CN102220432A - 西红花干品的dna指纹图谱鉴定方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及西红花的DNA指纹图谱鉴定方法及其应用。本技术方案采用以下三个特异鉴别引物对西红花干品进行鉴定。UBC868：GAAGAAGAAGAAGAA(5'to3')（SEQ ID NO：1）；UBC859：TGTGTGTGTGTGTGTGAC(5'to3')（SEQ ID NO：2）；UBC818：CACACACACACACACAG (5'to3')（SEQ ID NO：3）。适用于西红花饮片鉴定、含西红花干品组分的中药制剂鉴定的应用。相对于现有技术，具有准确性高、重现性好和专属性强等优点。
Description
技术领域
本发明属生物医药领域，具体涉及西红花的DNA指纹图谱鉴定方法及其应用。
技术背景
近年来，DNA分子鉴定技术已经广泛的应用到中药材的品种鉴定等研究领域。DNA分子标记能反映生物个体或种群基因组中某种差异特征的DNA片段，能够直接反映基因组DNA间的差异。PCR（polymerase chain reaction，是特异DNA的体外酶促快速扩增反应）与分子生物学技术的广泛应用，也推进了ISSR、RAPD、SSR、RFPL、AFLP等技术在植物分类与中药材鉴别方面的应用，并且占据着十分重要的位置。
中国药典2010版一部收载，中药西红花是鸢尾科番红花属植物番红花Crocus sativus L.的干燥柱头，具有活血化瘀，散郁开结，凉血解毒等功效。西红花在临床上用于治疗忧思郁结，胸膈痞闷，吐血，伤寒发狂，惊怖恍惚，妇女经闭，血滞月经不调，产后瘀血作痛，跌打损伤等。西红花价格十分昂贵，被誉为“植物黄金”。市售假冒伪劣的藏红花产品层出不穷、屡见不鲜。
现有的藏红花鉴别技术仍然是以性状鉴别、理化鉴别和显微鉴别为主。这些方法虽然简单，但是专属性差，检测指标不能量化，同时受到实验操作者的主观因素影响大。中国药典2010版一部采用薄层色谱法和高效液相色谱法对西红花进行鉴别和含量测定的考察。但不同产地的藏红花、栽培藏红花与组培藏红花在主要成分有显著差异，同时在成分的种类和含量方面也有很大的差别，因此用薄层或高效液相色谱法从化学成分上鉴别西红花样品的真伪存在一定的局限性。特别是，对于西红花的鉴别，前人的研究几乎都是针对西红花鲜品，而西红花干品药材的DNA降解非常严重，西红花鲜品的鉴别方法不能完全适用于西红花干品。而目前还没有针对西红花干品药材DNA指纹图谱鉴定方面的文献报道。
发明内容
为克服以上技术问题，本发明提供了一种西红花干品的DNA指纹图谱鉴定方法及其应用。特别适用于西红花干品的鉴定，具有高专属性、准确性和重现性的优点。
该方法的总体构思是：从100个UBC系列引物中进行筛选，得到适用于ISSR（Inter-Simple Sequence Repeats）分析的三个特殊引物，所述的三个引物均可以用来准确鉴定西红花干品。
UBC系列的引物是指由加拿大不列颠哥伦比亚大学（University of British Columbia, 简称UBC）命名的系列简单重复序列的3'端或5'端加上2～4个随机核苷酸。现全球均采用这套命名规则。
本发明的技术方案为：
一种西红花干品的DNA指纹图谱鉴定方法，其特征在于，采用以下三个特异鉴别引物中的任一种进行对比鉴定。
1.UBC868: GAAGAAGAAGAAGAA(5'to3')(如SEQ ID NO:1)；
2.UBC859: TGTGTGTGTGTGTGTGAC (5'to3') (如SEQ ID NO:2)；
3.UBC818:CACACACACACACACAG (5'to3') (如SEQ ID NO:3)。
适用于西红花饮片鉴定、含西红花干品组分的中药制剂鉴定的应用。
鉴定的具体步骤为：
取西红花干品药材，提取DNA。建立PCR反应体系：在200μL PCR管中进行，反应总体积为25μL，反应体系包括10×PCR缓冲液2.5μL，2.5mmol/L dNTP 2μL，引物10 μmol/L 2μL，高保真TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.125μL，模板DNA 2μL，无菌双蒸水16.375μL。其中，鉴别引物有：
1.UBC868: GAAGAAGAAGAAGAA(5'to3')；
2.UBC859: TGTGTGTGTGTGTGTGAC(5'to3')；
3.UBC818:CACACACACACACACAG (5'to3')。
按照琼脂糖凝胶电泳法（中国药典2010版三部附录Ⅵ B），胶浓度为1.2%，胶中加入核酸凝胶染色剂（终浓度为0.05%），供试品与对照药材PCR反应液的上样量均为5μL，DNA分子量标记上样量为3μL (100μg/μL)。电泳结束后，取凝胶片在凝胶成像仪上检视。供试品凝胶电泳图谱中，在与对照药材电泳图谱相应位置上应有相同DNA条带。
相对于现有技术，本发明具有如下的优点：
① 专属性、准确性、重现性好。结果真实、稳定、可靠。
② 不受样品形态限制，原药材、饮片、粉末乃至丸剂、散剂之类生药原型的中成药均可应用。
③ 所需样品量少，尤其适用于贵重药材。
④ PCR仪的普及，使DNA分子标记更易推广。
附图说明
图1是本发明实施例中西红花样品DNA提取液的浓度纯度曲线图。
图2是引物UBC868对正伪品西红花的扩增电泳图。
图3是引物UBC859对正伪品西红花的扩增电泳图。
图4是引物UBC818对正伪品西红花的扩增电泳图。
图5是西红花对照药材、样品及伪品薄层图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明。
1. 模板DNA的提取
取要鉴定的西红花干品药材约200mg置乳钵中，加液氮适量，充分研磨使成粉末；取其中的100mg粉末置2mL离心管中，加入1000μL 磷酸盐缓冲液和2 μL RNaseA，混匀；再加150μL细胞核裂解液和20μL 蛋白酶 K，立即混匀，将离心管置56℃水浴30分钟；12000转离心10分钟；小心吸取上清液1000μL置新的离心管中，并加入350μL结合液，混匀；5．将DNA制备管置于2mL离心管中，将混合液移至制备管中，12000转离心1分钟；弃滤液，将制备管放回原来的2mL离心管中，加入500μL洗脱液1，离心（转数为每分钟12000转）1分钟；弃滤液，将制备管放回原来的2mL离心管中，加入700μL 洗脱液2，离心（转数为每分钟12000转）1分钟；弃滤液，将制备管放回原来的2mL离心管中，加入700μL洗脱液2，离心（转数为每分钟12000转）1分钟；弃滤液，将制备管放回原来的2mL离心管中，12000转离心1分钟； 将DNA纯化柱转移入另一离心管中，加入无菌双蒸水30μl（预热至65℃），室温放置3分钟后，离心（转数为每分钟12000转）1分钟，所得溶液即为供试品溶液，置-20℃保存备用。另取藏红花对照药材200mg（本实验的对照药材由深圳药检所提供），同法制成对照药材模板DNA溶液。
2.模板DNA的浓度和纯度检测
将上步骤提取得的DNA溶液，用Thermo NanoDrop ND2000检测所提取的DNA溶液，结果见图1。
从图1 的结果可以看出，DNA浓度为148.9ng/μL，OD260/OD280为1.77，接近1.8，说明DNA的纯度很高。若小于1.6则说明蛋白含量较高，若大于1.8则说明RNA含量较高。
说明提取得到的DNA的浓度和纯度都较高，完全符合PCR体系对DNA模板的要求。
3.引物的制备
将引物序列发送至上海英骏生物技术有限公司广州合成部合成，采用PAGE纯化，每管OD值为1，每个引物合成两管，3天后可获得。上海英骏生物技术有限公司提供的引物合成报告单显示：
UBC868每管的nmoles为11.8；UBC859每管的nmoles为10.4；UBC818每管的nmoles为10.3。
获得的引物为白色粉末，附在离心管内壁上。稀释前将引物离心管5000g离心1min，加入(每管引物的nmoles值/10)mL的TE缓冲液（10mM Tris-HCl,pH 8.0,1mM EDTA）中，制成引物溶液，于-20℃保存备用。引物溶液可稳定保存半年；引物粉末可稳定保存一年以上。
实施例1，用UBC868对西红花正伪品进行ISSR分析（Inter-Simple Sequence Repeats，简单重复序列间区，即在简单重复序列区序列的3'端或5'端加上2～4个随机核苷酸来扩增重复序列之间的区域）。
PCR反应体系：在200μL PCR管中进行，反应总体积为25μL，反应体系包括10×PCR缓冲液2.5μL，2.5mmol/L dNTP 2μL，UBC868 10 μmol/L 2μL，高保真TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.125μL，模板DNA 2μL，无菌双蒸水16.375μL。
PCR反应参数：94℃预变性5分钟，循环反应35次（94℃45秒，50℃45秒，72℃1分钟），最后延伸（72℃）8分钟。
重复三次提取模板DNA分别进行扩增，电泳结果如图2所示。
由图2可以看出，对于UBC868，十批正品均有相同数目、大小的条带，十批伪品的DNA条带与正品有明显差异。
因此，UBC868引物可以作为鉴别正伪品西红花的特异引物。
实施例2，用UBC859对西红花正伪品进行ISSR分析。
PCR反应体系：在200μL PCR管中进行，反应总体积为25μL，反应体系包括10×PCR缓冲液2.5μL，2.5mmol/L dNTP 2μL，UBC859 10 μmol/L 2μL，高保真TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.125μL，模板DNA 2μL，无菌双蒸水16.375μL。
PCR反应参数：94℃预变性5分钟，循环反应35次（94℃45秒，55℃45秒，72℃1分钟），最后延伸（72℃）8分钟。
重复三次提取模板DNA分别进行扩增，电泳结果如图3所示。
由图3可以看出，对于UBC859，十批正品均有相同的条带（略小于750bp），而十批伪品中，w4号伪品在正品条带的位置有相近的条带，但w4号伪品在其他位置有明显条带，而正品在该位置均无条带。可能是w4号伪品中掺伪的其他样品用UBC859也可以扩增出条带，故w4号伪品的条带数目比正品多。
因此，UBC859引物可以作为鉴别正伪品西红花的特异引物。
实施例3， 用UBC818对红花正伪品进行ISSR分析
PCR反应体系：在200μL PCR管中进行，反应总体积为25μL，反应体系包括10×PCR缓冲液2.5μL，2.5mmol/L dNTP 2μL，UBC868 10 μmol/L 2μL，高保真TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.125μL，模板DNA 2μL，无菌双蒸水16.375μL。
PCR反应参数：94℃预变性5分钟，循环反应35次（94℃45秒，58℃45秒，72℃1分钟），最后延伸（72℃）8分钟。
重复三次提取模板DNA分别进行扩增，电泳结果如图4所示。
由图4可以看出，对于UBC818，十批正品均有相同的条带，分子量相近约500bp，其中伪品w4也有与正品相似的两条带，但上图w4号伪品在其他位置有明显条带，而正品在该位置均无条带。可能是w4号伪品中掺伪的其他样品用UBC818也可以扩增出条带，故w4号伪品的条带数目比正品多。
因此，UBC818引物可以作为鉴别正伪品西红花的特异引物。
实施例4 ，正伪品的薄层验证实验对比。
参照中国药典2010版一部西红花鉴别项薄层条件，对所收集样品进行鉴别。薄层条件如下：
固定相：硅胶G薄层板（20×20cm）；展开剂：乙酸乙酯-甲醇-水（100: 16.5: 13.5）；日光检视；样品浓度：20mg/mL；点样量：5μL。
薄层实验结果见说明书图5。
从薄层图中可见，在对照药材的主斑点的位置，正品均有相应的斑点。但正品3号，7号和8号在箭头位置有明显的紫红色斑点，是对照药材中没有的，推测可能是不同产地或不同栽培等原因所形成的化学成分的差异。而伪品4号（W4）也与对照药材显相同的斑点，但箭头位置的紫红色斑点是对照药材中没有的，故推测W4为掺伪药材。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学
<120> 西红花干品的DNA指纹图谱鉴定方法及其应用
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gaagaagaag aagaa 15
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgtgtgtgtg tgtgtgac 18
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cacacacaca cacacag 17
Claims (4)
1.一种西红花干品的DNA指纹图谱鉴定方法，其特征在于：采用以下三个物质中的任一种作为鉴定引物：
（1）UBC868: GAAGAAGAAGAAGAA,如SEQ ID NO:1所示；
（2）UBC859: TGTGTGTGTGTGTGTGAC，如SEQ ID NO:2所示；
（3）UBC818: CACACACACACACACAG，如SEQ ID NO:3所示。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于该方法的步骤包括：
（1）.取西红花干品药材，提取DNA；
（2）.建立PCR反应体系：在PCR管中建立反应体系，反应体系包括10×PCR的缓冲液，2.5mmol/L dNTP，高保真TaqDNA聚合酶，模板DNA ，无菌双蒸水，鉴别引物为UBC868: GAAGAAGAAGAAGAA或UBC859: TGTGTGTGTGTGTGTGAC或UBC818:CACACACACACACACAG；
（3）.电泳图谱对照：采用琼脂糖凝胶电泳法，其中胶浓度为1.2%，胶中加入核酸凝胶染色剂，电泳结束后，取凝胶片在凝胶成像仪上检视；供试品凝胶电泳图谱中，在与对照药材电泳图谱相应位置上应有相同DNA条带。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，该方法的具体步骤为：
（1）.取西红花干品药材，提取DNA；
（2）.建立PCR反应体系：在200μL PCR管中进行，反应总体积为25μL，反应体系包括10×PCR缓冲液2.5μL，2.5mmol/L dNTP 2μL，鉴别引物10 μmol/L 2μL，高保真TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.125μL，模板DNA 2μL，无菌双蒸水16.375μL,鉴别引物为UBC868: GAAGAAGAAGAAGAA或UBC859: TGTGTGTGTGTGTGTGAC或UBC818:CACACACACACACACAG；
（3）.电泳图谱对照：按照琼脂糖凝胶电泳法，胶浓度为1.2%，胶中加入核酸凝胶染色剂，供试品与对照药材PCR反应液的上样量均为5μL，DNA分子量标记上样量为3μL (100μg/μL)；电泳结束后，取凝胶片在凝胶成像仪上检视，供试品凝胶电泳图谱中，在与对照药材电泳图谱相应位置上应有相同DNA条带。
4.如权利要求1、2或3所述的方法在西红花饮片鉴定、含西红花干品组分的中药制剂鉴定中的应用。
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