CN102106890B - 雪莲总倍半萜内酯的应用及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了雪莲总倍半萜内酯的应用及制备方法,属于医药技术领域;雪莲总倍半萜内酯在制备抗缺氧药物中的应用。其可通过溶剂法、二氧化碳超临界萃取、石油醚回流提取总倍半萜内酯。本发明通过实验发现并证明了雪莲总倍半萜内酯用于抗缺氧药物的制备中制备所得的药物具有明显的抗缺氧作用,本发明的制备方法简单,能够有效提取雪莲中的总倍半萜内酯。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域,涉及雪莲总倍半萜内酯的应用及制备方法。
背景技术
雪莲为菊科植物绵头雪莲花Saussurea Laniceps Hand.-Mazz.、大苞雪莲又名新疆雪莲花Saussurea involucrata Kar.et.Kin、水母雪莲花Saussurea medusa Maxim.等的带花全株。雪莲作为药用始载于8世纪藏族古代药物文献《月王药珍》,其后古典《西北域记》、《西部医典》以及清代《 本草纲目拾遗》中均有记载。以往文献报道关于雪莲的化学研究结果表明其主要成分有黄酮类、 生物碱类、 香豆素类、木质素类以及倍半萜类等化学成分。雪莲性温、味微苦、具有散寒除湿、强筋助阳、抗炎镇痛、收缩子宫等功能,可治疗风湿性关节炎、妇女小腹冷痛、阳痿抗衰老及抑制癌细胞增生等症。
近年来,国内对雪莲药理的研究主要集中于提高机体免疫力、祛风除湿和终止妊娠等作用,而关于其抗缺氧作用的研究较少,以其主要成分研制抗高原缺氧药物则未见报道。有关雪莲抗缺氧的研究报道见表6。由表中分析可知,从1996年至今有关雪莲抗缺氧药理作用的研究报道并不多,且只进行了水煎液和醇提物的药效学评价,未进行深入的植化研究,也未开发为相应的抗缺氧制剂。
表6 近年来有关雪莲的研究报道
涉及雪莲的获国药准字的药品有雪莲药酒(2个)、雪莲口服液、雪莲注射液(2个)、复方雪莲软胶囊、复方雪莲胶囊、四味雪莲花颗粒、雪莲归芪口服液和雪莲虫草合剂等,其功效均是提高免疫力和祛风除湿,主治类风湿性关节炎、强直性脊柱炎和各类退行性骨关节病等,无一种提及抗高原缺氧作用。 名称中涉及“雪莲”和“胶囊”的有复方雪莲胶囊和复方雪莲胶囊两种,但其组方、功效等均与本课题研究内容无相关性。。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的雪莲提取物的应用及制备方法。
雪莲总倍半萜内酯在制备抗缺氧药物中的应用;所述雪莲选自大苞雪莲、水母雪莲或苞叶雪莲中的一种。
本发明的雪莲提取物的制备方法如下所述:
1、溶剂法提取总倍半萜内酯:
①取干燥雪莲,粉碎,加10-15倍量体积浓度为0.01~95%的乙醇溶液,在20-70℃下温浸提取,反复多次,至提取液颜色变淡为止;过滤提取液,减压浓缩,得醇提浸膏;
②将步骤①的浸膏用水分散得水分散体系,依次用相当于水分散体系1/3~1倍体积的石油醚萃取多次,至萃取液颜色变淡为止,合并石油醚萃取液,减压浓缩,冷冻干燥;步骤①中所述的温浸提取反复多次,至提取液颜色变淡为止。
2、二氧化碳超临界萃取提取总倍半萜内酯:
取雪莲干燥药材,粉碎,过筛后加入超临CO2萃取池中,参数设置范围为:萃取压力10~ 25MPa;萃取池温度35~55 ℃, 解析压力3~5MPa,温度30~50 ℃,动态萃取30~120min,CO2流量10~30 L/h。
优选地,取雪莲干燥药材,粉碎,过筛后加入超临CO2萃取池中,参数设置范围为:萃取压力10~ 25MPa;萃取池温度35~55 ℃, 解析压力4.2 MPa,温度40 ℃,动态萃取30~120min,CO2流量20 L/h。
3、石油醚回流提取总倍半萜内酯:
取雪莲干燥药材,粉碎,加10-15倍量石油醚,回流提取,合并石油醚提取液,减压浓缩,冷冻干燥,即得。
所述雪莲总倍半萜内酯作为抗缺氧成分在医药上的应用:以雪莲总倍半萜内酯提取物为活性成分,配以药用铺料,用公知的方法制备成药剂学上的任何一种剂型。
动物实验
1. 1. 大苞雪莲总倍半萜内酯对常压密闭小鼠存活时间的影响
(1)实验目的:以小鼠在常压缺氧条件下呼吸停止死亡为指标,研究大苞雪莲总倍半萜内酯的耐缺氧作用,并考察其抗缺氧的量效关系。
(2)实验条件:三级动物实验室,室温20~25℃,空调恒温。
(3)实验对象:清洁级BALB/C小鼠,雄性,8周龄,体重(20±2 g),由兰州生物制品研究所实验动物中心提供,饲养于兰州军区兰州总医院实验动物科。
(4)试药与仪器:大苞雪莲原药材购自青海西宁三江宝商贸有限公司,并经兰州大学药学院生药学研究所杨永建教授鉴定;红景天胶囊(中国人民解放军红景天研制中心,20081030);乙酰唑胺(武汉远城科技发展有限公司,100114);250 mL广口瓶(统一用注水法校准,容积为250 ± 2.5ml);凡士林(包头黄河石化有限责任公司,批号 050521);钠石灰(英国Molecular Products Limited公司产品);BP210S电子天平(荷兰赛多利斯有限公司生产)。
(5)供试品的制备:取大苞雪莲粗粉,加15倍量70%乙醇,加热回流3次,每次1h,合并提取液,过滤,减压浓缩至浸膏状,将浸膏用3倍量水分散,用相当于水分散体系1/3体积的石油醚萃取至萃取液近无色,合并各萃取液,CO2冷冻干燥,得大苞雪莲总倍半萜内酯。临用前称取大苞雪莲总倍半萜内酯,先加适量吐温-80助溶,然后边研磨边加蒸馏水至刻度,配制成5、2.5、1.25 mg/ml的混悬液。
(6)实验方法与结果:取健康BALB/C小鼠60只,雌性,饲养适应3d后随机分成6组:缺氧模型组、乙酰唑胺对照组(200 mg·kg-1)、红景天胶囊对照组(500 mg·kg-1)、大苞雪莲总倍半萜内酯高(50 mg·kg-1)、中(25 mg·kg-1)、低(12.5 mg·kg-1)剂量组,每组10只。单次尾静脉注射给药,给药体积为0.2mL·20g-1。给药后20min,将小鼠分别放入盛有5 g钠石灰的250 mL广口瓶内(每瓶只放1只小鼠),用凡士林涂抹瓶口,密封,使之不漏气,立即计时,直至呼吸停止。以小鼠在密闭广口瓶内存活时间为指标,比较各药物组耐缺氧时间。结果见表1。
表1 尾静脉注射不同剂量大苞雪莲总倍半萜内酯对常压密闭小鼠存活时间的影响
注:## P﹤0.01,与缺氧模型组相比
结果:如表1结果所示,与缺氧模型组相比,大苞雪莲总倍半萜内酯高、中、低剂量组均可延长小鼠常压密闭缺氧存活时间(P﹤0.01),且呈剂量依赖性,与乙酰唑胺组和红景天胶囊组的存活时间无显著性差异(P〉0.05)。
(7)结论:
常压密闭缺氧是一种全身性缺氧实验,是筛选治疗缺氧性疾病药物的常用动物模型之一。本实验采用小鼠在常压缺氧条件下呼吸停止死亡时间作为抗缺氧活性筛选指标,结果发现,大苞雪莲总倍半萜内酯25、50、100mg/kg三个剂量组小鼠的存活时间呈剂量依赖性,以100mg/kg效果最佳,与红景天胶囊和乙酰唑胺阳性对照组无显著性差异,说明大苞雪莲总倍半萜内酯具有良好的耐缺氧作用,有很好的开发利用价值。
1.2. 大苞雪莲总倍半萜内酯对急性减压小鼠存活时间的影响
(1)实验目的:以小鼠在急性减压缺氧条件下呼吸停止死亡为指标,研究大苞雪莲总倍半萜内酯的耐缺氧作用。
(2)实验条件:三级动物实验室,室温20~25℃,空调恒温。
(3)实验对象:清洁级BABL /C,雄性, 8周龄,体重(20±2) g,由兰州生物制品研究所实验动物中心提供,合格证号: 14-002,饲养于兰州军区兰州总医院动物实验科。
(4)试药与仪器:红景天胶囊(中国人民解放军红景天研制中心,20081030);乙酰唑胺(武汉远城科技发展有限公司,100114);250 mL广口瓶(统一用注水法校准,容积为250 ± 2.5ml);凡士林(包头黄河石化有限责任公司,批号 050521);钠石灰(英国Molecular Products Limited公司产品);BP210S电子天平(荷兰赛多利斯有限公司生产);低压氧舱(贵州风雷航空军械有限责任公司)。
(5)供试品的制备:称取前述方法所提大苞雪莲总倍半萜内酯,先加适量吐温-80助溶,然后边研磨边加蒸馏水至刻度,配制成5 mg/ml的混悬液。
(6)实验方法与结果:取健康BALB/C小鼠40只,雄性,饲养适应3d后随机分成4组:缺氧型组、乙酰唑胺阳性对照组、大苞雪莲总倍半萜内酯高(50 mg·kg-1)剂量组,每组10只。单次尾静脉注射给药,给药体积为0.2mL·20g-1。给药后20 min,将动物放入低压舱,密闭舱门,以1000 m/min的速度减压上升海拔高度至5000m和8000m时分别各停留5min,最终上升至海拔高度10000m,维持此高度1h后,调节进孔阀门,缓慢降至正常海拔高度,打开舱门,观察统计1h内动物死亡率,并对实验结果进行方差分析。结果见表2。
表2 模拟急性高原减压缺氧对小鼠生存时间的影响(n=10)
注:## P﹤0.01,与缺氧模型组相比
结果:如表2结果所示,与缺氧模型组、乙酰唑胺组和红景天胶囊组相比,大苞雪莲总倍半萜内酯高剂量组可延长小鼠减压密闭缺氧存活时间(P﹤0.05),1h内死亡率为50%,说明大苞雪莲石油醚萃取部位能够有效降低小鼠在急性缺氧条件下的死亡率。
(7)结论:
急性减压实验是在模拟海拔10000m条件下,从整体水平上观察药物延长动物存活时间,评价药物对动物缺氧耐受力的提高程度的一种方法。本实验结果表明,大苞雪莲总倍半萜内酯能显著延长小鼠在海拔10000m条件下的存活时间。
1.3. 大苞雪莲总倍半萜内酯对慢性减压小鼠生化指标的影响
(1)实验目的:考察大苞雪莲总倍半萜内酯对小鼠在模拟高原环境下存活时间和能量代谢的影响情况。
(2)实验条件:三级动物实验室,室温20~25℃,空调恒温。
(3)实验对象:清洁级昆明种小白鼠,雌雄各半,8周龄,体重(20 ± 2 g),由兰州生物制品研究所实验动物中心提供,饲养于兰州军区兰州总医院实验动物科。
(4)试药与仪器:乙酰唑胺(武汉远城科技发展有限公司,100114);超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒、乳酸脱氢酶(LDH) 试剂盒、乳酸(LD)试剂盒、总蛋白质含量测定试剂盒、ATP含量测定试剂盒和ATP酶试剂盒(南京建成生物工程研究所);BP210S电子天平(荷兰赛多利斯有限公司生产);低压氧舱(贵州风雷航空军械有限责任公司)。
(5)供试品的制备:称取前述方法所提大苞雪莲总倍半萜内酯,先加适量吐温80助溶,然后边研磨边加蒸馏水至刻度,配制成5 mg/ml的混悬液。
(6)实验方法与结果:取健康BABL /C小鼠80只,雄性,饲养适应3d后随机分成4组:正常对照组、缺氧模型组、乙酰唑胺组(200 mg/kg)和大苞雪莲总倍半萜内酯高剂量组(50 mg/kg) ,每组20 只。单次尾静脉注射给药,给药体积为0.2mL·20g-1,给药后20min,将各组动物同时放入低压舱,密闭舱门,以100 m/min速度减压上升海拔高度至8000m,维持此高度6h后,调节进气孔阀门,缓慢降至正常海拔高度,打开舱门,迅速活杀,心脏采血500μL( EDTA-2K抗凝),即刻测定血糖、LD和LDH。同时分别迅速取动物大脑、心脏、肝脏和骨骼肌,于液氮中超低温冷藏备用,用于测定糖原、LD,LDH、ATP、K+Na +-ATP酶和Ga2+Mg2+-ATP酶。各指标测定方法均按照试剂盒说明书操作。
①大苞雪莲总倍半萜内酯对缺氧小鼠血浆、心肌组织LD含量、LDH活性的影响
如表3所示,缺氧模型组的血浆、心肌组织LD含量较正常对照组显著上升(P<0.01),LDH活性降低,而大苞雪莲总倍半萜内酯组的LD含量较缺氧模型组显著降低(P<0.01),LDH活性增强。乙酰唑胺组与大苞雪莲总倍半萜内酯组的变化趋势相同。
注:* P﹤0.05,** P﹤0.01,与正常组相比;
# P﹤0.05,## P﹤0.01,与缺氧模型组相比
② 对糖代谢的影响
如表4所示,缺氧模型组较正常对照组小鼠的血糖升高,肌糖原上升,肝糖原下降,总倍半萜内酯组的血糖较模型组下降(P<0.01),而肌糖原和肝糖原均升高(P<0.05)。乙酰唑胺组的血糖和肝糖原变化与总倍半萜内酯组一致,肌糖原变化与总倍半萜内酯组相反。
注:* P﹤0.05,** P﹤0.01,与正常组相比;
# P﹤0.05,## P﹤0.01,与缺氧模型组相比
③ 对心肌、脑组织中ATP含量和ATP酶的影响
如表5结果所示,缺氧模型组小鼠大脑皮质、心肌中ATP 含量、K+Na +-ATP酶和Ga2+Mg2+-ATP酶与正常对照组相比明显下降, 大苞雪莲总倍半萜内酯高剂量组上述指标下降幅度均明显小于模型组,与正常对照组接近。乙酰唑胺组与大苞雪莲总倍半萜内酯高剂量组作用效果相近。
注:* P﹤0.05,** P﹤0.01,与正常组相比;
# P﹤0.05,## P﹤0.01,与缺氧模型组相比
(7)结论:
慢性减压实验是模拟海拔8000m缺氧条件下,从组织水平上考察药物对缺氧动物能量代谢功能的影响情况。本实验发现,小鼠慢性缺氧6h后,心、脑、肝和骨骼肌组织ATP 含量、K+Na +-ATP酶和Ga2+Mg2+-ATP酶活性明显下降,血糖升高,肝糖原和肌糖原下降,血浆和心脏LD含量升高、LDH下降,而大苞雪莲总倍半萜内酯可以逆转这些变化趋势,从而加强糖酵解产能作用,并在一定程度上缓解糖酵解产生大量LD所致的细胞损害,同时调节糖代谢水平,使缺氧小鼠血糖维持在一个相对正常的水平。乙酰唑胺虽有类似作用,但活性明显低于大苞雪莲总倍半萜内酯。
综合以上研究结果,可以得出这样的结论:大苞雪莲总倍半萜内酯可通过促进缺氧小鼠糖酵解而发挥抗缺氧作用,而且效果有优于乙酰唑胺的趋势。如能进一步确定其抗缺氧的有效成分并阐明作用机制,对于大苞雪莲开发利用和一些缺氧引起的病理损害的防治将会产生积极作用。
具体实施方式
实施例1
溶剂法提取总倍半萜内酯:
①取干燥雪莲,粉碎,加10倍量体积浓度为95%的乙醇溶液,在20-30℃下温浸提取,反复多次,至提取液颜色变淡为止,提取液过滤,减压浓缩至比重约1.40g/ml,得醇提浸膏;
②将浸膏用3倍量水分散得水分散体系,依次用相当于水分散体系1/3倍体积的石油醚萃取多次,至萃取液颜色变淡为止,合并石油醚萃取液,减压浓缩,冷冻干燥。
实施例2
溶剂法提取总倍半萜内酯:
①取干燥雪莲,粉碎,加15倍量体积浓度为50%的乙醇溶液,在30-40℃下温浸提取,反复多次,至提取液颜色变淡为止,提取液过滤,减压浓缩至比重约1.40g/ml,得醇提浸膏;
②将浸膏用2倍量水分散得水分散体系,依次用相当于水分散体系1倍体积的石油醚萃取多次,至萃取液颜色变淡为止,合并石油醚萃取液,减压浓缩,冷冻干燥。
实施例3
二氧化碳超临界萃取提取总倍半萜内酯:
取雪莲干燥药材,粉碎,过筛后加入超临CO2萃取池中,参数设置范围为:萃取压力10~15MPa;萃取池温度35~40 ℃, 解析压力3.0 MPa,温度50 ℃,动态萃取120min,CO2流量30 L/h。
实施例4
二氧化碳超临界萃取提取总倍半萜内酯:
取雪莲干燥药材,粉碎,过筛后加入超临CO2萃取池中,参数设置范围为:萃取压力15~25MPa;萃取池温度40~55 ℃, 解析压力5.0 MPa,温度30 ℃,动态萃取60min,CO2流量10 L/h。
实施例5
石油醚回流提取总倍半萜内酯:
取雪莲干燥药材,粉碎,加11倍量石油醚,回流提取1h,共3次,合并石油醚提取液,减压浓缩,冷冻干燥,即得。
实施例6
石油醚回流提取总倍半萜内酯:
取雪莲干燥药材,粉碎,加14倍量石油醚,回流提取1h,共3次,合并石油醚提取液,减压浓缩,冷冻干燥,即得。
最后应说明的是:以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.雪莲总倍半萜内酯在制备抗缺氧药物中的应用,所述雪莲总倍半萜内酯是通过以下方法制得:
①取干燥雪莲,粉碎,加10-15倍量体积浓度为0.01~95%的乙醇溶液,在20-70℃下温浸提取,反复多次,至提取液颜色变淡为止;过滤提取液,减压浓缩,得醇提浸膏;
②将步骤①的浸膏用水分散得水分散体系,依次用相当于水分散体系1/3~1倍体积的石油醚萃取多次,至萃取液颜色变淡为止,合并石油醚萃取液,减压浓缩,冷冻干燥。
2.根据权利要求l所述的应用,其特征在于:所述雪莲选自大苞雪莲、水母雪莲或苞叶雪莲中的一种。
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