CN110279717A

CN110279717A - 鳄鱼甲有效组分的制备及其抗氧化、抗肝纤维化的应用

Info

Publication number: CN110279717A
Application number: CN201910512218.8A
Authority: CN
Inventors: 傅贵; 范明; 赵凤兰; 孙金纲
Original assignee: Lanxi Lishun Biological Co Ltd
Current assignee: Second Hospital of Dalian Medical University
Priority date: 2019-06-13
Filing date: 2019-06-13
Publication date: 2019-09-27
Anticipated expiration: 2039-06-13
Also published as: CN110279717B; CN112716980A

Abstract

本发明提供鳄鱼甲有效组分的制备方法，属于生物技术领域，包括提供包含水和粉状鳄鱼甲的浆体；并将浆体通过高压脉冲以获得有效组分；及回收有效组分；上述有效组分中含有多糖和蛋白成分；还制备一种包括苦参碱类生物碱、鳄鱼甲有效成分及传递介质的药用组合物。本发明提供的鳄鱼甲有效组分制备方法能增加浆体流动性，避免电场中局部高温破坏物质活性，促进有效成分透皮吸收效率；药用组合物制备方法能降低药物有效成分渗漏量和提高包封率，增加介质膜层流动性和稳定性，增强角质层弹性，降低对皮肤刺激性和过敏性，提高安全性；上述鳄鱼甲有效组分在抗氧化或抗肝纤维化药物或食品中的用途，药用组合物在抗氧化或抗肝纤维化药物中的用途。

Description

鳄鱼甲有效组分的制备及其抗氧化、抗肝纤维化的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及鳄鱼甲有效组分的制备及其抗氧化、抗肝纤维化的应用。

背景技术

肝纤维化(Hepatic fibrosis，HF)是各种慢性肝病发展成为肝硬化、肝癌的必经阶段，也是在肝病发展过程中一个可逆的阶段，因此成为肝病治疗的首选靶向性区段。肝纤维化为肝脏受到损伤后组织在自我修复过程中出现的代偿性产物，最具有代表性的是肝组织内细胞外基质(Extracellular Matrix，ECM)的过度沉积，纤维增生形成网状间隔阻碍了肝细胞与血液之间正常的物质与能量交换，大量肝细胞出现坏死，形成肝硬化；此外，自由基通过诱导脂质过氧化反应，引起肝纤维化细胞的分化和增殖，炎症反应的产生和持续作用，是诱发和加剧肝纤维化的重要因素。肝纤维化继续恶化导致肝硬化甚至肝癌，所以“肝炎-肝纤维化-肝硬化-肝癌”这一链条被公认为是各种慢性肝病导致严重后果的共同途径。迄今的研究已经证实肝纤维化经过适当的治疗是可以逆转的，只要能够减缓或阻止肝纤维化的发生，就可以减轻或治愈肝脏损伤病理进程。

目前，对肝纤维化发病机制的研究，在世界范围内取得突破性的进展，肝纤维化治疗研究主要集中在以下几个方面：1、保护肝细胞，抑制HSC激活，2、抑制ECM合成，促进其降解，3、抑制细胞因子活性，调节信号通路，然而在肝纤维化的预防和治疗方面却依然是科学界所面临的巨大挑战。

我国近年来广泛开展了中医药抗肝纤维化的研究，展示了天然药物用于肝纤维化治疗的巨大潜力。多糖因具有优异的抗氧化、清除自由基等作用，且具有高效、低毒、高生物利用率的特点，在预防和治疗由自由基引起的疾病如肿瘤、炎症等方面显示出独特的优越性。古代医籍和现代医学研究都表明，鳄鱼甲能够调和脾胃、疏肝解郁，含有强有力的抗癌物质和防止癌肿瘤新生细胞的生长因子，这种因子的抑癌效果是其它爬行动物的数万倍。苦参碱类生物碱(Sophora flavescens Ait.Alkaloid，SFAA)是广泛存在于豆科植物苦参、苦豆子及广豆根中的一类喹诺里西啶生物碱的总称，其在减轻肝纤维化程度的同时，可明显纠正肝内Th1细胞因子(IL-2IFN-γ)及Th2细胞因子(IL-10)的异常表达。因而将鳄鱼甲及其多糖提取物，与中药有效成分进行配伍，提高机体抗氧化、抗肝纤维化能力，为天然药物用于肝纤维化治疗提供更多途径。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能增加浆体流动性，避免电场中局部高温对热敏性物质活性的破坏，能促进有效成分的透皮效率和吸收效率的鳄鱼甲有效组分的制备方法，所制鳄鱼甲有效组分用于抗氧化或抗肝纤维化的药物或食品中的用途。

本发明的目的还在于提供一种能降低药物有效成分渗漏量和提高包封率，能增加介质膜层流动性和稳定性，能增强角质层弹性，降低药物对皮肤刺激性和过敏性，提高药用组合物安全性的含鳄鱼甲有效组分的药用组合物制备方法，所制组合物用于抗氧化或抗肝纤维化的药物中的用途。

本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

鳄鱼甲有效组分的制备方法，包括，提供包含水和粉状鳄鱼甲的浆体；并将浆体通过高压脉冲以胀破细胞获得有效组分；以及回收有效组分；

上述有效组分中含有多糖和分子量为5～80KD的蛋白成分。该制备方法通过高压脉冲将多糖和蛋白从鳄鱼甲中提取出来，避免热敏性物质被破坏，使得多糖和蛋白能够有针对性、靶向性地防治氧化应激和炎症因子诱发和加剧的肝纤维化症状，达到抗氧化抗肝纤维化的目的。

在本发明中，为了达到胀破细胞获得有效组分的目的，采取的高压脉冲操作条件为：电场强度为20～28kV/cm，脉冲数为8～12，浆体流速为10～15mL/s。更优选地，电场强度为20～25kV/cm，脉冲数为8～10，浆体流速为10～12mL/s。在浆体置于电场中时，鳄鱼甲细胞的细胞膜在强电场作用下被电击穿，产生不可修复的穿孔或破裂创伤，使细胞组织受损，打破了细胞内部的稳态，使得细胞内溶物溢出，其中包括有效组分多糖和蛋白。使用高压脉冲操作可以避免热敏性物质被高温浸渍提取方法所破坏，能够快速高效提取目标物质，并保持其生物活性，具有高效、节能、无污染的优点。

在本发明中，为了降低固液相对电流和细胞的干扰，使固液相之间交换达到平衡，浆体中粉状鳄鱼甲与水的料液比为1:20～30(g/mL)，粉状鳄鱼甲为过300～400目筛的鳄鱼甲细粉。高压脉冲电场中的流体需粉末粒度精细，否则容易堵塞装置而，影响提取效果。适当的料液比有利于粉末溶解，使得游离细胞数目增多，胞内物质渗出率增大，提取出的蛋白质和多糖也能够完全溶于水中。

本发明还提供了一种含鳄鱼甲有效组分的药用组合物的制备方法，所制药用组合物包括苦参碱类生物碱、上述的鳄鱼甲有效成分以及传递介质；

上述药用组合物的制备方法包括：

将苦参碱类生物碱和鳄鱼甲有效成分溶于溶剂后，形成第一溶液；

将传递介质溶于溶剂后，形成第二溶液；

将第一溶液与第二溶液混合形成W/O型乳剂后，减压旋蒸成膜，再进行水合处理后，即得平均粒径为120～250nm的组合物传递体；

上述第一溶液用溶剂为含有1,2-丙二醇、α-蒎烯和四甲基戊二酸的磷酸盐缓冲液。该方法通过利用传递介质类生物膜的特性和功能，将药物有效成分包封在其中，作为透皮给药载体增加药物透皮效率，促进药物吸收及长效缓释，减少了给药次数和给药频率，降低药物毒副作用和不良反应，提高了药物的生物利用度和稳定性，并且减少了用药个体差异。

在本发明中，为了提高鳄鱼甲有效成分和苦参碱类生物碱在被传递介质包覆的包封率，所用磷酸盐缓冲液中1,2-丙二醇、α-蒎烯和四甲基戊二酸的重量占比分别为0.4～1.0wt％、0.05～0.3wt％和0.1～0.15wt％。缓冲液中的1,2-丙二醇能软化磷脂膜，增加传递介质的变形性，且凝胶剂中的氮酮与1,2-丙二醇可协同起到增加药物溶解度、提高药物经皮渗透量的有益效果；α-蒎烯和四甲基戊二酸在旋转离心力下，嵌入传递介质分子层中，利用双环双键和羧基结构在空间排布中的不同位阻效应，降低了介质双分子层的不对称性，使得介质分子层形成的膜层有序且流动性强，从而增加了膜层稳定性，有利于膜层对有效成分的包封，提高了包封率，降低了药物有效成分渗漏量，另外传递介质在改变皮肤角质层脂质流动性以增加药物透皮效率时，两者能与滞留在角质层并与其中的羟基脂肪酸结合，填充角质层毛细血管细胞间隙，从而增强角质层弹性，同时使得组合物传递体的皮肤刺激性和过敏性显著降低，增加药用组合物安全性。

在本发明中，为了使传递体在旋蒸过程中成膜均匀，所用传递介质包括卵磷脂和胆固醇，其中卵磷脂与胆固醇的重量比为2.5～4:1；第二溶液用溶剂为无水乙醇。将卵磷脂和胆固醇溶于无水乙醇中，有利于形成W/O型乳剂，且磷脂和胆固醇混合使用使得乳剂旋蒸后，去除溶剂在器壁上能形成稳定均匀的膜，以增加有效成分的包封率。

在本发明中，为了使乳剂成膜均匀，采用的减压旋蒸操作条件为：温度为35～45℃，压力为-0.5～0Mpa；为了使膜相脱离容器，将传递体进行有效回收，采用的水合处理操作条件为：-5～0℃，超声1～2min后静置30～40min。在负压存在的条件下，乳剂中不同分子量的传递介质和有效成分在旋转时产生不同的离心力，之间的压强差使得传递介质变形成膜，而将有效成分包封在内，在不破坏活性的情况下，得到变形性和包封率高的传递体颗粒。

在本发明中，组合物传递体的给药方式为与药学上可接受的载体制成凝胶剂后进行外用给药；载体为包括卡波姆、氮酮和甘油的凝胶基质。更优选的，凝胶基质中卡波姆、氮酮和甘油的重量占比分别为0.5～1wt％、3～5wt％和3～5wt％。进一步优选地，外用给药主要方式为敷脐法。外用给药可以避免口服给药通过肠胃吸收分解而降低疗效的弊端，也降低了药物被酶破坏的不利影响，使药物直接通过扩散作用穿过角质层细胞，到达活性表皮被毛细血管吸收并进入体循环，提高了药物的生物利用度和稳定性，降低了毒副作用，并且减少了用药个体差异。

本发明中还提供了制得的鳄鱼甲有效组分的用途，该有效组分在抗氧化或抗肝纤维化的药物或食品中的用途。该有效成分中的多糖和蛋白能清除自由基，提高机体的抗氧化、抗炎症因子的作用，显著抑制TGF-β1诱导的大鼠肝星形细胞HSC-T6的增殖，减少细胞外基质生成，并通过增加基质金属蛋白-1(MMP-1)蛋白分泌、减少组织基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)蛋白分泌来促进细胞外基质的降解，同时减缓炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌，从而降低氧化应激和炎症反应诱发和加剧的肝纤维化程度。

本发明中还提供了制得的含鳄鱼甲有效组分的药用组合物的用途，该药用组合物在抗氧化或抗肝纤维化的药物中的用途。该药用组合物能发挥鳄鱼甲有效成分抗氧化、抗炎症因子的作用，同时能纠正肝内Th1细胞因子(IL-2IFN-γ)及Th2细胞因子(IL-10)的异常表达，减轻肝纤维化程度。

本发明的有益效果为：

1)本发明中鳄鱼甲有效成分的制备是通过高压脉冲将多糖和蛋白从鳄鱼甲中提取出来，避免热敏性物质被破坏，使得多糖和蛋白能够有针对性、靶向性地防治氧化应激和炎症因子诱发和加剧的肝纤维化症状，达到抗氧化抗肝纤维化的目的；

2)本发明中含鳄鱼甲有效组分的药用组合物的制备是通过利用传递介质类生物膜的特性和功能，将药物有效成分包封在其中，作为透皮给药载体增加药物透皮效率，促进药物吸收及长效缓释，减少了给药次数和给药频率，降低药物毒副作用和不良反应，提高了药物的生物利用度和稳定性，并且减少了用药个体差异；

3)本发明中经传递介质包封的药物有效成分渗漏量低，包封率高，介质膜层有序且流动性和稳定性强，且传递体能增强角质层弹性，对皮肤刺激性和过敏性低，药用组合物安全性高；

4)本发明的药用组合物通过外用给药可以避免口服给药通过肠胃吸收分解而降低疗效的弊端，也降低了药物被酶破坏的不利影响，使药物直接通过扩散作用穿过角质层细胞，到达活性表皮被毛细血管吸收并进入体循环，提高了药物的生物利用度和稳定性；

5)本发明中鳄鱼甲有效组分用于抗氧化或抗肝纤维化的药物或食品，药用组合物用于抗氧化或抗肝纤维化的药物，能提高机体的抗氧化、抗炎症因子的作用，显著抑制TGF-β1诱导的大鼠肝星形细胞HSC-T6的增殖，减少细胞外基质生成，并通过增加MMP-1蛋白分泌、减少TIMP-1蛋白分泌来促进细胞外基质的降解，同时减缓炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌，纠正肝内Th1细胞因子(IL-2IFN-γ)及Th2细胞因子(IL-10)的异常表达，从而降低氧化应激和炎症反应诱发和加剧的肝纤维化程度。

本发明采用了上述技术方案提供鳄鱼甲有效组分的制备及其抗氧化、抗肝纤维化的应用，弥补了现有技术的不足，设计合理，操作方便。

附图说明

图1为实施例1所得组合物传递体的粒径分布图；

图2为组合物传递体凝胶剂的累积释放度分布图；

图3为组合物传递体凝胶剂的经皮累积透过量及皮肤滞留量结果示意图；

图4为药用组合物对炎症细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6含量的影响示意图；

图5为药用组合物对HSC-T6细胞增殖的影响示意图；

图6为药用组合物对TGF-β1诱导的HSC-T6细胞TIMP-1、MMP-1表达量的影响示意图。

具体实施方式

以下结合具体实施方式和附图对本发明的技术方案作进一步详细描述：

在本发明中，为了降低固液相对电流和细胞的干扰，使固液相之间交换达到平衡，浆体中粉状鳄鱼甲与水的料液比为1:20～30(g/mL)，粉状鳄鱼甲为过300～400目筛的鳄鱼甲细粉。

在某些实施方式中，鳄鱼甲有效组分的具体制备步骤如下：将鳄鱼甲制粉过筛后，加入双蒸水制成浆体，然后将浆体置于高压脉冲电场中处理后，收集处理后的提取液，然后经4000～5000r/min离心5～10min，收集上清液，然后通过在0～4℃下透析截留和收集分子量为5～80KD的透析液，再将透析液进行冷冻干燥即得。

上述药用组合物的制备方法包括：

将传递介质溶于溶剂后，形成第二溶液；

在本发明中，苦参碱类生物碱均具有以苦参碱为代表的骨架结构的一类物质，包括但不限于苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱、槐定碱、槐胺碱等。

在本发明中，为了使传递体在旋蒸过程中成膜均匀，所用传递介质包括卵磷脂和胆固醇，其中卵磷脂与胆固醇的重量比为2.5～4:1；第二溶液用溶剂为无水乙醇。

在某些实施方式中，组合物传递体的给药方式为与药学上可接受的载体形成不同剂型并进行口服给药，药学上可接受的载体在剂型中的重量占比为0.01～80wt％。口服给药的剂型包括但不限于滴丸剂、片剂、胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、丹剂、混悬剂、粉剂。药学上可接受的载体可含有常用的赋形剂，诸如粘合剂(如明胶)、填充剂(如纤维素、甘露糖醇、乳糖等)、稀释剂、压片剂、润滑剂(如硬脂酸镁)、崩解剂(如淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、羟基乙酸淀粉钠等)、着色剂、调味剂和湿润剂(如十二烷基硫酸钠)，必要时可对片剂进行包衣。

本发明中还提供了制得的鳄鱼甲有效组分的用途，该有效组分在抗氧化或抗肝纤维化的药物或食品中的用途。

本发明中还提供了制得的含鳄鱼甲有效组分的药用组合物的用途，该药用组合物在抗氧化或抗肝纤维化的药物中的用途。

在下文中，为了帮助理解本发明，提供了以下实施例。然而，以下实施例仅用于使本发明更容易理解，而本发明的范围并不限制于在以下实例中。

实施例1：

含鳄鱼甲有效组分的药用组合物的制备方法，其具体步骤如下：

1)将鳄鱼甲制粉过300目筛后，以料液比为1:25(g/mL)的比例加入双蒸水制成浆体，然后将浆体置于电场强度为20kV/cm、脉冲数为8的高压脉冲电场中处理，浆体在电场中流速为10mL/s，收集处理后的提取液，然后经4500r/min离10min，收集上清液，然后通过在4℃下透析截留和收集分子量为5～80KD的透析液，再将透析液进行冷冻干燥，即得鳄鱼甲有效组分；

2)将鳄鱼甲有效组分和苦参碱类生物碱溶解于含有1,2-丙二醇、α-蒎烯和四甲基戊二酸的磷酸盐缓冲液中，制成第一溶液，上述缓冲液的加入量为鳄鱼甲有效组分和苦参碱类生物碱重量的3.5倍量，磷酸盐缓冲液中1,2-丙二醇、α-蒎烯和四甲基戊二酸的重量占比分别为0.5wt％、0.1wt％和0.12wt％；

3)取重量比为2.5:1的卵磷脂和胆固醇，添加3.5倍量的无水乙醇溶解，形成第二溶液；

4)将第一溶液与第二溶液混合，探头式超声处理20s形成W/O型乳剂后，于温度为45℃、压力为-0.5Mpa条件下减压旋蒸5min成膜，再添加进3倍量的磷酸盐缓冲液，于-5℃下超声1min后静置30min，即得平均粒径为120～250nm的组合物传递体。

实施例2：

1)将鳄鱼甲制粉过400目筛后，以料液比为1:23(g/mL)的比例加入双蒸水制成浆体，然后将浆体置于电场强度为23kV/cm、脉冲数为10的高压脉冲电场中处理，浆体在电场中流速为12mL/s，收集处理后的提取液，然后经5000r/min离心10min，收集上清液，然后通过在2℃下透析截留和收集分子量为5～80KD的透析液，再将透析液进行冷冻干燥，即得鳄鱼甲有效组分；

2)将鳄鱼甲有效组分和苦参碱类生物碱溶解于含有1,2-丙二醇、α-蒎烯和四甲基戊二酸的磷酸盐缓冲液中，制成第一溶液，上述缓冲液的加入量为鳄鱼甲有效组分和苦参碱类生物碱重量的4.5倍量，磷酸盐缓冲液中1,2-丙二醇、α-蒎烯和四甲基戊二酸的重量占比分别为0.8wt％、0.12wt％和0.13wt％；

3)取重量比为3.5:1的卵磷脂和胆固醇，添加5倍量的无水乙醇溶解，形成第二溶液；

4)将第一溶液与第二溶液混合，探头式超声处理30s形成W/O型乳剂后，于温度为40℃、压力为-0.2Mpa条件下减压旋蒸10min成膜，再添加进3.5倍量的磷酸盐缓冲液，于-5℃下超声2min后静置40min，即得平均粒径为120～250nm的组合物传递体；

5)取卡波姆、甘油和氮酮加入双蒸水溶解膨胀静置12h，然后以三乙醇胺适量调节pH为6.5，得空白凝胶基质，上述基质中卡波姆、氮酮和甘油的重量占比分别为0.8wt％、3.5wt％和4.5wt％；

6)将组合物传递体溶液加入到空白凝胶基质中，边加边搅拌均匀后，置于棕色瓶密闭贮存，即得组合物传递体凝胶剂。

实施例3：

本实施例与实施例2的不同之处在于：

步骤1)具体步骤为：将鳄鱼甲制粉过400目筛后，以料液比为1:23(g/mL)的比例加入缓冲溶液制成浆体，然后将浆体置于电场强度为23kV/cm、脉冲数为10的高压脉冲电场中处理，浆体在电场中流速为12mL/s，收集处理后的提取液，然后经5000r/min离心10min，收集上清液，然后通过在2℃下透析截留和收集分子量为5～80KD的透析液，再将透析液进行冷冻干燥，即得鳄鱼甲有效组分，上述缓冲溶液为酒石酸氢钾和邻硝基苯酚钠的混合双蒸水溶液，缓冲溶液中亲水性基团的存在，能与蛋白质分子中的亚基结合，减缓了蛋白质分子中亚基的解离和通过非共价键聚集现象，增加了浆体的流动性，从而避免了浆体在电场中流动不畅造成的局部高温对有效成分活性的破坏，同时两者能凭借亲水特性充分吸收水分，使得鳄鱼甲有效成分在细胞中流动性增大，能快速进入体循环，以促进药物吸收效率和透皮效率；

其他步骤与实施例2一致，制得组合物传递体凝胶剂。

实施例4：

本实施例与实施例2的不同之处在于：

步骤1)具体步骤为：将鳄鱼甲制粉过400目筛后，以料液比为1:23(g/mL)的比例加入双蒸水制成浆体，然后将浆体浸泡3h后，煮沸回流提取，第一次回流提取2h，滤渣用200目筛网过滤后，以料液比为1:10(g/mL)的比例加入双蒸水回流提取1h，过滤后，合并两次所得滤液，然后通过在2℃下透析截留和收集分子量为5～80KD的透析液，再将透析液进行冷冻干燥，即得鳄鱼甲有效组分；

其他步骤与实施例2一致，制得组合物传递体凝胶剂。

实施例5：

本实施例与实施例2的不同之处在于：

步骤4)制得的组合物传递体，向其中加入明胶10wt％、甘露糖醇8wt％和淀粉22wt％，经压制后，制得组合物传递体片剂；

其他步骤与实施例2一致，制得组合物传递体片剂。

实施例6：

本实施例与实施例2的不同之处在于：

未进行步骤3)和4)，直接将步骤2)所得第一溶液加入到步骤5)所得空白凝胶基质中，边加边搅拌均匀后，置于棕色瓶密闭贮存，即得组合物传递体凝胶剂；

其他步骤与实施例2一致，制得组合物传递体凝胶剂。

实施例7：

本实施例与实施例2的不同之处在于：

步骤2)中所用缓冲液为含有1,2-丙二醇的磷酸盐缓冲液，即缓冲液中为添加α-蒎烯和四甲基戊二酸；

其他步骤与实施例2一致，制得组合物传递体凝胶剂。

试验例1：

组合物传递体的粒径分布测定

将实施例1所制得组合物传递体样品用纯化水稀释后移取1mL，用激光粒度仪测定其粒径。样品在室温条件下，平行测定3次，取平均值。所得粒径分布图如附图1所示。

由图1可知，组合物传递体的粒径分布比较均匀，集中在160～200nm，整体分布范围在120～250nm，传递体的粒径越小，凝胶剂的载药量越高，且透皮效率越高，具有更大的皮肤角质层透过量，能够提高药物透皮性能和局部生物利用度，从而可提高药物治疗指数。

试验例2：

组合物传递体的包封率测定

试验样品：实施例1和2、实施例7中所制组合物传递体。

测定方法：色谱柱：Amino(5μm，4.6mm×250mm)，流动相：乙腈-无水乙醇-3％磷酸溶液(80:10:10)，检测波长：220nm，体积流量：1.0mL/min，柱温：25℃，进样量：10μL。

精密移取适量组合物传递体混悬液置于Amicon Ultra离心超滤管的截留管中，以6000r/min的速度离心20min，取存在于外管中的超滤液。测得苦参碱类生物碱和鳄鱼甲有效成分的药物浓度(C1)，并计算出游离药物量(W1)。另取相同量组合物传递体混悬液置于容量瓶中，加消解液破乳，并以流动相稀释至刻度后，转移至Amicon Ultra离心超滤管的截留管中，以5000r/min的速度离心5min，取存在于外管中的超滤液。同法测得苦参碱类生物碱和鳄鱼甲有效成分的药物浓度(C2)，并计算出传递体中的药物总量(W2)。并按照以下公式计算包封率：

包封率E％＝(W2-W1)/W2×100％；

其中W1为游离药量(mg)，W2为包封药量(mg)。测定结果如下表1所示。

表1 组合物传递体包封率测定结果

药物包封率是传递体给药体系安全、有效与实现靶向治疗的重要基础，故包封率是传递体给药系统中的重要质量参数。结果表明，实施例1和2对药物的包封率差异不大，实施例7则明显低于前两者，说明形成第一溶液用缓冲液中α-蒎烯和四甲基戊二酸对提高包封率、降低药物有效成分渗漏量具有显著有益效果。

试验例3：

组合物传递体凝胶剂的药效学测定

试验样品：实施例2、3、6所制组合物传递体凝胶剂。

1、体外释放性质检测：取各组凝胶剂各5mL，置于透析袋中，用夹子封口。以生理盐水400mL为溶出介质，于32℃下恒温水浴搅拌，以200r/min进行体外释放实验，分别在0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h、36h、48h、60h、72h定时取样，每次取1mL释放介质，同时补加32℃的生理盐水1mL。将取出的释放介质用0.22μm微孔滤膜过滤，测定药物含量，计算药物累积释放度。结果如附图2所示。

由图可知，实施例6所制凝胶剂在生理盐水中12h基本施药完全，累积释放度达到97.78％，而实施例2和3表现相差不大，基本在24h达到释药量的峰值，累积释药量分别达到85.36％和86.12％，此后缓慢释放72h时分别达到95.59％和95.28％，表明组合物传递体凝胶剂较实施例6所制无传递介质的凝胶剂更具有缓释作用。

2、(1)传递体凝胶剂的经皮累积透过量检测：采用改良Franz扩散池进行传递体凝胶体外经皮渗透实验。取适当大小(3.0cm²)未损伤的实验用小鼠离体下腹部皮肤，皮角质层朝上，真皮层朝接收池，固定于扩散池。向供给池中分别加入传递体凝胶剂0.2g，接收池加入提前加热到32℃的生理盐水(6.5mL)，使接收液与皮肤紧密接触，排尽气泡不留空腔。再将扩散池固定在磁力搅拌器上，保持恒温在32℃搅拌。分别于1h、2h、4h、8h、12h、24h时取样并补加等量同温度的生理盐水。将所取样液以0.22μm滤膜滤过后，移取各个时间点的样品液，测定各个时间点药物峰面积，带入标准曲线算出药物浓度Ci，计算其累积透过量Q(μg/cm²)。

(2)传递体凝胶剂的皮肤滞留量检测：在经皮渗透实验结束后取下试验皮，用生理盐水反复擦拭皮肤表面，以除去表面残留药物后用滤纸吸干水分。将其剪碎置离心管中，加定量生理盐水浸泡，超声20min，5000r/min离心15min，取上清液以0.22μm微孔滤膜过滤后，以HPLC法测定峰面积，带入标准曲线算出药物浓度，计算皮肤滞留量Qs。结果如附图3所示。

由图可知，实施例2和3组合物传递体凝胶剂组的24h累积透过量和皮肤滞留量均显著高于实施例6无传递介质的凝胶剂，其中实施例2的24h累积透过量和皮肤滞留量分别是实施例6组的2.63倍和5.98倍，说明添加有传递介质的凝胶剂的透皮吸收效果更好；实施例3较实施例2的表现更优异，24h累积透过量和皮肤滞留量较实施例2分别高出1.21倍和1.11倍，说明实施例3制备中所用酒石酸氢钾和邻硝基苯酚钠的混合双蒸水溶液对促进药物吸收和透皮具有显著的有益效果。

试验例4：

组合物传递体凝胶剂的毒理学测定

试验样品：实施例2和实施例7所制组合物传递体凝胶剂。

1、皮肤刺激性试验：采用同体左右两侧皮肤自身对比法，取大鼠20只随机分为完整皮肤组和破损皮肤组。左侧分别涂抹厚度约1mm的组合物传递体凝胶剂，右侧涂抹等量的空白凝胶基质。每日2次，连续用药14d。每次涂药前要脱毛，完整皮肤组不得损伤皮肤，以保证受试药物与皮肤充分接触。第15d时以温生理盐水清洁给药部位，于去除药物后1h、24h、48h、72h，观察红斑、水肿情况，记录实验结果。破损皮肤处理方法：破损皮肤组用灭菌的16号针头在脱毛皮肤上划出长约2cm的“#”6个，划伤的深度以不伤真皮、有轻微渗血为宜。

试验结果及分析如下：试验期间完整皮肤和破损皮肤组别涂抹空白凝胶基质的部位均未见红斑、水肿等现象，实施例2组的完整皮肤和破损皮肤部位均未见红斑、水肿等现象，实施例7完整皮肤组涂药部位均未见红斑、水肿等现象，而破损皮肤组中勉强有可见红斑，但随后可自行消失，表明空白基质组和组合物传递体凝胶剂对完整皮肤或者破损皮肤均无刺激性，但显然实施例2较实施例7的刺激性更低，是由于制备第一溶液时所用缓冲液中α-蒎烯和四甲基戊二酸的添加表现出降低皮肤刺激性的有益效果。

2、皮肤过敏性试验：选择健康Wistar大鼠20只，雌雄各半，完整皮肤和破损皮肤各半，分别涂抹厚度约1mm的空白基质和组合物传递体凝胶剂于除毛区，并在第7d和第14d以上述相同的方法各重复给药，共给药3次。于末次给药后第7d，以玻璃棒刮去凝胶，纸巾将脱毛区擦拭干净，即刻观察，然后于24h、48h、72h记录过敏反应情况。

试验结果及分析如下：试验期间完整皮肤和破损皮肤组别涂抹空白凝胶基质的部位均未见红斑、水肿等现象，实施例2组的完整皮肤和破损皮肤部位均未见红斑、水肿等现象，实施例7完整皮肤组涂药部位均未见红斑、水肿等现象，而破损皮肤组中勉强有可见红斑，但随后可自行消失，表明空白基质组和组合物传递体凝胶剂对完整皮肤或者破损皮肤均具有弱致敏性，但显然实施例2较实施例7的致敏率更低，是由于制备第一溶液时所用缓冲液中α-蒎烯和四甲基戊二酸的添加表现出降低皮肤过敏性的有益效果。

3、皮肤急性毒性试验：选择健康Wistar大鼠24只，雌雄各半，随机分为组合物传递体凝胶剂和空白基质组，每组8只(完整皮肤和破损皮肤各半)，分别涂抹厚度约1mm的空白基质、组合物传递体凝胶剂于除毛区，每日用药2次，连续用药15d，在试验前和用药后15d观察有无红斑、水肿、站立不稳、休克等严重药物反应，有无死亡现象，并进行统计处理。

试验结果及分析如下：试验期间各组大鼠外观体征、行为活动、饮水和进食等情况均无明显差异，均未出现任何异常反应和死亡，实施例与空白基质组对比无显著性差异，表明组合物传递体凝胶剂对大鼠的正常生长无明显影响，外用安全毒性低，增加药用组合物安全性。

试验例5：

药用组合物对氧化应激损伤细胞抗氧化能力的影响

试验样品：实施例2、3、4、5所制药用组合物。

试验方法：将冻存细胞复苏后，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基于37℃恒温培养箱中进行培养，接种后细胞生长至对数期后，分别添加含有浓度为5mg/mL的实施例所制组合物的DMEM/F12培养基(10％胎牛血清)(对照组不添加组合物)，置于37℃、5％CO₂的恒温培养箱中培养24h，用PBS洗涤细胞以去除残留样品，然后添加含2mmol/L H₂O₂的DMEM/F12培养基(10％胎牛血清)进行处理(空白组不添加H₂O₂)，置于37℃、5％CO₂的恒温培养箱中继续培养4h，弃去旧培养液，用PBS洗涤细胞以去除残留的H₂O₂后，收集细胞，将细胞超声破碎后取得细胞裂解液。采用试剂盒对细胞裂解液的抗氧化指标(过氧化氢酶CAT、谷胱甘肽GSH、丙二醛MDA、超氧化物歧化酶SOD等)及采用MTT法测定细胞存活率进行检测。检测结果如表2、3所示。

表2 组合物对氧化损伤细胞存活率的影响结果

由表2可知，H₂O₂能使细胞发生明显氧化应激损伤，而在添加了实施例所制组合物后，细胞存活率有极显著的提高，说明组合物能在一定程度上缓解细胞因氧化应激损伤导致的存活率降低现象，减少细胞发生氧化应激的损伤程度，具有显著的抗氧化性能；实施例4较其它组别存活率低，是由于提取鳄鱼甲有效成分采用加热回流，相较高压脉冲组别高温对热敏性有效成分的活性损伤较大，并且提取率较高压脉冲小，故而药效略差；实施例3最优是由于鳄鱼甲提取用缓冲溶液的改变，避免了浆体在电场中流动不畅造成的局部高温对有效成分活性的破坏，从而增加了有效成分的活性保持和有效作用量。

表3 组合物对氧化损伤细胞抗氧化指标的影响结果

由表3可知，空白组细胞的CAT活力最高，对照组经H₂O₂处理后细胞的CAT活力显著下降，说明细胞发生了强烈的氧化损伤，细胞本身的防御体系无法正常抵御刺激，细胞抗氧化能力较低；与对照组相比，添加实施例所制组合物预处理后细胞的CAT活力显著提高，说明组合物能在一定程度上缓解细胞因H₂O₂过量导致的氧化应激损伤和抗氧化能力降低现象，且实施例2和实施例5差异不大，较实施例4效果好，较实施例3的效果略差。

由表3可知，空白组细胞的GSH含量最高，对照组经H₂O₂处理后细胞的GSH含量显著下降，说明细胞受到了强烈的外界刺激，加快了细胞内GSH的消耗，抗氧化能力明显下降；与对照组相比，添加实施例所制组合物预处理后细胞的GSH含量显著提高，说明组合物能提高细胞内GSH水平，在一定程度上缓解细胞因氧化应激导致的GSH严重消耗现象，且实施例2和实施例5差异不大，较实施例4效果好，较实施例3的效果略差。

由表3可知，空白组正常细胞的SOD活力和对照组稍有差异，略微下降；与对照组相比，添加实施例所制组合物预处理后细胞的SOD活力也没有明显的上升或下降趋势，说明通过H₂O₂刺激细胞发生氧化应激损伤不会使胞内SOD活力大幅度下降，组合物也不能通过提高氧化损伤细胞的SOD活力这条途径来提高细胞的抗氧化能力。

由表3可知，空白组正常细胞的MDA含量很低，对照组细胞的MDA含量极显著上升，表明细胞内脂质发生了强烈的过氧化反应，产生了大量MDA，细胞发生了严重的氧化损伤；与对照组相比，添加实施例所制组合物预处理后细胞的MDA含量均有明显下降，表明组合物均能在一定程度上缓解氧化应激损伤细胞的脂质氧化现象，减少细胞损伤程度。

试验例6：

药用组合物对炎症因子的改善作用

试验样品：实施例2、5和6所制药用组合物。

试验动物：BALB/c小鼠40只，体重(20±2)g，饲养环境中12小时灯照/黑暗循环，温度(22±2)℃，相对湿度(60±10)％，提供充足的水和标准饲料。

试验方案：小鼠适应环境一周后，随机分为5组：空白组、对照组、实施例1组、实施例2组、实施例4组，每组8只。按表4试验方案进行试验。

表4 动物试验方案

试验分组	模型建立(8～12天)	药用物质(1～14天)
			空白组	蒸馏水(饮用)	蒸馏水(灌胃)
对照组	3％四氯化碳溶液(饮用)	蒸馏水(灌胃)
			实施例2组	3％四氯化碳溶液(饮用)	实施例2组合物(外敷)
实施例5组	3％四氯化碳溶液(饮用)	实施例5组合物(灌胃)
			实施例6组	3％四氯化碳溶液(饮用)	实施例6组合物(外敷)

小鼠饮用3％四氯化碳溶液5天即可造成中毒性肝炎。试验小鼠使用药用组合物剂量为1500mg/天。试验第15天处死小鼠。利用酶联免疫吸附双抗体夹心法检测小鼠肝脏组织的炎症细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6含量。结果如附图4所示。

图4为组合物对炎症细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6含量的影响示意图。由图4可知，空白组小鼠的炎症细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平均较低，而对照组TNF-α、IL-1β和IL-6水平与空白组相比均极显著地上升；与对照组相比，实施例组合物均能使炎症细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平显著降低，说明组合物能缓解小鼠肝脏组织炎症的产生，减少炎症细胞因子的分泌；其中实施例2和实施例6的下降程度较实施例5的程度更多，说明外敷较灌胃而言药效发挥更好，实施例2较实施例6表现更好，说明传递介质有利于促进药物的吸收和透皮效果。

试验例7：

药用组合物对HSC-T6细胞增殖的影响试验

试验样品：实施例1～4所制传递体和药用组合物。

试验方法：取对数生长期的HSC-T6细胞，以1×10⁴个/孔100μL细胞密度接种于96孔板内，分别设空白组、5ng·mL^-1 TGF-β1组、实施例1～4的4个组别、加入5ng·mL^-1 TGF-β1的实施例1～4的4个组别处理组，每组设3个平行孔。在细胞培养箱中培养24h后，每孔加入新鲜配制的5g·L^-1 MTT0.01mL，37℃细胞培养箱继续培养4h。吸弃孔内上清液，加入DMSO0.15mL，在微孔板上充分振摇10min，用酶标仪在570nm处检测各组的OD值，计算细胞存活率。独立重复3次实验。计算公式为：细胞存活率＝(A给药组/A空白组)×100％。所得结果如附图5所示。

图5为药用组合物对HSC-T6细胞增殖的影响示意图，在TGF-β1不存在情况下，实施例1～4处理组中HSC-T6细胞存活率依次分别为91.75％、92.77％、93.81％、90.08％，均在90％以上，说明组合物对HSC-T6细胞无明显毒性。在TGF-β1存在情况下，5ng·mL^-1 TGF-β1组细胞存活率为112.27％，显著促进HSC-T6细胞增殖，实施例1～4处理组中HSC-T6细胞存活率依次分别为98.36％、96.72％、97.32％、102.49％，与5ng·mL^-1 TGF-β1组比较，实施例1～4处理组均能显著抑制HSC-T6细胞增殖；实施例1～3抑制效果显著高于实施例4，是由于实施例4提取鳄鱼甲有效成分采用加热回流，相较实施例1～3采用高压脉冲组别，高温对热敏性有效成分的活性损伤较大，且提取率较高压脉冲小，故而药效略差。

试验例8：

药用组合物对HSC-T6细胞中TIMP-1、MMP-1的含量的影响试验

试验样品：实施例1～4所制传递体和药用组合物。

试验方法：取对数生长期的HSC-T6细胞，以1×10⁴个/孔100μL细胞密度接种于96孔板内，分别设空白组、5ng·mL^-1 TGF-β1组、实施例1～4的4个组别、加入5ng·mL^-1 TGF-β1的实施例1～4的4个组别处理组，每组设3个平行孔。在细胞培养箱中培养24h后，吸取上清液，TIMP-1、MMP-1含量的测定使用ELISA试剂盒。所得结果如附图6所示。

图6为药用组合物对TGF-β1诱导的HSC-T6细胞TIMP-1、MMP-1表达量的影响示意图，与空白组比较，5ng·mL^-1 TGF-β1作用于HSC-T6细胞后，能显著增加TIMP-1的表达，降低MMP-1的表达，与5ng·mL^-1 TGF-β1模型组比较，实施例1～4处理组均能不同程度的抑制HSC-T6细胞TIMP-1的表达，促进MMP-1的表达。

上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。

以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

Claims

1.鳄鱼甲有效组分的制备方法，其特征在于：包括，提供包含水和粉状鳄鱼甲的浆体；并将所述浆体通过高压脉冲以胀破细胞获得有效组分；以及回收所述有效组分；

所述有效组分中含有多糖和分子量为5～80KD的蛋白成分。

2.根据权利要求1所述的鳄鱼甲有效组分的制备方法，其特征在于：所述高压脉冲操作条件为：电场强度为20～28kV/cm，脉冲数为8～12，浆体流速为10～15mL/s。

3.根据权利要求1所述的鳄鱼甲有效组分的制备方法，其特征在于：所述浆体中粉状鳄鱼甲与水的料液比为1:20～30(g/mL)，所述粉状鳄鱼甲为过300～400目筛的鳄鱼甲细粉。

4.含鳄鱼甲有效组分的药用组合物的制备方法，其特征在于：所述药用组合物包括苦参碱类生物碱、如权利要求1～3所述的鳄鱼甲有效成分以及传递介质；所述药用组合物的制备方法包括：

将所述苦参碱类生物碱和鳄鱼甲有效成分溶于溶剂后，形成第一溶液；

将所述传递介质溶于溶剂后，形成第二溶液；

将所述第一溶液与第二溶液混合形成W/O型乳剂后，减压旋蒸成膜，再进行水合处理后，即得平均粒径为120～250nm的组合物传递体；

所述第一溶液用溶剂为含有1,2-丙二醇、α-蒎烯和四甲基戊二酸的磷酸盐缓冲液。

5.根据权利要求4所述的含鳄鱼甲有效组分的药用组合物的制备方法，其特征在于：所述磷酸盐缓冲液中1,2-丙二醇、α-蒎烯和四甲基戊二酸的重量占比分别为0.4～1.0wt％、0.05～0.3wt％和0.1～0.15wt％。

6.根据权利要求4所述的含鳄鱼甲有效组分的药用组合物的制备方法，其特征在于：所述传递介质包括卵磷脂和胆固醇，所述卵磷脂与胆固醇的重量比为2.5～4:1；所述第二溶液用溶剂为无水乙醇。

7.根据权利要求4所述的含鳄鱼甲有效组分的药用组合物的制备方法，其特征在于：所述减压旋蒸操作条件为：温度为35～45℃，压力为-0.5～0Mpa；所述水合处理操作条件为：-5～0℃，超声1～2min后静置30～40min。

8.根据权利要求4所述的含鳄鱼甲有效组分的药用组合物的制备方法，其特征在于：所述组合物传递体的给药方式为与药学上可接受的载体制成凝胶剂后进行外用给药；所述载体为包括卡波姆、氮酮和甘油的凝胶基质。

9.如权利要求1～3任一项所述的制备方法制得的鳄鱼甲有效组分的用途，其特征在于：所述有效组分在抗氧化或抗肝纤维化的药物或食品中的用途。

10.如权利要求4～8任一项所述的制备方法制得的含鳄鱼甲有效组分的药用组合物的用途，其特征在于：所述药用组合物在抗氧化或抗肝纤维化的药物中的用途。