CN102766624A

CN102766624A - 用于检测转基因玉米Bt176转化体特异性序列的引物组、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN102766624A
Application number: CN2012102424076A
Authority: CN
Inventors: 刘唐书; 肖维威; 张宝; 周琳华; 佘之韵; 朱文亮; 梁宇斌
Original assignee: Guangdong Testing Institute of Product Quality Supervision
Current assignee: Guangdong Testing Institute of Product Quality Supervision
Priority date: 2012-07-12
Filing date: 2012-07-12
Publication date: 2012-11-07

Abstract

本发明公开了用于检测转基因玉米Bt176转化体特异性序列的引物组、试剂盒及方法。本发明设计了2对LAMP引物组，引物组1检测内参照基因zSSIIb，可检出样品中的玉米成分，同时可排除假阴性结果；引物组2检测Bt176的转化体特异性序列，该序列为插入的外源基因与植物基因组连接的边界序列，具有高度特异性，可有效检出Bt176转基因玉米成分。本试剂盒用于样品检测分析时分别设置了阳性对照、空白对照和内对照，可避免假阳性和假阴性的产生。检测不需要特殊的设备，检测成本低；检测结果通过反应液的颜色变化用肉眼观察即可进行判定，鉴定简便，结果可视化，适用于现场快速检测及基层大样本量的筛查，易于大范围的推广应用。

Description

用于检测转基因玉米Bt176转化体特异性序列的引物组、试剂盒及方法

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种用于检测转基因玉米Bt176转化体特异性序列的引物组、试剂盒及方法。

背景技术

随着转基因生物的迅速发展，其安全性在全球范围内引起激烈的争论与普遍关注。为保障消费者的知情权和选择权，世界上许多国家和地区都制定了相应的法律和法规，加强对进出口转基因产品的管理，这给为转基因生物安全监管提供技术支撑的转基因检测工作带来更大的挑战。检测转基因产品的方法有很多，主要分为针对外源蛋白质的检测与针对外源核酸的检测两大类。但转基因产品，经过多道程序加工处理，绝大部分蛋白质已经被变性、破坏，检出率较低。所以针对外源核酸的检测更为普遍。

转基因产品中转入的外源核酸一般包括启动子、标记基因、目的基因和终止子，针对这些基因进行扩增分析可筛选检测待检样品中的转基因成分。根据检测靶标的不同，转基因产品的检测方法分为筛查法、基因特异性检测法、结构特异性检测法、转化事件特异性检测法4个层次，检测的特异性由低到高。转化事件特异性检测法是针对插入的外源序列与植物基因组连接的边界序列（即转化体特异性序列）进行检测。由于插入位点的唯一性，转化事件特异性检测具有更高的特异性和准确性，不仅可判断待检样品中是否含有转基因成分，而且还可具体鉴定待检样品含有何种转基因品系，因此相比其它3种方法具有更好的特异性。

转基因玉米Bt176具有抗鳞翅目尤其是玉米螟等害虫及耐草胺磷除草剂的抗性，自1995年在美国准许无限制种植以来，Bt176玉米已经在许多国家和地区大面积种植并作为食品和饲料广泛应用。

目前国内外已建立了多种检测转基因玉米Bt176的普通PCR法、荧光定量PCR法，这些方法都需要特特殊的试剂（如荧光探针）和复杂昂贵的仪器（如PCR仪、real-time PCR仪），不适于现场的快速检测和基层的普及使用。

环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是由日本荣研化学株式会社Notomi T等于2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法。该技术利用一种具有链置换活性的Bst DNA聚合酶在恒温条件（65℃左右）保温30-60分钟，即可实现核酸的大量扩增。其特点是操作简单、快速、特异性高、成本低廉，故被广大研究者认为是可能替代PCR的新的核酸扩增技术。

因此针对转基因玉米Bt176建立一种高特异性、适于大范围推广应用的转化事件特异性检测方法具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种转基因玉米Bt176及其加工品的检测引物组。

本发明的另一个目的在于提供一种转基因玉米Bt176及其加工品的检测试剂盒。

本发明的另一个目的在于提供一种转基因玉米Bt176及其加工品的检测方法。

本发明所采用的技术方案是：

转基因玉米Bt176及其加工品的检测引物组，包括引物组1和引物组2，其中，引物组1包括外引物zSSIIb-F3、zSSIIb-B3和内引物zSSIIb-FIP、zSSIIb-BIP，序列如下：

zSSIIb- F3：TGACCGTTAGCAATGGCTAC（SEQ ID NO:1）；

zSSIIb- B3：AGCGTCTCGAACGTGTAGT（SEQ ID NO:2）；

zSSIIb-FIP：ATGCCCTGCAGCTTCCAGTCGGGGAGCTGAAGACTTCGGAA（SEQ ID NO:3）；

zSSIIb-BIP： CGTGAACGGCATCGACATGAGCTGGTGTAGTCGTCGGAGTG（SEQ ID NO:4）；

引物组2包括外引物Bt176-F3、Bt176-B3和内引物Bt176-FIP、Bt176-BIP，序列如下：

Bt176-F3：CGGCTTCAAGCACGGGA（SEQ ID NO:5）；

Bt176-B3：GAGGGAGAGAGAGGGAGC（SEQ ID NO:6）；

Bt176-FIP ：AGGACCGGACGGGGCAGTACACTGGCATGACGTGGGTT（SEQ ID NO:7）；

Bt176- BIP：TCTCCTCCATTGATGCACGCCGGGGGAAGGGAGAAACGG（SEQ ID NO:8）。

转基因玉米Bt176及其加工品的检测试剂盒，包括：（1）上述的引物组1；（2）引物组2；（3）Bst DNA聚合酶；（4）LAMP反应液；（5）染色剂；（6）内对照；（7）阳性对照。

引物组1中外引物和内引物的添加摩尔比为1:8；所述引物组2中外引物和内引物的添加摩尔比为1:8。

LAMP反应液，由0. 2 mol/L Mg₂SO₄、25 mmol/L dNTP、10×Bst buffer、5 mol/L 甜菜碱按1：4：10：20的比例配比而成。

染色剂为SYBR Green。

内对照为含有玉米内参照基因zSSIIb（SEQ ID NO:9）的重组质粒；阳性对照为含有转基因玉米Bt176转化体特异性序列（SEQ ID NO:10）的重组质粒。

内对照和阳性对照的重组质粒的载体为pMDl8-T载体。

利用上述试剂盒检测转基因玉米Bt176及其加工品的方法，包括如下步骤：

（1）提取纯化待检样品DNA；

（2）LAMP法检测；

LAMP法检测玉米内参照基因zSSIIb：设置样品管（加样品DNA）、内对照（加含有zSSIIb基因的重组质粒DNA）、空白对照（加灭菌去离子水）， 25μL反应体系含有：引物组1外引物对0.2μmol/L，内引物对1.6μmol/L ，Bst DNA聚合酶0.32U/μL，LAMP反应液9μL，待检样品DNA50ng，用灭菌去离子水补齐到25μl。将配制好的反应管混匀后离心，并于65℃反应50min，并在80℃持续10min；反应完毕后，往反应管中加入染色剂，混匀，根据显色结果来判断待检样品中是否含有zSSIIb基因；

LAMP法检测转基因玉米Bt176转化体特异性序列：设置样品管（样品DNA）、阳性对照（含有转基因玉米Bt176转化体特异性序列的重组质粒DNA）、空白对照（灭菌去离子水）， 25μL反应体系含有：引物组2外引物对0.2μmol/L，内引物对1.6μmol/L ，Bst DNA聚合酶0.32U/μL，反应液9μL，待检样品DNA50ng，用灭菌去离子水补齐到25μl。将配制好的反应管混匀后离心，并于65℃反应50min，并在80℃持续10min；反应结束后，往反应管中加入染色剂，混匀，根据显色结果来判断待检样品中是否含有转基因玉米Bt176转化体特异性序列；

（3）结果判断：如果步骤（2）中内对照、阳性对照呈阳性，空白对照呈阴性，而样品zSSIIb基因检测呈阳性、转基因玉米Bt176转化体特异性序列检测呈阳性，则表明待检样品含有转基因玉米Bt176成分。

本发明的有益效果在于：

1、本发明设计了2对LAMP引物组，引物组1检测内参照基因zSSIIb，可检出样品中的玉米成分，同时可排除假阴性结果；引物组2检测Bt176的转化体特异性序列，该序列为插入的外源基因与植物基因组连接的边界序列，具有高度特异性，可有效检出Bt176转基因玉米成分。

2、本发明所述的试剂盒自行研制了阳性对照物和内对照物，用于样品检测分析时分别设置了阳性对照、空白对照和内对照，可避免假阳性和假阴性的产生。

3、本发明的检测试剂盒是在恒温下进行扩增检测，一台恒温水浴锅就能满足实验要求，不需要特殊的设备，检测成本低；检测结果通过反应液的颜色变化通过肉眼观察即可进行判定，鉴定简便，结果可视化；适用于现场快速检测及基层大样本量的筛查，易于大范围的推广应用。

附图说明

图1是本发明检测方法的显色结果示意图（1，绿色，阳性；2，橙色，阴性）；

图2是转化体特异性序列的敏感性分析结果（1：2copies/μl，2：20copies/μl，3：200copies/μl，4：2000copies/μl，5：20000copies/μl，6：200000copies/μl，7：2000000copies/μl）。

图3是特异性分析结果(A引物组1检测结果：1.转基因玉米Bt176，2.非转基因玉米，3.转基因水稻TT51-1，4.转基因油菜RT73，5.转基因甜菜H7-1，6.转基因玉米MON810，7. 抗草甘膦转基因大豆，8.内对照，9.空白对照；B引物组2检测结果：1. 转基因玉米Bt176，2.非转基因玉米，3.转基因水稻TT51-1，4.转基因油菜RT73，5.转基因甜菜H7-1，6.转基因玉米MON810，7. 抗草甘膦转基因大豆，8.阳性对照，9.空白对照)。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件操作，例如Sambrook等编著的分子克隆：实验室手册(New York ：Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：转基因玉米Bt176检测试剂盒的研制

本发明的转基因玉米Bt176检测试剂盒由（1）Bst DNA聚合酶；（2）引物组1；（3）引物组2；（4）反应液；（5）染色剂（SYBR Green）；（6）内对照；（7）阳性对照组成，其中Bst DNA聚合酶、反应液、显色液等可由相应公司购买，而检测引物组、内对照和阳性对照物为自行研制。

一、实验材料

转基因玉米Bt176

二、试剂

Bst DNA 聚合酶、10×Bst buffer购自美国New England Biolabs公司；甜菜碱购自美国Sigma公司；dNTP、MgSO4分析纯、Premix Taq DNA聚合酶、pMD18-T载体、DNA分子量Marker、转基因基因组DNA提取试剂盒（GMO DetectionVer.2.0）购自宝生物工程(大连)有限公司；质粒小提试剂盒购自OMEGA公司；DH5ɑ菌株为本实验室保存；引物由上海英潍捷基生物工程技术服务有限公司合成。

三、主要仪器设备

C1000型PCR仪(Bio-Rad Laboratories，Inc.)

Gel型凝胶成像系统(Bio-Rad Laboratories，Inc.)

Biophotometer plus紫外分光光度计(Eppendorf，Inc.)

其他仪器包括：恒温水浴锅，离心机，恒温培养箱，电子天平，微量移液器等。

四、实验方法和过程

1、引物组的设计

通过GenBank查询和检索相关国内外文献资料获得转基因玉米Bt176的内参照基因zSS

b（GenBank AF019297）和转化体特异性序列（GenBank AJ878607.1）。根据获得的序列信息，利用在线http://primerexplorer.jp/e/PrimerExploerV4 软件分别设计了2组引物，分别用于扩增zSS

b基因和转基因玉米Bt176转化体特异性序列。zSS

b基因扩增引物包括外引物zSS

b-F3、zSS

b-B3和内引物zSS

b-FIP、zSS

b-BIP；转化体特异性序列扩增引物由外引物Bt176-F3、Bt176-B3和内引物Bt176-FIP、Bt176-BIP组成。引物序列见表1.

2、内对照和阳性对照的制备

2. 1总DNA提取

（1)称取1g转基因玉米Bt176标准品至50mL离心管中。

（2)加入10 mL65℃预热的CTAB提取缓冲液和RNase A酶，颠倒混匀后于65℃温育30min，期间颠倒混匀离心管2-3次，12000 rpm离心机，离心10min，转移2-4mL上清液至10mL离心管中。

（3)加入与上清等体积的三氯甲烷，颠倒混匀后，12000 rpm离心机，离心10min，转移上清液至10mL离心管中。

(4)加入2×体积的CTAB沉淀液，颠倒混匀后，室温静置1h；12000 rpm离心机，离心10min，弃上清。

（5)向沉淀中加入400μL氯化钠溶液，使沉淀溶解，转移溶解液至1.5mLEppendorf离心管。

（6)在溶解液中加入等体积三氯甲烷，颠倒混匀，用12000 rpm离心机，离心10min，转移上层水相至1.5mLEppendorf离心管。

（7) 加入0.6倍体积4℃预冷的异丙醇，颠倒混匀后，4℃下静置30 min，4℃12000 rpm离心机，离心10min，小心弃去上清液。

（8）加入700μL4℃预冷的70%乙醇，倾斜离心管，轻转数圈后，4℃12000 rpm离心机，离心10min，小心弃去上清液。

（9）重复一次，室温或核酸真空干燥系统中挥干液体。

（10）加50μLTE缓冲溶液溶解，调整浓度至100μg/mL，-20℃保存备用。

2. 2 PCR扩增

2.2.1内对照zSS

b基因的PCR扩增

利用表1中的引物zSSb-F3和zSS

b-B3，以转基因玉米Bt176标准品基因组DNA为模板，进行PCR扩增，反应体系和程序见表2和表3，获得190bp的zSS

b基因（SEQ ID NO:9）。

2.2.2阳性对照转化体特异性序列的PCR扩增

以转基因玉米Bt176标准品基因组DNA为模板，利用表1中的引物Bt176-F3和Bt176-B3进行PCR扩增，反应体系和程序见表2和表3。获得199bp的转化体特异性序列（SEQ ID NO:10）。

2. 3内对照和阳性对照的构建

按照pMDl8-T载体试剂盒说明书，将zSSb基因和转化体特异性序列的PCR产物分别构建到载体上，并转化DH5a感受态菌株，构建重组质粒pMDl8-zSS

b和pMDl8-Bt176。利用菌落PCR对重组菌株进行鉴定，通过测序分析确定重组质粒中的外源序列与预期一致。

2. 4内对照和阳性对照的制备

按照质粒提取试剂盒说明书提取质粒pMDl8-zSS

b和pMDl8-Bt176分别作为本发明试剂盒的内对照和阳性对照物。紫外分光光度仪检测质粒DNA纯度和浓度，用超纯水将质粒DNA稀释至50μg/mL。

实施例2：转基因玉米Bt176检测试剂盒的应用

一、实验材料

转基因玉米Bt176。

非转基因玉米。

其他转基因材料：转基因油菜RT73、转基因甜菜H7-1、转基因水稻TT51-1、转基因玉米MON810、抗草甘膦转基因大豆

二、试剂

Bst DNA 聚合酶、10×Bst buffer购自美国New England Biolabs公司；甜菜碱购自美国Sigma公司；dNTP、MgSO4分析纯、转基因基因组DNA提取试剂盒（GMO DetectionVer.2.0）购自宝生物工程(大连)有限公司；引物由上海英潍捷基生物工程技术服务有限公司合成。

三、主要仪器设备

Gel型凝胶成像系统(Bio-Rad Laboratories，Inc.)

Biophotometer plus紫外分光光度计(Eppendorf，Inc.)

四、实验方法和过程

1、试剂盒检测体系的建立

1.1内对照检测体系的建立

利用表1中的引物组1，以pMDl8-ZSSIIB重组质粒DNA为模板，进行LAMP扩增，反应体系和程序见表4和表5。

1.2阳性对照检测体系的建立

利用表1中的引物组2，以pMDl8-Bt176重组质粒DNA为模板，进行LAMP扩增，反应体系和程序见表6和表7。

2、试剂盒的使用说明

2. 1样品DNA 的提取

（1）称取1g样品至50mL离心管中。

（2）加入10 mL65℃预热的CTAB提取缓冲液和Rnase A酶，颠倒混匀后于65℃温育30min，期间颠倒混匀离心管2-3次，12000 rpm离心机，离心10min，转移2-4mL上清液至10mL离心管中。

（3）加入与上清等体积的三氯甲烷，颠倒混匀后，12000 rpm离心机，离心10min，转移上清液至10mL离心管中。

（4）加入2×体积的CTAB沉淀液，颠倒混匀后，室温静置1h；12000 rpm离心机，离心10min，弃上清。

（5）向沉淀中加入400μL氯化钠溶液，使沉淀溶解，转移溶解液至1.5mLEppendorf离心管。

（6）在溶解液中加入等体积三氯甲烷，颠倒混匀，用12000 rpm离心机，离心10min，转移上层水相至1.5mLEppendorf离心管。

（7）加入0.6倍体积4℃预冷的异丙醇，颠倒混匀后，4℃下静置30 min，4℃12000 rpm离心机，离心10min，小心弃去上清液。

（9）重复一次，室温或核酸真空干燥系统中挥干液体。

2. 2样品DNA 的检测

每个样品需同时分别进行引物组1（按检测体系1进行）和引物组2（按检测体系2进行）的扩增检测。检测体系1设置内对照和空白对照，检测体系2设置阳性对照和空白对照。阳性对照和内对照反应液呈绿色，结果为阳性，说明2个检测体系正常；空白对照反应液呈绿色，结果为阴性，说明系统无污染，可排除假阳性结果。样品检测体系1扩增反应液呈绿色，结果为阳性，说明样品中含有大豆成分，样品提取的DNA质量过关，可排除检测体系2的假阴性结果；样品检测体系1扩增反应液呈橙色，结果为阴性，说明样品中不含大豆成分。样品检测体系2扩增反应液呈绿色，结果为阳性，说明样品中含抗草甘膦转基因大豆成分；样品检测体系2扩增反应液呈橙色，结果为阴性，说明样品中不含抗草甘膦转基因大豆成分（图1）。

敏感性分析

将提取的pMDl8-Bt176重组质粒DNA，测定其纯度和浓度，并按公式：质粒拷贝数=质粒质量(g)／(质粒分子碱基对数(bp)×660)×6.02×10²³，将浓度转换成以拷贝数作为计量单位后，按10倍倍比的梯度稀释标准质粒分子，依次配制成2000000copies/μl，200000copies/μl，20000 copies/μl，2000copies/μl，200copies/μl，20copies/μl，2copies/μl七个梯度的标准溶液。按照1.2的方法进行扩增检测，确定试剂盒的检测灵敏度为200copies/μl（图2）。

特异性分析

提取转基因玉米Bt176、非转基因玉米、抗草甘膦转基因大豆、转基因油菜RT73、转基因甜菜H7-1、转基因水稻TT51-1、转基因玉米MON810的基因组DNA，使用分光光度计确定其浓度和纯度后，按照1.1和1.2的方法进行zSS

b基因和转基因玉米Bt176转化体特异性序列的扩增检测，结果只在转基因玉米Bt176、非转基因玉米、转基因玉米MON810中检测到zSS

b基因，仅在转基因玉米Bt176中检测到Bt176转化体特异性序列，说明该试剂盒具有高效的特异性（图3）。

以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。

<110> 广东产品质量监督检验研究院

<120> 用于检测转基因玉米Bt176转化体特异性序列的引物组、试剂盒及方法

<130>

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgaccgttag caatggctac 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agcgtctcga acgtgtagt 19

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgccctgca gcttccagtc ggggagctga agacttcgga a 41

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgtgaacggc atcgacatga gctggtgtag tcgtcggagt g 41

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cggcttcaag cacggga 17

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gagggagaga gagggagc 18

<210> 7

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aggaccggac ggggcagtac actggcatga cgtgggtt 38

<210> 8

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tctcctccat tgatgcacgc cgggggaagg gagaaacgg 39

<210> 9

<211> 190

<212> DNA

<213> 转基因玉米Bt176

<400> 9

tgaccgttag caatggctac atgtgggagc tgaagacttc ggaaggcggg tggggcctcc 60

acgacatcat aaaccagaac gactggaagc tgcagggcat cgtgaacggc atcgacatga 120

gcgagtggaa ccccgctgtg gacgtgcacc tccactccga cgactacacc aactacacgt 180

tcgagacgct 190

<210> 10

<211> 191

<212> DNA

<213> 转基因玉米Bt176

<400> 10

cggcttcaag cacgggaact ggcatgacgt gggtttctgg cagctggact tcagcctgcc 60

ggtactgccc cgtccggtcc tgcccgtcac cgagatctga tgttctctcc tccattgatg 120

cacgccatca atggccttga agccttggcc gaccgtttct cccttccccc tgggctccct 180

ctctctccct c 191

Claims

1.转基因玉米Bt176及其加工品的检测引物组，包括引物组1和引物组2，其中，引物组1包括外引物zSSIIb-F3、zSSIIb-B3和内引物zSSIIb-FIP、zSSIIb-BIP，序列如下：

zSSIIb- F3：TGACCGTTAGCAATGGCTAC（SEQ ID NO:1）；

zSSIIb- B3：AGCGTCTCGAACGTGTAGT（SEQ ID NO:2）；

zSSIIb-FIP：ATGCCCTGCAGCTTCCAGTCGGGGAGCTGAAGACTTCGGAA（SEQ ID NO:3）；

zSSIIb-BIP： CGTGAACGGCATCGACATGAGCTGGTGTAGTCGTCGGAGTG（SEQ ID NO:4）；

Bt176-F3：CGGCTTCAAGCACGGGA（SEQ ID NO:5）；

Bt176-B3：GAGGGAGAGAGAGGGAGC（SEQ ID NO:6）；

Bt176-FIP：AGGACCGGACGGGGCAGTACACTGGCATGACGTGGGTT（SEQ ID NO:7）；

Bt176- BIP：TCTCCTCCATTGATGCACGCCGGGGGAAGGGAGAAACGG（SEQ ID NO:8）。

2.转基因玉米Bt176及其加工品的检测试剂盒，包括：（1）权利要求1所述的引物组1；（2）权利要求1所述的引物组2；（3）Bst DNA聚合酶；（4）LAMP反应液；（5）染色剂；（6）内对照；（7）阳性对照。

3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，引物组1中外引物和内引物的添加摩尔比为1:8；所述引物组2中外引物和内引物的添加摩尔比为1:8。

4.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的LAMP反应液，由0. 2 mol/L Mg₂SO₄、25 mmol/L dNTP、10×Bst buffer、5 mol/L 甜菜碱按1：4：10：20的比例配比而成。

5.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述染色剂为SYBR Green。

6.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的内对照为含有玉米内参照基因zSSIIb（SEQ ID NO:9）的重组质粒；所述阳性对照为含有转基因玉米Bt176转化体特异性序列（SEQ ID NO:10）的重组质粒。

7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，内对照和阳性对照的重组质粒的载体为pMDl8-T载体。

8.利用权利要求2的试剂盒检测转基因玉米Bt176及其加工品的方法，包括如下步骤：

（1）提取纯化待检样品DNA；

（2）LAMP法检测；

LAMP法检测zSSIIb基因：设置样品管（加样品DNA）、内对照（加含有zSSIIb基因的重组质粒DNA）、空白对照（加灭菌去离子水）， 25μL反应体系含有：引物组1外引物对0.2μmol/L，内引物对1.6μmol/L ，Bst DNA聚合酶0.32U/μL，LAMP反应液9μL，待检样品DNA50ng，用灭菌去离子水补齐到25μl；将配制好的反应管混匀后离心，并于65℃反应50min，并在80℃持续10min；反应完毕后，往反应管中加入染色剂，混匀，根据显色结果来判断待检样品中是否含有zSSIIb基因；

LAMP法检测转基因玉米Bt176转化体特异性序列：设置样品管（样品DNA）、阳性对照（含有转基因玉米Bt176转化体特异性序列的重组质粒DNA）、空白对照（灭菌去离子水）， 25μL反应体系含有：引物组2外引物对0.2μmol/L，内引物对1.6μmol/L ，Bst DNA聚合酶0.32U/μL，反应液9μL，待检样品DNA50ng，用灭菌去离子水补齐到25μl；将配制好的反应管混匀后离心，并于65℃反应50min，并在80℃持续10min；反应结束后，往反应管中加入染色剂，混匀，根据显色结果来判断待检样品中是否含有转基因玉米Bt176转化体特异性序列；