CN101418348A - 新疆雪莲的hplc指纹图谱及dna指纹图谱的建立方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及新疆雪莲的HPLC指纹图谱以及DNA指纹图谱的建立方法，其特征是HPLC指纹图谱包括乙酸乙酯、正丁醇两个不同极性提取部位的指纹图谱，乙酸乙酯提取部位的指纹图谱标示出20个共有峰，其中7个峰分别指认为东莨菪素、芦丁、异槲皮苷、忍冬苷、斛皮苷、高车前素和粗毛豚草素，正丁醇提取部位的指纹图谱标示出11个共有峰，其中3个峰分别指认为佛手内酯、东莨菪素和芦丁；DNA指纹图谱由RAPD和ISSR两种分子指纹图谱组成，HPLC指纹与DNA指纹相结合能从化学和生物学角度对新疆雪莲优劣、真伪进行全面、有效的检测。

Description

新疆雪莲的HPLC指纹图谱及DNA指纹图谱的建立方法

技术领域

本发明涉及新疆雪莲的HPLC指纹图谱及DNA指纹图谱的建立方法，可从化学和生物学两个角度对新疆雪莲进行质量检测。

背景技术

新疆雪莲全草入药，是雪莲花类药材主流品种。雪莲药用历史较久，甘、苦、温，归肝、脾、肾经。具有清热解毒、祛风除湿、通经活血、强筋助阳、抗炎镇痛、暖宫散寒等功效；用于风湿性关节炎、宫寒腹痛、闭经、胎衣不下、中风、肾虚腰痛、遗精阳痿、麻疹不透、肺寒咳嗽、高山不适应症等，为藏医、藏兽医、民间中医所习用。

近年来，随着中药现代化、国际化的深入发展，政府、企业和研究人员越来越清醒地认识到，控制中药的质量是我们亟待解决的关键技术之一，目前全国各科研机构已纷纷进行中药指纹图谱的研究。国家药品监督管理局己于2000年底颁布了《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》，在中药注射剂领域率先推行指纹图谱作为重要质控标准。中药指纹图谱按测定手段可分为中药化学指纹图谱和中药生物指纹图谱。中药化学指纹图谱首推色谱方法和联用技术。中药生物指纹图谱主要是测定各种中药材的DNA图谱，利用聚合酶链反应(PCR)从不同生物样品中人工扩增DNA片段。这种DNA片段的大小、数目可因不同的生物而异，故称之为“DNA指纹图谱”。DNA指纹分析是重要的分子标记技术，它包括限制性片段长度多态性分析(RFLP)、扩增片段长度多态性分析(AFLP)、随机扩增多态性分析(RAPD)、简单重复序列和简单重复序列区间多态性分析(SSR和ISSR)等。其中，RAPD和ISSR技术采用随机引物对基因组DNA进行全扫描，具有比其他分子标记技术简单易行，经济快速等优点，对DNA多态性检测效率高，可随寡聚核苷酸基因引物结合位点的频率有效地对基因组进行差异性分析。

目前关于雪莲HPLC指纹图谱的专利尚未见到，已发表文章共有7篇，其中苗爱东等人以乌鲁木齐南山产新疆雪莲药材为分析对象，建立了7个不同产地的新疆雪莲药材样品的指纹图谱，确定了13个共有峰，但未对这些峰进行指认(苗爱东、孙殿甲、彭燕等，HPLC法建立新疆雪莲指纹图谱研究，中成药，2003，25(9)：691-693)；苗爱东等人还研究了雪莲注射液的HPIC指纹图谱测定方法，以紫丁香苷为对照品，标示出雪莲注射液的11个特征指纹峰(苗爱东、孙殿甲、彭燕等，雪莲注射液HPLC指纹图谱研究，中国中药杂志，2004，29(11)：1044-1046)；薛秀峰等对10批次的雪莲药材制成的供试液进行指纹研究，确定17个峰为共有指纹峰，并指认8号峰为绿原酸，10号峰为紫丁香苷，13号峰为芦丁(薛秀峰，张海茹，潘丽娜等，雪莲及其注射液的指纹图谱研究.哈尔滨医科大学学报，2005，39(1)：72-74)；黄毅等研究了采自奇台县种植基地的天山雪莲不同部位的HPLC指纹图谱，得出了15个共有峰，但未进行色谱峰的指认(黄毅，周茜，阎明等，天山雪莲不同部位总黄酮含量及高效液相指纹图谱分析，中药材，2005，28(11)：980-982)；王晓玲等人建立了购于新疆药材公司的10批新疆雪莲样品的指纹图谱，标示出12个共有峰，鉴定出其中7个化学成分，分别为东莨菪苷、芦丁、异槲皮苷、忍冬苷、斛皮苷、高车前素和粗毛豚草素(王晓玲，蔡敏，周燕等，新疆雪莲的高效液相指纹图谱及液-质联用分析，天然产物研究与开发，2006，18(4)：624-627)；闫明等人采用HPLC/DAD法对7个产地的雪莲色谱图中共有8强峰进行了光谱相似检验，共有8强峰的UV光谱图完全一致，光谱相似指数为1，8个共有峰中峰3为芦丁(闰明，黄毅，仲婕等，HPLC/DAD光谱相似指数法在雪莲指纹图中的研究，药物分析杂志，2007，27(4)：506-509)；欧元等人以绿原酸、紫丁香苷、芦丁、木犀草素、芹菜素5种对照品为对照，建立了10个不同产地天山雪莲的指纹图谱，标示出天山雪莲的13个特征指纹峰(欧元，袁晓凡，徐春明等，天山雪莲HPLC指纹图谱研究，中草药，2008，39(1)：105-108)。

以上7篇文章中除1篇研究的只是雪莲注射剂外，其余用于指纹图谱研究的雪莲药材的制备都是使用雪莲的醇提物(不同浓度的甲醇或乙醇提取物)直接进行色谱分析，得出的共有峰数较少，很多研究中还未对共有峰进行指认。此外，很多文章中雪莲药材的来源地单一或不够广泛。样品收集是研究指纹图谱最初也是最关键的步骤，由于不同产地的中药材化学成分很可能差异很大，所以收集的样品要有足够的代表性，只有在相当数量的样品中，才能清楚地显现出它的特征。所以，至少要对10个产地以上不同等级的样品进行分析和考察，从中归纳出各批合格样品所共有、峰面积相对稳定的色谱峰作为指纹峰。只有保证样品的代表性，才能保证建立的指纹图谱的药效性。同时，雪莲化学成分非常复杂，包括黄酮、生物碱、多糖、内酯、挥发油等多类化学成分。由于每种分析方法只能表达中药材的部分信息，对于化学成分复杂的中药材，可以采取分部位提取分别研究或采用不同分析方法的策略获得更多的信息，必要时可以由多种方法制定一组图谱共同构成指纹图谱。

雪莲DNA指纹图谱研究尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供10个产地的新疆雪莲不同提取部位的、色谱峰表征信息量大的HPLC指纹图谱以及新疆雪莲DNA指纹图谱的建立方法，用于对雪莲进行有效的质量检测。本发明同时提供了10个产地新疆雪莲的乙酸乙酯和正丁醇两个不同极性提取部位的HPLC指纹图谱。

本发明中10个不同产地的新疆雪莲的HPLC指纹图谱的建立通过以下步骤实施：

1)本发明采用如表1所示的10个不同产地的新疆雪莲为供试材料。

表1 雪莲样品来源

2)样品溶液的制备：分别取雪莲样品，粉碎后过40目筛，精密称取，置圆底烧瓶中用70％乙醇浸泡，摇床过夜，超声细胞粉碎机提取，离心，上清液减压浓缩后，悬浮于水中，用等体积石油醚萃取2-3次，回收废液，水层以乙酸乙酯萃取1-2次，乙酸乙酯层浓缩至干，甲醇定容，水层再用正丁醇萃取1-2次，合并后浓缩至干，甲醇定容，用0.20μm有机相针式滤器过滤后取滤液进行色谱分析。

3)色谱条件的选择：岛津VP-ODS色谱柱，乙腈-0.1％的乙酸梯度洗脱，梯度条件：0min-20min-40min-60min；乙腈浓度：5％-30％-30％-100％，二元梯度洗脱，检测波长：270nm，柱温：30℃，流速：1.0mL/min。

4)测定：分别精密吸取乙酸乙酯层和正丁醇层供试品溶液各5uL分别进样分析，记录时间为60min。乙酸乙酯提取部位标示出共有特征指纹峰20个，其峰面积总和占总峰面积的90％以上，以其中9号峰芦丁峰的相对保留时间和相对峰面积为1，共有特征指纹峰如表2所示；正丁醇提取部位标示出共有特征指纹峰11个，其峰面积总和占总峰面积的90％以上，以其中10号峰芦丁峰的相对保留时间和相对峰面积为1，共有特征指纹峰如表2所示。

5)HPLC-MS分析：通过正负离子扫描可获得各个化学成分的[M+H]⁺和[M-H]^-的准分子离子峰，由此得知化合物的分子量，结合相关报道(王晓玲，蔡敏，周燕等，新疆雪莲的高效液相指纹图谱及液-质联用分析，天然产物研究与开发，2006，18(4)：624-627)，在乙酸乙酯提取部位指认了7个成分的化学结构，在正丁醇提取部位指认了3个成分的化学结构，结果如表2所示。

表2 新疆雪莲乙酸乙酯提取部位和正丁醇提取部位的共有特征指纹峰

本发明中DNA指纹图谱的建立通过以下步骤实施：

1)选用如表1所示的10个不同产地的新疆雪莲为供试材料。

2)新疆雪莲DNA的提取及纯化；

3)用获得高纯度新疆雪莲DNA为模板进行RAPD和ISSR分析；

4)选择有代表性(稳定性和重复性)的多态性RAPD和ISSR扩增条带，根据所选择条带的有、无构建供试材料DNA指纹图谱。该图谱为由“1”和“0”组成的句子以阵列形式表现出来。所述数字“1”表示图谱中某个位置上有扩增带存在，数字“0”表示在某个位置上没有扩增条带存在。

本发明的优点如下：

1)本发明以10个不同产地的新疆雪莲分成乙酸乙酯和正丁醇两个不同极性提取部位建立起来的HPLC指纹图谱，共有峰数多，表征信息量大，指认的共有峰较多，代表性强，将两个提取部位的指纹图谱作为整体看待，可实现对化学成分复杂的雪莲质量优劣与真伪的全面、有效判断。

2)本发明建立的新疆雪莲HPLC指纹图谱方法简便，精密度、稳定性、重复性好，能从色谱的整体面貌上把握雪莲药材的化学成分。

3)本发明提出的新疆雪莲DNA指纹图谱的建立方法，采用RAPD和ISSR两种技术能从遗传本质上准确、可靠地对雪莲进行种质鉴定。

4)本发明提供的新疆雪莲HPLC指纹图谱与提出的DNA指纹图谱的建立方法相结合，可以从化学和生物学两个角度对雪莲质量进行检测。

附图说明

图1：10个产地新疆雪莲乙酸乙酯提取部位的HPLC指纹图谱

图2：10个产地新疆雪莲正丁醇提取部位的HPLC指纹图谱

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，下述实施例仅用于说明本发明而并非对本发明的限制。

实施例一 新疆雪莲HPLC指纹图谱的建立

1.仪器与材料

Shimadzu LC-20A色谱仪，配自动进样器，PDA二极管阵列检测器，LC solution色谱工作站，日本岛津公司；LTQ液质联用仪，美国热电公司；有机相过滤膜d：50mm，孔径：0.22μm，有机相针式过滤器13mm×0.20μm，上海安谱公司；40目标准筛，孔径：0.45μm：上虞市仪器厂；JY99-2D超声波细胞粉碎机；宁波新芝科器研究所；TDL-5-A型低速台式离心机，上海安亭科学仪器厂；超纯水器，美国Millipore公司；RE-52AA旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；KQ5200DB型数控超声清洗器，中国玉环曙峰。

甲醇、乙腈(色谱醇J&K Chemical)；无水甲醇、乙酸(分析纯，北京化工厂)；水为超纯水，10个不同产地的雪莲。

2.样品的制备

与“发明内容”所述“样品的制备”相同。

3.新疆雪莲的HPLC指纹图谱测定

3.1 色谱条件

与“发明内容”所述“色谱条件”相同

3.2 共有峰确定

如“发明内容”所述在乙酸乙酯提取部位标示出20个共有峰(表3和表4)，在正丁醇提取部位标示出11个共有峰(表5和表6)。

表3 10个产地新疆雪莲药材乙酸乙酯层共有峰的相对保留时间

表4 10个产地新疆雪莲药材乙酸乙酯层共有峰的相对峰面积

表5 10个产地新疆雪莲药材正丁醇层共有峰的相对保留时间

表6 10个产地新疆雪莲药材正丁醇层共有峰的相对峰面积

3.3 指纹图谱精密度试验

精密称取一种新疆雪莲粉末5g，按照2.2所示方法制备成供试品溶液，连续进样6次，分别对共有峰的相对保留时间和相对峰面积进行统计，RSD％小于3％。结果表明此方法精密度好。

3.4 指纹图谱稳定性试验

精密称取新疆雪莲粉末5g，按照2.2所示方法制备成供试品溶液，在室温下分别放置0、2、4、8、12、24h后进样分析，分别对共有峰的相对保留时间和相对峰面积进行统计，RSD％小于3％。说明供试品溶液在24h内稳定。结果表明此方法稳定性好。

3.5 指纹图谱重复性试验

取同一批新疆雪莲粉末6份，按照2.2所示方法制备成6份供试品溶液，分别进样，对共有峰的相对保留时间和相对峰面积进行统计，RSD％小于3％。结果表明此方法重复性好。

4.HPLC-MS分析

如“发明内容”所述在乙酸乙酯提取部位指认了7个成分的化学结构，在正丁醇提取部位指认了3个成分的化学结构，结果分别见表7和表8。

表7 新疆雪莲乙酸乙酯层的HPLC-MS分析结果

表8 新疆雪莲正丁醇层的HPLC-MS分析结果

实施例2 新疆雪莲DNA指纹图谱的建立方法：

1.DNA的提取

采取各产地药材的干燥叶片磨样，利用CTAB法提取其DNA，所得的DNA采用凝胶电泳结合密度扫描法鉴定其纯度和浓度。

2.PCR扩增

PCR反应在型号为Longene MG-96G的PCR扩增仪上进行，反应体系为25ul。其中，

RAPD分析包含：模板基因组50ng DNA、2.3mmol/LMg²⁺、1.8UTaq酶、0.35mmol/LdNTP、0.6umol/L引物，基本扩增程序为：95℃预变性2min，94℃变性40s，37℃退火1min，72℃延伸2min，40个循环，最后72℃延伸7min。

ISSR分析包含：模板基因组50ng DNA、2.5mmol/L Mg²⁺、2.5U Taq酶、0.35mmol/LdNTP、0.8umol/L引物，基本扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火45s，72℃延伸2min，40个循环，最后72℃延伸7min。

3.PCR扩增产物的电泳检测

PCR扩增产物中加入0.005％的溴酚兰指示剂，室温下在2％的琼脂糖凝胶上电泳2h(100v)，条带分子量大小通过凝胶成像扫描分析。

4.数据的分析

统计能产生多态性的引物在10个产地新疆雪莲DNA样品中扩增的电泳带总数与多态性带的数目。在电泳图谱同一个位点上有电泳带记录为1，无电泳带记录为0。0、1矩阵图输入计算机。根据Nei的方法计算不同产地新疆雪莲间的相似系数(GS)，按平均距离法(UPGMA法)进行聚类分析。

5.DNA指纹图谱的构建

按照上述各材料各引物的扩增情况，挑取具有代表性的(稳定性和重复性良好的)RAPD和ISSR多态性带，绘制10个产地新疆雪莲的DNA指纹图谱。

Claims (6)

1、新疆雪莲的HPLC指纹图谱及DNA指纹图谱的建立方法，其特征在于：

1)HPLC指纹图谱是对10个不同产地的新疆雪莲的乙酸乙酯和正丁醇两个不同极性提取部位进行指纹图谱分析；

2)DNA指纹图谱建立方法，是采用RAPD和ISSR两种分子标记技术进行DNA多态性分析。

2、根据权利1要求的新疆雪莲的HPLC指纹图谱，其特征在于，乙酸乙酯提取部位共有特征指纹峰有20个，其峰面积总和占总峰面积的90％以上，以其中9号峰芦丁峰的相对保留时间和相对峰面积为1，共有特征指纹峰为：

1号峰：相对保留时间0.103-0.110，相对峰面积0.003-0.414；

2号峰：相对保留时间0.123-0.131，相对峰面积0.008-0.189；

3号峰：相对保留时间0.149-0.151，相对峰面积0.002-0.114；

4号峰：相对保留时间0.205-0.214，相对峰面积0.002-0.076；

5号峰：相对保留时间0.228-0.232，相对峰面积0.002-0.087；

6号峰：相对保留时间0.616-0.623，相对峰面积0.013-0.268；

7号峰：相对保留时间0.800-0.813，相对峰面积0.072-0.503；

8号峰：相对保留时间0.829-0.851，相对峰面积0.002-1.522；

9号峰：相对保留时间1，相对峰面积1；

10号峰：相对保留时间1.056-1.060，相对峰面积0.032-0.307；

11号峰：相对保留时间1.074-1.081，相对峰面积0.027-0.203；

12号峰：相对保留时间1.154-1.158，相对峰面积0.049-3.682；

13号峰：相对保留时间1.176-1.180，相对峰面积0.020-0.395；

14号峰：相对保留时间1.323-1.343，相对峰面积0.032-3.354；

15号峰：相对保留时间1.872-1.894，相对峰面积0.043-6.491；

16号峰：相对保留时间2.251-2.267，相对峰面积0.074-1.752；

17号峰：相对保留时间2.275-2.289，相对峰面积0.025-2.167；

18号峰：相对保留时间2.293-2.308，相对峰面积0.383-16.732；

19号峰：相对保留时间2.742-2.759，相对峰面积0.006-0.432；

20号峰：相对保留时间2.765-2.786，相对峰面积0.019-1.157；

正丁醇提取部位共有特征指纹峰有11个，其峰面积总和占总峰面积的90％以上，以其中10号峰芦丁峰的相对保留时间和相对峰面积为1，共有特征指纹峰为：

1号峰：相对保留时间0.124-0.133，相对峰面积0.013-0.204；

2号峰：相对保留时间0.150-0.153，相对峰面积0.013-0.119；

3号峰：相对保留时间0.204-0.207，相对峰面积0.022-0.244；

4号峰：相对保留时间0.229-0.244，相对峰面积0.014-0.265；

5号峰：相对保留时间0.442-0.456，相对峰面积0.012-0.145；

6号峰：相对保留时间0.540-0.552，相对峰面积0.021-0.316；

7号峰：相对保留时间0.699-0.704，相对峰面积0.040-0.162；

8号峰：相对保留时间0.712-0.726，相对峰面积0.007-0.158；

9号峰：相对保留时间0.839-0.871，相对峰面积0.129-2.956；

10号峰：相对保留时间1，         相对峰面积1；

11号峰：相对保留时间1.059-1.094，相对峰面积0.019-0.050。

3、根据权利1要求的新疆雪莲的HPLC指纹图谱，其特征在于，经LC-MS分析并结合文献报道，将乙酸乙酯提取部位的峰4、9、10、11、12、16、18分别指认为东莨菪素、芦丁、异槲皮苷、忍冬苷、斛皮苷、高车前素和粗毛豚草素；将正丁醇提取部位的峰2、3、10分别指认为佛手内酯、东莨菪素和芦丁。

4、根据权利1要求的新疆雪莲的HPLC指纹图谱，其特征在于，该图谱的建立包括以下步骤：

1)样品的制备：雪莲样品粉碎后过40目筛，精密称取，置圆底烧瓶中用70％乙醇浸泡，摇床过夜，超声细胞粉碎机提取，离心，上清液减压浓缩后，悬浮于水中，用等体积石油醚萃取2-3次，回收废液，水层以乙酸乙酯萃取1-2次，乙酸乙酯层浓缩至干，甲醇定容，水层再用正丁醇萃取1-2次，合并后浓缩至干，甲醇定容，用0.20μm有机相针式滤器过滤后取滤液进行色谱分析。

2)色谱条件：岛津VP-ODS色谱柱，乙腈-0.1％的乙酸梯度洗脱，梯度条件：0min-20min-40min-60min；乙腈浓度：5％-30％-30％-100％，二元梯度洗脱，检测波长：270nm，柱温：30℃，流速：1.0mL/min。

3)测定：分别精密吸取乙酸乙酯层和正丁醇层供试品溶液各5uL分别进样分析，记录时间为60min。

4)LC-MS分析。

5、根据权利1要求的新疆雪莲的DNA指纹图谱建立方法，其特征在于，该图谱为由“1”和“0”组成的句子以阵列形式表现出来，所述数字“1”表示图谱中某个位置上有扩增带存在，数字“0”表示在某个位置上没有扩增条带存在。

6、根据权利1要求的新疆雪莲的DNA指纹图谱建立方法，其特征在于，按如下步骤操作：

1)新疆雪莲DNA的提取及纯化；

2)用获得的高纯度新疆雪莲DNA为模板进行RAPD和ISSR分析；

3)选择有代表性的多态性RAPD和ISSR扩增条带，根据所选择条带的有、无构建供试材料DNA指纹图谱。

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