は８匹のマウスの平均標準偏差値であって、＊はp<0.05、＊＊はp<0.01で高脂肪食餌と比較したとき、有意であることを意味する（ND:正常食餌群；HF：高脂肪食餌群；250mg/kg:高脂肪食餌＋ID1215B−250mg/kg：500mg/kg高脂肪食餌群＋ID1215B−500mg/kg;750mg/kg:高脂肪食餌＋ID1215B−750mg/kg)。

図９は肥満誘導動物モデルから本発明組成物の抗肥満効果と関連した低温試験結果である。数値は８匹のマウスの平均標準偏差値であって、＊はp<0.05、＊＊はp<0.01で高脂肪食餌と比較したとき、有意であることを意味する（■：高脂肪食餌；◆：高脂肪食餌＋ID1215B(250mg/kg);▲：高脂肪食餌＋ID1215B(500mg/kg;●：高脂肪食餌＋ID1215B(750mg/kg))。

図10は肥満誘導動物モデルから代謝症候群関連効果を試験した結果である。図10Aはグルコース経口投与による血中グルコース濃度を測定した結果である。数値は８匹のマウス均標準偏差値であって、＊はp<0.05で、高脂肪食餌と比較したとき、有意であることを意味する（□：正常食餌；■：高脂肪食餌；◆：高脂肪食餌＋ID1215B(250mg/kg);▲：高脂肪食餌＋ID1215B(500mg/kg);●高脂肪食餌＋ID1215B(750mg/kg))。図10Bは肥満食餌群とID1215B投与群の８週後曲線下面積(AUC, Area under curves)を比較したものである。図11は肥満誘導動物モデルから血中脂質濃度を測定した結果である。図11Aは血中コレステロール、図11Bは血中中性脂肪を，図11Cは血中遊離脂肪酸濃度を高脂肪食餌群と比較した図である。（ND:正常食餌群；HF：高脂肪食餌群；250mg/kg:高脂肪食餌＋ID1215B−250mg/kg：500mg/kg：高脂肪食餌＋ID1215B−500mg/kg;750mg/kg:高脂肪食餌＋ID1215B−750mg/kg)。

図12は肥満誘導動物モデルから８週後、肝と脂肪組織を光学顕微鏡で観察して脂肪及び肝細胞の差を比較した図である。図12Aは脂肪細胞の大きさの差を示した図であり、図12Bは肝細胞の状態及び脂肪空胞程度を表わす図である。（ND:正常食餌群；HF：高脂肪食餌群；250mg/kg:高脂肪食餌＋ID1215B−250mg/kg：500mg/kg：高脂肪食餌＋ID1215B−500mg/kg;750mg/kg:高脂肪食餌＋ID1215B−750mg/kg)。

以下、本発明の実施例により詳細に説明する。

ただし、下記実施例は本発明を例示するのみであり、本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。

<実施例１>
SIRT1発現増強抽出物の効能確認
＜１−１＞SIRT1 発現増強程度比較(in vitro)
SIRT1活性を最も高める抽出物を選別するために、韓国内の多くの産地から採取した本発明の黄精(Polygonoatum sibiricum: ID1216）、眞黄精（Polygonoatum sibiricum falcatum: ID1215)、アマドコロ(Polygonoatum stenophyllum: ID1214)及び鳴子ユリ(Polygonoatum lasianthum: ID1213)等４種に対するエチルアセテート抽出物を比較した。

エチルアセテート抽出物の収得方法は、10gのそれぞれの試料を細切した後、30mlの100%エタノールに浸漬し、常温で24時間ずつ３回繰返し抽出した抽出溶液をろ過装置でろ過し、減圧装置でメタノールを除去してメタノール抽出液を収得した。前記過程により収得したメタノール抽出物にエチルアセテートと水をそれぞれ20mlずつ添加して混合した後、上層を濃縮してエチルアセテート抽出物を収得した。

それぞれのエチルアセテート抽出物等は、エタノールで２回洗浄して残留溶媒を除去して減圧濃縮し、DMSOに一定濃度で溶解させ、無血清Dulbecco's modified Eagle培地(DMEM)に0.5%(v/v)比率で添加した培地でHEK293細胞を16乃至20時間培養後に得た蛋白質を8%SDS-PAGEゲルで電気泳動し、PVDF膜に移してSIRT1と特異抗体(Cell Signalling Technology,米国)で免疫ブロット(immunoblotting)する検索システムを確立した。対照群には薬剤が含まれないDMSO処理群を使用してSIRT1の発現を対照群より増加させた薬剤を選別した。

その結果、図１Ａに示した通り、前記４種のエチルアセテート抽出物全てSIRT1発現増強活性が確認され、眞黄精抽出物(ID1215)の活性が最も高いことを確認した。さらに、図１Ｂに示した通り、眞黄精抽出物(ID1215)は黄精(ID1216)に比べて８倍以上低い濃度でもSIRT1の発現増強効能を示した。

＜実施例２＞
ID1215とID1216に対する生体内SIRT1発現試験
ID1215とID1216が生体内でSIRT1発現を増加させるか否かを確認するために、C57BL6マウスを対象に各臓器別にSIRT1の発現様相を確認した。

全ての動物施術は、日東製薬（韓国）動物倫理委員会のガイドラインにより行った。８週令C57BL/6の雄マウスをオリエンタルバイオから購入した。飼育室温度23℃、湿度50±10%になるように維持し、明暗は12時間で(day light 08:00〜20:00)を周期にして１週間環境に適応させて実験を行った。吸収を容易にするため、絶食したマウスにID1215とID1216をそれぞれ500mg/kg体重(=500mpk)になるように投与した。投与５時間後、マウスから肝、脂肪、筋肉を摘出した。摘出した組織の一部はRNA抽出のために、液体窒素に急速冷凍後−70℃で使用時まで保管し、残りの摘出した組織は蛋白質抽出のために蛋白分解酵素抑制剤と、Na₃VO₄が含まれた破砕用緩衝溶液（Homogenization buffer）(10mMTris,pH7.4,150mMNaCl,1mMEDTA10%glycerol,0.1%TritonX-100）に入れて、BCA定量法を利用して蛋白質を定量した。SIRT1の発現を確認するために、筋肉を除いた残りの組織は、60μg蛋白質（筋肉内は100μg)を８％SDS-PAGEゲルから分離した後、PVDF膜に移して5%脱脂乳で10分間ブロッキングして抗SIRT1抗体でウェスタンブロットを行った。

その結果、図２に示した通り、ID1216とID1215全て脂肪と筋肉から類似した様相でSIRT1蛋白質発現を増加させた。

＜実施例３＞
ID1215とID1216に対する抗肥満効能試験
SIRT1発現試験を通じてID1215とID1216が共に抗肥満効果を示すと予想された。生体外実験でSIRT1活性増強効能が高かったID1215とID1216に対する抗肥満効能を比較するために、DIOモデル試験を行った。

＜３−１＞高脂肪食餌による肥満誘導マウスモデル製作
試験は８週令のC57BL6マウスに40%脂肪が含まれた高脂肪食餌にID1215とID1216を添加した飼料を与えながら12週間観察した。

高脂肪食餌に抗肥満効能に対する陽性対照群でシブトラミンは0.01%、ID1215とid1216はそれぞれ0.5%になるように混合して製作し、使用前まで冷蔵保管した。飼料の構成成分は表１の通りである。

動物の準備は実施例２と同一に進行した。マウスは12週間高脂肪食餌を自在に摂取した。試験群は牛脂が含まれていない一般処理群(ND)、薬剤未処理高脂肪食餌群(HF)、ID1215とID1216を高脂肪食餌飼料ｋｇ当たり5000mgずつ含まれる群(ID1215,ID1216)、高脂肪食餌飼料ｋｇ当たり100mgのシブトラミンを含む群に分けて10匹ずつ試験を行った。

＜３−２＞体重変化測定
体重は１週間に１度測定した。実験終了後全ての群のマウスは血漿を回収し、解剖して肝と腹部脂肪の重量を測定した。一部肝の組織と脂肪組織は組織染色をして観察した。

その結果、図３に示した通り、ID1216とID1215をそれぞれ添加した肥満飼料投与群は高脂肪食餌群に比べて12週後体重がそれぞれ8.6%、25.9%減少し、陽性対照群であるシブトラミン投与群は、始めの内は肥満抑制効能があったが８週以降効能がなくなってしまった。さらに、表２及び図４に示した通り、薬剤投与群は12週後剖検の際、高脂肪食餌群に比べて腹部脂肪組織の量が高脂肪食餌群に比べてID1216の場合3.2%、ID1215の場合41.9%減少し、シブトラミン投与群は3.2%減少した。肝の質量はID1216が脂肪食餌群に比べて6.2%、ID1215が31.2%減少し、シブトラミン投与群では肝の質量変化がなかった。肝組織に対する組織学的分析の結果、高脂肪食餌群の肝組織から広範囲に亘って緻密に分布していた脂肪がID1215投与群で局所的で軽症に緩和されたことを確認した（結果は図示せず）。

＜３−３＞血液検査
実験終了後、各群のマウスから血液を採取して血漿を分離した。コレステロールは自動乾燥化学分析器(A25 analyzer,Biosystems)を使用して分析し、中性脂肪はTriglyceride assay Kit(Cayman)で、遊離脂肪酸はNEFA(Wako)を利用して製造社の指針に従い測定した。

その結果、図５及び表３に示した通り、代謝症候群に関する指標として血液内総コレステロール量は高脂肪食餌群対比ID1216投与群は10.6%、ID1215投与群では27.8%減少され、中性脂肪と遊離脂肪酸はID1216投与群でそれぞれ14.9%、15.4%減少し、ID1215投与群では27.0%、38.2%減少したことを確認した。ID1216の場合、体重増加抑制効能及び脂肪と肝組織量の減少程度が微弱であるに反し、代謝症候群関連効果は比較的高く、ID1215はID1216と比較して肥満をはじめ、全ての代謝症候群疾患改善効果が高いと予想された。

前記実施例のID1215とID1216に対する肥満及び代謝症候群と関連した効能試験結果を総合して見るに、これら組成物全て500mg/kg用量で長期間経口投与の際にも、毒性のないと判断され、現在肥満治療剤として市販中のシブトラミンと比較して同等以上の抗肥満効能を示しているばかりでなく、肥満及び代謝症候群と関連した多様な標識等を改善させることが分かった。

＜実施例４＞
抽出物の最適抽出条件の確立
エチルアセテート等の有機溶媒を使用する場合、食用や人体に使用しようとする場合には、分離精製過程が複雑であるか、又は残留有機溶媒により使用が不可能な場合が発生するので、使用が可能なエタノール（酒精）を利用した抽出法を確立した。従って、抽出物内の本発明の有効成分の含量が高く、抽出量が多く大量生産の際、工程化が容易で生産単価を下げる目的に最適な抽出条件の試験を行った。

エチルアセテート抽出物の収得方法は実施例１の方法と同じである。10%の試料を細切した後、30mlの100%メタノールに浸漬して常温で24時間ずつ３回繰返し抽出した抽出溶液をろ過装置でろ過し、減圧装置でメタノールを除去してメタノール抽出物を収得した。前記過程により収得されたメタノール抽出液にメタノール抽出物をエチルアセテートと水をそれぞれ20mlずつ添加して混合し、上層を濃縮してエチルアセテート抽出物を収得した。

従って、抽出工程を簡素化するために80%のエタノールを使用して次のように抽出した。細切した10gの試料に80%のエタノール30mlずつに浸漬して、24時間ずつ３回繰返し抽出した抽出溶液をろ過装置でろ過し、減圧装置で溶媒等を除去して80%のエタノール抽出物を収得した。80%のエタノール抽出物は試料の重量対比17%の抽出物を示し、エチルアセテート抽出物の抽出率0.2%に比べて85倍高い抽出率を示した。

＜実施例５＞
ID1215とID1216のエタノール抽出物のSIRT1発現増強効果試験

前記実施例４で抽出したそれぞれの抽出物を、DMSOに一定濃度に溶解させて実施例１の方法でSIRT1活性の可否を試験した。

SIRT1活性を最も高める溶媒別抽出物を選別するために、韓国内の多くの産地から採集した本発明の眞黄精、黄精の80%エタノール抽出物とエチルアセテート抽出物を比較した。実験は実施例１での通り抽出物を濃度別にHEK 293細胞に処理したあと、SIRT1の発現増加をウェスタンブロットで確認した。

その結果、図６に示した通り、黄精80%エタノール抽出物(ID1216B)及び眞黄精80%エタノール抽出物(ID1215B)は黄精エチルアセテート抽出物(ID1216)及び眞黄精エチルアセテート抽出物(ID1215)と類似したSIRT1発現増強効能を示した。

抽出物の安定性及び経済性の面で長所があるばかりでなく、細胞内SIRT1発現増強効果も高い眞黄精80%エタノール抽出物(ID1215B)に対して、250,500,750mg/kg用量でマウスに投与しながら抗肥満効果を検証した。

＜実施例６＞
ID1215Bに対する抗肥満効能試験

＜６−１＞高脂肪食餌による肥満誘導マウスモデル製作
試験は８週令のC57BL6マウスに、40%脂肪が含まれた飼料を与えながら、PBS溶解させた ID1215Bを250,500,750mg/kgで毎日１回経口投与する方法で８週間体重変化を測定して、８週後多様な肥満及び関連指標等の変化を一般食餌及び肥満食餌マウス群等と比較した。

試験群は牛脂が含まれていない一般飼料処理群(ND)、薬剤未処理高脂肪食餌群(HF)、高脂肪食餌を与えながら１日１回ID1215Bを250mg/kg投与する群(ID1215B-250mg/kg)、500mg/kg投与する群(ID1215B-500mg/kg)、750mg/kg投与する群(ID1215B-750mg/kg)に分けて８匹ずつ試験を行った。NDとHFはID1215B投与群と同一な試験結果のため１日１回PBSを投与した。

＜６−２＞体重変化測定
体重は１週間に１度測定された。実験終了後全ての群のマウスは血漿を回収して肝と腹部脂肪の重量を測定した。一部肝組織と脂肪組織は組織染色をして観察した。

その結果、図７に示した通り、ID1215B投与群は高脂肪食餌群に比べて８週後体重が250,500,750mg/kg投与群で、それぞれ17.0、15.4、17.0%減少した。さらに、表４、図８及び図12に示した通り、薬剤投与群は８週後の剖検の際、高脂肪食餌群に比べて腹部脂肪組織の量が全てのID1215B投与群から10%以上減少し、脂肪細胞の大きさも減った（図12A参照）。肝の質量は、250,500,750mg/kg投与群において、高脂肪食餌群に比べてそれぞれ18.6、14.0、24.4%減少した。肝組織に対する組織学的分析の結果、高脂肪食餌群の肝組織から広範囲で緻密に分布していた脂肪が、ID1215B投与群で局所的に軽症に緩和されたことを確認した（図12B参照）。

＜６−３＞低温試験
体重減少の原因を確認するために、低温試験を行った。マウスを４℃の低温空間で８時間の間、１〜２時間毎に直腸内の温度を測定して記録し、これを初期体温と比較した。

その結果、図９に示した通り、ID1215B投与群は高脂肪食餌群で表われる体温低下をかなり克服したので、ID1215B投与による体重増加抑制効能は、体内の活発な代謝を通じた熱発散増加による結果であることが分かる。

＜６−４＞インシュリン抵抗性に対する糖耐性度測定
インシュリン抵抗性による糖耐性度を測定するために、16時間以上絶食させたマウスの尻尾から血液を採り血糖を測定し（０分）、ブドウ糖を2g/kgで注射後、10,20,30,60,120分に血液を採り血糖を測定して記録した。

その結果、図10に示した通り、ID1215Bを250,500,750mg/kg用量で投与した群の曲線下面積(AUC、Area under curves)はそれぞれ14236*、8387*、7789*で高脂肪食餌群に比べて、それぞれ31.6、59.7、62.6%減少して糖耐性が改善された（＊はp<0.05）。

＜６−５＞血液検査
実験終了後、各群のマウスから血液を採取して血漿を分離した。毒性関連指標とコレステロールは自動乾燥化学分析器で分析し、中性脂肪と遊離脂肪酸はTriglyceride assay Kit(Cayman)と、NEFA(Wako)をそれぞれ使用して製造社の指針に従い測定した。

その結果、表５と図11に示した通り、代謝症候群に関する指標として血液内のコレステロールは有意的な差はなかったが、中性脂肪はID1215B投与群で高脂肪食餌群に比べてそれぞれ30.1、42.5、47.2%減少して濃度依存性を示し、遊離脂肪酸もそれぞれ、7.1、7.1、14.3%減少した。従って、ID1215Bは体重増加抑制ばかりでなく、多様な代謝症候群疾患の改善効果が高いことと予想される。

さらに、表６に示した通り、ID1215B投与群は肥満誘導群で見られる肝毒性関連の指標(ALT、AST等)の異常を正常食餌群と類似した程度に下げて、薬剤投与の際心配される腎臓毒性と関連した指標（クレアチン、BUN等）は正常食餌群と比べて有意的変化を示さなかった。

＜６−６＞肝と脂肪組織の光学顕微鏡観察
動物実験終了後、肝と脂肪組織の変化を確認するために、Ｈ＆Ｅ（ヘマトキシリンとエオシン）染色後、光学顕微鏡観察を行った。

摘出した肝と脂肪組織は一定部位を適当な大きさに切って、通常の方法により10%ホルマリンに固定して水洗、パラビン包埋過程を経てブロックを製作した。作ったブロックは4μmの厚さで切片を作り一般的な変化を観察するために、ヘマトキシリン(hematoxylin)とエオシン(eosin)染色を行った。

全ての濃度のID1215B投与群は、高脂肪食餌群のような黄褐色に変色することなく、一般食餌群と類似した鮮紅色を示し、空胞変性の範囲や程度もはっきり減少した。脂肪組織分析結果でも高脂肪食餌群と比べて全ての用量のID1215B投与群で、脂肪細胞の大きさが小さいことが確認できた（図12参照）。

＜実施例７＞
単回及び繰返し投与毒性試験
ID1215Bを経口投与するとき、毒性誘発の可否を確認するために、単回毒性及び４週繰返し投与毒性試験を行った。

単回毒性は６週令の雄ICRマウスを各６匹を一つの群として、ID1215Bを経口で1.000〜5.000mg/kg体重で単回投与後、２週間生存可否を観察して実験動物を安楽死させて剖検を通じて、前記異常所見を観察した。全ての濃度のID1215B投与群で斃死した動物はなく、臓器の異常所見も発見できず毒性がないものと判断された（結果は図示せず）。

繰返し投与毒性は、６週令の雄のICRマウス各６匹を一つの群にして、ID1215Bを経口で1.000〜3.000mg/kg体重で、１日１回28日間繰返し投与しながら、体重変化、一般症状及び生存の可否を観察し、実験動物を剖検して臓器異常の所見を観察した。全ての濃度のID1215B投与群から斃死した動物はなく、臓器異常の所見も発見されず、表７に示した通り、ALT、AST等の肝毒性に関連した指標及びクレアチン、BUN等のような腎臓毒性に関連した指標等では全て有意的な変化がなかった。

ID1215Bもやはり前記の方法で単回（1,000〜3,000mg/kg体重）及び７日間繰返し投与毒性（500〜1,500mg/kg体重）を確認したが、全ての濃度で生存率、剖検の際の異常所見、肝毒性及び腎臓毒性と関連した血液生化学的指標等でvehicleと有意的な差は見られなかった（結果は図示せず）。

前記実施例のID1215Bに対する肥満及び代謝症候群と関連した効能及び毒性試験群結果を総合して見れば、本組成物は最大5.000mg/kgの高容量単回投与及び3.000mg/kg用量で繰返し投与の際にも毒性がなかったばかりでなく、最大750mg/kg用量で長期間経口投与の時にも毒性無しで抗肥満効能及び代謝症候群と関連した多様な標識等を改善させることが分かった。

本発明は眞黄精又は黄精抽出物を有効成分として含有する肥満、肥満合併症又は代謝症候群の予防及び治療用薬学的又は食品組成物、肥満、肥満合併症又は代謝症候群の予防及び治療用製剤を製造するための眞黄精又は黄精抽出物の新規な用途及び前記抽出物を利用した肥満、肥満合併症又は代謝症候群の治療方法に関するものであり、前記眞黄精又は黄精抽出物は細胞内SIRT1蛋白質を高い水準に維持させ、体重、腹部脂肪及び糖耐性度を減少させる効能を有するので、肥満、肥満合併症又は代謝症候群の予防及び治療用薬学的組成物又は食品組成物の有効成分として活用することができる。

Claims

眞黄精(Polygonatum falcatum)抽出物、又は黄精(Polygonatum sibiricum)抽出物を含有する肥満の予防及び治療用薬学的組成物。
前記抽出物は水、エタノール、酒精、メタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、アセトン、エーテル、クロロホルム、エチルアセテート、メチレンクロライド、ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル、ジエチルエーテル、ベンゼンからなる群より選ばれた一つ以上の溶媒抽出物であることを特徴とする請求項１記載の組成物。
肥満の予防及び治療用製剤を製造するための眞黄精抽出物又は黄精抽出物の使用。