WO2006115202A1

WO2006115202A1 - ニコチンの毒性軽減組成物

Info

Publication number: WO2006115202A1
Application number: PCT/JP2006/308421
Authority: WO
Inventors: Yoshiko Miyazaki; Shinobu Matsuda; Osami Aki
Original assignee: Fuji Sangyo Co., Ltd.
Priority date: 2005-04-25
Filing date: 2006-04-21
Publication date: 2006-11-02

Abstract

【課題】タバコに含まれるニコチンが喫煙者並びに受動喫煙者の健康に悪影響を及ぼすことはよく知られている。喫煙者の多くは禁煙したいと思っているが、ニコチンの依存性の故にその成功率は低い。そこで喫煙しながらでもニコチンの毒性をなるべく軽減しうる方法が待たれている。【解決手段】タデアイ、特にその植物体を発酵させることにより得られる藍染料用調製物「すくも」の水抽出物を含む組成物を体内に投与、摂取することにより喫煙によるニコチンの毒性を著しく軽減させることが判明し、前記課題を解決するに到った。

Description

明細書

ニコチンの毒性軽減組成物

技術分野

[0001] 本発明は、動物体内に吸収されたニコチンの毒性を軽減する組成物に関し、特にタバコの喫煙による喫煙者自身および受動喫煙者が被るニコチンの毒性を軽減する組成物に関する。

背景技術

[0002] 我が国では、平成 15年に健康増進法が施行された。これは我が国における急速な高齢化の進展及び疾病の変化に伴い、国民の栄養の改善や健康増進を図るため、疾病の早期発見 '早期治療の二次予防に止まらず、発病を予防する一次予防に重点が置かれるようになってきた力である。

[0003] 喫煙の人体に及ぼす悪影響については古くから指摘がなされてきており、禁煙の推進、受動喫煙の防止策が検討されてきている。

しかし、平成 14年国民栄養調査において、成人喫煙率は男性でなお平均 43.3%であり、女性は平均 10.2%であった。その後男性の喫煙率は減少する傾向を示しているものの、青少年や女性の喫煙率はむしろ増加傾向にあり、特に、若い女性の喫煙者率が目立って上昇している。

妊婦の喫煙については妊婦自身の問題にとどまらず、その影響は胎児に及び、未熟児や、胎児の脳障害、心臓病、先天奇形、流産、死産の要因となることがあるので事態は深刻である。

[0004] タバコに含まれる三大有害物質は、ニコチン、一酸化炭素およびタールと!/、われている。その中でニコチンは、胃粘膜の血液量の減少、消化吸収能力の低下、味覚異常、心拍数や血液量の増加、末梢血管の収縮、遊離脂肪酸の増加、血小板凝集及び血栓形成促進作用、学習力の低下など様々な有害性と共に、麻薬と同様に依存性、耽溺性を有していることが特徴的である。

通常、喫煙により吸収されたニコチンは、肝臓でコチュンという無毒物質に代謝され、尿中に排出されるが、この代謝が充分に行われないと体内で-トロソァミンという有毒物質に変化し、心臓病、高血圧症、糖尿病などを誘発したり、発ガン物質を誘発したりする。それゆえ、ニコチンへの依存による喫煙の継続は種々の生活習慣病につながる危険性が高い。

[0005] 禁煙を試みようする人にとって、それを成功させる手助けとして、ニコチンガムや- コチンパッドが知られている。ニコチンガムは、胃や咽の痛み、口腔内炎症が起こる場合があり、又一日の喫煙本数が 5本を越える人にとっては効き目が低、と言われている。ニコチンパッドは皮膚の炎症を伴うことがあり、適切量の設定が難しぐ効果が奏されないとして中断してしまうケースが多いと言われている。しかも、ー且禁煙に成功したかに見えても、一本でも再喫煙するとすぐにニコチンレセプターの数が増え、喫煙者に舞、戻ってしまう傾向が強、。

また、喫煙によるニコチンへの依存性を軽減させる医薬の研究も行われており、 5H T 受容体拮抗薬が有効であるとして提案されて!ヽる (特許文献 1)が、向神経作用

1A

の強、薬物であるのでニコチン依存症軽減剤としては実用化されて、な、。

特許文献 1 :特開平 7— 165612号公報

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0006] この様に、どうしても禁煙できない人にとって、喫煙しながらでもニコチン等による毒性を軽減することができれば、人体への悪影響は低く抑えることができる。

そこで本発明者らは、ニコチンによる毒性を軽減しうる物質について種々研究を重ねた結果、意外にもタデアイ (蓼藍)の植物体の発酵物である藍染料用調製物「すくも」の水又は熱水抽出物が、ニコチンの毒性を著しく軽減しうることを見出し、さらに研究を重ねて本発明を完成した。

課題を解決するための手段

[0007] すなわち本発明は、

(1)タデ科植物に属するタデアイ (Polygonum tinctorium Lour)またはャナギタデ (Poly gonum hydropiperし)、キツネノマゴ科植物に属するリュウキユウアイ (別名：キアイ、 St orbilanthbes flaccidifoliu Ness)、トウダイグサ科物に属するャマアイ (Mercurialis lei ocarpa Siebold)、マメ科植物に属するインドアイ（Indigofera sulfruticosa)またはァブラナ科タイセィ属の 2年生草であるマツアイ（別名：ヨーロッパアイ、 Isatis tinctoria L.) の植物体の水抽出物またはこれらの植物体を発酵させて得られる藍染料用調製物の水抽出物を有効成分として含有するニコチンの毒性軽減糸且成物、

(2)藍染料用調製物が、タデアイを発酵させた「すくも」である（1)記載のニコチンの毒性軽減組成物、

(3)水抽出物が、 50〜100°Cの温水又は熱水で抽出されたものである (1)記載のニコチンの毒性軽減組成物、

(4)前記（1)記載の組成物を喫煙者に投与する喫煙によるニコチンの毒性軽減方法である。

[0008] 本発明の組成物は、タデ科植物に属するタデアイ (Polygonum tinctorium Lour)またはャナギタデ (Polygonum hydropiper L.)、キツネノマゴ科植物に属するリュウキユウァィ（別名：キアイ、 Storbilanthbes flaccidifoliu Ness)またはトウダイグサ科植物に属するャマアイ (Mercurialis leiocarpa Siebold)、マメ科植物に属するインドアイ (Indigotera su flfruticosa)、またはアブラナ科タイセィ属の 2年生草であるマツアイ (別名：ヨーロッパアイ） (Isatis timctoria L.)の植物体の水抽出物またはこれらの植物体を発酵させて得られる藍染料用調製物の水抽出物である。ャナギタデは葉の色によりべ-タデとも呼ばれ、また葉の色が緑色の場合にはァオタデとも呼ばれる力いずれも子葉である。植物体とは、葉 (子葉を含む)、茎、根、花、果実を含む概念であり、生植物体、それらの乾燥物であってもよい。この植物体を水で抽出したものが「水抽出物」である。特にタデアイの葉や茎を乾燥、発酵させて得られる藍染料用調製物「すくも」は本発明の水抽出物の原料として好ましいものである。

[0009] 「藍染料用調製物」とは、上述の藍の原料植物または藍染料用調製物の物理的または化学的処理による加工物の全てを含み、原料および製造方法の如何は問わない。

[0010] 染料の製造工程でタデアイ力も作られる「すくも」と呼ばれる藍発酵物は、アイの葉' 茎を収穫し、水洗してきざみ、乾燥した後、水をかけて 2〜3ヶ月間発酵させた赤黒い腐葉土のような形状のもので、古来藍染料調製物として用いられてきたものである。この発明で用いる藍染料用調製物である「すくも」の製造方法の概略は次の通りである

[0011] 3月上旬にタデアイの種子を蒔き、約 1ヶ月後に間引きを行う。 5月に約 50cmに生長した苗を本植えする。 6月下旬、花の蕾がでる直前に葉を刈り、天日で乾燥して細断する。 9月、この乾燥葉に少量の水を打っては攪拌し、必要により筵を被せて 35〜38 °Cで発酵させる。 2〜3ヶ月ほどの間にこの水打ちと撹拌を 3〜4日に一度の割合で繰り返しながら発酵させえると黒い腐葉土の様な物が得られる。それが「すくも」と称されるものである。

[0012] 得られた「すくも」を 10〜100重量倍の水、好ましくは海洋深層水（水深 200mより深い所にある海水）中に入れ、室温もしくは 50〜100°C、好ましくは 60〜85°Cの熱水に 2 日間ほど浸漬する。これを遠心分離し、上澄液をミリポアフィルターでろ過して除菌する。このようにして得られたものを「すくも水抽出液」と称することがある。

[0013] 「すくも水抽出液」にエタノールを添加していくと沈殿を生じる。また「すくも水抽出液」は、三価の鉄イオンを含む、 1% FeCl、 1%フェリシアン化カリウム（へキサシァノ鉄（

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III)酸カリウム）水溶液の添加によって青色沈殿を生成するので、還元性のフエノール性 OH基を有している。

[0014] 「すくも水抽出液」をさらに、 110°Cで 10分間程度加熱滅菌してもよい。「すくも水抽出液」を蒸発乾固したものが「すくも抽出物」である。これを粉砕すると黒褐色の粉末となる。この粉末は、多糖類を含む複数の化合物の混合物と考えられ、熱に安定で、水、アルカリ水には易溶であり、酸や有機溶媒には溶けにくい。

「すくも抽出物」は、メタノール、ピリジン、ァセトニトリルなどの有機溶媒には溶解せず、 0.1N NaHCO水溶液、 0.5N NaOH水溶液等のアルカリ性水溶液、あるいは水に溶

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解する。

[0015] 収穫された植物体を乾燥した後、発酵工程を経ずに微粉末に粉砕し、加圧、加熱滅菌したものを「藍乾燥葉 ·茎 ·種子粉末」と称することがある。藍乾燥葉を温水又は熱水で抽出物した生葉抽出液を乾燥したものが「生葉抽出物」と称するものである。

[0016] 本発明の組成物は、植物体の水抽出液のまま、又は必要により適当な濃度に調整し、又は濃縮乾固して、経口的に投与したり、またその水溶液を注射、注入等非経口的に体に投与してもよぐ組成物含有液をミストとして粘膜から吸収させてもよい。一且抽出液を乾固して粉末としたものをそのまま、または再度水溶液として投与又は摂取してもよい。本発明の組成物は乾燥物および水溶液も臭いはほとんどなぐ味も無味に近い。

[0017] 乾燥組成物のラットにおける静注の LD は 10g/kg以上で、極めて低毒性である。

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本発明の組成物は、ニコチン溶液と混合しただけではニコチンの毒性減弱効果は認められず、組成物が体内へ吸収され、体内にあるニコチンレセプターとニコチンとの結合を阻害し、体内からそのままあるいは無毒物質として代謝、排泄させることによりその効果が発揮されると考えられる。

[0018] 本発明の具体的な使用方法を挙げれば次の通りである。（1)タバコの製造過程で、タバコ葉に 0.001〜10%に希釈した「すくも抽出物溶液」を噴霧したり、タバコの葉を溶液に浸漬して組成物をタバコ葉に染み込ませる、またはタバコのフィルターに染み込ませる。（2)室内用加湿器に「すくも抽出物溶液」を加え、ミストとして呼吸器粘膜から体内に摂取させる。 (3)室内の消臭剤の揮発性成分に本組成物を含ませて揮発させ、常時体内に摂取できるようにする。（4)室内用壁紙'布あるいは塗料に本組成物を含ませ揮発させて常時体内に摂取させる。 (5)自動車の内装材に本組成物を含ませ常時揮発させて体内に摂取させる。（6)人工観葉植物葉あるいはその基材に本組成物を含ませておき、揮発させて体内に摂取させる。（7)エアーコンディショナーの空気の流通路に本組成物溶液を静置 ·添着しておき、室内に常時吹き込み体内に摂取させる。（8)食品中、たとえばチューイングガム、キャンディー、ジュース等に本組成物を適当量添加して、経口的に体内に摂取させる。（9)本組成物を含む錠剤、力プセル剤、丸剤、液剤、チュヮブル剤、粉末剤、顆粒、パッチ剤、クリーム剤、ゲル剤など、通常の医薬として、経口的、非経口的に投与する。

本発明の組成物の摂取、投与時期は、その利用形態によって異なるが、タバコを一服吸う前 30〜0分、特に 20〜5分前に摂取することが効果的であり、その投与量、摂取量は、紙卷タバコ 1本当たり、「すくも抽出物」（乾燥物）として 0.0001〜lmg、好ましくは 0.001〜0.5mgを一応の目安とすればよ!ヽ。

発明の効果 [0019] タバコへの依存性により、禁煙が実行できない人や喫煙者の側にいることにより受動的に吸入させられる人のニコチンの毒性を軽減させることはニコチンに起因する疾病の予防、治療に大いに意味がある。特に妊婦の受動喫煙によるニコチンの毒性を減弱させることは、母体と胎児にとって極めて意義のあることである。

発明を実施するための最良の形態

[0020] 次に実施例、試験例を挙げて本発明をより具体的に説明する。

実施例 1

[0021] 「タデアイ生葉抽出物」の調製

タデアイの葉を採取し、水でよく洗い、最後に蒸留水で洗って乾燥し、 15.1gの乾燥物を得た。これをみじん切りにし、乳鉢ですりつぶし、蒸留水を加え、ヒーター付きスターラーで 75〜80°Cに加熱しながら、 10分間攪拌した。ヌッチェにろ紙を敷き、前記摩砕物をァスピレーターで吸引ろ過した。吸引し終わると毎回ろ紙を替え、残渣をもう一度集め、乳鉢ですりつぶして 75〜80°Cの熱水による抽出を繰り返した。この操作を 6回繰り返すことにより得られた「タデアイ生葉抽出液」は、合計 845 mLとなった。その熱水抽出液から、 50mLとり出し、 200mLのナス型フラスコに入れてエバポレーターにかけ、水分を蒸発させた。容量が残り 10mL位になった時、さらに抽出液 50mL を加え、再度エバポレーターより濃縮した。これを 5回繰り返したところで、別のナス型フラスコに入れ替え凍結乾燥器 (Eyela freeze dryer FD- 1)で予備凍結後、約 27時間で乾燥し、 0.35gのタデアイ生葉抽出物 (凍結乾燥品）を得た。

上記熱水抽出液の濃縮操作を 6回 (合計 300mL)繰り返した後、約 35時間凍結乾燥して、 0.41gの凍結乾燥品を得た。

すなわち、熱水抽出液 550mLから、 0.76gの「タデアイ生葉抽出物」（凍結乾燥品）が得られた。

実施例 2

[0022] 「すくも海洋深層水抽出物」の調製

タデアイの葉'茎混合物を適宜の大きさに裁断、粉末化したのち約 3ヶ月間発酵させて得られた「すくも」 50gを海洋深層水（ミネラル水） 1Uこ 1日浸漬した後、 10,000rp mで、 10分間遠心分離した。さらに、 0.2ミリミクロンのミリポアフィルターでろ過して「すくも海洋深層水抽出液」約 900mLを得た。この「すくも海洋深層水抽出液」を実施例 1 に準じて濃縮、凍結乾燥し、約 9gの「すくも海洋深層水抽出物 (凍結乾燥品)」を得た実施例 3

[0023] 「すくも海洋深層水抽出物」の調製

タデアイの葉'茎混合物を適宜の大きさに裁断、粉末化したのち約 3ヶ月間発酵させた「すくも」 50gを海洋深層水 1Lに 1日浸漬した後、 10,000rpmで 10分間遠心分離した。この上澄液を 0.2ミリミクロンのミリポアフィルターでろ過して除菌した後、さらに、 11 0°Cで 10分間加熱滅菌した。この「すくも海洋深層水抽出液」を実施例 1に準じて濃縮、凍結乾燥し、約 11重量％の「すくも海洋深層水抽出物 (凍結乾燥品)」を得た。実施例 4

[0024] 「すくも熱水抽出物」の調製

タデアイの葉'茎混合物を適宜の大きさに裁断、粉末化したのち 3ヶ月間発酵させて得られた「すくも」 80gを約 75°Cの水 800mLで 10分間抽出し、 7,500rpmで、 30分間遠心分離した。上澄みをさらに、 0.2ミリミクロンのミリポアフィルターでろ過した後、残渣を 3回約 75°Cの水で抽出し抽出液を合わせて「すくも熱水抽出液」約 2 , 600mLを得た。この「すくも熱水抽出液」を濃縮後、実施例 2に準じて凍結乾燥し、約 26gの「すくも熱水抽出物」を得た。

[0025] [試験例 1]

「すくも熱水抽出物」および「タデアイ生葉抽出物」のニコチン毒性軽減効果 (1)マウスを用いた「すくも熱水抽出物」の経口投与試験

使用動物： ddy系マウス、 6週令、平均体重 22g、各群 6匹

ニコチン投与量： 65mg/kg

「すくも熱水抽出物溶液」：約 lmL中に実施例 4で得られた「すくも熱水抽出物」を 10、 20、 40mg/kg溶解してヽる「すくも熱水抽出物溶液」を調製した。

投与方法： 10、 20、 40mg/kgの「すくも熱水抽出物」を含有する約 lmLの溶液を胃ゾンデによりマウスの胃に注入した。 10分後にニコチン 65mg/kg溶解した溶液約 lmLを同じく胃ゾンデによりマウスの胃に注入し、 12時間にわたり生存の有無を確認した。その結果を表 1に示す。

[0026] [表 1]

「すくも熱水抽出物」の経口投与によるニコチンの毒性軽減作用

表 1から明らかなように、ニコチン 65mg/kgをマウスに経口投与するに先立ち、 10分前に「すくも熱水抽出物溶液」を経口投与しておくとマウスの生存割合は「すくも熱水抽出物」に用量依存的に増加した。

[0027] (2)マウスを用いた「タデアイ生葉抽出物」および「すくも熱水抽出物」の腹腔内投与実験

使用動物： C57LB/CrSLc系マウス、 7週令、平均体重 22g、各群 6匹

ニコチン投与量： 3.8〜7.6 μ g/kg

「タデアイ生葉抽出物溶液」及び「すくも熱水抽出物溶液」の調製:約 100 L中に「タデアイ生葉抽出物」 40.0mg/kg又は「すくも熱水抽出物」 1.0mg/kgを溶解した水溶液を調製した。

投与方法:生理的食塩水、「タデアイ生葉抽出物」 40.0mg/kg又は「すくも熱水抽出物」1.0mg/kgを lmL生理的食塩水に溶解した溶液を注射器によりマウスの腹腔内に投与した。その約 10分後にニコチン 3.80 g/kg、 5.06 ^ g/kg, 6.34 g/kgおよび 7.60 g/kgを溶解した生理的食塩水を腹腔内投与し、 12時間にわたり生存の有無を確認した。その結果を表 2に示す。

[0028] [表 2] 「タテ 'アイ生葉抽出物」及び「すくも熱水抽出物」の腹腔内投与によるニコチンの毒性軽減作用

[0029] 試験例 2 :ニコチンによる好中球貪食活性阻害に対する防止効果実験

( 1)黄色ブドウ球菌死菌体の調製方法

(_a)試薬調製

(a— 1) 0.1%ゼラチンハンクス緩衝液（Gelatin Hanks Buffer)の調製

ハンクス Hanks液（日水製薬 (株）製) 4.90gを純水 400mLで溶解したものと、ゼラチン (MERCH製) 0.5gを純水 lOOmLで加熱溶解したものをメスフラスコでよく混合し、炭酸水素ナトリウム（半井ィ匕学薬品 (株)製)を 0.3g加えて pHを約 7.4にあわせ、クリーンベンチ内で滅菌済試験瓶を用いてろ過滅菌 (Coster Bottle Top Filter)を行った。これを 0. 1%ゼラチンハンクス緩衝液とした。

[0030] (a 2)染色液レフレルメチレンブルー液の調製

99%アルコール 90mLに純水 10mLをカ卩え、 90%アルコールとした。また、水酸化力リウム (特級：半井ィ匕学薬品 (株)製) O.lgを純水 8.4mLに溶かし、 1%ΚΟΗ液とした。メチレンブルー（和光純薬工業 (株)） 1.4gを 90%アルコール lOOmLに溶かしてメチレンブルー原液とし、メチレンブルー原液 30mLと l%KOH lmL、純水 lOOmLをよく混合し、レフレルメチレンブルー液とした。

[0031] (b)培地の調製

まず、普通寒天培地（日水製薬 (株)製)を三角フラスコに 7.0g測り、純水 200mLをカロえて混合した。これを 121°Cで 20分間オートクレープ（トミー工業 (株)製: AUTO CLA VE SS235)に力 4ナ滅菌した。これをクリーンベンチ内で熱いうちに滅菌済みシャーレに均等に分け入れ、固めて平面培地とした。

[0032] (c)黄色ブドウ球菌死滅体の調製白金耳を加熱殺菌して冷ました後、黄色ブドウ球菌株 (S. aureus 209P)力菌を取り出し、平面培地にのばし、 37°Cで 10日間培養した。培養して黄色に変色した菌から、一つのコロニーを集菌し、平面培地に植え替え、再び 37°Cで 72時間培養した。操作はすべてクリーンベンチ内でおこなった。 72時間後、次のようにして集菌した。

黄色ブドウ球菌を培養した平面培地に 0.1%ゼラチンノヽンタス緩衝液を lmL(2mL)加え、白金耳で培地力菌を力き取り懸濁液とした。この懸濁液から 10 Lを別の試験管に取り出し、 0.1%ゼラチンハンクス緩衝液 990 Lをカ卩え、よく混合して 100倍希釈液を作成し、さらにこの混合液から 500 Lを取り出し、染色液レフレルメチレンブルー液 500 Lを加えて 5分間染色した。染色した液力少量を計算盤に注ぎ、顕微鏡で菌数を数え、計算によりもとの菌数を求めた。懸濁液は 121°Cで 20分間オートクレープにかけ、黄色ブドウ球菌死菌体とした。

血球計算盤 6区画分の菌数をカウントし、平均をとつた。各菌数計算は下記の式により希釈溶液の補正をして、元の菌数を求めた。

57(平均) X 25 X 100 X 10⁴ X 2 X 5

=1.425 Χ 10^ω (個/ mL)

[0033] (2)ニコチン '黄色ブドウ球菌死菌体懸濁液の調製方法

ニコチン原液は 0.1%ゼラチンハンクス緩衝液 900 Lにニコチン 100 gを加え、 100 μ g/mL濃度に調製し、これを用いて表 3に示す各濃度のニコチン溶液を作成した。マイクロチューブに各濃度のニコチン溶液を加え、黄色ブドウ球菌死菌体懸濁液は予め調製しておいたものを使用し、 1.425 X 10^1Q個/ mLが、 4.0 X 10⁸個/ mLになるよう計算し、〈0.04/1.425=0.0280701πιί=28 /ζ ί〉各試験管について 0.1%ゼラチンハンクス緩衝液で調製し、ボルテックスミキサー（ェムエス機器 (株)製）にて混合し懸濁した。その組成を表 3に示す。

[0034] [表 3] ·黄色ブドウ球菌死滅体懸濁液」組成（黄色球菌死滅体 4 X 10⁸ Ce l l s )

[0035] (3)「タデアイ生葉抽出物，黄色ブドウ球菌死菌体懸濁液」の調製方法

タデアイ生葉原液は 0.1%ゼラチンハンクス緩衝液 1000 μ Lにタデアイ生葉抽出物 0. 0800gを加え、 80mg/mL濃度に調製し、各濃度の「タデアイ生葉抽出物溶液」を作成した。

マイクロチューブに各濃度の「タデアイ生葉抽出物溶液」を加え、既作成の黄色ブドウ球菌死菌体懸濁液を使用して、菌体 1.425 X 10¹⁽⁾個/ mLが、 4.0 X 10⁸個/ mLになるよう (0.04/1.425=0.0280701=28 L)0.1%ゼラチンハンクス緩衝液で調製し、ボルテックスミキサー (ェムエス機器 (株)製）にて混合し懸濁した。これを「タデアイ生葉抽出物'黄色ブドウ球菌死菌体懸濁液」とした。その組成を表 4に示す。

[0036] [表 4]

「タテ 'アイ生葉抽出物 · 黄色ブドウ球菌死滅体懸濁液濃度」の組成

(黄色球菌死滅体 4 X 10⁸ Cc l l s )

(4)「すくも熱水抽出物 ·黄色ブドウ球菌死菌体懸濁液」の調製方法

「すくも熱水抽出物原液」は 0.1%ゼラチンハンクス緩衝液 1000 μしに「すくも熱水抽出物」 0.0020gをカ卩え、 2mg/mL濃度に調製したものである。この「すくも抽出物原液」を水で希釈して各濃度の「すくも熱水抽出物溶液」を作成した。

マイクロチューブに各濃度の「すくも熱水抽出物溶液」を加え、既作製の黄色ブドウ球菌死菌体懸溶液を使用して菌体 1.425 X 10^1Q個/ mLが、 4.0 X 10⁸個/ mLになるよう（ 0.04/1425=0.0280701mL=28 μ L)0.1%ゼラチンハンクス緩衝液で調製し、ボルテックスミキサー (ェムエス機器 (株)製)）にて混合し懸濁した。これを「すくも抽出物'黄色ブドウ球菌死菌体懸濁液」とした。その組成を表 5に示す。

[0038] [表 5]

「すくも熱水抽出物 ·黄色ブドウ球菌死滅体懸濁液濃度」の組成

(黄色フ' Vゥ球菌死滅体 4 X 10⁸ Ce l l s/mL)

[0039] (5)白血球の調製

(a)試薬調製

トリス—塩ィ匕アンモ-ゥム緩衝液 (溶血液)の調製

HCL (和光純薬工業 (株)製) 4.26mLに純水 45.74mLをカ卩え、これを IN HCLとした。トリス緩衝液（ナカライテクス (株)製） 2.06gを純水 80mLに溶かし、 IN HCLをカ卩えて pH7. 65に調整し、全体量を lOOmLとしたものと塩ィ匕アンモ-ゥム (和光純薬工業 (株)製) 4.1 5gを純水 500mLに溶かしたものを 1:9の割合で混合し、 PH7.6に調整した。試薬瓶に入れて 121°Cで 20分間オートクレーブにかけ滅菌した。

[0040] RPMI 1640培地の調製

RPMI 1640(日水製薬 (株)製) 10.4gと炭酸水素ナトリウム (半井ィ匕学薬品 (株)製) 1.2g 、結晶ペニシリン Gカリウム (明治製菓 (株)製) 10万単位、硫酸ストレプトマイシン（明治製菓 (株)製) O.lgを 950mL程の純水とよく混合した。全体で lOOOmLの培地ができるように、純水と 1Nの塩酸を数滴加え、 PH試験紙 (BTB試験紙)を用いて pHを 7.1〜7.4に合わせた。これを、クリーンベンチ内で滅菌済み試験瓶を用いて濾過滅菌 (Coster B uffer Top FILTER)し、 RPMI 1640培地とした。また、市販の滅菌済み RPMI 1640溶液 ( Sigma (株)製)も使用した。 [0041] (b)好中球の調製

へパリン加採血した健康人末梢血 20mLを単一複分割培地 mono- poly resolving me dium (大日本製薬 (株)製) 5mLの入った滅菌済み丸底スピッツ管に 5mLずつゆっくり入れ、 20°C 1500rpmで 30分間遠心分離器 (冷却遠心機日立工機 (株)製: 05PR-22)で遠心分離した。分離した好中球をパスツールピペットにて取り分け一つにまとめ、 0.1%ゼラチンノヽンタス緩衝液をカ卩えて 4°C、 1500rpmで 15分間遠心分離し、洗浄した。遠心後、上清を吸引して取り除き、沈殿した細胞にトリス塩ィ匕アンモ-ゥム緩衝液を 30mL 加えてよく攪拌し、室温で 15分間放置して溶血させた。その後、 4°C 1500rpmで 15分間遠心分離して細胞を洗浄した。さらに RPMI 1640培地を 20mLカ卩えて、攪拌したあと、計算盤に少量注ぎ、位相差顕微鏡 (OLYMPUS IX70-22PH)で細胞数を数え、好中球の細胞数力 .O X 10⁶ cells/mLになるように計算して RPMI 1640培地の量を決定した。残りの溶液を再び 4°C、 1500rpmで 15分間遠心分離し、上清を除去した後、計算にて求めた量の RPMI 1640培地を加え、さらに全体の 10%容量の非働化 Fetal bovine serum (GIBCO Laber atories)を加えた。以上の操作を測定時毎に行った。

[0042] 健康人末梢血を比重法によって 4層に分離し、下から赤色をした赤血球 (RBC)層、白色の好中球 (Neutrophil)層、同様に白色の単球 (Monocyte)層、黄色みを帯びた血清層が得られた。このうちの好中球層を取り出した。好中球の細胞数が 5.0 X 10⁶cells /mLになるように調製した。細胞は実験する日の朝に、健常人より採取して細胞を分離し 7こ。

[0043] (6)好中球貪食活性測定方法

(a)ニコチンによる好中球貪食活性阻害への影響

上記で調製した好中球懸濁液 (A)200 Lを cover slip (三光純薬 (株)製: 13mm、 roun d)上で、 COインキュベーター (三洋電機 (株)製: MCO-96)にて 90分間、 37°C、 CO 4.

2 2

9%で培養し、吸着させた。その後、 RPMI 1640培地で 3回洗浄し、 cover slip上に吸着されなかった好中球を除去した。その後、 0〜1.0 /z L/mLの各濃度に調製した-コチン混合液を上記好中球の cover slipに加え、 COインキュベータ一にて 60分間、 37°C

2

、 CO 4.9%で培養し、好中球の貪食実験を行なった。

2

インキュベート後、 RPMI 1640培地にて 3回洗浄し、メタノールに約 10秒間浸漬して固定し、スライドガラスにのせて自然乾燥させた。その後、染色液レフレルメチレンブルー液 200 Lをのせ 1分間放置して染色後、純水にて洗浄し乾燥させた。これを顕微鏡 (Nikon社製 AFX- 11)、対物レンズ (ORYMPUS JAPAN社製: X 100)を用いて 1000 倍として観察した。各濃度について無作為に 120個 (30 X 4ケ所)の好中球を選び、その細胞内に貪食された菌数を数え、その平均値と標準偏差を求めた。

[0044] (b)「タデアイ生葉抽出物溶液」及び「すくも熱水抽出物溶液」のニコチンの好中球貪食活性阻害に及ぼす影響

上記で調製した好中球懸濁液 (A) 200 μ Lを cover slip (三光純薬 (株)製： 13mm、 ro und)上で、 COインキュベーター（三洋電機 (株)製: MCO— 96)にて 90分間、 37°C、 C

2

〇 4.9%で培養し、吸着させた。 RPMI 1640培地で 3回洗浄し、 cover slip上に吸着

2

されなかった好中球を除去した。この cover slip上の好中球に「タデアイ生葉抽出物溶液」及び「すくも溶液」を添加し、 10分後に 0〜1.0 /z L/mLの各濃度に調製したニコチン混合液を上記好中球の cover slipに力！]え、 COインキュベータ一にて 60分間、 37

2

°C、 CO 4.9%で培養し、好中球の貪食実験を行なった。

2

[0045] インキュベート後、 RPMI1640培地にて 3回洗浄し、メタノールに約 10秒間つけて固定して、スライドガラスにのせ自然乾燥した。その後、染色液レフレルメチレンブルー液 200 Lをのせ 1分間放置して染色後、純水にて洗浄し乾燥させた。これを顕微鏡（ Nikon社製 AFX- 11)、対物レンズ（ORYMPUS JAPAN社製： X 100)を用いて 1000倍として観察した。各濃度について無作為に 120個（30 X 4ケ所)の好中球を選び、その細胞内に貪食された菌数を数え、その平均値と標準偏差を求めた。

[0046] (7)貪食活性測定結果

(a)ニコチンの好中球貪食活性に及ぼす影響

黄色ブドウ球菌死菌体に、 0〜1.0 /z L/mLの 6段階の濃度に調製したニコチン溶液をカロえてヒト好中球に貪食させ、メチレンブルーで染色させた後、顕微鏡 (Nikon社製： AFX-II)、対物レンズ（ORYMPAS JAPAN社製： X 100)を用いて 1000倍として観察した。各濃度について無作為に 120個 (30 X 4ケ所)の好中球を選び、その細胞内に貪食された菌数をカウントした。その菌数の平均値と標準偏差を求め、その結果を表 6 に示した。 [0047] (b)「ニコチン +タデアイ生葉抽出物溶液」及び「ニコチン +すくも熱水抽出物溶液」の好中球貪食活性に及ぼす影響

ニコチン溶液添カ卩 10分前に、「タデアイ生葉抽出物溶液」又は「ニコチン +すくも熱水抽出物溶液」を加え、次いで黄色ブドゥ球菌死菌体に、 0〜1.0 μ L/mLの 6段階の濃度に調製したニコチン溶液を加えてヒト好中球に貪食させ、メチレンブルーで染色させた後、顕微鏡 (Nikon社製: AFX- 11)、対物レンズ（ORYMPAS JAPAN社製： X 100 )を用いて 1000倍として観察した。各濃度にっ、て無作為に 120個（30 X 4ケ所)の好中球を選び、その細胞内に貪食された菌数をカウントした。その菌数の平均値と標準偏差を求め、その結果を表 6に示した。

また、ニコチン、「ニコチン +タデアイ生葉抽出物溶液」および「ニコチン +すくも熱水抽出物溶液」におヽては、それらをレ、ずれも含まなヽ場合の値 (初期値)を 100として、試料添カ卩による貪食活性の変化を表 7に示した。

[0048] [表 6]

ニコチンによる好中球貪食活性阻害作用（平均値土標準偏差）

[0049] [表 7] 「タテ 'アイ生葉抽出物」および「すくも熱水抽出物」によるニコチンの

好屮球貪食活性阻害作用軽減効果

(初期値を 100とした場合の貪食活性の変化）（平均値 ±標準偏差)

[0050] 前記の通り、「ニコチン群」、「ニコチン +タデアイ生葉抽出物群」および「ニコチン + すくも熱水抽出物群」の 3群から得られた貪食活性の 2元配置分散分析を行った。その結果、「ニコチン群」と「ニコチン +タデアイ生葉抽出物群」とを比較したところ、群とニコチン濃度の因子に有意な交互作用が認められた (F=94.02、 P〈0.001)。また、この有意な交互作用下において両群およびニコチン濃度それぞれの単純主効果に有意な差が認められた（群： F=5.60、 P=0.018、ニコチン濃度： F=103.84、 P〈0.001)。同様に、「ニコチン群」と「ニコチン +すくも熱水抽出物群」とを比較した結果、これらの群とニコチン濃度の因子に有意な交互作用が認められた (_F=114.82、 Pく 0.001)。また、この有意な交互作用下において両群およびニコチン濃度それぞれの単純主効果に有意な差が認められた (群： F=68.85、 P<0.001)。

これらの結果から、「ニコチン群」と比較して、「ニコチン +タデアイ生葉抽出物群」及び「ニコチン +すくも熱水抽出物群」には、好中球の貪食活性を賦活させる作用があることが確認された。

[0051] 試験例 3：「すくも熱水抽出物」の喫煙時の指先温度に及ぼす影響

(1)試験概要喫煙者 3名（一日平均 20本程度の紙巻きタバコを吸う人で、いずれも 30歳代の男性 )および非喫煙者 3名（20歳代男性 2名、 30歳代男性 1名）を被験者とし、喫煙前に水を飲ませた場合と、「すくも熱水抽出物溶液」を飲ませた場合のそれぞれについて、喫煙前後の指先温度の変化を経時的にサーモグラフィ一により観察した。

[0052] (2)試験方法

実施例 4で得られた凍結乾燥物 26gを 2,574mLの水に溶解して 1%「すくも熱水抽出物溶液」とした。

健康状態良好な上記の被験者 6名を実験室（室温 24± 1°C、湿度 17± 1%)に入室させ、 10分間安静状態にした後、両手の甲側の温度をサーモグラフィ一により測定し、市販の飲料水 50mLを飲ませた。 30分経過した時各被験者にタバコ (ハイライト、タール 17mg、ニコチン 1.4mg)を 5服喫煙させ (ただし、非喫煙者には煙を口に含ませるだけにした。）、その後 3分おきに 18分経過するまで被験者の左右の手の指先（中指)の温度をサーモグラフィ一により測定した。

前記試験終了 2時間後、上記の被験者 6名を前記と同じ実験室 (室温 24± 1°C、湿度 17± 1%)に入室させ、 10分間安静状態にした後両手の甲側の温度をサーモグラフィ一により測定をしてから、前記「すくも液」 50mLを飲ませた。 30分経過した時各被験者にタバコ（ハイライト、タール 17mg、ニコチン 1.4mg)を 5服喫煙させ (ただし、非喫煙者には煙を口に含ませるだけにした。）、その後 3分おきに 18分経過するまで被験者の左右の手の指先（中指)の温度をサーモグラフィ一により測定した。その結果を表 8 および表 9にまとめた。

[0053] [表 8]

9]

[0055] (3)試験結果

(1)「すくも熱水抽出物溶液」を投与しない場合の喫煙時の体温変化

全被験者において、喫煙による末梢の血管収縮による体温低下が見られたが、指先における温度低下パターン、レベルは喫煙者と非喫煙者において多少異なっていた。

喫煙者では喫煙 6分後で最低値付近に達し、 18分後まで持続していた。一方、非喫煙者においては 12分後まで低下し続け、それから少しずつ快復しだしたが、 18分後でも完全回復には至らな力つた。また、低下レベルについては、喫煙者の方がより顕著であった。

(2)「すくも熱水抽出物溶液」を投与した場合の指先温度変化

すくも摂取における有効性は、多少個人差がみられたものの全被験者において顕著な体温の低下抑制が観察された。

喫煙者では喫煙 6分後より体温回復が見られ、非喫煙者にお!/、ては 6〜9分後まで僅かに体温が低下したものの、 12分後にはほぼ安静状態にまで回復していた。表 8および表 9の結果から、喫煙者、非喫煙者ともに、「すくも熱水抽出物溶液」を投与した後に喫煙した場合の指先の温度低下の度合いは、「すくも熱水抽出物溶液」を投与しな、で喫煙した場合の指先の温度低下の度合ヽに比して遙かに低く、喫煙前の「すくも熱水抽出物溶液」の投与が、喫煙による体温低下を抑制していることが明らかとなった。

産業上の利用可能性

[0056] 喫煙による健康阻害の実体が明らかにされるに従って、喫煙者の多くは禁煙を試みるものの、タバコに含まれるニコチンの依存性により、多くの人が挫折の道を迪る。そこで次善の策として、喫煙をしてもニコチンの毒性を軽減することができれば-コチンによる健康阻害をいくらかでもくい止める事ができる。本発明の組成物は溶液として、タバコ葉に染み込ませたり、加湿器の水に加えてミストとして呼吸粘膜から吸収させたり、製剤化した錠剤、カプセル剤、液剤などの薬剤として、又はガム、ジュースなどの食品に添カ卩して、経口的に体内に摂取することによりニコチンの毒性を大幅に軽減することが可能である。

Claims

請求の範囲

[1] タデ科植物に属するタデアイ (Polygonum tinctorium Lour)またはャナギタデ (Polygo num hydropiper L.)、キツネノマゴ科植物に属するリュウキユウアイ（別名：キアイ、 Stor bilanthbes flaccidifoliu Ness八トウグイグサ科植物に属するャマアイ (Mercurialis leioc arpa Siebold)、マメ科植物に属するインドアイ（Indigofera suflfruticosa)またはアブラナ科タイセィ属の 2年生草であるマツアイ（別名：ヨーロッパアイ、 Isatis tinctoria L.)の植物体の水抽出物またはこれらの植物体を発酵させて得られる藍染料用調製物の水抽出物を有効成分として含有するニコチンの毒性軽減組成物。

[2] 藍染料用調製物が、タデアイを発酵さてた「すくも」である請求項 1記載のニコチンの毒性軽減組成物。

[3] 水抽出物が、 50〜100°Cの温水又は熱水で抽出されたものである請求項 1記載のニコチンの毒性軽減組成物。

[4] 請求項 1記載の組成物を喫煙者に投与する喫煙によるニコチンの毒性軽減方法。