CN108226331B - 一种抗肿瘤注射制剂的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种抗肿瘤注射制剂的检测方法，所述抗肿瘤注射制剂是由中药材人参、斑蝥、黄芪和刺五加制成，所述检测方法包括性状、鉴别、检查、指纹图谱、含量测定项目。其中，鉴别包括显色反应以及对刺五加、人参、黄芪药材的定量鉴别；检查包括5‑羟甲基糠醛、炽灼残渣、溶液颜色等注射制剂的特殊检查；指纹图谱是采用HPLC法对人参、黄芪、刺五加所含活性成分的表征；含量测定是对产品中总皂苷、紫丁香苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和斑蝥素的含量进行检测。与现有技术相比，本发明增加了对刺五加药材的鉴别、5‑羟甲基糠醛等的特殊检查、指纹图谱表征，以及紫丁香苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量测定，优化了人参、黄芪药材的鉴别方法，以及斑蝥素的含量测定方法，提高了对产品质量检测的要求，更加适合于今后药品的质量控制，保障药品质量和临床药效。

Description

一种抗肿瘤注射制剂的检测方法

技术领域

本发明属于药品领域，具体涉及一种抗肿瘤注射制剂的检测方法。

背景技术

癌症是严重威胁人类健康的一大类疾病，艾迪注射制剂由斑蝥、人参、黄芪和刺五加制成，具有清热解毒、消瘀散结的作用，主要用于原发性肝癌，肺癌，直肠癌，恶性淋巴瘤，妇科恶性肿瘤等疾病，上市产品艾迪注射液的现行质量标准编号为WS3—B—3809—98，收载于卫生部药品标准中药成方制剂第二十册。

本发明在前期的研究中，在质量标准的基础上逐渐增加了一些检测指标，同时优化部分检测环节中试剂、检测手段或者是样品的制备等过程。比如200510200881.2治疗肿瘤的注射制剂的质量控制方法，优化了人参皂苷Re和斑蝥素的含量测定以及人参和黄芪的薄层鉴别；200710078008.X一种艾迪注射制剂的检测方法级分案申请201010531105.1、201010531088.1，优化了人参、黄芪的薄层鉴别中供试品溶液的制备方法及薄层板厚度，以及斑蝥素的含量测定方法；CN200810068789.9艾迪制剂中人参皂苷含量测定方法，优化了对人参皂苷的含量测定。但是随着社会的发展，对于药品的质量控制的要求越来越高，对其中活性成分的鉴别、含量测定等检测指标也逐渐需要进行明确，而且对于寻找快捷方便可控的检测方法的需求也越来越迫切，并且，国家食品药品监督管理局已颁布了《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》，中药指纹图谱有望作为一种强制执行的质量措施载入《中华人民共和国药典》，为实现中药走向世界提供有力的质量保证。因此，在外因和内因的双重要求下，如何有效控制该产品的质量，确保该产品的临床疗效，以及满足国家标准对于安全性、有效性等要求，是本申请人长期以来一直研究的问题。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种抗肿瘤注射制剂的检测方法，其质量控制效果好，具体表现为：指纹图谱表征较全面，客观真实地反映了产品内在化学成分的种类与数量，与对照相比相似度高，能有效表征艾迪制剂的产品质量；鉴别方法准确有效，含量测定方法精密度高，重现性好，稳定性好，回收率高，检测方法整体的测量结果准确可靠，提高了艾迪制剂的质量控制标准，可有效地控制产品质量，从而确保其临床疗效。

具体地：

一种抗肿瘤注射制剂的检测方法，所述注射制剂由斑蝥1-2份、人参30-70份、黄芪75-125份、刺五加130-180份制成注射液，所述检测方法由性状、鉴别、检查、指纹图谱、含量测定项目组成，其特征在于：

所述鉴别包括α-萘酚显色反应，以异嗪皮啶为对照、以二氯甲烷∶甲醇∶甲酸＝30-50∶0.3-0.6∶0.3-0.6为展开剂、对制剂中刺五加药材的薄层色谱鉴别，以及以人参皂苷Re、Rg1、Rb以及黄芪甲苷为对照、以三氯甲烷∶甲醇∶水∶甲酸＝10-20∶4-8∶0.5-2∶0.2-0.5为展开剂、对制剂中人参和黄芪药材的薄层色谱鉴别；

所述检查为溶液的颜色、pH值检查，以甲醇：0.4％冰醋酸＝2-8:92-98为流动相、对注射剂中5-羟甲基糠醛含量进行的HPLC法检查，以及对注射液中炽灼残渣、热原、异常毒性、过敏反应、溶血与凝聚、其他注射剂项目的检查；

所述指纹图谱是对制剂中人参、黄芪、刺五加药材，以含0.005％体积量的三氟醋酸的乙腈溶液为流动相A，以含0.005％体积量的三氟醋酸的水溶液为流动相B，进行梯度洗脱的HPLC法指纹图谱表征过程；

所述含量测定是对制剂中人参总皂苷含量进行测定，采用人参皂苷Re对照品为对照的紫外-可见分光光度法；对刺五加中所含的紫丁香苷、黄芪中所含的毛蕊异黄酮葡萄糖苷进行含量测定，采用甲醇为流动相A、水为流动相B进行梯度洗脱的HPLC法；对斑蝥所含斑蝥素含量进行测定，采用以5％二苯基-95％二甲基聚硅氧烷为固定相的气相-毛细管色谱法。

所述抗肿瘤注射制剂可以采用上市艾迪注射液的制备方法，也可以采用现有专利或文献提供的方法制备，还可以采取以下方法制备：

处方：斑蝥1.5g、人参50g、黄芪100g、刺五加150g；

制法：以上四味，人参加50％乙醇温浸，加热回流提取两次，第一次3小时，第二次1.5小时，滤过，回收乙醇，药液备用；药渣与黄芪、刺五加加水煎煮三次，第一次3小时，第二次1.5小时，第三次1小时，滤过，浓缩，与人参药液合并，浓缩至相对密度为1.15～1.25(60℃～70℃)，加乙醇使含醇量至75％，冷藏；滤过，回收乙醇，药液水沉(加水，煮沸，冷藏)；滤过，滤液浓缩至相对密度为1.15～1.25(60℃～70℃)，加乙醇使含醇量至90％，冷藏；滤过，回收乙醇，药液水沉两次；滤过，滤液浓缩，灭菌，冷藏；滤过，用氢氧化钠溶液调pH值至7.0～7.6，灭菌，冷藏；滤过，滤液浓缩，水沉；滤过，超滤，冷藏；超滤，得提取液冷藏备用。斑蝥加水温浸，煎煮四次，每次1小时，滤过，浓缩，以石硫法(氧化钙，亚硫酸)处理两次，灭菌，冷藏；取上清液，浓缩至相对密度1.02～1.10(60℃～70℃)，醇沉两次，加乙醇使含醇量分别至75％、85％，冷藏；滤过，滤液回收乙醇，水沉两次(加水，煮沸，亚硫酸调pH值至4.0～5.0，冷藏)；滤过，亚硫酸调pH值至4.0～5.0，灭菌，冷藏；滤过，超滤，冷藏；超滤，灭菌，得斑蝥提取液冷藏备用。将上述两种提取液混合，加入甘油、聚山梨酯-80，加注射用水稀释至1000ml，调pH值，过滤，灌封，115℃灭菌30分钟，即得。

进一步的，所述鉴别方法如下：

(1)取注射液50-100ml浓缩至10-20ml后，加乙醇50-100ml，搅匀，滤过，沉淀物用乙醇洗涤1-3次，将沉淀物用5-10ml水溶解，取1-2ml置试管中，微热后加入5％的α-萘酚乙醇溶液5-10滴，摇匀，再沿管壁缓缓加入浓硫酸0.5-1ml，在两液面接界处显紫红色环；

(2)取注射液50-100ml，用二氯甲烷振摇提取1-3次，每次用量30-60ml，合并二氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇2-4ml使溶解，作为供试品溶液，二氯甲烷提取后的水液备用；另取异嗪皮啶对照品，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2015年版四部通则0502的薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各1μl～4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷∶甲醇∶甲酸＝30-50∶0.3-0.6∶0.3-0.6为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm波长的紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝色荧光斑点；

(3)取鉴别(2)项下二氯甲烷提取后的水液，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取1-3次，每次用量50-100ml，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2-3次，每次用量30-60ml，弃去氨试液，正丁醇液蒸干，残渣加水10-20ml使溶解，通过已处理好的内径1.5cm，长15cm的DA－201大孔吸附树脂柱，用水100-200ml洗脱，弃去洗脱液，再用15-30％的乙醇80-160ml洗脱，弃去洗脱液，再用35-50％的乙醇80-160ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2-4ml使溶解，作为供试品溶液；另取人参皂苷Rg₁对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rb₁对照品及黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml各含0.5mg的混合溶液，作为对照品溶液；照中国药典2015年版四部通则0502的薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl～20μl，分别点于同一硅胶H高效薄层板上进行带状点样，以三氯甲烷∶甲醇∶水∶甲酸＝10-20∶4-8∶0.5-2∶0.2-0.5为展开剂，于30℃以下展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，置365nm波长的紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

更进一步的，所述鉴别方法如下：

(1)取注射液50ml浓缩至10ml后，加乙醇50ml，搅匀，滤过，沉淀物用乙醇洗涤2次，将沉淀物用5ml水溶解，取1ml置试管中，微热后加入5％的α-萘酚乙醇溶液5滴，摇匀，再沿管壁缓缓加入浓硫酸0.5ml，在两液面接界处显紫红色环；

(2)取注射液50ml，用二氯甲烷振摇提取2次，每次用量30ml，合并二氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液，二氯甲烷提取后的水液备用；另取异嗪皮啶对照品，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2015年版四部通则0502的薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各1μl～2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷∶甲醇∶甲酸＝40∶0.5∶0.5为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm波长的紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝色荧光斑点；

(3)取鉴别(2)项下二氯甲烷提取后的水液，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次用量50ml，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次，每次用量30ml，弃去氨试液，正丁醇液蒸干，残渣加水10ml使溶解，通过已处理好的内径1.5cm，长15cm的DA-201大孔吸附树脂柱，用水100ml洗脱，弃去洗脱液，再用20％的乙醇80ml洗脱，弃去洗脱液，再用40％的乙醇80ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取人参皂苷Rg₁对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rb₁对照品及黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml各含0.5mg的混合溶液，作为对照品溶液；照中国药典2015年版四部通则0502的薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl～10μl，分别点于同一硅胶H高效薄层板上进行带状点样，以三氯甲烷∶甲醇∶水∶甲酸＝15∶6∶1∶0.2为展开剂，于30℃以下展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，置365nm波长的紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

进一步的，对5-羟甲基糠醛的含量检查方法如下：

按照中国药典2015年版四部通则0512中高效液相色谱法测定：

取注射液1-2ml，作为供试品溶液；另取5-羟甲基糠醛对照品，精密称定，加0.1％甲酸溶液稀释制成每lml中含5μg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2015年版四部通则0512中高效液相色谱法测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇：0.4％冰醋酸溶液＝2-8:92-98为流动相；检测波长为284nm；柱温为30℃；理论板数按5-羟甲基糠醛峰计算不低于4000；精密量取供试品溶液与对照品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；计算5-羟甲基糠醛含量。

更进一步的，所述5-羟甲基糠醛的含量检查方法中，流动相为甲醇：0.4％冰醋酸溶液＝4:96。

进一步的，指纹图谱表征方法如下：

按照中国药典2015年版四部通则0512中高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以含0.005-0.01％体积量的三氟醋酸的乙腈溶液为流动相A，以含0.005-0.01％体积量的三氟醋酸的水溶液为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为210nm；柱温为20℃；流速为每分钟0.7ml；理论板数按紫丁香苷峰计算应不低于5000；

所述梯度洗脱条件为：

0-5min，流动相A 2％，流动相B 98％；

5-10min，流动相A 2-5％，流动相B 98-95％；

10-18min，流动相A 5-10％，流动相B 95-90％；

18-30min，流动相A 10-15％，流动相B 90-85％；

30-38min，流动相A 15-20％，流动相B 85-80％；

38-50min，流动相A 20-23％，流动相B 80-77％；

50-65min，流动相A 23-38％，流动相B 77-62％；

65-75min，流动相A 38-55％，流动相B 62-45％；

75-95min，流动相A 55-100％，流动相B 45-0％；

95-110min，流动相A 100％，流动相B 0％；

参照物溶液的制备：取紫丁香苷对照品、刺五加苷E对照品、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml各含50μg的混合溶液，摇匀，即得；

供试品溶液的制备：取注射液5-10ml，通过已预处理的固相萃取柱，先以水1ml洗脱，弃去水液，再用甲醇洗脱，收集洗脱液至2-4ml量瓶中，至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录110分钟的色谱图，即得。

更进一步的，所述指纹图谱表征中，流动相A、B中三氟醋酸的体积量为0.005％；供试品溶液的制备方法为：取注射液5ml，通过已预处理的固相萃取柱，先以水1ml洗脱，弃去水液，再用甲醇洗脱，收集洗脱液至2-4ml量瓶中，至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

进一步的，紫丁香苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量测定方法如下：

照中国药典2015年版四部通则0512中高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以水为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为260nm，理论板数按紫丁香苷峰计算应不低于2000；

所述梯度洗脱条件为：

0-10min，流动相A 25％，流动相B 75％；

10-13min，流动相A 25-350％，流动相B 75-650％；

13-30min，流动相A 35-60％，流动相B 60-40％；

30-31min，流动相A 100％，流动相B 0％；

31-35min，流动相A 100％，流动相B 0％；

对照品溶液的制备：取紫丁香苷对照品、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含紫丁香苷25μg、毛蕊异黄酮葡萄糖苷15μg的混合溶液，即得；

供试品溶液的制备：取注射液，滤过，取续滤液，即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

进一步的，斑蝥素的含量测定方法如下：

照中国药典2015年版四部通则0521中气相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以5％二苯基-95％二甲基聚硅氧烷为固定相的石英毛细管柱，柱长为30m，内径为0.32mm，膜厚度为0.25μm；柱温为程序升温：初始温度为100℃，以每分钟2℃的速率升温至140℃；进样口温度为250℃，检测器温度为300℃；载气为氮气，流速为2.5±0.5ml/分钟；分流进样，分流流量3ml/min，分流比为1:1；理论板数按斑蝥素峰计算应不低于15000，相对标准偏差应不大于3.5％；

对照品溶液的制备：取斑蝥素对照品，精密称定，加二氯甲烷制成每1ml含10μg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取注射液20-40ml，置分液漏斗中，加入1.8mol/L硫酸溶液2-4ml，混匀，精密加入二氯甲烷2-4ml，振摇提取，静置分层，取二氯甲烷液，滤过，取续滤液，即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2μl，注入气相色谱仪，测定，计算，即得。

进一步的，人参总皂苷的含量测定方法如下：

照中国药典2015年版四部通则0401中紫外-可见分光光度法测定：

对照品溶液的制备：取人参皂苷Re对照品，精密称定，加甲醇制成每1ml含1.6mg的溶液，摇匀，即得；

标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0μl、20μl、40μl、60μl、80μl、100μl，分别置10ml具塞试管中，置水浴上挥去溶剂，立即取出，放冷，加5％香草醛冰醋酸溶液0.2ml、高氯酸0.8ml，摇匀，置60℃水浴中加热15分钟，取出，用水冷却2分钟，加冰醋酸5ml，摇匀，照紫外—可见分光光度法，在544nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线；

供试品溶液的制备：取注射液20-40ml，置分液漏斗中，用三氯甲烷振摇提取2-4次，每次20-30ml，合并三氯甲烷液，用水洗涤2-3次，每次5-10ml，弃去三氯甲烷液，洗液与上述水液合并，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取2-4次，每次50-60ml，合并正丁醇液，加入无水硫酸钠3-5g，搅拌，放至澄清；将正丁醇液移至蒸发皿中，用少量正丁醇洗涤无水硫酸钠，洗液并入蒸发皿中，蒸干，用少量水溶解残渣，通过已处理好的内径1.5cm、长15cm的DA-201大孔吸附树脂柱上，待液面接近棉花层后，用水100-200ml洗脱，控制流速为0.3-0.5ml/min，弃去洗液，再用65-75％乙醇80-100ml洗脱，收集洗脱液于蒸发皿中，置水浴上蒸干，残渣加甲醇溶解，并转移至5-10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；

测定法：精密量取供试品溶液100μl，照标准曲线的制备项下的方法，自“置10ml具塞试管中”起依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中人参皂苷Re的浓度，计算，即得。

具体地，一种抗肿瘤注射制剂的检测方法，所述检测方法如下：

性状：

产品为浅黄色至浅棕色的澄明液体；

鉴别：

(1)取注射液50-100ml浓缩至10-20ml后，加乙醇50-100ml，搅匀，滤过，沉淀物用乙醇洗涤1-3次，将沉淀物用5-10ml水溶解，取1-2ml置试管中，微热后加入5％的α-萘酚乙醇溶液5-10滴，摇匀，再沿管壁缓缓加入浓硫酸0.5-1ml，在两液面接界处显紫红色环；

(2)取注射液50-100ml，用二氯甲烷振摇提取1-3次，每次用量30-60ml，合并二氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇2-4ml使溶解，作为供试品溶液，二氯甲烷提取后的水液备用；另取异嗪皮啶对照品，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2015年版四部通则0502的薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各1μl～4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷∶甲醇∶甲酸＝30-50∶0.3-0.6∶0.3-0.6为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm波长的紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝色荧光斑点；

(3)取鉴别(2)项下二氯甲烷提取后的水液，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取1-3次，每次用量50-100ml，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2-3次，每次用量30-60ml，弃去氨试液，正丁醇液蒸干，残渣加水10-20ml使溶解，通过已处理好的内径1.5cm，长15cm的DA－201大孔吸附树脂柱，用水100-200ml洗脱，弃去洗脱液，再用15-30％的乙醇80-160ml洗脱，弃去洗脱液，再用35-50％的乙醇80-160ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2-4ml使溶解，作为供试品溶液；另取人参皂苷Rg₁对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rb₁对照品及黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml各含0.5mg的混合溶液，作为对照品溶液；照中国药典2015年版四部通则0502的薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl～20μl，分别点于同一硅胶H高效薄层板上进行带状点样，以三氯甲烷∶甲醇∶水∶甲酸＝10-20∶4-8∶0.5-2∶0.2-0.5为展开剂，于30℃以下展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，置365nm波长的紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

检查：

(1)溶液的颜色：取注射液1-2ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，按照中国药典2015年版四部通则0901第一法与黄色8号标准比色液比较，不得更深；

(2)pH值：3.8-5.8；

(3)5-羟甲基糠醛：按照中国药典2015年版四部通则0512中高效液相色谱法测定：

取注射液1-2ml，作为供试品溶液；另取5-羟甲基糠醛对照品，精密称定，加0.1％甲酸溶液稀释制成每lml中含5μg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2015年版四部通则0512中高效液相色谱法测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇：0.4％冰醋酸溶液＝2-8:92-98为流动相；检测波长为284nm；柱温为30℃；理论板数按5-羟甲基糠醛峰计算不低于4000；精密量取供试品溶液与对照品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；计算5-羟甲基糠醛含量；

(4)炽灼残渣：取注射液1-2ml，置坩埚中，水浴上蒸干，按照中国药典2015年版四部通则0841进行测定，不得过1.0％(g/ml)；

(5)热原：取注射液20-40ml，用氯化钠注射液或5％～10％葡萄糖注射液稀释至100ml，按家兔体重1kg注射10ml的剂量，按照中国药典2015年版四部通则1142进行检查，应符合规定；

(6)异常毒性：取注射液，按照中国药典2015年版四部通则1141进行检查，按静脉注射法给药，应符合规定；

(7)过敏反应：取注射液，按照中国药典2015年版四部通则1147进行检查，应符合规定；

(8)溶血与凝聚：取注射液，按照中国药典2015年版四部通则1148进行检查，应符合规定；

(9)其他：应符合中国药典2015年版四部通则0102注射剂项下有关的各项规定；

指纹图谱：按照中国药典2015年版四部通则0512中高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以含0.005-0.01％体积量的三氟醋酸的乙腈溶液为流动相A，以含0.005-0.01％体积量的三氟醋酸的水溶液为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为210nm；柱温为20℃；流速为每分钟0.7ml；理论板数按紫丁香苷峰计算应不低于5000；

所述梯度洗脱条件为：

0-5min，流动相A 2％，流动相B 98％；

5-10min，流动相A 2-5％，流动相B 98-95％；

10-18min，流动相A 5-10％，流动相B 95-90％；

18-30min，流动相A 10-15％，流动相B 90-85％；

30-38min，流动相A 15-20％，流动相B 85-80％；

38-50min，流动相A 20-23％，流动相B 80-77％；

50-65min，流动相A 23-38％，流动相B 77-62％；

65-75min，流动相A 38-55％，流动相B 62-45％；

75-95min，流动相A 55-100％，流动相B 45-0％；

95-110min，流动相A 100％，流动相B 0％；

参照物溶液的制备：取紫丁香苷对照品、刺五加苷E对照品、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml各含50μg的混合溶液，摇匀，即得；

供试品溶液的制备：取注射液5-10ml，通过已预处理的固相萃取柱，先以水1ml洗脱，弃去水液，再用甲醇洗脱，收集洗脱液至2-4ml量瓶中，至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录110分钟的色谱图，即得；

含量测定：

(1)总皂苷：照中国药典2015年版四部通则0401中紫外-可见分光光度法测定：

对照品溶液的制备：取人参皂苷Re对照品，精密称定，加甲醇制成每1ml含1.6mg的溶液，摇匀，即得；

标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0μl、20μl、40μl、60μl、80μl、100μl，分别置10ml具塞试管中，置水浴上挥去溶剂，立即取出，放冷，加5％香草醛冰醋酸溶液0.2ml、高氯酸0.8ml，摇匀，置60℃水浴中加热15分钟，取出，用水冷却2分钟，加冰醋酸5ml，摇匀，照紫外—可见分光光度法，在544nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线；

供试品溶液的制备：取注射液20-40ml，置分液漏斗中，用三氯甲烷振摇提取2-4次，每次20-30ml，合并三氯甲烷液，用水洗涤2-3次，每次5-10ml，弃去三氯甲烷液，洗液与上述水液合并，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取2-4次，每次50-60ml，合并正丁醇液，加入无水硫酸钠3-5g，搅拌，放至澄清；将正丁醇液移至蒸发皿中，用少量正丁醇洗涤无水硫酸钠，洗液并入蒸发皿中，蒸干，用少量水溶解残渣，通过已处理好的内径1.5cm、长15cm的DA-201大孔吸附树脂柱上，待液面接近棉花层后，用水100-200ml洗脱，控制流速为0.3-0.5ml/min，弃去洗液，再用65-75％乙醇80-100ml洗脱，收集洗脱液于蒸发皿中，置水浴上蒸干，残渣加甲醇溶解，并转移至5-10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；

测定法：精密量取供试品溶液100μl，照标准曲线的制备项下的方法，自“置10ml具塞试管中”起依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中人参皂苷Re的浓度，计算，即得；

(2)紫丁香苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷：照中国药典2015年版四部通则0512中高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以水为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为260nm，理论板数按紫丁香苷峰计算应不低于2000；

所述梯度洗脱条件为：

0-10min，流动相A 25％，流动相B 75％；

10-13min，流动相A 25-350％，流动相B 75-650％；

13-30min，流动相A 35-60％，流动相B 60-40％；

30-31min，流动相A 100％，流动相B 0％；

31-35min，流动相A 100％，流动相B 0％；

对照品溶液的制备：取紫丁香苷对照品、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含紫丁香苷25μg、毛蕊异黄酮葡萄糖苷15μg的混合溶液，即得；

供试品溶液的制备：取注射液，滤过，取续滤液，即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

(3)斑蝥素：照中国药典2015年版四部通则0521中气相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以5％二苯基-95％二甲基聚硅氧烷为固定相的石英毛细管柱，柱长为30m，内径为0.32mm，膜厚度为0.25μm；柱温为程序升温：初始温度为100℃，以每分钟2℃的速率升温至140℃；进样口温度为250℃，检测器温度为300℃；载气为氮气，流速为2.5±0.5ml/分钟；分流进样，分流流量3ml/min，分流比为1:1；理论板数按斑蝥素峰计算应不低于15000，相对标准偏差应不大于3.5％；

对照品溶液的制备：取斑蝥素对照品，精密称定，加二氯甲烷制成每1ml含10μg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取注射液20-40ml，置分液漏斗中，加入1.8mol/L硫酸溶液2-4ml，混匀，精密加入二氯甲烷2-4ml，振摇提取，静置分层，取二氯甲烷液，滤过，取续滤液，即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2μl，注入气相色谱仪，测定，计算，即得。

更具体地，检测方法如下：

性状：

产品为浅棕色的澄明液体；

鉴别：

(1)取注射液50ml浓缩至10ml后，加乙醇50ml，搅匀，滤过，沉淀物用乙醇洗涤2次，将沉淀物用5ml水溶解，取1ml，置试管中，微热后加入5％的α-萘酚乙醇溶液5滴，摇匀，再沿管壁缓缓加入浓硫酸0.5ml，在两液面接界处显紫红色环；

(2)取注射液50ml，用二氯甲烷振摇提取2次，每次用量30ml，合并二氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液，二氯甲烷提取后的水液备用；另取异嗪皮啶对照品，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2015年版四部通则0502的薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各1μl～2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷∶甲醇∶甲酸＝40∶0.5∶0.5为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm波长的紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝色荧光斑点；

(3)取鉴别(2)项下二氯甲烷提取后的水液，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次用量50ml，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次，每次用量30ml，弃去氨试液，正丁醇液蒸干，残渣加水10ml使溶解，通过已处理好的内径1.5cm、长15cm的DA－201大孔吸附树脂柱，用水100ml洗脱，弃去洗脱液，再用20％的乙醇80ml洗脱，弃去洗脱液，再用40％的乙醇80ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取人参皂苷Rg₁对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rb₁对照品及黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml各含0.5mg的混合溶液，作为对照品溶液；照中国药典2015年版四部通则0502的薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl～10μl，分别点于同一硅胶H高效薄层板上进行带状点样，以三氯甲烷∶甲醇∶水∶甲酸＝15∶6∶1∶0.2为展开剂，于30℃以下展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，置365nm波长的紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

检查：

(1)溶液的颜色：取注射液1ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，按照中国药典2015年版四部通则0901第一法与黄色8号标准比色液比较，不得更深；

(2)pH值：照中国药典2015年版四部通则0631检查，pH为3.8-5.8；

(3)5-羟甲基糠醛：按照中国药典2015年版四部通则0512中高效液相色谱法测定：

取注射液，作为供试品溶液；另取5-羟甲基糠醛对照品，精密称定，加0.1％甲酸溶液稀释制成每lml中含5μg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2015年版四部通则0512中高效液相色谱法测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇：0.4％冰醋酸溶液＝4:96为流动相；检测波长为284nm；柱温为30℃；理论板数按5-羟甲基糠醛峰计算不低于4000；精密量取供试品溶液与对照品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；计算5-羟甲基糠醛含量；

(4)炽灼残渣：取注射液2ml，置坩埚中，水浴上蒸干，按照中国药典2015年版四部通则0841进行测定，不得过1.0％(g/ml)；

(5)热原：取注射液30ml，用氯化钠注射液或5％～10％葡萄糖注射液稀释至100ml，按家兔体重1kg注射10ml的剂量，按照中国药典2015年版四部通则1142进行检查，应符合规定；

(6)异常毒性：取注射液，按照中国药典2015年版四部通则1141进行检查，按静脉注射法给药，应符合规定；

(7)过敏反应：取注射液，按照中国药典2015年版四部通则1147进行检查，应符合规定；

(8)溶血与凝聚：取注射液，按照中国药典2015年版四部通则1148进行检查，应符合规定；

(9)其他：应符合中国药典2015年版四部通则0102注射剂项下有关的各项规定；

指纹图谱：按照中国药典2015年版四部通则0512中高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，Kromasil100-5-C18，柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm；以含0.005％体积量的三氟醋酸的乙腈溶液为流动相A，以含0.005％体积量的三氟醋酸的水溶液为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为210nm；柱温为20℃；流速为每分钟0.7ml；理论板数按紫丁香苷峰计算应不低于5000；

所述梯度洗脱条件为：

0-5min，流动相A 2％，流动相B 98％；

5-10min，流动相A 2-5％，流动相B 98-95％；

10-18min，流动相A 5-10％，流动相B 95-90％；

18-30min，流动相A 10-15％，流动相B 90-85％；

30-38min，流动相A 15-20％，流动相B 85-80％；

38-50min，流动相A 20-23％，流动相B 80-77％；

50-65min，流动相A 23-38％，流动相B 77-62％；

65-75min，流动相A 38-55％，流动相B 62-45％；

75-95min，流动相A 55-100％，流动相B 45-0％；

95-110min，流动相A 100％，流动相B 0％；

参照物溶液的制备：取紫丁香苷对照品、刺五加苷E对照品、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml各含50μg的混合溶液，摇匀，即得；

供试品溶液的制备：取注射液5ml，通过已预处理的固相萃取柱：

6cc(500mg)C18Cartridges，先以水1ml洗脱，弃去水液，再用甲醇洗脱，收集洗脱液至2ml量瓶中，至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录110分钟的色谱图，即得；

含量测定：

(1)总皂苷：照中国药典2015年版四部通则0401中紫外-可见分光光度法测定：

对照品溶液的制备：取人参皂苷Re对照品，精密称定，加甲醇制成每1ml含1.6mg的溶液，摇匀，即得；

标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0μl、20μl、40μl、60μl、80μl、100μl，分别置10ml具塞试管中，置水浴上挥去溶剂，立即取出，放冷，加5％香草醛冰醋酸溶液0.2ml、高氯酸0.8ml，摇匀，置60℃水浴中加热15分钟，取出，用水冷却2分钟，加冰醋酸5ml，摇匀，照紫外—可见分光光度法，在544nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线；

供试品溶液的制备：取注射液20ml，置分液漏斗中，用三氯甲烷振摇提取3次，每次20ml，合并三氯甲烷液，用水洗涤2次，每次5ml，弃去三氯甲烷液，洗液与上述水液合并，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次50ml，合并正丁醇液，加入无水硫酸钠3g，搅拌，放至澄清；将正丁醇液移至蒸发皿中，用少量正丁醇洗涤无水硫酸钠，洗液并入蒸发皿中，蒸干，用少量水溶解残渣，通过已处理好的内径1.5cm、长15cm的DA-201大孔吸附树脂柱上，待液面接近棉花层后，用水100ml洗脱，控制流速为0.4ml/min，弃去洗液，再用70％乙醇80ml洗脱，收集洗脱液于蒸发皿中，置水浴上蒸干，残渣加甲醇溶解，并转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；

测定法：精密量取供试品溶液100μl，照标准曲线的制备项下的方法，自“置10ml具塞试管中”起依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中人参皂苷Re的浓度，计算，即得；

(2)紫丁香苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷：照中国药典2015年版四部通则0512中高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以水为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为260nm，理论板数按紫丁香苷峰计算应不低于2000；

所述梯度洗脱条件为：

0-10min，流动相A 25％，流动相B 75％；

10-13min，流动相A 25-350％，流动相B 75-650％；

13-30min，流动相A 35-60％，流动相B 60-40％；

30-31min，流动相A 100％，流动相B 0％；

31-35min，流动相A 100％，流动相B 0％；

对照品溶液的制备：取紫丁香苷对照品、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含紫丁香苷25μg、毛蕊异黄酮葡萄糖苷15μg的混合溶液，即得；

供试品溶液的制备：取注射液，滤过，取续滤液，即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得：

(3)斑蝥素：照中国药典2015年版四部通则0521中气相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以5％二苯基-95％二甲基聚硅氧烷为固定相的石英毛细管柱，柱长为30m，内径为0.32mm，膜厚度为0.25μm；柱温为程序升温：初始温度为100℃，以每分钟2℃的速率升温至140℃；进样口温度为250℃，检测器温度为300℃；载气为氮气，流速为2.5±0.5ml/分钟；分流进样，分流流量3ml/min，分流比为1:1；理论板数按斑蝥素峰计算应不低于15000，相对标准偏差应不大于3.5％；

对照品溶液的制备：取斑蝥素对照品，精密称定，加二氯甲烷制成每1ml含10μg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取注射液20ml，置分液漏斗中，加入1.8mol/L硫酸溶液2ml，混匀，精密加入二氯甲烷2ml，振摇提取，静置分层，取二氯甲烷液，滤过，取续滤液，即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2μl，注入气相色谱仪，测定，计算，即得。

其中，前述检查项目中：5-羟甲基糠醛限度为：每ml注射液中不高于0.5mg；所述指纹图谱表征项目中：供试品指纹图谱分别呈现与参照物色谱峰保留时间相同的色谱峰，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，分析0min～85min图谱，供试品指纹图谱与对照指纹图谱经相似度计算，相似度不低于0.88；含量测定项目中：每ml注射液含总皂苷以人参皂苷Re(C₄₈H₈₂O₁₈)计，不少于0.2mg；每ml注射液含刺五加以紫丁香苷(C₁₇H₂₄O₉)计，不少于13.0μg，含黄芪以毛蕊异黄酮葡萄糖苷(C₂₂H₂₂O₁₀)计，不少于7.0μg；每ml制剂含斑蝥以斑蝥素(C₁₀H₁₂O₄)计，为0.8μg～3.0μg。

本发明的有益效果在于：

1、本发明在检测方法中增加了指纹图谱的表征过程，明确了10个共有峰，其中包括腺嘌呤、腺苷，刺五加中紫丁香苷、刺五加苷E、异嗪皮啶，黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷，指纹图谱表征较全面，客观真实地反映了产品内在活性成分的种类与数量，与对照图谱相比相似度高，能有效表征艾迪制剂的产品质量；并且，与文献《艾迪注射液高效液相色谱指纹图谱研究》(徐晓卫等，医药导报，2012年5月1日)相比，具有样品处理方法简单、共有峰多且对共有峰的成分进行确认、进行了峰归属研究等优点；与《艾迪注射液色谱指纹图谱的研究》(高阳，沈阳药科大学硕士论文，20040401)相比，进行了供试品制备的优化，使表征更加合理有效，并且进一步对共有峰的成分进行确认，研究全面、彻底，方法耐用性高。并且通过多批样品的指纹图谱考察，进一步表明了艾迪注射制剂工艺稳定、产品质量可靠。

2、本发明在检测方法中新增建立了刺五加的薄层鉴别方法，对展开系统、供试品制备方法、点样量等均进行了选择和优化，避免了提取溶剂和展开试剂三氯甲烷毒性大、不环保，对照药材制备与产品工艺不匹配，样品点样之后有拖尾、检视效果不佳，展开剂极性大等问题，该方法专属性强、稳定性高，与药典2015版中刺五加药材的鉴别方法、CN200910073000.3五加生化胶囊的质量控制方法相比，更适合艾迪制剂中刺五加药材的鉴别，方法准确有效。

3、本发明在检测方法中增加了对刺五加中紫丁香苷、黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量测定，并且对方法中流动相试剂的种类和比例、洗脱方式等进行优化；使得含量测定方法精密度高，重现性好，稳定性好，回收率高，适合制剂中刺五加类成分的含量测定，全面客观地反应了艾迪注射制剂中各活性成分含量。

4、本发明修订了人参、黄芪的薄层鉴别方法，修改了其中供试品溶液的制备方法，以及展开剂中溶剂种类及用量配比，与药典2015版中人参、黄芪药材的鉴别方法、CN201210109783.8、CN200710200659.1以及本申请人前期申请的艾迪制剂检测方法相比，更适合艾迪制剂中人参、黄芪药材的鉴别，方法准确有效。

5、本发明修改了斑蝥素含量测定中的气相色谱法为气相-毛细管色谱法，且优化了供试品的制备等过程和参数，比中国药典收载的斑蝥中斑蝥素含量测定的HPLC法、文献“注射用艾迪(冻干)药学研究初探”更能快速、准确地获取制剂中斑蝥素的含量。

6、本发明还进一步根据国家对注射制剂安全性要求逐步提高的原则，增加了5-羟甲基糠醛含量、炽灼残渣、溶液颜色、异常毒性、过敏、溶血与凝聚等检查项目，并且改变了5-羟甲基糠醛含量测定中流动相比例和检测方式，能准确有效地进行注射制剂的指标检查，保证产品安全、可靠。

综上，本发明的检测方法整体的测量结果准确可靠，提高了艾迪制剂的质量控制标准，可有效地控制产品质量，从而确保其临床疗效。

为能更好的阐述本发明的有益效果，本发明还列举了如下研究过程，旨在说明本发明的有益效果，但决不仅限于本发明的保护范围。

一、指纹图谱表征研究

申请人在艾迪注射制剂此前的研究中，主要侧重于鉴别、含量测定等项目的优化方面，对能够全面客观表征中药成分的指纹图谱有过基础性的研究，但还不够完善，目前现有公开的文献主要有两篇：文献A——徐晓卫等，艾迪注射液高效液相色谱指纹图谱研究，医药导报，2012年5月1日；文献B——高阳，艾迪注射液色谱指纹图谱的研究，沈阳药科大学硕士论文，20040401。

本发明研究过程中，发现文献A具有以下缺陷：1、样品处理方法复杂，艾迪注射液作为中药注射剂，指纹图谱体现的信息少且只有6个共有峰。2、没有对共有峰的成分进行确认，共有峰的来源不清。(这个是最主要的)3、没有进行峰归属研究，指纹图谱无法全面反映艾迪注射液的质量。

而文献B：1、没有对供试品溶液的制备方法进行研究，没有富集纯化方法的比较。2、只有共有峰的归宿研究，没有对共有峰的成分进行确认。研究不彻底。3、耐用性考察不全面。4、该文献中试验样品选择较少，研究的重复性、反复论证性还可以更加客观和丰富。

因此，本发明力图寻找更加适合艾迪注射制剂的指纹图谱表征方法，使得图谱反映信息丰富、共有峰多、且成分确认、共有峰的来源清晰。主要进行了供试品制备的研究、色谱条件研究、方法学考察研究、艾迪制剂样品检测研究等内容。

1.1供试品溶液的制备方法研究

艾迪注射液制剂由人参、黄芪、刺五加、斑蝥四味药组成，其方中人参、黄芪和刺五加主要含有皂苷类、黄酮类和多糖类等成分，斑蝥主含挥发性成分如斑蝥素等。经HPLC初步检测后，发现含有大量极性大或中等极性的的化合物，极性相近且色谱峰众多，因此样品需进行预处理，以得到分离度较好的更多的色谱峰信号。

1.1.1富集纯化方法的比较

方法一：取艾迪注射液样品5ml，用水饱和正丁醇振摇提取4次(10ml,10ml,10ml,10ml)，合并正丁醇层和水层，分别蒸干，残渣分别50％甲醇2ml使溶解，过滤，取续滤液，HPLC分析。(液-液萃取)

方法二：取艾迪注射液样品5ml，通过已处理好的SPE固相萃取小柱(Alltech C18500mg)，先用水10ml洗脱，收集水液，继用甲醇5ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣分别加50％甲醇2ml使溶解，摇匀，过滤，取续滤液，HPLC分析。(固相萃取)

方法三：取艾迪注射液样品5ml，通过已处理好的AB-8型大孔吸附树脂柱(内径1.2cm,高15cm)，分别使用水50ml洗脱、50ml乙醇洗脱，收集各部分洗脱液，浓缩至干后，以50％甲醇2ml溶解，滤过，取续滤液，HPLC分析。(大孔树脂吸附)

方法四：取艾迪注射液样品5ml，减压蒸干，残渣以2ml50％甲醇溶解，滤过，取续滤液，HPLC分析。(无纯化)

结果：首先对比液-液萃取法，由样品检测图谱可知大部分色谱峰成分在正丁醇层中可体现，但注射剂中色谱峰检出主要成份(来源于刺五加)有部分在水层中未被萃取出来，因此液-液萃取法不适用；其次，对比固相萃取法及大孔吸附树脂法所得样品图谱，固相萃取与大孔吸附树脂除杂效果基本一致，考虑大孔吸附树脂溶剂用量较大，操作相对繁琐，初步选择固相萃取法富集纯化供试品；最后，比较固相萃取两个样品，水洗脱除杂效果较好，但在20-30分钟有两个比较明显的色谱峰成分损失，因此后续考察固相萃取洗脱体积。

1.1.2固相萃取各部洗脱体积的考察

1.1.2.1水洗脱体积的确定

分别取艾迪注射液样品5ml、10ml，上已预处理好的固相萃取柱(GRACE-Pure SPEC18-max 500mg/6ml)，收集上样尾液，依次用1ml水洗脱5次，分别收集洗脱液滤过后直接液相检测，记录40min图谱数据。结果表明，大部分极性较大影响色谱图谱检视效果的色谱峰成分均于上样尾液及第1-2个1ml水洗脱液(1-2个柱体积)洗脱出来，20-30min色谱峰仍有少量损失，但剩余部分仍可检出，因此确定固相萃取除杂方法为上样后，以1-2ml水洗脱并弃去洗脱液。

1.1.2.2甲醇洗脱方式确定

固相萃取试验(前述方法2)中发现甲醇洗脱2ml左右即可将色带洗脱完全，因此在试验中考察直接用甲醇洗脱除杂后的样品置2ml量瓶至刻度，对比前文5ml甲醇洗脱蒸干复溶的样品。结果表明，供试品制备时甲醇洗脱这一步骤选择直接加甲醇洗脱置2ml量瓶中至刻度即可，该方法简化步骤，操作简单。

1.1.3固相萃取柱考察

取艾迪注射液5ml，分别使用Agilent、Waters、GracePure三种品牌的同规格的C18固相萃取柱同法制备供试品，经液相检测，三种品牌的固相萃取柱制备的供试品图谱基本无差异，证明本方法C18固相萃取柱选择范围广，考虑方法的可重复性，建议固定固相萃取柱品牌为Waters

6cc。

1.1.4结果

通过上述实验研究，最终确定供试品溶液的制备方法为：精密量取本品5-10ml，通过已预处理的固相萃取柱(规格500mg，6ml)，用水1-2ml洗脱，弃去水液，再用甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液至2-4ml量瓶中并至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

1.2色谱条件选择

1.2.1检测波长选择：对供试品溶液进行了全波长检测，结果表明，大多数成分在200-210nm处有较好的紫外吸收，考虑到203nm与210nm得到的色谱图无显著差异，且210nm检测基线相对比较平稳，因此选择210nm作为检测波长。

1.2.2流动相考察

试验过程中分别考察了乙腈-水、乙腈-三氟醋酸溶液和乙腈-磷酸溶液三种流动相系统，结果：流动相中不加酸，部分色谱峰无法检出，乙腈-三氟醋酸系统色谱峰分效果优于乙腈-磷酸系统，但乙腈-三氟醋酸系统色谱图在70min后基线会向下漂移，在乙腈及水相中均加入相同量的三氟醋酸(0.005-0.01％)后基线平稳，因此确定流动相为乙腈(含0.005-0.01％三氟醋酸(V/V))-水(含0.005-0.01％三氟醋酸(V/V))系统，优选流动相为乙腈(含0.005％三氟醋酸(V/V))-水(含0.005％三氟醋酸(V/V))系统。

1.2.3色谱柱考察

分别考察了五种品牌共八种型号的C18色谱柱：①Kromasil、②AgientZorbaxExtend、③AgientEclipseplus、④AgelaDurashell、⑤Waters SYMMETRY、⑥PhenomenexGemini-NX、⑦KShiSeido CAPCELL PAK、⑧AcchromTature；结果显示：柱⑦和柱⑧为亲水色谱柱，检测图谱与其他色谱柱相比有部分色谱峰成分未能明显检出，差异大，不可使用，其他柱②～柱⑥检测图谱与柱①比较，色谱峰检出及分离度仍略有差异，其中柱③紫丁香苷后的来源于刺五加的绿原酸类成分检出不明显，但标准中标注的10个共有峰在这六根色谱柱中很容易找到，因此，可以确定该方法色谱柱耐用性良好，但亲水性的色谱柱不适用；另为保障相似度计算结果稳定，建议固定色谱柱品牌为Kromasil 100-5-C18 5μm 4.6×250mm。

1.2.4柱温流速考察

分别考察了不同的柱温柱流速对供试品溶液的分离效果，结果表明：样品中大部分色谱峰成分极性相近，且极性加大，因此不同的柱温与柱流速对部分色谱峰的分离度有直接影响，综合考虑流速为0.7ml/min，柱温为20℃的图谱中各色谱峰分离度最佳，因此本方法需严格控制柱温为20℃，柱流速为0.7mg/min。

1.2.5色谱时间考察

供试品溶液进样后，记录200分钟时间(95min后均为纯有机相流动相)的色谱图，考察是否出峰完全。结果表明，在此色谱条件下，110分钟以后基线平稳，无色谱峰检出，初步确定色谱采集时间为110min。

1.2.6流动相空白及溶剂空白考察

照供试品溶液制备方法下估算样品溶剂约为50％左右的甲醇溶液，因此，取同批次甲醇制备50％甲醇溶液，照拟定的指纹图谱方法检测，同时采集空白流动相图谱。结果表明，在溶剂空白图谱中于4min左右有一小峰检出，与样品图谱对比不影响样品测定；图谱中85min后的色谱峰低波长下流动相空白所致，因此后文中数据分析时仅对0-85min的色谱峰进行积分并分析。

1.2.7辅料空白影响的考察

取按注射剂工艺剂量制备混合(甘油+吐温80)辅料样品，照注射液方法制备供试品，并测定图谱。结果：辅料空白样品在102.7min左右有一色谱峰成分检出；将注射液检测图谱、空白考察图谱叠加后分析，可知注射液110min图谱中，85min后的杂峰不仅有流动相空白峰，还有辅料经纯乙腈洗脱检出的色谱峰成分，因此，为避免辅料中成分累积污染色谱柱，指纹图谱色谱条件仍按前文方法采集110min图谱，但数据处理时仅对0-85min的色谱峰成分进行分析。

1.2.8结果

通过上述实验方法研究，【指纹图谱】色谱条件与系统适用性试验最终确定为：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(优选Kromasil 100-5-C18 5μm4.6×250mm，即柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以乙腈(含0.005-0.01％三氟醋酸(V/V))为流动相A，以水(含0.005-0.01％三氟醋酸(V/V))为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱；检测波长为210nm；柱温为20℃；流速为每分钟0.7ml；理论板数按紫丁香苷峰计算应不低于5000。

表1指纹图谱检测梯度洗脱表

1.3方法学研究

按照指纹图谱相关技术要求，对指纹图谱检测方法进行精密度、稳定性和重复性考察，并采用指纹图谱相似度评价软件计算相关结果，其结果均符合要求。

其中，精密度试验是按“供试品溶液制备方法”制备1份供试品溶液，连续进样6次进行检测，结果表明，相似度均在0.991～0.996之间，仪器精密度良好。

稳定性试验是按“供试品溶液制备方法”制备1份供试品溶液，分别在约0，4，8，16，26，34小时检测，结果表明，供试品在34小时检测，相似度在0.997～0.999之间，因此表明供试品在34小时内检测，样品稳定性良好。

重复性试验是按“供试品溶液制备方法”平行制备6份供试品溶液，分别在前述色谱条件下进行检测，结果表明，相似度在0.995～0.999之间，重复性良好。

另外，按“供试品溶液制备方法”平行制备3份供试品溶液，分别在Agilent1260型高效液相色谱仪、ThermoUltiMate 3000型高效液相色谱仪、SHIMADZU Prominence LC-20A型高效液相色谱仪上相同色谱条件下检测，对三种仪器下指纹图谱进行相似度评价，以Agilent图谱为参照，可知Thermo仪器图谱与Agilent相似度高达0.993，色谱图基本一致，SHIMADZU图谱与Agilent图谱相似度为0.976，亦大于0.9，色谱峰检出基本一致，保留时间有差异。三种仪器见相似度均大于0.9，该方法不同仪器耐用性较好。

1.4样品检测研究

对20批样品进行了指纹图谱检测，并采用指纹图谱相似度评价软件计算相关结果，生成对照指纹图谱，结果表明，相似度在0.928～0.995之间，各批次重复性良好，注射制剂工艺较稳定。

共有峰的标注：色谱图选择积分时间为0～85min，积分参数为：斜率灵敏度为30，峰宽为0.01，最小峰面积为1，最小峰高为1；在此方法下，所得各批次注射液指纹图谱中共有峰面积与总峰面积占比≧90％。选择注射剂指纹图谱中峰面积占总峰面积≧2％且峰型好、分离度高的色谱峰进行标注，共标注10个共有峰，其中，峰1为腺嘌呤，峰2为腺苷，峰4为紫丁香苷(刺五加)，峰5为刺五加苷E(刺五加)，峰6为毛蕊异黄酮葡萄糖苷(黄芪)，峰7为异嗪皮啶(刺五加)。

指纹图谱相似度标准的制定所有批次艾迪注射液指纹图谱与共有模式的相似度在0.929～0.996之间，平均值达到0.988，综合分析，暂定指纹图谱相似度值不低于0.88。

1.5对照品峰指认研究

在已确定的色谱条件下，分别进样原儿茶酸(0.105mg/ml)、紫丁香苷(0.102mg/ml)、绿原酸(0.0238mg/ml)、刺五加苷E(0.1034mg/ml)、毛蕊异黄酮葡萄糖苷(0.0522mg/ml)、异嗪皮啶(0.102mg/ml)、芒柄花苷(0.0725mg/ml)、人参皂苷Rg1(0.106mg/ml)、人参皂苷Re(0.102mg/ml)、人参皂苷Rb1(0.106mg/ml)、人参皂苷Rd(0.107mg/ml)、斑蝥素(0.126mg/ml)、黄芪甲苷(0.381mg/ml)、胞苷(0.235mg/ml)、腺嘌呤(0.100mg/ml)、尿苷(0.102mg/ml)、鸟苷(0.104mg/ml)、腺苷(0.268mg/ml)对照品溶液和供试品溶液，对色谱峰进行指认。见色谱图1。

结果表明，在此色谱条件下，注射液指纹图谱在来源于人参的皂苷类成分、来源于黄芪的甲苷、来源于斑蝥的斑蝥素成分相应的出峰位置均未检出明显的色谱峰。经指认后，确定图中峰1为腺嘌呤(人参，黄芪)，峰2为腺苷(人参，黄芪，刺五加)，峰4为紫丁香苷(刺五加)，峰5为刺五加苷E(刺五加)，峰6为毛蕊异黄酮葡萄糖苷(黄芪)，峰7为异嗪皮啶(刺五加)。

1.6峰归属研究

按照现有技术中艾迪注射制剂的制备工艺，分别制备班蝥、人参、刺五加和黄芪药材单煎液，然后按照“供试品溶液的制备方法”分别制成各药材供试品溶液，在已确定的色谱条件下，分别进样各药材供试品溶液和成品供试品溶液，确定对照指纹图谱中各峰的归属。

结果：选择与对照图谱相似度为0.996的批号为20160612批注射液的指纹图谱，积分时间0～85min，积分参数为：斜率灵敏度为30，峰宽为0.01，最小峰面积为1,最小峰高为1，选择15批注射剂指纹图谱中峰面积占总峰面积≧0.5％的色谱峰进行编号标注，共标注40个色谱峰，其中专属于刺五加药材的色谱峰有25个，占62.5％，专属于黄芪药材的色谱峰有6个，占15％，其余色谱峰均非专属色谱峰，其中峰5～7及峰9分析人参药材的贡献较大，但非人参药材特有的皂苷类成分，处方中斑蝥的用量最低，在此样品量下，未检出专属于斑蝥的色谱峰。

表2指纹图谱色谱峰匹配结果

1.7半成品指纹图谱研究

另外，本发明还针对注射制剂的本成品，选择8-10批样品按照成品供试品制备方法准备样品，同法进行指纹图谱检测，接过显示半成品各批次之间相似度在0.993-0.997之间，重复性良好，表明注射制剂工艺稳定；同时，将生成的艾迪注射液成品指纹图谱共有模式与注射液半成品指纹图共有模式对比，结果表明半成品与成品件相似度为0.992，色谱图几乎无差异。

1.8结果

综合以上指纹图谱分析的研究过程，选择1.4的供试品制备方法，2.8的色谱条件，注射制剂的指纹图谱相似度在0.928～0.995之间，方法重复性、精密度、稳定性均良好，仪器耐用性好，并且共有峰多、对照品峰指认客观较完全，峰归属研究显示专属于刺五加、黄芪的色谱峰多，含人参、刺五加、黄芪的色谱峰均得到指认，本发明方法的表征效果良好、较全面，客观真实地反映了产品内在活性成分的种类与数量，与对照图谱相比相似度高，能有效表征艾迪制剂的产品质量。

二、鉴别方法研究

2.1刺五加薄层色谱鉴别研究

现有技术中，中国药典2015版一部P206刺五加(以下简称文献1)中，公开了对刺五加的薄层鉴别方法为：以刺五加对照药材、异嗪皮啶对照品为对照，以三氯甲烷：甲醇＝19:1为展开剂；供试品制备方法为：75％乙醇加热回流提取1小时，过滤后用三氯甲烷振摇提取2次，蒸干后甲醇溶解；点样量为10μl。

CN200910073000.3五加生化胶囊的质量控制方法(以下简称文献2)中，公开了对刺五加的薄层鉴别方法为：以紫丁香苷、异嗪皮啶对照品为对照，以氯仿-甲醇-水(8∶1∶0.1)为展开剂；供试品制备方法为：甲醇超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解；点样量为10μl。

本发明过程中分别对展开系统、供试品制备、对照的选择、点样量等进行研究：

2.1.1展开系统的选择

本研究过程中，分别考虑文献1、2及其他试剂作为艾迪注射制剂中刺五加药材鉴别展开系统的可能性，分别准备艾迪注射液样品、缺刺五加的阴性样品、刺五加药材制成的阳性药品以及异嗪皮啶对照样品，供试样品的制备参考文献1用三氯甲烷提取后甲醇溶解，检测波长365nm。

考察结果如下表3：

表3艾迪注射制剂中刺五加药材鉴别展开系统的选择

以上结果表明，采用序号4的展开剂，分离度好，斑点显色清晰，阴性对照无干扰，进一步对溶剂的比例进行研究，结果显示：二氯甲烷：甲醇：甲酸在30-50∶0.3-0.6∶0.3-0.6范围内均能获得理想的检视效果，其中40∶0.5∶0.05效果最佳。在上述范围内随机选择比例进行3次重复，显示方法重现性好。

2.1.2供试品制备方法的研究

本发明前期考察时使用三氯甲烷，所制得供试品检出效果较好；但三氯甲烷为管控的易制毒试剂，供试品制备过程中所使用的量较大，为试验安全，同法分别使用三氯甲烷、二氯甲烷为提取溶剂制备供试品，考察两种溶剂制备的供试品差异，结果两种溶剂提取得到的供试品薄层鉴别无差异，鉴于三氯甲烷的毒性，确定供试品制备方法为：

取注射液50-100ml，用二氯甲烷振摇提取1-3次，每次用量30-60ml，合并二氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇2-4ml使溶解，作为供试品溶液。

优选为：取注射液50ml，用二氯甲烷振摇提取2次，每次30ml，合并二氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。

2.1.3供试品点样量及点样方式考察

取注射液按照前述方法制成供试品，分别吸取供试品0.5、1、1.5、2、2.5、3μl、异嗪皮啶对照品1μl，进行条带式、圆点式点样的研究，分别点于同一硅胶G薄层板(青岛海洋)上，以二氯甲烷-甲醇-甲酸(40：0.5：0.05)为展开剂，展开，取出，晾干，于366nm下检视，结果显示：供试品条带式、圆点式点样，点样量在1-2μl均可，优选1μl。

2.1.4研究结果

综合以上研究结果，采用二氯甲烷：甲醇：甲酸＝30-50∶0.3-0.6∶0.3-0.6为展开系统；供试品制备方法为：取注射液50-100ml，用二氯甲烷振摇提取1-3次，每次用量30-60ml，合并二氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇2-4ml使溶解；点样量1-2μl。

研究过程中进一步考察了该鉴别方法的耐用性，专属性考察显示刺五加阴性无干扰，专属性良好；薄层板筛选考察选择了青岛海洋化工厂分厂、烟台江友硅胶开发有限公司两个厂家的包含G、GF₂₅₄、H共四种薄层色谱硅胶预制板，结果表明四种薄层板中比移值有差异，但不影响检视效果；展开温度考察选择了置于冰箱、40℃烘箱、实验室自然温度条件下展开，结果表明温度对鉴别方法无影响，7-40℃均可；湿度考察选择了18％～75％范围，均斑点清晰、分离度良好。同时在研究过程中考虑参考药典方法，除异嗪皮啶外，还选择刺五加对照药材作为对照，并进行了供试品的制备方法(乙醇回流、水回流)对比、检视效果对比等研究，结果显示仅以异嗪皮啶对照品对照即可满足鉴别要求，增加对照药材为对照意义不大，且可以节约操作程序，方法客观、便捷、有效、合理。

因此，本发明刺五加的鉴别方法分离度好，斑点显色清晰，阴性对照无干扰，无拖尾，溶剂无毒，重现性好。

2.2人参、黄芪薄层色谱鉴别研究

现有技术中，艾迪注射液质量标准、《中国药典》2015年版一部人参、黄芪质量标准，专利CN201210109783.8补气养阴中药复方制剂的质量检测方法、CN200710200659.1复方斑蝥口服制剂的质量控制方法均报道了对人参、黄芪的鉴别。

本发明过程中分别参考上述文献或专利，对展开系统、供试品制备、对照的选择、点样量等进行研究：

2.2.1展开剂系统的研究

分别准备艾迪注射液样品，人参皂苷Re、Rg₁、Rd、Rf、Rb₁及黄芪甲苷对照品，参考前述文献进行供试品和对照品的准备。考察结果如下表4：

表4艾迪注射制剂中人参、黄芪药材鉴别展开系统的选择

以上结果表明，采用序号4的展开剂，分离度好，斑点显色清晰，阴性对照无干扰，进一步对溶剂的比例进行研究，结果显示：三氯甲烷∶甲醇∶水∶甲酸＝10-20∶4-8∶0.5-2∶0.2-0.5范围内均能获得理想的检视效果，其中三氯甲烷∶甲醇∶水∶甲酸＝15∶6∶1∶0.2效果最佳。在上述范围内随机选择比例进行3次重复，显示方法重现性好。

2.2.2供试品制备方法的研究

方法一：取注射液50ml，置分液漏斗中，用三氯甲烷30ml振摇提取，弃去三氯甲烷层，水层用水饱和正丁醇提取2次，每次50ml，合并两次正丁醇液，用氨试液洗涤两次，每次30ml，弃去氨试液(下层)，正丁醇液于水浴上蒸干，加水10ml溶解上DA-201树脂柱，先用水100ml洗，弃去，分别20％、40％、80％、95％乙醇各80ml逐级洗脱并收集，蒸干，用甲醇2ml复溶，滤过，即得。

方法二：方法同前，取消树脂柱洗脱步骤。

方法三：取注射液50ml，置分液漏斗中，用三氯甲烷30ml振摇提取，弃去三氯甲烷层，水层用水饱和正丁醇提取2次，每次50ml，合并两次正丁醇液，用氨试液洗涤两次，每次30ml，弃去氨试液(下层)，正丁醇液于水浴上蒸干，加水10ml溶解上DA-201树脂柱，先用水100ml洗，弃去，再用20％乙醇80ml洗，弃去，收集40％乙醇80ml洗液，蒸干，用甲醇2ml复溶，滤过，即得。

方法四：同方法三，区别为三氯甲烷替换为二氯甲烷。

照薄层色谱法试验，吸取上述溶液各5～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水-甲酸(15：6：1：0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热，置紫外光灯(365nm)下检视。

结果显示：方法二中正丁醇萃取后未使用树脂纯化的供试品，粘度大，未能有效展开；方法一中DA201树脂纯化后，20％醇部位指标成分检出低且色谱信息模糊，可弃去，95％醇部位已无指标成分信息，可弃去，通过对照品信息对照，主要的薄层信息集中于40％乙醇部位，初步选择40％乙醇洗脱部位为供试品继续摸索方法；另薄层色谱图中虽然黄芪甲苷与Rf重叠，但两种成分色谱信息不同，黄芪甲苷为橘黄色荧光，Rf为蓝色荧光，由颜色可知注射液中可检出黄芪甲苷，而Rf为非指标成分，忽略。进一步考察的方法三和方法四显示采用二氯甲烷与三氯甲烷提取除杂后的样品无太大区别，选择二氯甲烷萃取除杂即可，并且选择二氯甲烷，可以两种鉴别使用同一份注射液原液，优化了检测过程中样品的准备步骤，使鉴别方法便捷有效。

进一步的，在考察过程中得知，人参阳性与对照药材无区别，鉴别可考虑增加人参对照药材作为对照；黄芪阳性点样量略低，因此检出信息略少于对照药材，而黄芪对照药材经树脂柱纯化所得样品薄层信息佳，故黄芪对照药材样品制备选择与注射液相同的树脂纯化方法；毛蕊异黄酮葡萄糖苷点样失败，经其他试验认证可知黄芪对照药材图谱中近前沿部分的清晰的蓝色荧光为毛蕊异黄酮葡萄糖苷成分，偏黄或黄绿色荧光的成分为芒柄花苷成分，芒柄花苷在注射液供试品中亦检出，因此亦可以考虑增加黄芪对照药材为对照。

2.2.3点样量及条带宽度考察

分别吸取供试品1-10μl点于同一高效硅胶H板，以三氯甲烷-甲醇-水-甲酸(15：6：1：0.2)为展开剂，检视结果显示随着点样量的增大，人参皂苷类成分检出愈加清晰，因此确定供试品点样量在5-10μl均可；

分别吸取供试品5μl点于同一高效硅胶H板，点样宽度为0、2、3、4、5、6、7、8、9、10mm，以三氯甲烷-甲醇-水-甲酸(15：6：1：0.2)为展开剂，检视结果显示由于该鉴别色谱图中色谱信息量大，适宜条带状点样，带宽控制在6-10mm检视效果均较好。

2.2.4检视考察

本申请人之前研究资料中，检视方式为喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热数分钟，放置1小时以上后再置紫外光灯(365nm)下检视。分别对比了显色后即检视及放置1小时候检视，发现显色后即检视色谱图中各色谱荧光颜色更鲜明，因此无需放置，加热显色后即检视即可。

2.2.5研究结果

综合以上研究结果，采用三氯甲烷∶甲醇∶水∶甲酸＝10-20∶4-8∶0.5-2∶0.2-0.5为展开系统；供试品制备方法为：取刺五加鉴别项下二氯甲烷提取后的水液，用水饱和的正丁醇提取，用氨试液洗涤，正丁醇液蒸干，残渣加水溶解，DA－201树脂柱(水洗，再用20％乙醇洗脱，用40％乙醇洗脱)，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解；点样量5-10μl，显色后即检视。

研究过程中进一步考察了该鉴别方法的耐用性，专属性考察显示在与对照品色谱相应位置上，分别显相同颜色的荧光斑点，Rg1检出位置人参阴性略有干扰，黄芪甲苷检出位置黄芪阴性中略有干扰，但干扰信息颜色与黄芪甲苷完全不同，可明确判断黄芪甲苷的检出，专属性良好；薄层板筛选考察选择了青岛海洋硅胶G、GF₂₅₄、Merck硅胶G、H，安徽良辰产高效硅胶G、H，烟台GF₂₅₄等薄层板，结果表明Merck硅胶G、H薄层板，安徽良辰高效硅胶H板均效果最佳，综合优选高效硅胶H板；展开温度考察选择了置于冰箱、40℃烘箱、实验室自然温度条件下展开，结果表明展开温度在40℃左右时，整体比移值升高，Rg1鉴别效果不佳，其他影响不大，高温对结果有影响，建议鉴别时控制环境温度低于30℃；湿度考察选择了75％湿度，结果显示高湿对鉴别无影响。同时在研究过程中考虑参考现有方法，选择增加人参和黄芪的对照药材作为对照，但鉴于对照药材供试品制备方法繁琐，且供试品中主要的检出斑点使用人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1及黄芪甲苷对照品作为对照即可达到鉴别效果，增加人参对照药材和黄芪对照药材为对照意义不大还额外增加操作步骤。

因此，本发明人参、黄芪的鉴别方法分离度好，斑点显色清晰，阴性对照无干扰或少干扰，并且直接采用刺五加鉴别后的水样，使得鉴别过程中使用同一份注射液原液，优化了检测过程中样品的准备步骤，使鉴别方法便捷有效、重现性好。

2.3斑蝥鉴别考察

参考《中国药典》2015年版一部斑蝥质量标准中的薄层鉴别方法，对艾迪注射液中斑蝥的鉴别进行了研究，研究过程中以斑蝥素为指标，初步摸索得到适宜的展开系统(二氯甲烷)、供试品制备方法，但供试品取样量大、点样量大，勉强能检出斑蝥素，考虑本质量标准含量测定部分制定了斑蝥素含量测定标准，未建立艾迪注射液斑蝥薄层鉴别方法。

三、含量测定研究

原部颁标准中含量测定仅有紫外分光光度法测人参总皂苷，气相-填充柱色谱法测斑蝥素，为提高质量标准，经研究：建立了艾迪注射制剂紫丁香苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷的HPLC含量测定方法，修订了斑蝥素的含量测定方法为气相-毛细管柱色谱法，新增及修订的方法耐用性好，可用于艾迪注射制剂的质量控制。研究过程概述如下：

3.1紫丁香苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷的HPLC含量测定研究

现有技术中，《中国药典》2015年版一部刺五加、黄芪质量标准，文献C--注射用艾迪(冻干)药学研究初探(李清，沈阳药科大学博士论文，20061201)，文献D--RP-HPLC-ELSD同时测定艾迪注射液中5种苷类成分的含量(陈重，中国中药杂志，20110315)均报道了对刺五加、黄芪的含量测定方法、检测指标等内容。本发明在过程中分别参考上述文献或专利，对流动相组成、流动相梯度、供试品制备方法、指标选择等进行研究。

3.1.1色谱条件研究

1)流动相条件的确定：分别准备艾迪注射液样品，紫丁香苷、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品，参考前述文献和艾迪注射液的部颁标准进行供试品和对照品的准备。采用HPLC方法测定含量，考察结果如下表5：

表5色谱条件的选择

以上结果表明，采用方法5，分离度好，阴性无干扰，专属性较好。

2)检测波长：《中国药典》2015年版一部中紫丁香苷检测波长为265nm，毛蕊异黄酮葡萄糖苷检测波长为260nm，二者检测波长相近，因此最终选择二种成分同时在260nm下测定。

3)色谱条件耐用性考察：对安捷伦等四种品牌的6根不同型号色谱柱进行考察，结果显示除Agilent ZORBAX Extend色谱柱外(该色谱柱柱效低，峰型差)，其他色谱柱对二个成分均能达到很好的分离效果，且阴性无干扰，色谱条件对色谱柱选择性很低，适用范围广；

考察了柱温25℃、30℃、35℃，结果表明柱温30℃±5℃对紫丁香苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷两个成分分离度几乎无影响；考察了0.8mL/min、0.9mL/min、1.0mL/min、1.1mL/min、1.2mL/min的柱流速，结果：流速0.8～1.2ml/min，各色谱峰分离基本无影响。

使用同一色谱柱，分别在Agilent1100、ACCHROM S6000、Thermo DIONEXUltiMate3000系列高效液相色谱仪测定三批艾迪注射液中紫丁香苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量，结果表明，三种仪器所得两种成分含量RSD％在1.82-5.81％之间，符合含量测定要求。

3.1.2供试品制备方法确定

艾迪注射制剂为以水为基质的液体制剂，使用Agilent1100高效液相色谱仪摸索条件，供试品直接进样检测，紫丁香苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷色谱峰峰面积均在500左右，因此样品无需复杂处理，可微孔滤膜滤过后直接进样用于含量测定。

3.1.3方法学研究

以紫丁香苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品配置标准品溶液，绘制标准曲线，然后取艾迪注射液样品，进行仪器精密度等的测定，结果显示：艾迪样品连续进样6次，峰面积RSD分别为紫丁香苷1.06％、毛蕊异黄酮葡萄糖苷0.19％，仪器精密度良好。艾迪样品制备6份供试液，分别进样考察，含量平均值及峰面积RSD分别为紫丁香苷(27.47μg/ml，0.76％)、毛蕊异黄酮葡萄糖苷(18.44μg/ml，0.21％)，方法重复性较好。艾迪样品分别于0、2.5、5、10、15、20、25小时进样检测，峰面积RSD分别为紫丁香苷1.45％、毛蕊异黄酮葡萄糖苷0.67％，供试品在25小时内检测，稳定性良好，能够满足测定要求。采用加样回收试验，紫丁香苷平均回收率为103.32％，RSD％为2.47％，毛蕊异黄酮葡萄糖苷平均回收率为97.96％，RSD％为2.55％，样品加样回收率良好。

3.1.4样品含量测定及含量限度研究

采用前述检测条件和供试品的制备方法，对27批艾迪供试品分别进样10-20μl，记录色谱图及峰面积，计算含量。结果显示：27批艾迪注射液中紫丁香苷的含量平均值为26.30μg/ml、毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量平均值为15.73μg/ml。

(1)按照《中国药典》收载原料刺五加中紫丁香苷含量0.05％折算制剂转移率理论值为75μg/ml，根据27批艾迪注射液紫丁香苷实际测定数据范围为14.95～34.45μg/ml，平均值为26.301μg/ml，平均转移率为35.07％。故按平均值的50％制订含量限度。故规定每ml制剂刺五加以紫丁香苷(C₁₇H₂₄O₉)计，不得少于13.0μg。按现在上市艾迪注射液10ml/支计，不得少于130.0μg/支。

(2)按照《中国药典》收载原料黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量0.02％折算制剂转移率理论值为20μg/ml，根据27批艾迪注射液毛蕊异黄酮葡萄糖苷实际测定数据范围为7.370～21.967μg/ml，平均值为15.734μg/ml，平均转移率为78.67％。鉴于毛蕊异黄酮葡萄糖苷实际含测数据相差较大，故按平均值的45％制订含量限度。故规定每ml制剂含黄芪以毛蕊异黄酮葡萄糖苷(C₂₂H₂₂O₁₀)计，不得少于7.00μg。按现在上市艾迪注射液10ml/支计，不得少于70.0μg/支。

3.2斑蝥素含量测定中检测方法的修订研究

艾迪注射液的部颁标准中，斑蝥素含量测定方法为气相填充柱色谱法，方法老旧；中国药典收载斑蝥中斑蝥素的含量测定方法为HPLC法研究初期曾考虑使用HPLC法测定艾迪注射液中斑蝥素含量，但斑蝥素无C＝C键和共轭结构,无强的生色团，HPLC-UV法检测，高浓度，低检出，且阴性干扰大，调整流动相，未能使注射液样品中其他成分与斑蝥素成分有效分离；而斑蝥素成分本身具有挥发性，因此本研究采用毛细管气相色谱法测定斑蝥素含量，并完成方法学研究。

3.2.1色谱条件与系统适应性试验

以5％二苯基-95％二甲基聚硅氧烷为固定相的石英毛细管柱(柱长为30m，内径为0.32mm，膜厚度为0.25μm)；柱温为程序升温：初始温度为100℃，以每分钟2℃的速率升温至140℃。进样口温度为250℃，检测器温度为300℃；载气为氮气，流速为3.0ml/分钟；分流进样，分流比为1:1(分流流量3ml/min)。理论板数按斑蝥素峰计算应不低于15000。在此色谱条件下，供试品色谱中斑蝥素色谱峰与相邻色谱峰有较好分离，阴性样品无干扰，专属性较好。

3.2.2色谱条款耐用性考察研究

色谱柱考察：对安捷伦、菲罗门公司的2种品牌同规格型号、同品牌同型号不同批号的色谱柱进行考察，结果显示在正文所述色谱条件下，均能使斑蝥素成分与相邻色谱峰成分很好的分离，阴性无干扰，色谱条件对色谱柱选择性很低，适用范围广；

载气流速考察：使用安捷伦HP-5色谱柱在相同的升温程序下，考察了不同的载气流速2.0ml/min～3.0ml/min，结果在该色谱条件下，载气为氮气，流速在2.5±0.5ml/min范围内，艾迪注射液样品中斑蝥素成分与相邻色谱峰成分分离度均符合含量测定要求。优选载气流速为3.0ml/min。

3.2.3供试品制备方法确定

方法一：样品50ml，加入1.8mol/L硫酸溶液5ml，用氯仿振摇提取3次(50、30、30ml)，合并氯仿液，用旋转蒸发仪浓缩定容至5ml，即得。

方法二：样品10ml，加入1.8mol/L硫酸溶液1ml，再精密加入1ml氯仿，振摇提取，静置分层，必要时离心，取下层液即得。

结果表明：方法二所述操作简单且节能，考虑萃取所使用的试剂氯仿为三类易制毒品，为管控试剂，因此在萃取方法考察的同时亦萃取试剂以二氯甲烷替代的可能性进行研究。提取溶剂选择三氯甲烷、二氯甲烷，结果显示二氯甲烷(斑蝥素峰面积195.5)提取率高于三氯甲烷(斑蝥素峰面积185.0)，提取次数选择二氯甲烷提取0-4次，结果显示提取2～3次几乎无差异(斑蝥素峰面积197.6-202.6)，提取4次，提取率反而变低(斑蝥素峰面积187.2)，提取一次再经浓缩提取率最低(斑蝥素峰面积175.7)，而直接使用2ml溶剂提取，无浓缩步骤，提取液直接检测所得提取率最佳(斑蝥素峰面积211.3)。

最终选择供试品制备方法为：取注射液20-40ml，置分液漏斗中，加入1.8mol/L硫酸溶液2-4ml，混匀，精密加入二氯甲烷2-4ml，振摇提取，静置分层，取二氯甲烷液，滤过，取续滤液，即得。优选为：样品20ml，加入1.8mol/L硫酸溶液2ml，混合均匀，精密加入二氯甲烷2ml，振摇提取，静置分层，取二氯甲烷层，0.22μm微孔滤膜滤过，即得。

3.2.4方法学研究

以对照品对照品配置标准品溶液，绘制标准曲线，然后取艾迪注射液样品，进行仪器精密度等的测定，结果显示：艾迪对照样品连续进样6次，峰面积RSD为0.78％，仪器精密度良好。艾迪样品制备6份供试液，分别进样考察，含量平均值及峰面积RSD分别为1.895μg/ml，3.61％，方法重复性较好。艾迪样品分别于0、2、4、8、12、16小时进样检测，峰面积RSD为2.30％，供试品在16小时内检测，稳定性良好。采用加样回收试验，斑蝥素平均回收率为106.59％，RSD％为2.70％，方法准确度满足含量测定要求。

3.2.5样品含量测定及含量限度研究

采用前述检测条件和供试品的制备方法，对26批艾迪供试品分别进样2-4μl，记录色谱图及峰面积，计算含量。结果显示：26批艾迪注射液中斑蝥素的含量平均值为0.0021mg/ml。原部颁标准中，斑蝥素的含量要求为0.008-0.030mg/支，前述26批样品均符合要求，故含量限度不做改变。

四、注射制剂检查指标研究

本次研究过程中，鉴于对注射制剂的严格要求和规定，因此在原部颁标准及注射剂项下有关的各项规定(《中国药典》2015年版四部通则0102)的基础上增加了溶液的颜色、炽灼残渣、5-羟甲基糠醛、异常毒性、溶血和凝聚、过敏反应的检查项，修改了原部颁标准中比色法重金属检查法和pH值范围。

4.1溶液的颜色：由于艾迪注射制剂中含有人参、黄芪、刺五加等中药材，故药品颜色较深，为有效的控制注射剂颜色，将艾迪注射液定量稀释至标准黄色比色液合适的比色范围。经研究，将艾迪注射液溶液颜色检查的标准定为：精密吸取注射液1ml，至10ml的量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，与标准8号黄色比较不得更深。经检查，28批样品均符合要求。

4.2炽热残渣：照2015年版《中国药典》四部通则0841炽灼残渣检查法检测。结果：十批艾迪注射液炽灼残渣在0.01～0.06％(g/ml)，均符合药典要求。

4.3重金属与有害元素检查

原部颁标准中艾迪注射液的重金属检查为比色法，2015版《中国药典》四部通则0102注射剂项下收载的“重金属及有害元素残留量”检验项目，采用的原子吸收法更为灵敏、测定元素更多、数据更直观，故将艾迪注射液检查项中重金属比色法修改为采用原子吸收法测定重金属及有害元素残留量，已达到新版药典的要求。对20批艾迪注射液进行检测，样品中铅、镉、砷、汞、铜均远远低于检出限，符合药典要求。

4.4 5-羟甲基糠醛(5-HMF)

艾迪注射制剂原料中均含有多糖、寡糖类成分，而5-羟甲基糠醛(5-HMF)是葡萄糖等单糖化合物在高温或弱酸条件下产生的一种醛类化合物，文献报道认为5-HMF对人体有副作用，对人体横纹肌和内脏有一定损害。近年来，中成药对5-HMF的测定与控制越来越重视，而注射液原标准中未对5-HMF进行限度控制，为建立更加完善的艾迪注射液质量控制方法，保障药品安全，通过研究建立了艾迪注射液中5-羟甲基糠醛的限度检查方法。

主要研究点在于：参考文献《HPLC法测定参芪扶正注射液中5-羟甲基糠醛的含量极其来源的初步探讨》(刘潇潇等.药物分析杂志，2012,32(4))和《参麦注射液中5-羟甲基糠醛含量的高效液相色谱测定》(谭俊杰等.时珍国医国药，2010,21(7))关于其他品种中药注射剂5-羟甲基含量测定方法，使用RP-HPLC-UV法摸索艾迪注射液中该成分测定的色谱条件，分别考察过乙腈-水、乙腈-酸水、甲醇-水、甲醇-酸水等流动相组成，结果，本品极性较大，使用乙腈-水系统，尚未找到合适的方法，对比了甲醇-水及甲醇-不同酸水系统，结果注射液中5-HMF成分色谱峰在甲醇-0.4％冰醋酸(4:96)条件下峰型及分离度均最佳，最终确定流动相组成为甲醇-0.4％冰醋酸(4:96)。

进一步进行色谱柱及柱温柱流速、供试品制备方法以及仪器精密度、重复性、准确度等方法学的考察研究，对摸索出的检查条件(见实施例1)使用27批艾迪注射液样品(10ml/支)进行验证，结果表明该方法灵敏、有效，5-羟甲基糠醛含量范围23.93-83.26μg/支，再借鉴《中国药典》2015年版二部品种葡萄糖注射液和葡萄糖氯化钠注射液中5-羟甲基糠醛限度的规定，结合艾迪注射液的用法用量，暂定本品每支含5-羟甲基糠醛不得过500μg。由此可见，本方法检查结果远远低于药典规定(同等换算)的要求。

4.5异常毒性：按照《中国药典》2015年版四部通则1141检验，取艾迪注射液3批，按照1ml标准进行检验，全部小白鼠注射后在48小时内均未有死亡，符合规定。

4.6溶血与凝聚：按照《中国药典》2015年版四部通则1148检验，取艾迪注射液3批按8支试管进行检验，在3小时内未出现溶血和红细胞凝聚现象，符合规定。

4.7过敏试验：按照《中国药典》2015年版四部通则1147检验，取艾迪注射液3批，分别在首次注射后14天和21天，由静脉注射艾迪注射液1ml/只，注射后30分钟内豚鼠未见全身过敏反应，符合规定。

附图说明

图1为艾迪注射制剂对照指纹图谱；

10个共有峰：峰1为腺嘌呤，峰2为腺苷，峰4为紫丁香苷(刺五加)，峰5为刺五加苷E(刺五加)，峰6为毛蕊异黄酮葡萄糖苷(黄芪)，峰7为异嗪皮啶(刺五加)

具体实施方式：

实施例1：

抗肿瘤注射制剂(艾迪注射液)的检测方法

处方：斑蝥1.5g、人参50g、黄芪100g、刺五加150g，制成1000ml；

检测方法如下：

性状：

产品为浅棕色的澄明液体；

鉴别：

(1)取注射液50ml浓缩至10ml后，加乙醇50ml，搅匀，滤过，沉淀物用乙醇洗涤2次，将沉淀物用5ml水溶解，取1ml，置试管中，微热后加入5％的α-萘酚乙醇溶液5滴，摇匀，再沿管壁缓缓加入浓硫酸0.5ml，在两液面接界处显紫红色环；

(2)取注射液50ml，用二氯甲烷振摇提取2次，每次用量30ml，合并二氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液，二氯甲烷提取后的水液备用；另取异嗪皮啶对照品，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2015年版四部通则0502的薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各1μl～2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷∶甲醇∶甲酸＝40∶0.5∶0.5为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm波长的紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝色荧光斑点；

(3)取鉴别(2)项下二氯甲烷提取后的水液，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次用量50ml，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次，每次用量30ml，弃去氨试液，正丁醇液蒸干，残渣加水10ml使溶解，通过已处理好的内径1.5cm、长15cm的DA－201大孔吸附树脂柱，用水100ml洗脱，弃去洗脱液，再用20％的乙醇80ml洗脱，弃去洗脱液，再用40％的乙醇80ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取人参皂苷Rg₁对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rb₁对照品及黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml各含0.5mg的混合溶液，作为对照品溶液；照中国药典2015年版四部通则0502的薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl～10μl，分别点于同一硅胶H高效薄层板上进行带状点样，以三氯甲烷∶甲醇∶水∶甲酸＝15∶6∶1∶0.2为展开剂，于30℃以下展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，置365nm波长的紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

检查：

(1)溶液的颜色：取注射液1ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，按照中国药典2015年版四部通则0901第一法与黄色8号标准比色液比较，不得更深；

(2)pH值：照中国药典2015年版四部通则0631检查，pH为3.8-5.8；

(3)5-羟甲基糠醛：按照中国药典2015年版四部通则0512中高效液相色谱法测定：

取注射液，作为供试品溶液；另取5-羟甲基糠醛对照品，精密称定，加0.1％甲酸溶液稀释制成每lml中含5μg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2015年版四部通则0512中高效液相色谱法测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇：0.4％冰醋酸溶液＝4:96为流动相；检测波长为284nm；柱温为30℃；理论板数按5-羟甲基糠醛峰计算不低于4000；精密量取供试品溶液与对照品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；计算5-羟甲基糠醛含量；

(4)炽灼残渣：取注射液2ml，置坩埚中，水浴上蒸干，按照中国药典2015年版四部通则0841进行测定，不得过1.0％(g/ml)；

(5)热原：取注射液30ml，用氯化钠注射液或5％～10％葡萄糖注射液稀释至100ml，按家兔体重1kg注射10ml的剂量，按照中国药典2015年版四部通则1142进行检查，应符合规定；

(6)异常毒性：取注射液，按照中国药典2015年版四部通则1141进行检查，按静脉注射法给药，应符合规定；

(7)过敏反应：取注射液，按照中国药典2015年版四部通则1147进行检查，应符合规定；

(8)溶血与凝聚：取注射液，按照中国药典2015年版四部通则1148进行检查，应符合规定；

(9)其他：应符合中国药典2015年版四部通则0102注射剂项下有关的各项规定；

指纹图谱：按照中国药典2015年版四部通则0512中高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，Kromasil100-5-C18，柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm；以含0.005％体积量的三氟醋酸的乙腈溶液为流动相A，以含0.005％体积量的三氟醋酸的水溶液为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为210nm；柱温为20℃；流速为每分钟0.7ml；理论板数按紫丁香苷峰计算应不低于5000；

所述梯度洗脱条件为：

0-5min，流动相A 2％，流动相B 98％；

5-10min，流动相A 2-5％，流动相B 98-95％；

10-18min，流动相A 5-10％，流动相B 95-90％；

18-30min，流动相A 10-15％，流动相B 90-85％；

30-38min，流动相A 15-20％，流动相B 85-80％；

38-50min，流动相A 20-23％，流动相B 80-77％；

50-65min，流动相A 23-38％，流动相B 77-62％；

65-75min，流动相A 38-55％，流动相B 62-45％；

75-95min，流动相A 55-100％，流动相B 45-0％；

95-110min，流动相A 100％，流动相B 0％；

参照物溶液的制备：取紫丁香苷对照品、刺五加苷E对照品、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml各含50μg的混合溶液，摇匀，即得；

供试品溶液的制备：取注射液5ml，通过已预处理的固相萃取柱：

6cc(500mg)C18Cartridges，先以水1ml洗脱，弃去水液，再用甲醇洗脱，收集洗脱液至2ml量瓶中，至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录110分钟的色谱图，即得；

含量测定：

(1)总皂苷：照中国药典2015年版四部通则0401中紫外-可见分光光度法测定：

对照品溶液的制备：取人参皂苷Re对照品，精密称定，加甲醇制成每1ml含1.6mg的溶液，摇匀，即得；

标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0μl、20μl、40μl、60μl、80μl、100μl，分别置10ml具塞试管中，置水浴上挥去溶剂，立即取出，放冷，加5％香草醛冰醋酸溶液0.2ml、高氯酸0.8ml，摇匀，置60℃水浴中加热15分钟，取出，用水冷却2分钟，加冰醋酸5ml，摇匀，照紫外—可见分光光度法，在544nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线；

供试品溶液的制备：取注射液20ml，置分液漏斗中，用三氯甲烷振摇提取3次，每次20ml，合并三氯甲烷液，用水洗涤2次，每次5ml，弃去三氯甲烷液，洗液与上述水液合并，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次50ml，合并正丁醇液，加入无水硫酸钠3g，搅拌，放至澄清；将正丁醇液移至蒸发皿中，用少量正丁醇洗涤无水硫酸钠，洗液并入蒸发皿中，蒸干，用少量水溶解残渣，通过已处理好的内径1.5cm、长15cm的DA-201大孔吸附树脂柱上，待液面接近棉花层后，用水100ml洗脱，控制流速为0.4ml/min，弃去洗液，再用70％乙醇80ml洗脱，收集洗脱液于蒸发皿中，置水浴上蒸干，残渣加甲醇溶解，并转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；

测定法：精密量取供试品溶液100μl，照标准曲线的制备项下的方法，自“置10ml具塞试管中”起依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中人参皂苷Re的浓度，计算，即得；

(2)紫丁香苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷：照中国药典2015年版四部通则0512中高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以水为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为260nm，理论板数按紫丁香苷峰计算应不低于2000；

所述梯度洗脱条件为：

0-10min，流动相A 25％，流动相B 75％；

10-13min，流动相A 25-350％，流动相B 75-650％；

13-30min，流动相A 35-60％，流动相B 60-40％；

30-31min，流动相A 100％，流动相B 0％；

31-35min，流动相A 100％，流动相B 0％；

对照品溶液的制备：取紫丁香苷对照品、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含紫丁香苷25μg、毛蕊异黄酮葡萄糖苷15μg的混合溶液，即得；

供试品溶液的制备：取注射液，滤过，取续滤液，即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得：

(3)斑蝥素：照中国药典2015年版四部通则0521中气相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以5％二苯基-95％二甲基聚硅氧烷为固定相的石英毛细管柱，柱长为30m，内径为0.32mm，膜厚度为0.25μm；柱温为程序升温：初始温度为100℃，以每分钟2℃的速率升温至140℃；进样口温度为250℃，检测器温度为300℃；载气为氮气，流速为2.5±0.5ml/分钟；分流进样，分流流量3ml/min，分流比为1:1；理论板数按斑蝥素峰计算应不低于15000，相对标准偏差应不大于3.5％；

对照品溶液的制备：取斑蝥素对照品，精密称定，加二氯甲烷制成每1ml含10μg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取注射液20ml，置分液漏斗中，加入1.8mol/L硫酸溶液2ml，混匀，精密加入二氯甲烷2ml，振摇提取，静置分层，取二氯甲烷液，滤过，取续滤液，即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2μl，注入气相色谱仪，测定，计算，即得。

按前述方法测定艾迪注射液10批，性状、鉴别、检查均符合指标要求，每支含5-羟甲基糠醛均值为53.41μg；指纹图谱显示供试品与对照的指纹图谱相似度大于0.88，10个共有峰(见图1)：峰1为腺嘌呤，峰2为腺苷，峰4为紫丁香苷(刺五加)，峰5为刺五加苷E(刺五加)，峰6为毛蕊异黄酮葡萄糖苷(黄芪)，峰7为异嗪皮啶(刺五加)；含量测定显示含总皂苷以人参皂苷Re(C₄₈H₈₂O₁₈)计，范围在0.35-0.42mg/ml，含刺五加以紫丁香苷(C₁₇H₂₄O₉)计，范围在15.2-21.4μg/ml，含黄芪以毛蕊异黄酮葡萄糖苷(C₂₂H₂₂O₁₀)计，范围在14.2-18.6μg/ml，含斑蝥以斑蝥素(C₁₀H₁₂O₄)计，范围在2.01-2.35μg/ml。

实施例2：

抗肿瘤注射制剂的检测方法，其特征在于：检测方法如下：

性状：注射液为浅黄色至浅棕色的澄明液体；

鉴别：

(1)取注射液50ml浓缩至10ml后，加乙醇50ml，搅匀，滤过，沉淀物用乙醇洗涤1次，将沉淀物用5ml水溶解，取1ml置试管中，微热后加入5％的α-萘酚乙醇溶液5滴，摇匀，再沿管壁缓缓加入浓硫酸0.5ml，在两液面接界处显紫红色环；

(2)取注射液100ml，用二氯甲烷振摇提取3次，每次用量60ml，合并二氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇4ml使溶解，作为供试品溶液，二氯甲烷提取后的水液备用；另取异嗪皮啶对照品，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2015年版四部通则0502的薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各1μl～2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷∶甲醇∶甲酸＝30∶0.3∶0.3为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm波长的紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝色荧光斑点；

(3)取鉴别(2)项下二氯甲烷提取后的水液，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次用量100ml，合并正丁醇液，用氨试液洗涤3次，每次用量60ml，弃去氨试液，正丁醇液蒸干，残渣加水20ml使溶解，通过已处理好的内径1.5cm，长15cm的DA-201大孔吸附树脂柱，用水200ml洗脱，弃去洗脱液，再用30％的乙醇160ml洗脱，弃去洗脱液，再用50％的乙醇160ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇4ml使溶解，作为供试品溶液；另取人参皂苷Rg₁对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rb₁对照品及黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml各含0.5mg的混合溶液，作为对照品溶液；照中国药典2015年版四部通则0502的薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl～10μl，分别点于同一硅胶H高效薄层板上进行带状点样，以三氯甲烷∶甲醇∶水∶甲酸＝10∶4∶0.5∶0.2为展开剂，于30℃以下展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，置365nm波长的紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

检查：

(1)溶液的颜色：取注射液1ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，按照中国药典2015年版四部通则0901第一法与黄色8号标准比色液比较，不得更深；

(2)pH值：3.8-5.8；

(3)5-羟甲基糠醛：按照中国药典2015年版四部通则0512中高效液相色谱法测定：

取注射液1ml，作为供试品溶液；另取5-羟甲基糠醛对照品，精密称定，加0.1％甲酸溶液稀释制成每lml中含5μg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2015年版四部通则0512中高效液相色谱法测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇：0.4％冰醋酸溶液＝2:98为流动相；检测波长为284nm；柱温为30℃；理论板数按5-羟甲基糠醛峰计算不低于4000；精密量取供试品溶液与对照品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；计算5-羟甲基糠醛含量；

(4)炽灼残渣：取注射液1ml，置坩埚中，水浴上蒸干，按照中国药典2015年版四部通则0841进行测定，不得过1.0％(g/ml)；

(5)热原：取注射液20-40ml，用氯化钠注射液或5％～10％葡萄糖注射液稀释至100ml，按家兔体重1kg注射10ml的剂量，按照中国药典2015年版四部通则1142进行检查，应符合规定；

(6)异常毒性：取注射液，按照中国药典2015年版四部通则1141进行检查，按静脉注射法给药，应符合规定；

(7)过敏反应：取注射液，按照中国药典2015年版四部通则1147进行检查，应符合规定；

(8)溶血与凝聚：取注射液，按照中国药典2015年版四部通则1148进行检查，应符合规定；

(9)其他：应符合中国药典2015年版四部通则0102注射剂项下有关的各项规定；

指纹图谱：按照中国药典2015年版四部通则0512中高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以含0.005％体积量的三氟醋酸的乙腈溶液为流动相A，以含0.005％体积量的三氟醋酸的水溶液为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为210nm；柱温为20℃；流速为每分钟0.7ml；理论板数按紫丁香苷峰计算应不低于5000；

所述梯度洗脱条件为：

0-5min，流动相A 2％，流动相B 98％；

5-10min，流动相A 2-5％，流动相B 98-95％；

10-18min，流动相A 5-10％，流动相B 95-90％；

18-30min，流动相A 10-15％，流动相B 90-85％；

30-38min，流动相A 15-20％，流动相B 85-80％；

38-50min，流动相A 20-23％，流动相B 80-77％；

50-65min，流动相A 23-38％，流动相B 77-62％；

65-75min，流动相A 38-55％，流动相B 62-45％；

75-95min，流动相A 55-100％，流动相B 45-0％；

95-110min，流动相A 100％，流动相B 0％；

参照物溶液的制备：取紫丁香苷对照品、刺五加苷E对照品、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml各含50μg的混合溶液，摇匀，即得；

供试品溶液的制备：取注射液5ml，通过已预处理的固相萃取柱，先以水1ml洗脱，弃去水液，再用甲醇洗脱，收集洗脱液至2ml量瓶中，至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录110分钟的色谱图，即得；

含量测定：

(1)总皂苷：照中国药典2015年版四部通则0401中紫外-可见分光光度法测定：

对照品溶液的制备：取人参皂苷Re对照品，精密称定，加甲醇制成每1ml含1.6mg的溶液，摇匀，即得；

标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0μl、20μl、40μl、60μl、80μl、100μl，分别置10ml具塞试管中，置水浴上挥去溶剂，立即取出，放冷，加5％香草醛冰醋酸溶液0.2ml、高氯酸0.8ml，摇匀，置60℃水浴中加热15分钟，取出，用水冷却2分钟，加冰醋酸5ml，摇匀，照紫外-可见分光光度法，在544nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线；

供试品溶液的制备：取注射液20ml，置分液漏斗中，用三氯甲烷振摇提取2次，每次20ml，合并三氯甲烷液，用水洗涤2次，每次5ml，弃去三氯甲烷液，洗液与上述水液合并，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次50ml，合并正丁醇液，加入无水硫酸钠3g，搅拌，放至澄清；将正丁醇液移至蒸发皿中，用少量正丁醇洗涤无水硫酸钠，洗液并入蒸发皿中，蒸干，用少量水溶解残渣，通过已处理好的内径1.5cm、长15cm的DA-201大孔吸附树脂柱上，待液面接近棉花层后，用水100ml洗脱，控制流速为0.3ml/min，弃去洗液，再用65％乙醇80ml洗脱，收集洗脱液于蒸发皿中，置水浴上蒸干，残渣加甲醇溶解，并转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；

测定法：精密量取供试品溶液100μl，照标准曲线的制备项下的方法，自“置10ml具塞试管中”起依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中人参皂苷Re的浓度，计算，即得；

(2)紫丁香苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷：照中国药典2015年版四部通则0512中高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以水为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为260nm，理论板数按紫丁香苷峰计算应不低于2000；

所述梯度洗脱条件为：

0-10min，流动相A 25％，流动相B 75％；

10-13min，流动相A 25-350％，流动相B 75-650％；

13-30min，流动相A 35-60％，流动相B 60-40％；

30-31min，流动相A 100％，流动相B 0％；

31-35min，流动相A 100％，流动相B 0％；

对照品溶液的制备：取紫丁香苷对照品、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含紫丁香苷25μg、毛蕊异黄酮葡萄糖苷15μg的混合溶液，即得；

供试品溶液的制备：取注射液，滤过，取续滤液，即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

(3)斑蝥素：照中国药典2015年版四部通则0521中气相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以5％二苯基-95％二甲基聚硅氧烷为固定相的石英毛细管柱，柱长为30m，内径为0.32mm，膜厚度为0.25μm；柱温为程序升温：初始温度为100℃，以每分钟2℃的速率升温至140℃；进样口温度为250℃，检测器温度为300℃；载气为氮气，流速为2.5±0.5ml/分钟；分流进样，分流流量3ml/min，分流比为1:1；理论板数按斑蝥素峰计算应不低于15000，相对标准偏差应不大于3.5％；

对照品溶液的制备：取斑蝥素对照品，精密称定，加二氯甲烷制成每1ml含10μg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取注射液20ml，置分液漏斗中，加入1.8mol/L硫酸溶液2ml，混匀，精密加入二氯甲烷2ml，振摇提取，静置分层，取二氯甲烷液，滤过，取续滤液，即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2μl，注入气相色谱仪，测定，计算，即得。

实施例3：

抗肿瘤注射制剂的检测方法，其特征在于：检测方法如下：

性状：

注射液为浅黄色至浅棕色的澄明液体；

鉴别：

(1)取注射液100ml浓缩至20ml后，加乙醇100ml，搅匀，滤过，沉淀物用乙醇洗涤3次，将沉淀物用10ml水溶解，取2ml置试管中，微热后加入5％的α-萘酚乙醇溶液10滴，摇匀，再沿管壁缓缓加入浓硫酸1ml，在两液面接界处显紫红色环；

(2)取注射液50ml，用二氯甲烷振摇提取1次，用量30ml，二氯甲烷液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液，二氯甲烷提取后的水液备用；另取异嗪皮啶对照品，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2015年版四部通则0502的薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各2μl～4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷∶甲醇∶甲酸＝50∶0.6∶0.6为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm波长的紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝色荧光斑点；

(3)取鉴别(2)项下二氯甲烷提取后的水液，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取1次，用量50ml，正丁醇液用氨试液洗涤2次，每次用量30ml，弃去氨试液，正丁醇液蒸干，残渣加水10ml使溶解，通过已处理好的内径1.5cm，长15cm的DA-201大孔吸附树脂柱，用水100ml洗脱，弃去洗脱液，再用15％的乙醇80ml洗脱，弃去洗脱液，再用35％的乙醇80ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取人参皂苷Rg₁对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rb₁对照品及黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml各含0.5mg的混合溶液，作为对照品溶液；照中国药典2015年版四部通则0502的薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10μl～20μl，分别点于同一硅胶H高效薄层板上进行带状点样，以三氯甲烷∶甲醇∶水∶甲酸＝20∶8∶2∶0.5为展开剂，于30℃以下展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，置365nm波长的紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

检查：

(1)溶液的颜色：取注射液2ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，按照中国药典2015年版四部通则0901第一法与黄色8号标准比色液比较，不得更深；

(2)pH值：3.8-5.8；

(3)5-羟甲基糠醛：按照中国药典2015年版四部通则0512中高效液相色谱法测定：

取注射液2ml，作为供试品溶液；另取5-羟甲基糠醛对照品，精密称定，加0.1％甲酸溶液稀释制成每lml中含5μg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2015年版四部通则0512中高效液相色谱法测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇：0.4％冰醋酸溶液＝2-8:92-98为流动相；检测波长为284nm；柱温为30℃；理论板数按5-羟甲基糠醛峰计算不低于4000；精密量取供试品溶液与对照品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；计算5-羟甲基糠醛含量；

(4)炽灼残渣：取注射液2ml，置坩埚中，水浴上蒸干，按照中国药典2015年版四部通则0841进行测定，不得过1.0％(g/ml)；

(5)热原：取注射液20-40ml，用氯化钠注射液或5％～10％葡萄糖注射液稀释至100ml，按家兔体重1kg注射10ml的剂量，按照中国药典2015年版四部通则1142进行检查，应符合规定；

(6)异常毒性：取注射液，按照中国药典2015年版四部通则1141进行检查，按静脉注射法给药，应符合规定；

(7)过敏反应：取注射液，按照中国药典2015年版四部通则1147进行检查，应符合规定；

(8)溶血与凝聚：取注射液，按照中国药典2015年版四部通则1148进行检查，应符合规定；

(9)其他：应符合中国药典2015年版四部通则0102注射剂项下有关的各项规定；

指纹图谱：按照中国药典2015年版四部通则0512中高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以含0.01％体积量的三氟醋酸的乙腈溶液为流动相A，以含0.01％体积量的三氟醋酸的水溶液为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为210nm；柱温为20℃；流速为每分钟0.7ml；理论板数按紫丁香苷峰计算应不低于5000；

所述梯度洗脱条件为：

0-5min，流动相A 2％，流动相B 98％；

5-10min，流动相A 2-5％，流动相B 98-95％；

10-18min，流动相A 5-10％，流动相B 95-90％；

18-30min，流动相A 10-15％，流动相B 90-85％；

30-38min，流动相A 15-20％，流动相B 85-80％；

38-50min，流动相A 20-23％，流动相B 80-77％；

50-65min，流动相A 23-38％，流动相B 77-62％；

65-75min，流动相A 38-55％，流动相B 62-45％；

75-95min，流动相A 55-100％，流动相B 45-0％；

95-110min，流动相A 100％，流动相B 0％；

参照物溶液的制备：取紫丁香苷对照品、刺五加苷E对照品、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml各含50μg的混合溶液，摇匀，即得；

供试品溶液的制备：取注射液10ml，通过已预处理的固相萃取柱，先以水1ml洗脱，弃去水液，再用甲醇洗脱，收集洗脱液至4ml量瓶中，至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录110分钟的色谱图，即得；

含量测定：

(1)总皂苷：照中国药典2015年版四部通则0401中紫外-可见分光光度法测定：

对照品溶液的制备：取人参皂苷Re对照品，精密称定，加甲醇制成每1ml含1.6mg的溶液，摇匀，即得；

标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0μl、20μl、40μl、60μl、80μl、100μl，分别置10ml具塞试管中，置水浴上挥去溶剂，立即取出，放冷，加5％香草醛冰醋酸溶液0.2ml、高氯酸0.8ml，摇匀，置60℃水浴中加热15分钟，取出，用水冷却2分钟，加冰醋酸5ml，摇匀，照紫外-可见分光光度法，在544nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线；

供试品溶液的制备：取注射液40ml，置分液漏斗中，用三氯甲烷振摇提取4次，每次30ml，合并三氯甲烷液，用水洗涤3次，每次10ml，弃去三氯甲烷液，洗液与上述水液合并，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次60ml，合并正丁醇液，加入无水硫酸钠5g，搅拌，放至澄清；将正丁醇液移至蒸发皿中，用少量正丁醇洗涤无水硫酸钠，洗液并入蒸发皿中，蒸干，用少量水溶解残渣，通过已处理好的内径1.5cm、长15cm的DA-201大孔吸附树脂柱上，待液面接近棉花层后，用水200ml洗脱，控制流速为0.5ml/min，弃去洗液，再用75％乙醇100ml洗脱，收集洗脱液于蒸发皿中，置水浴上蒸干，残渣加甲醇溶解，并转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；

测定法：精密量取供试品溶液100μl，照标准曲线的制备项下的方法，自“置10ml具塞试管中”起依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中人参皂苷Re的浓度，计算，即得；

(2)紫丁香苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷：照中国药典2015年版四部通则0512中高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以水为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为260nm，理论板数按紫丁香苷峰计算应不低于2000；

所述梯度洗脱条件为：

0-10min，流动相A 25％，流动相B 75％；

10-13min，流动相A 25-350％，流动相B 75-650％；

13-30min，流动相A 35-60％，流动相B 60-40％；

30-31min，流动相A 100％，流动相B 0％；

31-35min，流动相A 100％，流动相B 0％；

对照品溶液的制备：取紫丁香苷对照品、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含紫丁香苷25μg、毛蕊异黄酮葡萄糖苷15μg的混合溶液，即得；

供试品溶液的制备：取注射液，滤过，取续滤液，即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

(3)斑蝥素：照中国药典2015年版四部通则0521中气相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以5％二苯基-95％二甲基聚硅氧烷为固定相的石英毛细管柱，柱长为30m，内径为0.32mm，膜厚度为0.25μm；柱温为程序升温：初始温度为100℃，以每分钟2℃的速率升温至140℃；进样口温度为250℃，检测器温度为300℃；载气为氮气，流速为2.5±0.5ml/分钟；分流进样，分流流量3ml/min，分流比为1:1；理论板数按斑蝥素峰计算应不低于15000，相对标准偏差应不大于3.5％；

对照品溶液的制备：取斑蝥素对照品，精密称定，加二氯甲烷制成每1ml含10μg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取注射液40ml，置分液漏斗中，加入1.8mol/L硫酸溶液4ml，混匀，精密加入二氯甲烷4ml，振摇提取，静置分层，取二氯甲烷液，滤过，取续滤液，即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2μl，注入气相色谱仪，测定，计算，即得。

实施例4：

抗肿瘤注射制剂的检测方法，其特征在于：检测方法如下：

性状：注射液为浅棕色的澄明液体；

鉴别：

(1)取注射液75ml浓缩至15ml后，加乙醇75ml，搅匀，滤过，沉淀物用乙醇洗涤2次，将沉淀物用5ml水溶解，取1ml置试管中，微热后加入5％的α-萘酚乙醇溶液5滴，摇匀，再沿管壁缓缓加入浓硫酸0.5ml，在两液面接界处显紫红色环；

(2)取注射液75ml，用二氯甲烷振摇提取2次，每次用量45ml，合并二氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇3ml使溶解，作为供试品溶液，二氯甲烷提取后的水液备用；另取异嗪皮啶对照品，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2015年版四部通则0502的薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各3μl～4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷∶甲醇∶甲酸＝40∶0.4∶0.4为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm波长的紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝色荧光斑点；

(3)取鉴别(2)项下二氯甲烷提取后的水液，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次用量75ml，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次，每次用量45ml，弃去氨试液，正丁醇液蒸干，残渣加水15ml使溶解，通过已处理好的内径1.5cm，长15cm的DA-201大孔吸附树脂柱，用水150ml洗脱，弃去洗脱液，再用25％的乙醇120ml洗脱，弃去洗脱液，再用45％的乙醇120ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇3ml使溶解，作为供试品溶液；另取人参皂苷Rg₁对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rb₁对照品及黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml各含0.5mg的混合溶液，作为对照品溶液；照中国药典2015年版四部通则0502的薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl～10μl，分别点于同一硅胶H高效薄层板上进行带状点样，以三氯甲烷∶甲醇∶水∶甲酸＝15∶6∶1∶0.4为展开剂，于30℃以下展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，置365nm波长的紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

检查：同实施例1；

指纹图谱：同实施例1；

含量测定：

(1)总皂苷：照中国药典2015年版四部通则0401中紫外-可见分光光度法测定：

对照品溶液的制备：取人参皂苷Re对照品，精密称定，加甲醇制成每1ml含1.6mg的溶液，摇匀，即得；

标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0μl、20μl、40μl、60μl、80μl、100μl，分别置10ml具塞试管中，置水浴上挥去溶剂，立即取出，放冷，加5％香草醛冰醋酸溶液0.2ml、高氯酸0.8ml，摇匀，置60℃水浴中加热15分钟，取出，用水冷却2分钟，加冰醋酸5ml，摇匀，照紫外-可见分光光度法，在544nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线；

供试品溶液的制备：取注射液30ml，置分液漏斗中，用三氯甲烷振摇提取3次，每次25ml，合并三氯甲烷液，用水洗涤3次，每次5ml，弃去三氯甲烷液，洗液与上述水液合并，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次55ml，合并正丁醇液，加入无水硫酸钠4g，搅拌，放至澄清；将正丁醇液移至蒸发皿中，用少量正丁醇洗涤无水硫酸钠，洗液并入蒸发皿中，蒸干，用少量水溶解残渣，通过已处理好的内径1.5cm、长15cm的DA-201大孔吸附树脂柱上，待液面接近棉花层后，用水150ml洗脱，控制流速为0.4ml/min，弃去洗液，再用70％乙醇90ml洗脱，收集洗脱液于蒸发皿中，置水浴上蒸干，残渣加甲醇溶解，并转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；

测定法：精密量取供试品溶液100μl，照标准曲线的制备项下的方法，自“置10ml具塞试管中”起依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中人参皂苷Re的浓度，计算，即得；

(2)紫丁香苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷：同实施例1；

(3)斑蝥素：照中国药典2015年版四部通则0521中气相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以5％二苯基-95％二甲基聚硅氧烷为固定相的石英毛细管柱，柱长为30m，内径为0.32mm，膜厚度为0.25μm；柱温为程序升温：初始温度为100℃，以每分钟2℃的速率升温至140℃；进样口温度为250℃，检测器温度为300℃；载气为氮气，流速为2.5±0.5ml/分钟；分流进样，分流流量3ml/min，分流比为1:1；理论板数按斑蝥素峰计算应不低于15000，相对标准偏差应不大于3.5％；

对照品溶液的制备：取斑蝥素对照品，精密称定，加二氯甲烷制成每1ml含10μg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取注射液30ml，置分液漏斗中，加入1.8mol/L硫酸溶液3ml，混匀，精密加入二氯甲烷3ml，振摇提取，静置分层，取二氯甲烷液，滤过，取续滤液，即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2μl，注入气相色谱仪，测定，计算，即得。

按实施例2-4的方法测定艾迪注射液共9批(每个实施例3批)，性状、鉴别、检查均符合指标要求，每支含5-羟甲基糠醛均值为67.52μg；指纹图谱显示供试品与对照的指纹图谱相似度大于0.88，10个共有峰(见图1)：峰1为腺嘌呤，峰2为腺苷，峰4为紫丁香苷(刺五加)，峰5为刺五加苷E(刺五加)，峰6为毛蕊异黄酮葡萄糖苷(黄芪)，峰7为异嗪皮啶(刺五加)；含量测定显示含总皂苷以人参皂苷Re(C₄₈H₈₂O₁₈)计，范围在0.31-0.36mg/ml，含刺五加以紫丁香苷(C₁₇H₂₄O₉)计，范围在14.1-17.8μg/ml，含黄芪以毛蕊异黄酮葡萄糖苷(C₂₂H₂₂O₁₀)计，范围在12.5-15.3μg/ml，含斑蝥以斑蝥素(C₁₀H₁₂O₄)计，范围在1.88-2.12μg/ml。

Claims (10)

1.一种抗肿瘤注射制剂的检测方法，所述注射制剂由斑蝥1-2份、人参30-70份、黄芪75-125份、刺五加130-180份制成注射液，所述检测方法由性状、鉴别、检查、指纹图谱、含量测定项目组成；所述鉴别方法为α-萘酚显色反应，以异嗪皮啶为对照、以二氯甲烷∶甲醇∶甲酸＝30-50∶0.3-0.6∶0.3-0.6为展开剂、对制剂中刺五加药材的薄层色谱鉴别，以及以人参皂苷Re、Rg1、Rb以及黄芪甲苷为对照、以三氯甲烷∶甲醇∶水∶甲酸＝10-20∶4-8∶0.5-2∶0.2-0.5为展开剂、对制剂中人参和黄芪药材的薄层色谱鉴别；

所述检查为溶液的颜色、pH值检查，以甲醇：0.4％冰醋酸＝2-8:92-98为流动相、对注射剂中5-羟甲基糠醛含量进行的HPLC法检查，以及对注射液中炽灼残渣、热原、异常毒性、过敏反应、溶血与凝聚、其他注射剂项目的检查；

所述指纹图谱是对制剂中人参、黄芪、刺五加药材，以三氟醋酸的乙腈溶液为流动相A，以三氟醋酸的水溶液为流动相B，进行梯度洗脱的HPLC法指纹图谱表征过程；

所述含量测定是对制剂中人参总皂苷含量进行测定，采用人参皂苷Re对照品为对照的紫外-可见分光光度法；对刺五加中所含的紫丁香苷、黄芪中所含的毛蕊异黄酮葡萄糖苷进行含量测定，采用甲醇为流动相A、水为流动相B进行梯度洗脱的HPLC法；对斑蝥所含斑蝥素含量进行测定，采用以5％二苯基-95％二甲基聚硅氧烷为固定相的气相-毛细管色谱法；

其特征在于：具体的指纹图谱表征方法如下：

按照中国药典2015年版四部通则0512中高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以含0.005-0.01％体积量的三氟醋酸的乙腈溶液为流动相A，以含0.005-0.01％体积量的三氟醋酸的水溶液为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为210nm；柱温为20℃；流速为每分钟0.7ml；理论板数按紫丁香苷峰计算应不低于5000；

所述梯度洗脱条件为：

0-5min，流动相A 2％，流动相B 98％；

5-10min，流动相A 2-5％，流动相B 98-95％；

10-18min，流动相A 5-10％，流动相B 95-90％；

18-30min，流动相A 10-15％，流动相B 90-85％；

30-38min，流动相A 15-20％，流动相B 85-80％；

38-50min，流动相A 20-23％，流动相B 80-77％；

50-65min，流动相A 23-38％，流动相B 77-62％；

65-75min，流动相A 38-55％，流动相B 62-45％；

75-95min，流动相A 55-100％，流动相B 45-0％；

95-110min，流动相A 100％，流动相B 0％；

参照物溶液的制备：取紫丁香苷对照品、刺五加苷E对照品、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml各含50μg的混合溶液，摇匀，即得；

供试品溶液的制备：取注射液5-10ml，通过已预处理的固相萃取柱，先以水1ml洗脱，弃去水液，再用甲醇洗脱，收集洗脱液至2-4ml量瓶中，至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录110分钟的色谱图，即得；

紫丁香苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量测定方法如下：

照中国药典2015年版四部通则0512中高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以水为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为260nm，理论板数按紫丁香苷峰计算应不低于2000；

所述梯度洗脱条件为：

0-10min，流动相A 25％，流动相B 75％；

10-13min，流动相A 25-35％，流动相B 75-65％；

13-30min，流动相A 35-65％，流动相B 65-40％；

30-31min，流动相A 100％，流动相B 0％；

31-35min，流动相A 100％，流动相B 0％；

对照品溶液的制备：取紫丁香苷对照品、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含紫丁香苷25μg、毛蕊异黄酮葡萄糖苷15μg的混合溶液，即得；

供试品溶液的制备：取注射液，滤过，取续滤液，即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.根据权利要求1所述的抗肿瘤注射制剂的检测方法，其特征在于：鉴别方法如下：

(1)取注射液50-100ml浓缩至10-20ml后，加乙醇50-100ml，搅匀，滤过，沉淀物用乙醇洗涤1-3次，将沉淀物用5-10ml水溶解，取1-2ml置试管中，微热后加入5％的α-萘酚乙醇溶液5-10滴，摇匀，再沿管壁缓缓加入浓硫酸0.5-1ml，在两液面接界处显紫红色环；

(2)取注射液50-100ml，用二氯甲烷振摇提取1-3次，每次用量30-60ml，合并二氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇2-4ml使溶解，作为供试品溶液，二氯甲烷提取后的水液备用；另取异嗪皮啶对照品，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2015年版四部通则0502的薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各1μl～4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷∶甲醇∶甲酸＝30-50∶0.3-0.6∶0.3-0.6为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm波长的紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝色荧光斑点；

(3)取鉴别(2)项下二氯甲烷提取后的水液，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取1-3次，每次用量50-100ml，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2-3次，每次用量30-60ml，弃去氨试液，正丁醇液蒸干，残渣加水10-20ml使溶解，通过已处理好的内径1.5cm，长15cm的DA－201大孔吸附树脂柱，用水100-200ml洗脱，弃去洗脱液，再用15-30％的乙醇80-160ml洗脱，弃去洗脱液，再用35-50％的乙醇80-160ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2-4ml使溶解，作为供试品溶液；另取人参皂苷Rg₁对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rb₁对照品及黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml各含0.5mg的混合溶液，作为对照品溶液；照中国药典2015年版四部通则0502的薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl～20μl，分别点于同一硅胶H高效薄层板上进行带状点样，以三氯甲烷∶甲醇∶水∶甲酸＝10-20∶4-8∶0.5-2∶0.2-0.5为展开剂，于30℃以下展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，置365nm波长的紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

3.根据权利要求2所述的抗肿瘤注射制剂的检测方法，其特征在于：鉴别方法如下：

(1)取注射液50ml浓缩至10ml后，加乙醇50ml，搅匀，滤过，沉淀物用乙醇洗涤2次，将沉淀物用5ml水溶解，取1ml置试管中，微热后加入5％的α-萘酚乙醇溶液5滴，摇匀，再沿管壁缓缓加入浓硫酸0.5ml，在两液面接界处显紫红色环；

(2)取注射液50ml，用二氯甲烷振摇提取2次，每次用量30ml，合并二氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液，二氯甲烷提取后的水液备用；另取异嗪皮啶对照品，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2015年版四部通则0502的薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各1μl～2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷∶甲醇∶甲酸＝40∶0.5∶0.5为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm波长的紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝色荧光斑点；

(3)取鉴别(2)项下二氯甲烷提取后的水液，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次用量50ml，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次，每次用量30ml，弃去氨试液，正丁醇液蒸干，残渣加水10ml使溶解，通过已处理好的内径1.5cm，长15cm的DA-201大孔吸附树脂柱，用水100ml洗脱，弃去洗脱液，再用20％的乙醇80ml洗脱，弃去洗脱液，再用40％的乙醇80ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取人参皂苷Rg₁对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rb₁对照品及黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml各含0.5mg的混合溶液，作为对照品溶液；照中国药典2015年版四部通则0502的薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl～10μl，分别点于同一硅胶H高效薄层板上进行带状点样，以三氯甲烷∶甲醇∶水∶甲酸＝15∶6∶1∶0.2为展开剂，于30℃以下展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，置365nm波长的紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

4.根据权利要求1所述的抗肿瘤注射制剂的检测方法，其特征在于：对5-羟甲基糠醛的含量检查方法如下：

按照中国药典2015年版四部通则0512中高效液相色谱法测定：

取注射液1-2ml，作为供试品溶液；另取5-羟甲基糠醛对照品，精密称定，加0.1％甲酸溶液稀释制成每lml中含5μg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2015年版四部通则0512中高效液相色谱法测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇：0.4％冰醋酸溶液＝2-8:92-98为流动相；检测波长为284nm；柱温为30℃；理论板数按5-羟甲基糠醛峰计算不低于4000；精密量取供试品溶液与对照品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；计算5-羟甲基糠醛含量。

5.根据权利要求4所述的抗肿瘤注射制剂的检测方法，其特征在于：所述5-羟甲基糠醛的含量检查方法中，流动相为甲醇：0.4％冰醋酸溶液＝4:96。

6.根据权利要求1所述的抗肿瘤注射制剂的检测方法，其特征在于：斑蝥素的含量测定方法如下：

照中国药典2015年版四部通则0521中气相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以5％二苯基-95％二甲基聚硅氧烷为固定相的石英毛细管柱，柱长为30m，内径为0.32mm，膜厚度为0.25μm；柱温为程序升温：初始温度为100℃，以每分钟2℃的速率升温至140℃；进样口温度为250℃，检测器温度为300℃；载气为氮气，流速为2.5±0.5ml/分钟；分流进样，分流流量3ml/min，分流比为1:1；理论板数按斑蝥素峰计算应不低于15000，相对标准偏差应不大于3.5％；

对照品溶液的制备：取斑蝥素对照品，精密称定，加二氯甲烷制成每1ml含10μg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取注射液20-40ml，置分液漏斗中，加入1.8mol/L硫酸溶液2-4ml，混匀，精密加入二氯甲烷2-4ml，振摇提取，静置分层，取二氯甲烷液，滤过，取续滤液，即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2μl，注入气相色谱仪，测定，计算，即得。

7.根据权利要求1所述的抗肿瘤注射制剂的检测方法，其特征在于：人参总皂苷的含量测定方法如下：

照中国药典2015年版四部通则0401中紫外-可见分光光度法测定：

对照品溶液的制备：取人参皂苷Re对照品，精密称定，加甲醇制成每1ml含1.6mg的溶液，摇匀，即得；

标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0μl、20μl、40μl、60μl、80μl、100μl，分别置10ml具塞试管中，置水浴上挥去溶剂，立即取出，放冷，加5％香草醛冰醋酸溶液0.2ml、高氯酸0.8ml，摇匀，置60℃水浴中加热15分钟，取出，用水冷却2分钟，加冰醋酸5ml，摇匀，照紫外—可见分光光度法，在544nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线；

供试品溶液的制备：取注射液20-40ml，置分液漏斗中，用三氯甲烷振摇提取2-4次，每次20-30ml，合并三氯甲烷液，用水洗涤2-3次，每次5-10ml，弃去三氯甲烷液，洗液与三氯甲烷提取分层后的水液合并，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取2-4次，每次50-60ml，合并正丁醇液，加入无水硫酸钠3-5g，搅拌，放至澄清；将正丁醇液移至蒸发皿中，用少量正丁醇洗涤无水硫酸钠，洗液并入蒸发皿中，蒸干，用少量水溶解残渣，通过已处理好的内径1.5cm、长15cm的DA-201大孔吸附树脂柱上，待液面接近棉花层后，用水100-200ml洗脱，控制流速为0.3-0.5ml/min，弃去洗液，再用65-75％乙醇80-100ml洗脱，收集洗脱液于蒸发皿中，置水浴上蒸干，残渣加甲醇溶解，并转移至5-10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；

测定法：精密量取供试品溶液100μl，照标准曲线的制备项下的方法，自“置10ml具塞试管中”起依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中人参皂苷Re的浓度，计算，即得。

8.根据权利要求1-7任一项所述的抗肿瘤注射制剂的检测方法，其特征在于：检测方法如下：

性状：

注射液为浅黄色至浅棕色的澄明液体；

鉴别：

(1)取注射液50-100ml浓缩至10-20ml后，加乙醇50-100ml，搅匀，滤过，沉淀物用乙醇洗涤1-3次，将沉淀物用5-10ml水溶解，取1-2ml置试管中，微热后加入5％的α-萘酚乙醇溶液5-10滴，摇匀，再沿管壁缓缓加入浓硫酸0.5-1ml，在两液面接界处显紫红色环；

(2)取注射液50-100ml，用二氯甲烷振摇提取1-3次，每次用量30-60ml，合并二氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇2-4ml使溶解，作为供试品溶液，二氯甲烷提取后的水液备用；另取异嗪皮啶对照品，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2015年版四部通则0502的薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各1μl～4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷∶甲醇∶甲酸＝30-50∶0.3-0.6∶0.3-0.6为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm波长的紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝色荧光斑点；

(3)取鉴别(2)项下二氯甲烷提取后的水液，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取1-3次，每次用量50-100ml，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2-3次，每次用量30-60ml，弃去氨试液，正丁醇液蒸干，残渣加水10-20ml使溶解，通过已处理好的内径1.5cm，长15cm的DA－201大孔吸附树脂柱，用水100-200ml洗脱，弃去洗脱液，再用15-30％的乙醇80-160ml洗脱，弃去洗脱液，再用35-50％的乙醇80-160ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2-4ml使溶解，作为供试品溶液；另取人参皂苷Rg₁对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rb₁对照品及黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml各含0.5mg的混合溶液，作为对照品溶液；照中国药典2015年版四部通则0502的薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl～20μl，分别点于同一硅胶H高效薄层板上进行带状点样，以三氯甲烷∶甲醇∶水∶甲酸＝10-20∶4-8∶0.5-2∶0.2-0.5为展开剂，于30℃以下展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，置365nm波长的紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

检查：

(1)溶液的颜色：取注射液1-2ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，按照中国药典2015年版四部通则0901第一法与黄色8号标准比色液比较，不得更深；

(2)pH值：3.8-5.8；

(3)5-羟甲基糠醛：按照中国药典2015年版四部通则0512中高效液相色谱法测定：

取注射液1-2ml，作为供试品溶液；另取5-羟甲基糠醛对照品，精密称定，加0.1％甲酸溶液稀释制成每lml中含5μg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2015年版四部通则0512中高效液相色谱法测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇：0.4％冰醋酸溶液＝2-8:92-98为流动相；检测波长为284nm；柱温为30℃；理论板数按5-羟甲基糠醛峰计算不低于4000；精密量取供试品溶液与对照品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；计算5-羟甲基糠醛含量；

(4)炽灼残渣：取注射液1-2ml，置坩埚中，水浴上蒸干，按照中国药典2015年版四部通则0841进行测定，不得过1.0％，以g/ml计；

(5)热原：取注射液20-40ml，用氯化钠注射液或5％～10％葡萄糖注射液稀释至100ml，按家兔体重1kg注射10ml的剂量，按照中国药典2015年版四部通则1142进行检查，应符合规定；

(6)异常毒性：取注射液，按照中国药典2015年版四部通则1141进行检查，按静脉注射法给药，应符合规定；

(7)过敏反应：取注射液，按照中国药典2015年版四部通则1147进行检查，应符合规定；

(8)溶血与凝聚：取注射液，按照中国药典2015年版四部通则1148进行检查，应符合规定；

(9)其他：应符合中国药典2015年版四部通则0102注射剂项下有关的各项规定；

指纹图谱：按照中国药典2015年版四部通则0512中高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以含0.005-0.01％体积量的三氟醋酸的乙腈溶液为流动相A，以含0.005-0.01％体积量的三氟醋酸的水溶液为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为210nm；柱温为20℃；流速为每分钟0.7ml；理论板数按紫丁香苷峰计算应不低于5000；

所述梯度洗脱条件为：

0-5min，流动相A 2％，流动相B 98％；

5-10min，流动相A 2-5％，流动相B 98-95％；

10-18min，流动相A 5-10％，流动相B 95-90％；

18-30min，流动相A 10-15％，流动相B 90-85％；

30-38min，流动相A 15-20％，流动相B 85-80％；

38-50min，流动相A 20-23％，流动相B 80-77％；

50-65min，流动相A 23-38％，流动相B 77-62％；

65-75min，流动相A 38-55％，流动相B 62-45％；

75-95min，流动相A 55-100％，流动相B 45-0％；

95-110min，流动相A 100％，流动相B 0％；

参照物溶液的制备：取紫丁香苷对照品、刺五加苷E对照品、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml各含50μg的混合溶液，摇匀，即得；

供试品溶液的制备：取注射液5-10ml，通过已预处理的固相萃取柱，先以水1ml洗脱，弃去水液，再用甲醇洗脱，收集洗脱液至2-4ml量瓶中，至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录110分钟的色谱图，即得；

含量测定：

(1)总皂苷：照中国药典2015年版四部通则0401中紫外-可见分光光度法测定：

对照品溶液的制备：取人参皂苷Re对照品，精密称定，加甲醇制成每1ml含1.6mg的溶液，摇匀，即得；

标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0μl、20μl、40μl、60μl、80μl、100μl，分别置10ml具塞试管中，置水浴上挥去溶剂，立即取出，放冷，加5％香草醛冰醋酸溶液0.2ml、高氯酸0.8ml，摇匀，置60℃水浴中加热15分钟，取出，用水冷却2分钟，加冰醋酸5ml，摇匀，照紫外-可见分光光度法，在544nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线；

供试品溶液的制备：取注射液20-40ml，置分液漏斗中，用三氯甲烷振摇提取2-4次，每次20-30ml，合并三氯甲烷液，用水洗涤2-3次，每次5-10ml，弃去三氯甲烷液，洗液与三氯甲烷提取分层后的水液合并，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取2-4次，每次50-60ml，合并正丁醇液，加入无水硫酸钠3-5g，搅拌，放至澄清；将正丁醇液移至蒸发皿中，用少量正丁醇洗涤无水硫酸钠，洗液并入蒸发皿中，蒸干，用少量水溶解残渣，通过已处理好的内径1.5cm、长15cm的DA-201大孔吸附树脂柱上，待液面接近棉花层后，用水100-200ml洗脱，控制流速为0.3-0.5ml/min，弃去洗液，再用65-75％乙醇80-100ml洗脱，收集洗脱液于蒸发皿中，置水浴上蒸干，残渣加甲醇溶解，并转移至5-10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；

测定法：精密量取供试品溶液100μl，照标准曲线的制备项下的方法，自“置10ml具塞试管中”起依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中人参皂苷Re的浓度，计算，即得；

(2)紫丁香苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷：照中国药典2015年版四部通则0512中高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以水为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为260nm，理论板数按紫丁香苷峰计算应不低于2000；

所述梯度洗脱条件为：

0-10min，流动相A 25％，流动相B 75％；

10-13min，流动相A 25-35％，流动相B 75-65％；

13-30min，流动相A 35-65％，流动相B 65-40％；

30-31min，流动相A 100％，流动相B 0％；

31-35min，流动相A 100％，流动相B 0％；

对照品溶液的制备：取紫丁香苷对照品、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含紫丁香苷25μg、毛蕊异黄酮葡萄糖苷15μg的混合溶液，即得；

供试品溶液的制备：取注射液，滤过，取续滤液，即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

(3)斑蝥素：照中国药典2015年版四部通则0521中气相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以5％二苯基-95％二甲基聚硅氧烷为固定相的石英毛细管柱，柱长为30m，内径为0.32mm，膜厚度为0.25μm；柱温为程序升温：初始温度为100℃，以每分钟2℃的速率升温至140℃；进样口温度为250℃，检测器温度为300℃；载气为氮气，流速为2.5±0.5ml/分钟；分流进样，分流流量3ml/min，分流比为1:1；理论板数按斑蝥素峰计算应不低于15000，相对标准偏差应不大于3.5％；

对照品溶液的制备：取斑蝥素对照品，精密称定，加二氯甲烷制成每1ml含10μg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取注射液20-40ml，置分液漏斗中，加入1.8mol/L硫酸溶液2-4ml，混匀，精密加入二氯甲烷2-4ml，振摇提取，静置分层，取二氯甲烷液，滤过，取续滤液，即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2μl，注入气相色谱仪，测定，计算，即得。

9.根据权利要求8所述的抗肿瘤注射制剂的检测方法，其特征在于：检测方法如下：

性状：

产品为浅棕色的澄明液体；

鉴别：

(1)取注射液50ml浓缩至10ml后，加乙醇50ml，搅匀，滤过，沉淀物用乙醇洗涤2次，将沉淀物用5ml水溶解，取1ml，置试管中，微热后加入5％的α-萘酚乙醇溶液5滴，摇匀，再沿管壁缓缓加入浓硫酸0.5ml，在两液面接界处显紫红色环；

(2)取注射液50ml，用二氯甲烷振摇提取2次，每次用量30ml，合并二氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液，二氯甲烷提取后的水液备用；另取异嗪皮啶对照品，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2015年版四部通则0502的薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各1μl～2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷∶甲醇∶甲酸＝40∶0.5∶0.5为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm波长的紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝色荧光斑点；

(3)取鉴别(2)项下二氯甲烷提取后的水液，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次用量50ml，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次，每次用量30ml，弃去氨试液，正丁醇液蒸干，残渣加水10ml使溶解，通过已处理好的内径1.5cm、长15cm的DA－201大孔吸附树脂柱，用水100ml洗脱，弃去洗脱液，再用20％的乙醇80ml洗脱，弃去洗脱液，再用40％的乙醇80ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取人参皂苷Rg₁对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rb₁对照品及黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml各含0.5mg的混合溶液，作为对照品溶液；照中国药典2015年版四部通则0502的薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl～10μl，分别点于同一硅胶H高效薄层板上进行带状点样，以三氯甲烷∶甲醇∶水∶甲酸＝15∶6∶1∶0.2为展开剂，于30℃以下展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，置365nm波长的紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

检查：

(1)溶液的颜色：取注射液1ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，按照中国药典2015年版四部通则0901第一法与黄色8号标准比色液比较，不得更深；

(2)pH值：照中国药典2015年版四部通则0631检查，pH为3.8-5.8；

(3)5-羟甲基糠醛：按照中国药典2015年版四部通则0512中高效液相色谱法测定：

取注射液，作为供试品溶液；另取5-羟甲基糠醛对照品，精密称定，加0.1％甲酸溶液稀释制成每lml中含5μg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2015年版四部通则0512中高效液相色谱法测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇：0.4％冰醋酸溶液＝4:96为流动相；检测波长为284nm；柱温为30℃；理论板数按5-羟甲基糠醛峰计算不低于4000；精密量取供试品溶液与对照品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；计算5-羟甲基糠醛含量；

(4)炽灼残渣：取注射液2ml，置坩埚中，水浴上蒸干，按照中国药典2015年版四部通则0841进行测定，不得过1.0％，以g/ml计；

(5)热原：取注射液30ml，用氯化钠注射液或5％～10％葡萄糖注射液稀释至100ml，按家兔体重1kg注射10ml的剂量，按照中国药典2015年版四部通则1142进行检查，应符合规定；

(6)异常毒性：取注射液，按照中国药典2015年版四部通则1141进行检查，按静脉注射法给药，应符合规定；

(7)过敏反应：取注射液，按照中国药典2015年版四部通则1147进行检查，应符合规定；

(8)溶血与凝聚：取注射液，按照中国药典2015年版四部通则1148进行检查，应符合规定；

(9)其他：应符合中国药典2015年版四部通则0102注射剂项下有关的各项规定；

指纹图谱：按照中国药典2015年版四部通则0512中高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，Kromasil100-5-C18，柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm；以含0.005％体积量的三氟醋酸的乙腈溶液为流动相A，以含0.005％体积量的三氟醋酸的水溶液为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为210nm；柱温为20℃；流速为每分钟0.7ml；理论板数按紫丁香苷峰计算应不低于5000；

所述梯度洗脱条件为：

0-5min，流动相A 2％，流动相B 98％；

5-10min，流动相A 2-5％，流动相B 98-95％；

10-18min，流动相A 5-10％，流动相B 95-90％；

18-30min，流动相A 10-15％，流动相B 90-85％；

30-38min，流动相A 15-20％，流动相B 85-80％；

38-50min，流动相A 20-23％，流动相B 80-77％；

50-65min，流动相A 23-38％，流动相B 77-62％；

65-75min，流动相A 38-55％，流动相B 62-45％；

75-95min，流动相A 55-100％，流动相B 45-0％；

95-110min，流动相A 100％，流动相B 0％；

参照物溶液的制备：取紫丁香苷对照品、刺五加苷E对照品、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml各含50μg的混合溶液，摇匀，即得；

供试品溶液的制备：取注射液5ml，通过已预处理的固相萃取柱：

6cc/500mg C18Cartridges，先以水1ml洗脱，弃去水液，再用甲醇洗脱，收集洗脱液至2ml量瓶中，至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录110分钟的色谱图，即得；

含量测定：

(1)总皂苷：照中国药典2015年版四部通则0401中紫外-可见分光光度法测定：

对照品溶液的制备：取人参皂苷Re对照品，精密称定，加甲醇制成每1ml含1.6mg的溶液，摇匀，即得；

标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0μl、20μl、40μl、60μl、80μl、100μl，分别置10ml具塞试管中，置水浴上挥去溶剂，立即取出，放冷，加5％香草醛冰醋酸溶液0.2ml、高氯酸0.8ml，摇匀，置60℃水浴中加热15分钟，取出，用水冷却2分钟，加冰醋酸5ml，摇匀，照紫外—可见分光光度法，在544nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线；

供试品溶液的制备：取注射液20ml，置分液漏斗中，用三氯甲烷振摇提取3次，每次20ml，合并三氯甲烷液，用水洗涤2次，每次5ml，弃去三氯甲烷液，洗液与三氯甲烷提取分层后的水液合并，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次50ml，合并正丁醇液，加入无水硫酸钠3g，搅拌，放至澄清；将正丁醇液移至蒸发皿中，用少量正丁醇洗涤无水硫酸钠，洗液并入蒸发皿中，蒸干，用少量水溶解残渣，通过已处理好的内径1.5cm、长15cm的DA-201大孔吸附树脂柱上，待液面接近棉花层后，用水100ml洗脱，控制流速为0.4ml/min，弃去洗液，再用70％乙醇80ml洗脱，收集洗脱液于蒸发皿中，置水浴上蒸干，残渣加甲醇溶解，并转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；

测定法：精密量取供试品溶液100μl，照标准曲线的制备项下的方法，自“置10ml具塞试管中”起依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中人参皂苷Re的浓度，计算，即得；

(2)紫丁香苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷：照中国药典2015年版四部通则0512中高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以水为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为260nm，理论板数按紫丁香苷峰计算应不低于2000；

所述梯度洗脱条件为：

0-10min，流动相A 25％，流动相B 75％；

10-13min，流动相A 25-35％，流动相B 75-65％；

13-30min，流动相A 35-65％，流动相B 65-40％；

30-31min，流动相A 100％，流动相B 0％；

31-35min，流动相A 100％，流动相B 0％；

对照品溶液的制备：取紫丁香苷对照品、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含紫丁香苷25μg、毛蕊异黄酮葡萄糖苷15μg的混合溶液，即得；

供试品溶液的制备：取注射液，滤过，取续滤液，即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得：

(3)斑蝥素：照中国药典2015年版四部通则0521中气相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以5％二苯基-95％二甲基聚硅氧烷为固定相的石英毛细管柱，柱长为30m，内径为0.32mm，膜厚度为0.25μm；柱温为程序升温：初始温度为100℃，以每分钟2℃的速率升温至140℃；进样口温度为250℃，检测器温度为300℃；载气为氮气，流速为2.5±0.5ml/分钟；分流进样，分流流量3ml/min，分流比为1:1；理论板数按斑蝥素峰计算应不低于15000，相对标准偏差应不大于3.5％；

对照品溶液的制备：取斑蝥素对照品，精密称定，加二氯甲烷制成每1ml含10μg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取注射液20ml，置分液漏斗中，加入1.8mol/L硫酸溶液2ml，混匀，精密加入二氯甲烷2ml，振摇提取，静置分层，取二氯甲烷液，滤过，取续滤液，即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2μl，注入气相色谱仪，测定，计算，即得。

10.根据权利要求8所述的抗肿瘤注射制剂的检测方法，其特征在于：所述检查项目中：5-羟甲基糠醛限度为：每ml注射液中不高于0.5mg；所述指纹图谱表征项目中：供试品指纹图谱分别呈现与参照物色谱峰保留时间相同的色谱峰，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，分析0min～85min图谱，供试品指纹图谱与对照指纹图谱经相似度计算，相似度不低于0.88；含量测定项目中：每ml注射液含总皂苷以人参皂苷Re(C₄₈H₈₂O₁₈)计，不少于0.2mg；每ml注射液含刺五加以紫丁香苷(C₁₇H₂₄O₉)计，不少于13.0μg，含黄芪以毛蕊异黄酮葡萄糖苷(C₂₂H₂₂O₁₀)计，不少于7.0μg；每ml制剂含斑蝥以斑蝥素(C₁₀H₁₂O₄)计，为0.8μg～3.0μg。

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