JP6134125B2 - 逆転写酵素阻害剤およびキット - Google Patents
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Images
Description
本発明の組成物に使用するニレの種類は特に制限されない。好ましいのは、ウルムスホランディカ(Ulmus hollandica)に属するニレを使用する態様である。ウルムスホランディカは、ウルムスカルピニフォラ(Ulmus carpinifolla)とウルムスグラブラ(Ulmus glabra)の交雑品種を含むものであり、比較的大型のものが多い。また、小枝表面が平滑であり、翼片の中央に実がつかないのが一般的である。ウルムスホランディカは、欧州において街路樹や公園樹として植えられており、園芸品種もある。
ウルムスカルピニフォラ(Ulmus carpinifolla)は、樹高が約25〜30mで、幅広で楕円状の樹形をしているのが一般的である。樹齢を重ねるに従って樹肌は荒くなる。小枝は比較的細くて、毛は生えていないものが多い。また、種によっては、生長の早い若枝にコルク層が明瞭に形成されることがある。葉は、逆卵型をしていて、8cm未満の小さいものが多い。左右には12組前後の葉脈がある。
ウルムスカルピニフォラ(Ulmus carpinifolla)に属するニレの種類は豊富であり、例えば、ダンピエリ(Dampieri)、ホエルショルミエンシス(Hoersholmiensis)、サルニエンシス(Sarniensis)、ウレデイ(Wredei)を例示することができる。
ウルムスグラブラ(Ulmus glabra)に属するニレの具体例として、カンペルドウニ(Camperdownii)、エキソニエンシス(Exoniensis)、ホリゾンタリス(Horizontalis)を例示することができる。
また、本発明では、ウルムスホランディカ(Ulmus hollandica)に属する植物種やその他のニレ種を他の植物種と交配させた植物種も好ましく使用することもできる。交配させる他の植物種は、他のニレ種であってもよいし、ニレ以外の植物種であってもよい。また、交配させる植物種は、1種類のみであってもよいし、複数種であってもよい。さらに、交配させて得た品種をさらに交配させて得た品種であってもよい。このように、本発明の組成物には、ウルムスホランディカ(Ulmus hollandica)をはじめとするニレに由来する植物種を利用したものがすべて包含される。
本発明では、ニレの花部を利用する。例えば、ウルムスホランディカ(Ulmus hollandica)に由来する植物種は、冬から初春にかけて莟をつけ、春に花を咲かせる。花芽の大きさは小さくてもよい。このため本発明では、莟の段階から花が散るまでの間に花部を取得して利用するのが好ましい。
花部を細片状または粉末状にするときには、採取した花部をそのままカッター、細断機、コロイドミルなどを用いて処理してもよいが、いったん乾燥してから細断、粉末化処理を行うのが好ましい。花部の乾燥は、水分含量が10重量%未満、好ましくは5重量%未満、より好ましくは3重量%未満になるまで行うのが一般的である。乾燥は、自然乾燥でも機械乾燥でもよい。また、乾燥を行う場合は、花部採取から30分以内に行うのが好ましい。
本発明で使用する生ウルシを得るための植物は、ウルシ科に属するものの中から選択することができる。特に好ましいのは、ウルシ科ウルシ属に属する植物種の葉部である。例えば、ウルシ(Rhus vernicitlua)、ヤマウルシ(Rhus trichocarpa)、シタウルシ(Rhus ambigna)、ヌルデ(Rhus javanica)、ヤマハゼ(Rhus sylvestris)を例示することができるが、これらに限定されるものではない。
たとえば、本発明の組成物を医薬品として使用する場合には、その投与経路によって様々な剤型を選択することができる。本発明の組成物は、経口的または非経口的に投与することができる。例えば、直腸投与、鼻内投与、頬側投与、舌下投与、膣内投与、筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与を行なうことが可能である。中でも、本発明の組成物は、経口投与、皮下投与または経皮投与するのが好ましく、経口投与することが特に好ましい。
具体的には、紅茶、清涼飲料水、ジュース、あめ、澱粉質食品、各種加工食品等に使用することができるが、使用形態はこれらの具体例に限定されるものではない。(1)ニレの花部のアルコール・水混合溶媒抽出物と、(2)生ウルシのアルコール・水混合溶媒抽出物と、(3)オウセイのアルコール・水混合溶媒抽出物の合計添加量(固形分)は、0.01〜99重量%の範囲内に設定することができる。また、必要に応じて、ゲル化剤などを添加して食感を改良してもよい。
本実施例において、本発明の組成物の具体例を例示する。
ウルムスホランディカ(ulmus hollandica)に属するウェガタア(Vegeta)、コメリン(commelin)およびグロネフェト(Groenveid)の花の莟を、オランダ国アムステルダム市内にて3月に採取した。採取した莟をそれぞれミキサーを用いて粉砕し、110〜120℃にて水分量1〜5%になるまで乾燥した。得られた乾燥粉末に脱酸素剤を入れて密封し、常温で保存した。
ウルシの樹液を中国にて採取し、濾過することにより生ウルシを得た。水分量が1〜5%になるまで乾燥して得られた乾燥粉末に脱酸素剤を入れて密封し、常温で保存した。
各乾燥粉末をそれぞれ1週間保存した後、ニレの乾燥粉末30gと生ウルシの乾燥粉末120gとオウセイの乾燥粉末25gをフラスコ内に入れ、さらに60%エタノール・40%水混合溶媒1500mlを入れた。ソックスレー抽出器により50℃±18℃で14時間抽出し、濃縮することにより固体状の組成物を得た。
実施例1と同じ方法により得た各乾燥粉末を用いて、別の本発明の組成物を製造した。
フラスコ内にニレの乾燥粉末30gと生ウルシの乾燥粉末125gとオウセイの乾燥粉末25gを入れ、さらに70%エタノール・30%水混合溶媒1500mlを入れた。フラスコに冷却管を取り付けて120〜190℃に設定したマントルヒーターを用いて14時間加熱することにより直抽出した。その後、室温まで冷却して吸引ろ過することにより固体状の組成物を得た。
実施例1および実施例2で得られた各固体状の組成物をデンプンと以下の表に示す量で混合することによって粉剤を製造した。
実施例2で製造した粉剤を、ゼラチンカプセルに充填することによってカプセル剤を製造した。
実施例1および実施例2で得られた各固体状の組成物を塩化ナトリウムとともに蒸留水に溶解した。乾燥粉末、塩化ナトリウムおよび蒸留水は、それぞれ以下の表に示す量で混合した。得られた水溶液を濾過することによって注射剤を製造した。
実施例1および実施例2で得られた各で得られた固体状の組成物を以下の成分と以下の表に示す割合で混合した。これによって、機能性飲料を製造した。
実施例1で得られた生ウルシの乾燥粉末そのものを用いて、実施例1と同様に60%エタノール・40%水混合溶媒1500mlを添加して50℃±18℃で抽出し、濃縮することにより比較例1の固体状の組成物を得た。
実施例1で得られた生ウルシの乾燥粉末120gとニレの乾燥粉末30gを混合した混合物を用いて、実施例1と同様に60%エタノール・40%水混合溶媒1500mlを添加して50℃±18℃で抽出し、濃縮することにより比較例2の固体状の組成物を得た。
実施例1で得られた生ウルシの乾燥粉末120gとオウセイの乾燥粉末25gを混合した混合物を用いて、実施例1と同様に60%エタノール・40%水混合溶媒1500mlを添加して50℃±18℃で抽出し、濃縮することにより比較例3の固体状の組成物を得た。
ウルシ若葉を石川県にて3月に採取し、ミキサーを用いて粉砕した後、110〜120℃にて水分量が1〜5%になるまで乾燥した。得られた乾燥粉末に脱酸素剤を入れて密封し、常温で保存した。
上記のウルシ若葉由来の乾燥粉末と実施例1のニレ由来の乾燥粉末をそれぞれ1週間保存した後、ニレの乾燥粉末7.5gとウルシの乾燥粉末7.5gを混合した。混合粉末に70%エタノール・30%水混合溶媒100mlを添加して5時間撹拌し、濃縮することにより比較例4の個体状の組成物を得た。
本試験例において、実施例1〜2および比較例1〜4の各組成物を用いてHeLa細胞増殖抑制作用を調べた。
10%牛胎仔血清を含むEagle’s MEM培地(0.1mM非必須アミノ酸添加)を用いて約1×104細胞/ウェル濃度のHeLa細胞懸濁液を調製し、96穴マルチウェルプレート(内径6mm)内に100μlずつ注入した。各組成物を60%エタノール・40%水混合溶媒に溶解した液剤を10μl添加して、37℃に維持したCO2インキュベーター(5%CO2)内にて2日間培養した。また、上記液剤を滴下せずに、同じ条件で2日間培養した試料も用意した(標準試料)。2日間培養後の各試料の位相差顕微鏡写真を撮影したところ、実施例と比較例の試料は細胞の増殖が阻害されており、標準試料は細胞の増殖が阻害されていないことが確認された。
また、上記の2日間培養後に培地をフェノールレッド不含培地に交換し、生細胞と反応して黄色に呈色する試薬を10μlずつ加えて、CO2インキュベーター(5%CO2)内にておいて37℃で約3時間培養した。ここで用いた試薬は、WST−1[(株)同仁化学研究所製]0.65mgと1−メトキシPMS[(株)同仁化学研究所製]0.07mgを1mlのPBSに溶解することにより調製した。3時間培養後の呈色状況を観察したところ、実施例と比較例の試料は黄色に呈色しておらず、標準試料は黄色に呈色していることが確認された。この呈色状況は、450nmの吸光度を測定することにより数値化することができる。
上記試験手順において、上記液剤を10μl添加した後に倍々希釈した試料をそれぞれ調製し、後の手順は同様にして呈色試験を行ってIC50値を得た。結果を表4に示す。
本試験例において、実施例1〜2および比較例1〜4の各組成物を用いてMCF−7細胞増殖抑制作用を調べた。
10%牛胎仔血清を含むEagle’s MEM培地(0.1mM非必須アミノ酸、1mMピルビン酸ナトリウム、10μg/mLインスリン添加)を用いて約1×104細胞/ウェル濃度のMCF−7細胞懸濁液を調製し、96穴マルチウェルプレート(内径6mm)内に100μlずつ注入した。各組成物を60%エタノール・40%水混合溶媒に溶解した液剤を10μl添加して、37℃に維持したCO2インキュベーター(5%CO2)内にて2日間培養した。また、上記液剤を滴下せずに、同じ条件で2日間培養した試料も用意した(標準試料)。2日間培養後の各試料の位相差顕微鏡写真を撮影したところ、実施例と比較例の試料は細胞の増殖が阻害されており、標準試料は細胞の増殖が阻害されていないことが確認された。
また、上記の2日間培養後に試験例1と同様にして呈色試験を行った。その結果、実施例と比較例の試料は黄色に呈色しておらず、標準試料は黄色に呈色していることが確認された。
さらに、試験例1と同様にして得られたIC50値を表4に示す。
本試験例において、実施例1〜2および比較例1〜4の各組成物を用いてDLD−1細胞増殖抑制作用を調べた。
10%牛胎仔血清を含むRPMI1640培地を用いて約1×104細胞/ウェル濃度のDLD−1細胞懸濁液を調製し、96穴マルチウェルプレート(内径6mm)内に100μlずつ注入した。各組成物を60%エタノール・40%水混合溶媒に溶解した液剤を10μl添加して、37℃に維持したCO2インキュベーター(5%CO2)内にて2日間培養した。また、上記液剤を滴下せずに、同じ条件で2日間培養した試料も用意した(標準試料)。2日間培養後の各試料の位相差顕微鏡写真を撮影したところ、実施例と比較例の試料は細胞の増殖が阻害されており、標準試料は細胞の増殖が阻害されていないことが確認された。
また、上記の2日間培養後に試験例1と同様にして呈色試験を行った。その結果、実施例と比較例の試料は黄色に呈色しておらず、標準試料は黄色に呈色していることが確認された。
さらに、試験例1と同様にして得られたIC50値を表4に示す。
本試験例において、実施例1〜2および比較例1〜4の各組成物を用いてイヌ骨肉腫の細胞株であるD−17細胞の増殖抑制作用を調べた。
10%牛胎仔血清を含む培地を用いて約1×104細胞/ウェル濃度のD−17細胞懸濁液を調製し、96穴マルチウェルプレート(内径6mm)内に100μlずつ注入した。各組成物を60%エタノール・40%水混合溶媒に溶解した液剤を10μl添加して、37℃に維持したCO2インキュベーター(5%CO2)内にて2日間培養した。また、上記液剤を滴下せずに、同じ条件で2日間培養した試料も用意した(標準試料)。2日間培養後の各試料の位相差顕微鏡写真を撮影したところ、実施例と比較例の試料は細胞の増殖が阻害されており、標準試料は細胞の増殖が阻害されていないことが確認された。
また、上記の2日間培養後に試験例1と同様にして呈色試験を行った。その結果、実施例と比較例の試料は黄色に呈色しておらず、標準試料は黄色に呈色していることが確認された。
さらに、試験例1と同様にして得られたIC50値を表4に示す。また、実施例2の組成物のD−17細胞に対する用量依存性を示すグラフを図1に示す。
本試験例において、実施例1〜2および比較例1〜4の各組成物を用いて逆転写酵素阻害作用を調べた。
各組成物を60%エタノール・40%水混合溶媒に溶解した液剤30μlに、反応用混合液10μl(0.05Mトリス−塩酸緩衝液pH8.0、0.01MDTT、0.1M塩化カリウム、0.006M塩化マグネシウム、2μg/mlPoly(A)p(dT)15、0.37μM3H−dTTP、10μMdTTP、グリセロール/水=25/16)、0.001U/mlのHIV−1逆転写酵素液10μl、緩衝液(50mMトリス−塩酸pH8.0、10mMDTT、200mM塩化カリウム、50v/v%グリセロール)10μlを添加して全量を50μlとした。攪拌して遠心分離した後、37℃で30分間インキュベートした。その後、氷冷しながらEDTA20μlを添加し、攪拌して遠心分離した。反応液50μlをイオン交換セルロースフィルターにスポットし、乾燥後に5%リン酸水素二ナトリウム(8回)、水(2回)、エタノール(2回)、ジエチルエーテル(2回)で洗浄した。イオン交換セルロースフィルターをシンチレーターに入れて、液体シンチレーションカウンターによって測定した。
反応液における試料濃度を変化させて、阻害率が50%のときの濃度をIC50とした。結果を表4に示す。
同様にして、実施例1〜2および比較例1〜4の各組成物を用いてα−グルコシダーゼ阻害作用を調べた。用いたα−グルコシダーゼは、マルターゼ活性とスクラーゼ活性を有する。IC50値を表4に示す。
Claims (8)
- ニレの花部のアルコール・水混合溶媒抽出物と、生ウルシのアルコール・水混合溶媒抽出物と、オウセイのアルコール・水混合溶媒抽出物とを含む逆転写酵素阻害剤。
- ウルシオールを含むことを特徴とする請求項1に記載の逆転写酵素阻害剤。
- ニレがウルムスホランディカ(Ulmus hollandica)に属することを特徴とする請求項1または2に記載の逆転写酵素阻害剤。
- ニレが、ウェガタア(Vegeta)、コメリン(Commelin)、グロネフェト(Groenveid)、ベルギカ(Belgica)、クルシウス(Clusius)、コルメラ(Columella)、ドドエンス(Dodoens)およびホメステッド(Homestead)からなる群から選択されることを特徴とする請求項3に記載の逆転写酵素阻害剤。
- ニレが、ウェガタア(Vegeta)、コメリン(Commelin)およびグロネフェト(Groenveid)からなる群から選択されることを特徴とする請求項4に記載の逆転写酵素阻害剤。
- 生ウルシを乾燥した後にアルコール・水混合溶媒で抽出した抽出物を含むことを特徴とする請求項1〜5のいずれか一項に記載の逆転写酵素阻害剤。
- アルコール・水混合溶媒のアルコール濃度が50〜80重量%であることを特徴とする請求項1〜6のいずれか一項に記載の逆転写酵素阻害剤。
- (1)ニレの花部のアルコール・水混合溶媒抽出物と、(2)生ウルシのアルコール・水混合溶媒抽出物と、(3)オウセイのアルコール・水混合溶媒抽出物が、それぞれキットを構成する複数の組成物のいずれかに含まれていることを特徴とする逆転写酵素阻害キット。
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