CN104800244A - 一种治疗肝纤维化的鳄鱼甲提取物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种治疗肝纤维化的中药提取物及其应用,所述提取物是将鳄鱼甲经水煎煮提取、浓缩、干燥制备成的鳄鱼甲提取物,药效学试验证明,所述提取物具有降低肝纤维化模型小鼠的血清转氨酶、减轻小鼠肝脏胶原纤维沉积程度、改善小鼠肝脏炎性及纤维化病理变化,具有预防和治疗肝纤维化病理变化,延缓慢性肝病向肝硬化的发展的功效,可望用于开发制备防治肝纤维化的药物。
Description
技术领域:
本发明属于中药领域,涉及一种治疗肝纤维化的中药提取物及其应用。
背景技术:
肝纤维化(Hepatic fibrosis,HF)是由多种慢性致病因素(炎症、酒精、寄生虫、中毒、代谢障碍、血液循环障碍、营养障碍等)作用于肝脏引起的肝内结缔组织异常增生,ECM(extea cellular matrix)细胞外基质过度沉积的共同病理过程,致病因子引起肝脏氧化应激反应和细胞因子的产生是肝纤维化发生的始动环节。肝纤维化是慢性肝病向肝硬化发展的早期和必经阶段,在一定情况下可以逆转,但若病因持续存在,肝纤维化逐渐加重,肝小叶及血管等逐渐被改建,肝脏正常结构遭到破坏,导致相应器官功能障碍与衰竭,将严重危害生命健康。因此,减缓、阻止和逆转肝纤维化是慢性肝病的重要治疗措施。
鳄鱼是脊索动物门爬行纲鳄目动物的通称,我国古代称鳄鱼为“鼍龙”,又名鮀鱼(《神农本草经》)、土龙(《续博物志》)。鳄鱼作为药用动物,早在南北朝时期的《本草经集注》就有对鳄鱼甲的记载:“味辛,微温。……主心腹症瘕、伏坚、积聚、寒热,女子崩中下血五色,小腹阴中相隐痛,疮疥死肌。”《名医别录》称其“有毒,……主五邪涕泣时惊,腰中重痛,小儿气癃,眦溃。”《本草拾遗》称鼍甲“主恶疮,腹内症瘕”,“炙烧浸酒,主瘰疬,杀虫,瘘疮,风顽疥瘙”。《本草纲目》“鳞部”第四十三卷详细的记载了“鼍龙”,称其甲味辛,性温,有破血逐瘀、消肿生肌之功效。《中华本草》曾经记载扬子鳄的甲片,有消积、化瘀杀虫的功能,主治心腹症瘕积聚,崩中带下,疮疥、恶疮,肠风痔疾。
现代医学研究证明,鳄鱼全身都是宝,鳄鱼肉、骨、甲及内脏含有丰富的优良蛋白质和人体必需的氨基酸、不饱和脂肪酸、维他命及各种微量元素。然而,以鳄鱼甲为原料治疗肝纤维化的研究成果,迄今为止,尚未见有相关报道。
发明内容:
本发明的目的,是提供一种治疗肝纤维化的中药提取物及其应用,所述中药提取物是指鳄鱼甲经水煎煮提取、浓缩、干燥制备成的鳄鱼甲提取物。所述提取物含有大量的骨胶原、蛋白质、钙、磷等成分。
本发明提供所述鳄鱼甲提取物的制备方法。
本发明还提供所述鳄鱼甲提取物在治疗肝纤维化中的应用。
本发明还提供以所述鳄鱼甲提取物为有效成分与要学上可接受的载体组成的药物组合物。
本发明还提供所述药物组合物在治疗肝纤维化中的应用。
近年来,本发明人为了解和验证鳄鱼甲提取物对肝纤维化的治疗作用,曾用鳄鱼甲提取物对动物进行了药效学实验研究,结果证明:鳄鱼甲提取物具有降低肝纤维化模型小鼠的血清转氨酶、减轻小鼠肝脏胶原纤维沉积程度、改善肝纤维化模型小鼠肝脏炎性及纤维化病理变化,具有预防和治疗肝纤维化病理变化,延缓慢性肝病向肝硬化发展进程的作用,可望将其用于开发制备防治肝纤维化的药物。
本发明所述治疗肝纤维化的中药提取物的制备方法包括如下步骤:取鳄鱼甲,加10倍量水浸泡1小时,煎煮1小时,过滤,滤液另器储存,药渣再加8倍量水,煎煮1小时,过滤,滤液与前次滤液合并,低温减压蒸馏滤液,浓缩至比重1.20的稠膏,冷冻干燥,得到鳄鱼甲提取物。
本发明所述中药提取物的剂型可以是多种制剂,优选为口服制剂。
本发明提供了所述中药提取物在制备防治肝纤维化药物中的应用。为此,选择应用广泛的四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4),腹腔注射,诱导构建小鼠肝纤维化模型,采用鳄鱼甲提取物低剂量组生药0.675g/kg(体质量)、中剂量组生药1.35g/kg(体质量)、高剂量组生药2.7g/kg(体质量)治疗用药,观察鳄鱼甲提取物对小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆红素(TBIL)等生化指标和肝组织羟脯氨酸(HYP)含量的影响,并通过肝组织病理切片观察肝脏病理变化。结果表明:鳄鱼甲提取物能显著降低小鼠血清中AST、ALT活性,降低TBIL、HYP含量,使肝组织变性明显减轻。所以说,鳄鱼甲提取物对四氯化碳致小鼠肝纤维化有显著的保护作用。
附图说明:
图1-本发明的中药组合物对CCl4肝纤维化模型小鼠的血清谷草转氨酶活性的影响
图2-本发明的中药组合物对CCl4肝纤维化模型小鼠的血清谷丙转氨酶活性的影响
图3-为本发明的中药组合物对CCl4肝纤维化模型小鼠的肝组织羟脯氨酸含量的影响
图4-本发明的中药组合物对CCl4肝纤维化模型小鼠的肝脏病理变化的影响
图5-本发明的中药组合物对CCl4肝纤维化模型小鼠的肝脏胶原沉积的影响
图中:N-表示正常组;M-表示模型组;低-表示鳄鱼甲提取物小鼠按生药0.675g/kg剂量;中-表示鳄鱼甲提取物小鼠按生药1.35g/kg剂量;高-表示鳄鱼甲提取物小鼠按生药2.7g/kg剂量;P-表示阳性对照组,小鼠按100mg/kg剂量用水飞蓟素。
具体实施方式:
为使本发明的技术方案便于理解,以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不是限制本发明的保护范围。在阅读了本发明的内容后,本领域技术人员可以对本发明作各种修订或改动,这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求书所限定的范围。
为完成实施例的必要条件:
1、实验材料
1.1、仪器
电热恒温振荡水槽(DKZ-450B,上海森信);四联磁力搅拌机(HJ-4,江苏金坛);pH计(PB-10,sartorius),电子天平(BS 224S,sartorius);荧光倒置显微镜(Eclipse TE2000-U,Nikon);酶标仪(DNM-9602,北京普朗);高压灭菌锅(DSX-280B,上海申安);软蜡(熔点52℃-54℃)、硬蜡(56℃-58℃)购自上海华永石蜡有限公司);石蜡切片机(Leica,德国);
1.2、药物与试剂
鳄鱼甲提取物(5g/ml,本发明制备);水飞蓟素胶囊(140mg/粒,产品批号:B1101617,德国马博士大药厂);苏木素伊红(HE)染色试剂盒购自碧云天生物技术研究所;血清总胆红素TBIL、谷丙转氨酶ALT(赖氏法)、谷草转氨酶AST(赖氏法)检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所;羟脯氨酸Hyp(消化法)测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所;总SOD活性检测(NBT法)、脂质氧化(MDA)检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所。透明质酸(HA)、III型胶原(C-III)、层粘连蛋白(LN)、IV型胶原(C-IV)均购自Groundwork BiotechnologyDiagnosticate Ltd.;BCA蛋白浓度测定试盒购自碧云天生物技术研究所。
1.3、实验动物与溶液配制
健康雄性KM小鼠60只,体重20g±2g,购自福建吴氏实验动物。饲养温度25℃,实验前适应环境一周,饲料为鼠繁殖料。
25%CCl4:取25mL CCl4用玉米油定容至100mL。
10%中性福尔马林溶液:甲醛100mL,磷酸二氢钾4g,磷酸氢二钠6.5g,蒸馏水定容至1000mL。
0.5%盐酸溶液:取0.5mL浓盐酸用蒸馏水定溶至100mL。
10%多聚赖氨酸:取10mL多聚赖氨酸用蒸馏水定溶至100mL。
60%中性树胶:取60mL中性树胶用二甲苯定溶至100mL。
《实施例1》鳄鱼甲提取物的制备
取中药材鳄鱼甲500g,加5kg水浸泡1小时,煎煮1小时,过滤,滤液另器储存,药渣再加4kg水,煎煮1小时,过滤,滤液与前次滤液合并,60℃减压蒸馏滤液,浓缩至比重1.20的稠膏,冷冻干燥,得到鳄鱼甲提取物。
《实施例2》鳄鱼甲提取物的制备
取中药材鳄鱼甲1000g,加10kg水浸泡1小时,煎煮1小时,过滤,滤液另器储存,药渣再加8kg水,煎煮1小时,过滤,滤液与前次滤液合并,65℃减压蒸馏滤液,浓缩至比重1.20的稠膏,冷冻干燥,得到鳄鱼甲提取物。
《实施例3》动物模型的构建制备
60只小鼠分为6组,分别为:正常组,模型组,鳄鱼甲提取物低剂量组,鳄鱼甲提取物中剂量组,鳄鱼甲提取物高剂量组,阳性药物水飞蓟素组。正常组注射玉米油,其他组以25%CCl41mL/100g体重腹腔注射,一周两次,连续八周,完成四氯化碳致肝纤维化小鼠模型的构建。
《实施例4》分组进行给药试验
鳄鱼甲提取物使用前制成混悬液。小鼠的给药剂量根据体表面积的公式:小鼠的用药剂量=9倍成人的用药剂量来进行换算,高剂量组每千克体重用量为正常成人用量的18倍,中剂量组每千克体重用量为正常成人用量的9倍,低剂量组每千克体重用量为正常成人用量的4.5倍,因此低剂量组为0.675g/kg(体质量),中剂量组为1.35g/kg(体质量),高剂量组为2.7g/kg(体质量),阳性药物组水飞蓟素为100mg/kg(体质量),正常组给以蒸馏水,于造模第8周开始给予上述药液灌胃,至第12周末,采集小鼠血清及肝组织进行检测。
《实施例5》血清学及肝脏病理学检测
小鼠给药结束后,摘除眼球取血,室温静置0.5h,血清析出后,置于离心机内6000r/min,离心10min,吸取血清,进行谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆红素(TBIL)等生化指标的检测,按试剂盒说明操作。处死小鼠,并立刻完整摘取肝脏,经预冷的生理盐水漂洗,取左叶置于-70℃保存,以备制作肝组织匀浆;取肝组织右叶相同部位置于10%中性福尔马林液中常规固定,用于肝组织病理染色学和天狼腥红染色检查。
《实施例6》肝脏中羟脯氨酸(Hyp)含量测定
精确称取组织湿重30-100mg放入试管中,准确加水解液1ml,混匀。加盖后95℃或者沸水浴水解20分钟(水解10分钟时混匀一次,目的是使水解更充分),比色法测定肝脏中羟脯氨酸(Hyp)含量,按羟脯氨酸试剂盒说明操作。数据的统计分:实验数据用均数±标准差表示,统计方法为单因素方差分析,用SPSS16.0统计软件处理。实验结果表明:本发明的鳄鱼甲提取物中、高剂量组治疗用药可降低小鼠血清谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性(图1、图2);高剂量组还可降低小鼠肝脏羟脯氨酸含量(图3),图中:*P<0.05,**P<0.01vs模型组。肝组织HE染色结果表明,模型组可见肝小叶正常结构消失,汇管区大量炎性细胞浸润,成纤维细胞大量增生,肝索排列紊乱,肝细胞广泛变性和坏死,细胞核消失;而鳄鱼甲提取物治疗各组,小鼠炎性细胞浸润和成纤维细胞增生明显减少,肝细胞变性坏死有不同程度的好转,肝细胞条索开始出现,肝小叶正常结构开始恢复,较模型组组有明显好转(图4);肝组织天狼腥红胶原染色结果表明,模型组汇管区可见较多假小叶形成,大量胶原纤维沉积;本发明的鳄鱼甲提取物各剂量组未见假小叶形成,胶原纤维沉积减轻(图5)。以上实验结果表明,本发明所述中药提取物-鳄鱼甲提取物对肝纤维化病变有明显治疗作用。
Claims (6)
1.一种治疗肝纤维化的鳄鱼甲提取物,其特征是,所述提取物系指鳄鱼甲经水煎煮提取、浓缩、干燥制备成的鳄鱼甲提取物。
2.制备权利要求1所述提取物的方法,其主要步骤是:取鳄鱼甲,加10倍量水浸泡1小时,煎煮1小时,过滤,滤液另器储存,药渣再加8倍量水,煎煮1小时,过滤,滤液与前次滤液合并,低温减压蒸馏滤液,浓缩至比重1.20的稠膏,冷冻干燥,得到鳄鱼甲提取物。
3.权利要求1、2所述的提取物,其药用剂型可以是多种制剂,优选为口服制剂。
4.权利要求1、2、3所述的提取物在制备防治肝纤维化药物中的应用。
5.以权利要求1所述鳄鱼甲提取物为有效成分与要学上可接受的载体组成的药物组合物。
6.权利要求5所述组合物在制备防治肝纤维化药物中的应用。
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