CN101892293A - 环介导等温扩增技术LAMP检测霍乱弧菌mdh基因及其检测试剂盒 - Google Patents

环介导等温扩增技术LAMP检测霍乱弧菌mdh基因及其检测试剂盒 Download PDF

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loop
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匡燕云
叶卫翔
范放
朱海
吕敬章
赵芳
洪小柳
刘慧玲
万志刚
马淑棉
黄李华
宋志强
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Original Assignee
Food Inspection & Quarantine Technology Center Of Shenzhen Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

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Abstract

本发明属于生物技术应用领域，用于测定微生物，涉及一种基于环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术的霍乱弧菌快速检测技术。本发明通过计算机软件分析霍乱弧菌保守和特异性基因序列，设计出四条引物完全与识别的靶序列中六个结合区匹配，该方法利用一种链置换DNA聚合酶-Bst(Bacillus stearothermophilus)DNA polymerase在恒温(65℃)的条件下反应1小时即可完成核酸扩增反应，通过荧光染色直接目测比色就可以得到清晰的反应结果，进而确定标本中是否存在霍乱弧菌。该试剂盒内有环介导等温扩增反应液、Bst DNA聚合酶、显色剂；反应液含有反应缓冲液、dNTP、硫酸镁、上游内引物、下游内引物、上游外引物、下游外引物和甜菜碱；检测霍乱弧菌的方法包括细菌DNA的提取、霍乱弧菌的环介导等温扩增、显色检测。其特点是特异性、敏感性高、检测时间短和检测成本比普通PCR低。

Description

环介导等温扩增技术LAMP检测霍乱弧菌mdh基因及其检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术应用领域，涉及一种基于环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification LAMP)的食源性病原体快速检测方法。
背景技术
霍乱弧菌的检测一般采用荧光PCR基因诊断技术，但远远不能满足霍乱弧菌快速诊断的要求。国内常用的方法为常规PCR检测，但传统PCR检测技术易出现假阳性，人为因素大，不能达到快速准确查清细菌性食源性疾病病因的目的。基于环介导等温扩增技术(LAMP)的检测试剂盒检测霍乱弧菌的优点是快速、特异性强、灵敏度高且成本低。不需要长时间的温度循环，不需要PCR等昂贵的仪器，不需要繁琐的电泳紫外观察等过程。
发明内容
本发明的目的是提供一种霍乱弧菌快速检测试剂盒及其检测方法。本发明通过计算机软件分析霍乱弧菌保守和特异性基因序列，选择霍乱弧菌的管家基因mdh gene为靶基因，设计出四条引物与靶基因的六个区域完全匹配。mdh gene GenBank登陆号：AF 343303，所述引物与所述靶基因的95位～285位的核酸序列的一部分或其互补链互补。本发明通过提供一种对霍乱弧菌特定基因片段具有特异性的引物组，及其用包含有上述引物组的试剂盒检测标本中是否存在霍乱弧菌特定基因片段，进而确定标本中是否存在霍乱弧菌。本发明的优点是快速、特异性强、灵敏度高且成本低。本发明涉及的霍乱弧菌快速检测试剂盒，其中的试剂包括如下(1)～(3)：
(1)环介导等温扩增反应液：
含有10×Thermopol反应缓冲液、300～500μMdNTP、6～10mM硫酸镁。1.2～1.6μM上游内引物、1.2～1.6μM下游内引物、0.2～0.3μM上游外引物、0.2～0.3μM下游外引物和0.2～0.6M甜菜碱；
上游内引物为：
5-GCTTTCACAATGCCAGCGTTCATTTTGTTTCTGCGGGTGTTGCA-3、
下游内引物为：
5-TTGCTGTGGTGTGTCCGAAGGTTTTGGGACCGTTGTGTTCACTG-3、
上游外引物为：GGTGCGGATGTGGTTCTG；
下游外引物为：AGCACTTCGGCTGCGATA
(2)Bst DNA聚合酶：8U/μL；
(3)显色剂：为10％的荧光染料SYBR GREEN I。
上面所述环介导等温扩增(LAMP)反应液每管共有22μL，其最佳组成为：2.5μL 10×Thermopol反应缓冲液、1μL 10mmol/LdNTP(四种脱氧核糖核酸的混合物)、2μL 20pmol/μL上游内引物(FIP)、2μL 20pmol/μL下游内引物(BIP)、1μL 5pmol/μL上游外引物(F3)、1μL 5pmol/μL下游外引物(B3)、8μL 25mmol/LMgSO4、2μL 5mol/L甜菜碱和2.5μLddH2O。
使用上述试剂盒检测霍乱弧菌的方法，依次包括下列步骤(1)～(3)：
(1)待检样品或细菌DNA的提取：
提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA OD260/OD280在1.6～2.0范围内，浓度在10～100ng/μL范围内。
(2)进行霍乱弧菌的环介导等温扩增反应：
A.在装有22μL LAMP反应液的反应管中加入2μL待检模板DNA，于恒温95℃放置3～5min，立即置于冰上1～3min；
B.然后在反应管中加入1μL Bst DNA聚合酶，并于恒温60～65℃扩增反应45～90min；
C.将温度调到80～95℃中止反应，3～5min后取出待检。
(3)显色检测：
在上述待检的每个反应管中加入1μL显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，反应液颜色变为绿色，说明待检样品含有或为霍乱弧菌。
具体实施方式
下列实施例进一步说明本发明，但不应当作对本发明的限制。
实施例1
按下列配方制作霍乱弧菌的环介导等温扩增试剂盒：
(1)LAMP反应液：
2.5μL 10×Thermopol反应缓冲液、1μL 10mmol/L dNTP(四种脱氧核糖核酸的混合物)、2μL20pmol/μL上游内引物(FIP)、2μL 20pmol/μL下游内引物(BIP)、1μL 5pmol/μL上游外引物(F3)、1μL 5pmol/μL下游外引物(B3)、8μL 25mmol/LMgSO4、2μL 5mol/L甜菜碱和2.5μL ddH2O。
其中所述的上游内引物：
5-GCTTTCACAATGCCAGCGTTCATTTTGTTTCTGCGGGTGTTGCA-3、
下游内引物：
5-TTGCTGTGGTGTGTCCGAAGGTTTTGGGACCGTTGTGTTCACTG-3
上游外引物：5-GGTGCGGATGTGGTTCTG-3、
下游外引物：5-AGCACTTCGGCTGCGATA-3
其中混合物dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP∶dATP∶dGTP∶dCTP＝1∶1∶1∶1。
(2)BStDNA聚合酶：8U/μL；
(3)显色剂：为10％的荧光染料SYBRGREEN I。
按照以下(1)～(3)程序进行检测：
(1)样品DNA的提取
检测霍乱弧菌(Vibrio cholerae)，菌种为标准菌株M045。使用PE公司液体工作站提取样品DNA，DNA OD260/OD280能够达到1.8，浓度达到20ng/μL
(2)进行菌样的环介导等温扩增反应：
A.在装有22μL LAMP反应液的反应管中加入2μL待检模板DNA，于，95℃放置5min，立即置于冰上1min；
B.在上述反应管中加入1μL Bst DNA聚合酶，并于恒温水浴上65℃扩增反应1小时；
C.将水浴调到80℃中止反应，3min后取出待检；
(3)显色检测：
在上述待检的每个反应管中加入1μL显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，反应液颜色变为绿色，说明待检样品为霍乱弧菌。
实施例2
按下列配方制作霍乱弧菌的环介导等温扩增试剂盒：
(1)LAMP反应液：
2.5μL 10×Thermopol反应缓冲液、1μL 10mmol/L dNTP(四种脱氧核糖核酸的混合物)、2μL20pmol/μL上游内引物(FIP)、2μL20pmol/μL下游内引物(BIP)、1μL 5pmol/μL上游外引物(F3)、1μL 5pmol/μL下游外引物(B3)、8μL25mmol/LMgSO4、2μL 5mol/L甜菜碱和2.5μL ddH2O。
其中所述的上游内引物、下游内引物、上游外引物、下游外引物同上。
上述混合物dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比同上。
(2)BStDNA聚合酶：8U/μL；
(3)显色剂：为10％的荧光染料SYBRGREEN I。
按照以下(1)～(3)程序进行检测：
(1)样品DNA的提取
检测霍乱弧菌(Vibrio cholerae)，菌种为标准菌株M045。使用水煮法提取样品DNA，DNAOD260/OD280能够达到1.8，浓度达到20ng/μL。
(2)进行菌样的环介导等温扩增反应：
A.在装有22μL LAMP反应液的反应管中加入2μL待检模板DNA，于，95℃放置5min，立即置于冰上1min；
B.在上述反应管中加入1μL BstDNA聚合酶，并于恒温水浴上65℃扩增反应1小时；
C.将水浴调到80℃中止反应，3min后取出待检；
(3)显色检测：
在上述待检的每个反应管中加入1μL显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，反应液颜色变为绿色，说明待检样品为霍乱弧菌。
核苷酸序列表
<110>深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心
<120>环介导等温扩增技术LAMP检测霍乱弧菌mdh基因及其检测试剂盒
<160>4
<210>1
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<221>prim_bind
<222>(1)…(44)
<400>1
GCTTTCACAATGCCAGCGTTCATTTTGTTTCTGCGGGTGTTGCA    44
<210>2
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<221>prim_bind
<222>(1)…(44)
<400>2
TTGCTGTGGTGTGTCCGAAGGTTTTGGGACCGTTGTGTTCACTG    44
<210>3
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<221>prim_bind
<222>(1)…(18)
<400>3
GGTGCGGATGTGGTTCTG  18
<210>4
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<221>prim_bind
<222>(1)…(18)
<400>4
AGCACTTCGGCTGCG ATA  18

Claims (3)

1.一种霍乱弧菌快速检测试剂盒，其特征在于其中的试剂包括下列(1)～(3)：
(1)环介导等温扩增反应液：
包括10×Thermopol反应缓冲液、300～500μM dNTP、6～10mM硫酸镁(MgSO4)、1.2～1.6μM上游引内物(FIP)、1.2～1.6μM下游内引物(BIP)、0.2～0.3μM上游外引物(F3)、0.2～0.3μM下游外引物(B3)和0.2～0.6M甜菜碱；其中10×Thermopol反应缓冲液含有200mM pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCL)、100mM氯化钾(KCL)、100mM硫酸铵((NH4)2SO4)、20mM硫酸镁MgSO4和1％曲拉通X-100(TritonX-100)；
其中上游内引物：
5-GCTTTCACAATGCCAGCGTTCATTTTGTTTCTGCGGGTGTTGCA-3、
下游内引物：
5-TTGCTGTGGTGTGTCCGAAGGTTTTGGGACCGTTGTGTTCACTG-3、
上游外引物：5-GGTGCGGATGTGGTTCTG-3、
下游外引物：5-AGCACTTCGGCTGCGATA-3、
(2)BstDNA聚合酶：8U/μL；
(3)显色剂：为10％的荧光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。
2.根据权利要求1中所述的霍乱弧菌快速检测试剂盒，其特征是上述的dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP∶dATP∶dGTP∶dCTP＝1∶1∶1∶1。
3.使用上述试剂盒检测霍乱弧菌的方法，其特征是依次包括下列步骤(1)～(3)：
(1)待检样品或细菌DNA的提取：提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA OD260/OD280在1.6～2.0范围内，浓度在10～100ng/μL范围内；
(2)进行霍乱弧菌的环介导等温扩增反应：A.在装有22μL LAMP反应液的反应管中加入2μL待检样品模板DNA，于恒温95℃放置3～5min，立即置于冰上1～3min；B.然后在反应管中加入1μL BStDNA聚合酶，并于恒温65℃扩增反应45～90min；C.将温度调到80℃中止反应，3～5min后取出待检；
(3)显色检测：在待检的上述每个反应管中加入1μL显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，反应液颜色变为绿色，说明待检样品含有或为霍乱弧菌。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103361414A (zh) * 2013-03-20 2013-10-23 冯家望 肠致病性大肠杆菌的lamp检测引物组、试剂盒及检测方法
CN106636381A (zh) * 2016-12-07 2017-05-10 广西壮族自治区兽医研究所 一种霍乱弧菌环介导等温扩增试剂盒及其应用
CN109055500A (zh) * 2018-09-13 2018-12-21 中国人民解放军疾病预防控制所 一种基于分子信标的荧光环介导等温扩增方法
CN110592250A (zh) * 2019-11-01 2019-12-20 中国人民解放军总医院 用于检测肠道致病菌的lamp引物组合及其应用
CN112301108A (zh) * 2020-11-06 2021-02-02 中山大学 一种数字环介导等温扩增的方法

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103361414A (zh) * 2013-03-20 2013-10-23 冯家望 肠致病性大肠杆菌的lamp检测引物组、试剂盒及检测方法
CN103361414B (zh) * 2013-03-20 2015-01-07 冯家望 肠致病性大肠杆菌的lamp检测引物组、试剂盒及检测方法
CN106636381A (zh) * 2016-12-07 2017-05-10 广西壮族自治区兽医研究所 一种霍乱弧菌环介导等温扩增试剂盒及其应用
CN109055500A (zh) * 2018-09-13 2018-12-21 中国人民解放军疾病预防控制所 一种基于分子信标的荧光环介导等温扩增方法
CN110592250A (zh) * 2019-11-01 2019-12-20 中国人民解放军总医院 用于检测肠道致病菌的lamp引物组合及其应用
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