CN107586865A

CN107586865A - 一种用于快速检测中药材西红花的lamp引物及包含该引物的检测试剂盒

Info

Publication number: CN107586865A
Application number: CN201710310960.1A
Authority: CN
Inventors: 赵明明; 郭力城; 刘思琪
Original assignee: Bao Tong (guan) Bio Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Hainan Medical College
Priority date: 2017-05-06
Filing date: 2017-05-06
Publication date: 2018-01-16

Abstract

本发明涉及一组西红花特异性分子鉴别引物，可用于西红花及其常见混伪品的现场鉴别区分，对确保用药安全及保护消费者利益具有重要的现实意义。本发明是以西红花通用条形码序列psbA‑trnH为靶序列，设计4条LAMP特异性扩增引物。该引物组涵盖西红花及其常见混伪品靶基因变异位点。通过LAMP检测方法，可有效鉴定区分西红花及其常见混伪品；所述试剂盒包括所述LAMP引物、Bst DNA聚合酶、含dNTPs的反应缓冲液和钙黄绿素。本发明为科学研究和生产实践提供了一种快捷、易操作、成本低廉的西红花现场鉴定技术。

Description

一种用于快速检测中药材西红花的LAMP引物及包含该引物的检测试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及中药及中药材鉴定领域，特别涉及一种西红花环等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)引物组及包含此引物组的试剂盒。

背景技术

西红花为鸢尾科植物番红花Crocus sativus L.的干燥柱头。又名藏红花、番红，具有活血化瘀、凉血解毒、解郁安神的功效。主产于西班牙、希腊、法国及中亚西亚一带，我国于20世纪80年代引种并获得成功，现在上海、江苏、浙江、北京、等地有栽培，以上海为主产地。由于产量低，亩产不足两公斤，故价格十分昂贵，根据西红花质量的不同，每克零售价在40-100元不等，为牟取暴利，混伪、掺假现象层出不穷。为确保药材市场中西红花的质量及其临床应用，须建立一种切实可行的鉴别方法。

常见西红花的鉴别方法有性状、理化、显微、含量测定法，气相色谱法、DNA分子技术等鉴别方法，这些方法各有优缺点，但这些方法均比较繁琐，需要精密实验设备和操作人员良好的生物学背景，不利于推广。本发明针对西红花及其混伪品的基因靶序列(psbA-trnH)差异位点设计特异引物，进行西红花的分子鉴别，通过水浴锅等恒温保温设备，保温30分钟，不需要进行基因测序和电泳分析，即可显示结果。可更加快速、简便、高效的鉴别西红花真伪。

环介导等温扩增技术(LAMP)是荣研化学Notomi等研发可取代PCR的一种简便、快速、准确的基因扩增方法，可以在等温条件下一步完成。LAMP技术的方法原理是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在恒温条件(60～65℃)保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应，直接靠扩增副产物焦磷酸镁沉淀的浊度判断是否发生反应。短时间扩增效率可达到10⁹～10¹⁰个拷贝。不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程。本发明应用西红花特异性鉴定引物组，利用LAMP技术开展西红花快速检测，特异性、灵敏度比普通变温PCR方法更高，同时可以免除高昂的仪器投入，便于基层推广使用。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测西红花的环介导等温扩增引物组。本发明所提供的检测西红花的环介导等温扩增引物，是以西红花通用条形码鉴定序列psbA-trnH为靶序列，设计可供环介导的等温扩增技术进行的西红花特异性鉴别引物：包括可以识别靶DNA四个不同序列的两个内引物(正向内引物和反向内引物)，两个外引物(正向外引物和反向外引物)，内引物包含靶DNA的正义链和反义链和两个环引物。根据所设计的西红花特异性鉴别引物组，建立了用于西红花及其常见混伪品鉴别区分的环介导等温扩增方法。其中所述的引物的序列如下：

CS-F3：5’-TTGTATGGCCAATCATTGTG-3’

CS-B3：5’-ATTCTATTGGACATAGAATGCC-3’

CS-FIP：

5’-ACTCAACATGAGGGAGGAGAAAGGGTATAATGGTAGATGCCCG-3’

CS-BIP：5’-TTCCCGATAAATGATTGGCTACAAAGGAGTAATCCGCTGTGA-3’

反应体系包括：2.5μL10×ThermoPol缓冲液，两个内引物CS-FIP和CS-BIP的终浓度为1～2μM，两个外引物CS-F3和CS-B3的终浓度为0.1～0.4μM，dATP、dGTP、dCTP、dTTP各1-2.5mM，甜菜碱0.5-3M，待检样品DNA 100ng，Bst DNA聚合酶5-20U，钙黄绿素1μL。混匀后在约63-68℃内保温30-60min，然后80℃保温10min。LAMP反应结束后，裸眼观察被检样品LAMP反应产物的颜色，如果颜色为绿色或黄绿色则表示检测药材中存在西红花，如果是桔色则表示检测药材不存在西红花。

本发明所提供的西红花检测方法具有以下优点：(1)检测时间短，1小时内即可获得检测结果，比现有的分子生物学检测方法缩短数小时。(2)仪器要求宽松，不需要普通PCR所用的PCR仪、电泳槽及凝胶成像系统，只要一个水浴锅即可完成检测反应，可实现现场检测。(3)操作简单，整个过程不涉及复杂的仪器设备，不需要检测人员的生物学背景知识，检测结果清晰，只用肉眼观察颜色即可判断。(4)在本发明的LAMP反应体系中，加入了一种染料钙黄绿素，该染料在反应液配置时加入，反应结束后，无需开盖，直接根据颜色变化进行结果判定，能有效的降低污染的可能性。

附图说明

图1药材西红花及其伪品LAMP反应检测结果

1：药材西红花；2：药材红花；3：玉米须；4：阴性对照(ddH₂O)

具体实施方式

本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。

实施例1、一种基于LAMP法鉴定名贵中药西红花的方法

为了建立西红花的LAMP检测方法，首先要选择西红花所特有的核苷酸序列，然后进行LAMP引物的设计和合成。研究表明西红花psbA-trnH序列(GenBank登录号：KX108704.1)可作为西红花的特异性核苷酸序列，用于西红花的鉴定和检测。通过引物设计软件

primerexplorer4.0(https://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/)设计LAMP引物。其中所设计引物序列如下：

正向外引物CS-F3：5’-TTGTATGGCCAATCATTGTG-3’

反向外引物CS-B3：5’-ATTCTATTGGACATAGAATGCC-3’

正向内引物CS-FIP：5’-ACTCAACATGAGGGAGGAGAAAGGGTATAATGGTAGATGCCCG-3’

反向内引物CS-BIP：5’-TTCCCGATAAATGATTGGCTACAAAGGAGTAATCCGCTGTGA-3’

按照上述序列进行引物LAMP合成，即可进行LAMP检测。

1.材料和方法

1.1材料

所用材料包括：药材西红花、常见混伪品(红花、玉米须)

1.2实验仪器

台式高速离心机(Eppendorf公司)、水浴锅。

1.3方法

模板DNA的提取：选取无霉变的干燥药材标本0.03g，置于粉碎机中研磨粉碎。将粉末转移到2.0mL的微量离心管中，加入900μL已灭菌的CTAB提取液(2％CTAB，100mmol/LTris-HCl pH＝8.0，20mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl)、0.02g PVP40000、10μLβ-巯基乙醇充分振荡混匀，65℃水浴1.5h-2h，期间轻摇2-3次。结束后取出冷却至室温，加入900μL氯仿-异戊醇(24∶1)，充分振荡混匀，12000×g离心10min。取上清，加入等体积氯仿-异戊醇(24∶1)，充分振荡混匀，12000×g离心10min。取上清，加入2/3体积预冷的异丙醇溶液，-20℃放置0.5h以上。取出，12000×g离心10min，弃上清，沉淀用70％乙醇洗涤两次，配制LAMP反应体系：取上述制备的DNA模板1μL，加入到如下反应体系中：2.5μL10×ThermoPol缓冲液(20mM Tris-HCl，10mM(NH4)₂SO₄，10mM KCl，2mM MgSO₄，0.1％Triton X-100)，两个内引物CS-FIP和CS-BIP的终浓度为1.6μM，两个外引物CS-F3和CS-B3的终浓度为0.2μM，dATP、dGTP、dCTP、dTTP各1.25mM，甜菜碱1M，待检样品DNA10ng，Bst DNA聚合酶8U，钙黄绿素1μL加入双蒸水使反应体系达到25μL。

按照如下程序进行LAMP反应：65℃保温50min，然后80℃保温10min。

产物鉴定：裸眼检测被检样品LAMP反应产物的颜色。

2.结果

如果颜色为绿色或黄绿色则表示检测药材中存在西红花，结果为桔色表示不含有西红花。利用上述方法鉴定药材西红花，红花，玉米须等样品，仅药材西红花显示绿色。

具体实施例2检测试剂盒

1.材料和方法

1.1材料：同具体实施例1

1.2实验仪器：同具体实施例1

1.3方法

模板DNA制备：取3mg粉碎的西红花药材，加入20μL提取试剂A，充分混匀2min；加入80μL中和试剂B，离心3min；取20μL上清；加入80μL中和试剂B，离心3min；取1μL用作模板。

LAMP扩增反应：取扩增试剂C1管，加入1μL模板DNA及8U Bst DNA聚合酶(试剂D)，1μL钙黄绿素(试剂E)混匀后在约65℃内保温50min，然后80℃保温10min。

产物鉴定：裸眼检测被检样品LAMP反应产物的颜色。

2.结果

如果颜色为绿色表示检测药材中存在西红花，如果为桔色则表示不含有西红花。

SEQUENCE LISTING

<110> 宝童（固安）生物医药有限公司

<120> 一种用于快速检测中药材西红花的LAMP引物及包含该引物的检测试剂盒

<130> 2017

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttgtatggcc aatcattgtg 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

attctattgg acatagaatg cc 22

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

actcaacatg agggaggaga aagggtataa tggtagatgc ccg 43

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttcccgataa atgattggct acaaaggagt aatccgctgt ga 42

Claims

1.一种西红花检测用引物组，所述引物组由下列引物组成：

CS-F3：TTGTATGGCCAATCATTGTG

CS-B3：ATTCTATTGGACATAGAATGCC

CS-FIP：ACTCAACATGAGGGAGGAGAAAGGGTATAATGGTAGATGCCCG

CS-BIP：TTCCCGATAAATGATTGGCTACAAAGGAGTAATCCGCTGTGA

2.一种用于西红花药材的检测方法，该方法用于检测药材中是否存在西红花，其特征在于以西红花的psbA-trnH基因GenBank登陆号：KX108704.1核酸序列为靶序列，通过LAMP法用权利要求1所述引物组选择性扩增所述靶基因，确认是否存在扩增产物。

3.根据权利要求2所述的西红花药材的检测方法，其特征在于环介导的等温扩增反应体系包括2.5μL 10×ThermoPol缓冲液，两个内引物CS-FIP和CS-BIP的终浓度为1-2μM，两个外引物CS-F3和CS-B3的终浓度为0.1-0.4μM，dATP、dGTP、dCTP、dTTP各1-2.5mM，甜菜碱0.5-3M，待检样品DNA 1-100ng，Bst DNA聚合酶5-20U，钙黄绿素1μL，反应程序扩增温度63-68℃；所述检测方法具体为：1)样品处理和模板提取，样品范围适用于西红花药材及其原植物；2)西红花的环介导等温扩增，取扩增反应液，先加待测模版，再加酶，最后加双蒸水，形成如下总体积为25μL的反应体系，混匀后在约63-68℃内保温30-70min，然后80℃保温10min；3)LAMP反应结束后，裸眼检测被检样品LAMP反应产物的颜色，如果颜色为绿色或黄绿色则表示检测药材中存在西红花，如果是桔色则表示检测药材不存在西红花。

4.一种西红花检测用试剂盒，其特征在于由提取试剂A组成为0.5M氢氧化钠、1％PVP(聚吡咯烷酮)、1％Triton X100(曲通X100)，中和试剂B组成为0.1M Tris-HCl，扩增试剂C三个组件组成，扩增试剂C每管22μL含2.5μL10×ThermoPol缓冲液，两个内引物CS-FIP和CS-BIP的1.6μM，两个外引物CS-F3和CS-B3，0.2μM，dATP、dGTP、dCTP、dTTP各1.25mM，甜菜碱1M，13.9μL双蒸水，试剂D为LAMP扩增所用Bst DNA聚合酶，试剂E组成为钙黄绿素终浓度2.5μM；该试剂盒使用方法具体为：1)模板DNA制备：取1-3mg粉碎的样品，加入20μL提取试剂A，充分混匀2min；加入80μL中和试剂B，离心3min；取20μL上清；加入80μL中和试剂B，离心3min；取1μL用作模板；2)LAMP反应及检测：取扩增试剂C1管，加入1μL模板DNA及8U Bst DNA聚合酶及1μL实际E，混匀后在约63-68℃内保温30-70min，然后80℃保温10min；据权利要求3所述的西红花检测方法观察LAMP反应产物颜色判别是否存在西红花。