CN103361414A - 肠致病性大肠杆菌的lamp检测引物组、试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及肠致病性大肠杆菌的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法，其中，LAMP检测引物组包括下列引物：外引物F3：GGTAATACTAACACCGCA；外引物B3：ATGAGGATATCTACATGCAGTTG；内引物FIP：TCAAGGTTGTTGCACTAACACATGTTTGGTTACTATCTGAGTAT；内引物BIP：GACTCTAGTTGTTGTTAATATCTCTAGCAGTACTATTAGCGC。
Description
【技术领域】
本发明属于生物检测领域，具体涉及肠致病性大肠杆菌(EPEC)的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法。
【背景技术】
大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)为革兰氏阴性无芽孢短杆菌，大小0.5×1～3μm，多数具周身鞭毛，能运动，能发酵多种糖类产酸、产气，是人和大多数温血动物肠道中的正常栖居菌，其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长，减少蛋白质分解产物对人体的危害，还能合成维生素B和K，以及有杀菌作用的大肠杆菌素。普通大肠杆菌正常栖居条件下不致病，但若进入腹腔、胆囊、膀胱等处可引起腹膜炎、胆囊炎、膀胱炎等肠道外感染。大肠杆菌在肠道中大量繁殖，几占粪便干重的1/3。在环境卫生不良的情况下，常随粪便散布在周围环境中。若在水和食品中检出此菌，可认为是被粪便污染的指标，从而可能有肠道病原菌的存在，因此，是饮用水和食物(或药物)的卫生学标准。
大肠杆菌的抗原成分复杂，可分为菌体抗原(O)、鞭毛抗原(H)和表面抗原(K)，后者有抗机体吞噬和抗补体的能力。根据菌体抗原的不同，可将大肠杆菌分为150多型，其中有16个血清型致病性强，引起腹泻，统称致病性大肠杆菌，也称为致泻性大肠杆菌，根据不同的生物学特性可将其分为5类：肠道致病性大肠杆菌(EPEC)、肠道产毒素性大肠杆菌(ETEC)、肠道侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠道出血性大肠杆菌(EHEC)、肠道黏附性大肠杆菌(EAEC)。其中，大肠杆菌O157:H7血清型属肠出血性大肠杆菌，大肠杆菌O157:H7引起肠出血性腹泻，约2％～7％的病人会发展成溶血性尿毒综合征，儿童与老人最容易出现后一种情况。致病性大肠杆菌通过污染饮水、食品、娱乐水体引起疾病暴发流行，病情严重者，可危急生命。自1982年由美国首次报道了大肠杆菌O157:H7引起的出血性肠炎的爆发以来，包括我国等许多国家都有报道，且日见增加，日本近年来因食物污染该菌导致的数起大暴发，格外引人注目，在美国和加拿大通常分离的肠道致病菌中，目前它已排在第二或第三位，已经成为世界性问题。世界卫生组织已将大肠杆菌O157:H7列为新的食源性疾病病原菌。
普通大肠杆菌和致病性大肠杆菌的传统检测方法需要2d的初发酵、2d的复发酵或增菌，再进行及后续的菌落纯化分离、生理生化鉴定以及血清学鉴定等，由于其耗时费力、步骤繁琐等不足之处，已经愈来愈跟不上人类对致病微，生物快速、简易、高特异性的鉴定要求。因此，在分子生物学水平上来研究普通大肠杆菌和致病性大肠杆菌的核酸结构和分子特征，可以大大提高对病原菌的检测和研究能力，提高检测工作效率。
目前，分子生物学检测方法中，核酸扩增法是最有效的工具之一。环媒等温核酸扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)方法，是一种新型等温核酸扩增法，为快速基因检测提供了一种新的技术途径，已具有成功应用的现实性，在食品安全检测、流行性病毒检测、临床诊断，以及水产养殖等领域的应用及研究已有文献报道。由于环媒等温核酸扩增的扩增过程依赖识别靶序列六个独立区域，所以对于微生物的鉴定具有高效率、高特异性、高敏感性等特点。此外，环媒等温核酸扩增的核酸扩增过程是在等温条件下进行，普通水浴锅或有稳定热源的设备就能满足反应要求，使检测成本大大降低，而PCR则需要昂贵的PCR仪进行一定温度程序的核酸扩增，因而，环媒等温核酸扩增比PCR对仪器设备要求低、检测成本也较低，更具推广性，可望作为常规检测工具。
【发明内容】
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种肠致病性大肠杆菌的LAMP检测引物组，其对肠致病性大肠杆菌具有良好的特异性。
本发明要解决的第二个技术问题是提供一种肠致病性大肠杆菌的LAMP检测试剂盒，其便于对肠致病性大肠杆菌进行LAMP检测。
本发明要解决的第三个技术问题是提供一种肠致病性大肠杆菌的LAMP检测方法，其具有特异性良好、灵敏较好、检测快速可靠、操作简单的特点。
上述第一个技术问题通过以下技术方案实现：
肠致病性大肠杆菌的LAMP检测引物组，其特征在于，包括下列引物：
外引物F3：GGTAATACTAACACCGCA；
外引物B3：ATGAGGATATCTACATGCAGTTG；
内引物FIP：
TCAAGGTTGTTGCACTAACACATGTTTGGTTACTATCTGAGTAT；
内引物BIP：
GACTCTAGTTGTTGTTAATATCTCTAGCAGTACTATTAGCGC。
通过实验证明，本发明提供的LAMP检测引物组对肠致病性大肠杆菌具有良好的特异性，该LAMP检测引物组针对的靶基因片段是肠致病性大肠杆菌的bfpA基因。
上述第二个技术问题通过以下技术方案实现：
肠致病性大肠杆菌的LAMP检测引试剂盒，其特征在于，包括以下成分：
还包括显色剂。所述显色剂为荧光染料SYBR Green I。
本发明提供的LAMP检测试剂盒集合了上述LAMP检测引物及LAMP检测的相关用料，便于使用者对肠致病性大肠杆菌进行LAMP检测。
上述第三个技术问题通过以下技术方案实现：
肠致病性大肠杆菌的LAMP检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(101)对待检样品提取待检模板DNA；
(102)进行环媒等温核酸扩增反应(LAMP反应)：
配置LAMP反应体系，每25μL体积的LAMP反应体系具体为：
；将LAMP反应体系置于LAMP浊度仪中进行63℃恒温反应90min，然后在80℃下保温5min。
通过实验证明，本发明提供的LAMP检测方法结合上述引物的良好特异性及LAMP方法的优点，具有以下特点：灵敏度较好、快速可靠、操作简单、鉴定简单。
【附图说明】
图1为实施例二中进行特异性实验的结果示意图；
图2为实施例三中进行灵敏度实验的结果示意图。
【具体实施方式】
实施例一
本实施例提供的肠致病性大肠杆菌的LAMP检测引物组，其包括下列引物：
外引物F3：GGTAATACTAACACCGCA；
外引物B3：ATGAGGATATCTACATGCAGTTG；
内引物FIP：
TCAAGGTTGTTGCACTAACACATGTTTGGTTACTATCTGAGTAT；
内引物BIP：
GACTCTAGTTGTTGTTAATATCTCTAGCAGTACTATTAGCGC。
该引物组针对的靶基因是肠致病性大肠杆菌的bfpA基因。
本实施例提供的肠致病性大肠杆菌的LAMP检测试剂盒，其包括以下成分：
本实施例提供的对待检样品进行LAMP检测的方法，具体包括以下步骤：
(101)对待检样品提取待检模板DNA；
采用DNA提取试剂盒(离心柱型)提取DNA，按照试剂盒提供的说明书进行操作，革兰氏阳性菌先用溶菌酶处理后再用DNA提取试剂盒提取DNA；
取5μL DNA溶液加ddH2O梯度稀释至1mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260nm和280nm处的光密度值。DNA的浓度按照以下公式计算获得：
C＝A×N×50/1000
式中：
C——DNA浓度(μg/μL)
A——260nm处的吸光值
N——核酸稀释倍数
1OD260nm＝50μg/mL双链DNA
当OD260/OD280比值在1.7～1.9之间时，适宜于PCR扩增和LAMP检测。
(102)进行环媒等温核酸扩增反应(LAMP反应)：
配置总体积为25μL的LAMP反应体系，具体为：
，将LAMP反应体系置于LAMP浊度仪中进行63℃恒温反应90min，然后在80℃下保温5min；
(103)结果判断，可以通过以下两种方式中一种进行：
第一种方式：通过观察反应管内沉淀的浊度变化来判断扩增结果，若出现沉淀为阳性，若没出现沉淀为阴性；
第二种方式是：在上述反应管中分别加入1-2μL显色剂，通常用量为2μL，显色剂可采用荧光染料SYBR Green I，混匀，若呈绿色为阳性，呈橙色则为阴性。
当然，结果判断的手段可采用本领域技术人员所掌握并可用于此结果判断的常规技术手段。
实施例二
本实施例主要对实施例一提供的肠致病性大肠杆菌的LAMP检测引物组进行LAMP引物特异性的鉴定。
分别提取表1中的编号为1-7的菌株的DNA作为LAMP反应中的待检模板DNA另外操作实施例一中所述的步骤(102)；以超纯水作为阴性对照，代替LAMP反应中的待检模板DNA另外操作实施例一中所述的步骤(102)。
表1大肠杆菌菌株
实验结果如图1，CH1线、CH2线、CH3线、CH4线、CH5线、CH6线、CH7线分别对应表1中的编号为1-7的菌株，CH8线对应ddH2O；从实验结果来看，LAMP检测引物组只对肠致病性大肠杆菌(EPEC)特异检出。
另外，本设计人还多种菌株对上述引物组进行LAMP特异性试验，具体数据如表2。
表2大肠杆菌菌株的LAMP特异性试验数据
实施例三
本实施例主要对实施例一提供的肠致病性大肠杆菌的LAMP检测进行灵敏度的评价。
为了评价LAMP方法的检测灵敏度，将编号ATCC43887的肠致病性大肠杆菌(EPEC)菌株的DNA分别稀释成五个浓度分别为107CFU/mL、106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL、102CFU/mL、101CFU/mL的DNA溶液，每个稀释度分别取2μl作为LAMP反应中的待检模板DNA操作实施例一中所述的步骤(102)；以ddH2O代替DNA模板作为阴性对照，代替LAMP反应中的待检模板DNA另外操作实施例一中所述的步骤(102)。
实验结果见图2，CH11线、CH12线、CH13线、CH14线、CH15线、CH16线、CH18线分别对应于稀释度为107CFU/mL、106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL、102CFU/mL、101CFU/mL的DNA溶液，CH18线对应于超纯水；从实验结果来看，本发明提供的LAMP检测方法的检出限均为103CFU/mL。
因此，从上面实验数据来看，引物组的特异性较好，使用上述引物组LAMP检测的灵敏度好；而且，相对于PCR方法，检测时间较短、操作方便。
本发明不局限于上述实施例，基于上述实施例的、未做出创造性劳动的简单替换，应当属于本发明揭露的范围。
序列表
<110>
<120>肠致病性大肠杆菌的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法
<130>冯家望；王小玉；胡松楠
<160>4
<170>PatentIn version3.5
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
GGTAATACTAACACCGCA 18
<210>2
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
ATGAGGATATCTACATGCAGTTG 23
<210>3
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
TCAAGGTTGTTGCACTAACACATGTTTGGTTACTATCTGAGTAT 44
<210>4
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
GACTCTAGTTGTTGTTAATATCTCTAGCAGTACTATTAGCGC 42
Claims (5)
1.肠致病性大肠杆菌的LAMP检测引物组，其特征在于，包括下列引物：
外引物F3：GGTAATACTAACACCGCA；
外引物B3：ATGAGGATATCTACATGCAGTTG；
内引物FIP：
TCAAGGTTGTTGCACTAACACATGTTTGGTTACTATCTGAGTAT；
内引物BIP：
GACTCTAGTTGTTGTTAATATCTCTAGCAGTACTATTAGCGC。
2.肠致病性大肠杆菌的LAMP检测引试剂盒，其特征在于，包括以下成分：
3.根据权利要求2所述的肠致病性大肠杆菌的LAMP检测引试剂盒，其特征在于，还包括显色剂。
4.根据权利要求3所述的肠致病性大肠杆菌的LAMP检测引试剂盒，其特征在于，所述显色剂为荧光染料SYBR Green I。
5.肠致病性大肠杆菌的LAMP检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(101)对待检样品提取待检模板DNA；
(102)进行环媒等温核酸扩增反应：
配置LAMP反应体系，每25μL体积的LAMP反应体系具体为：
；将LAMP反应体系置于LAMP浊度仪中进行63℃恒温反应90min，然后在80℃下保温5min。
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| CN101892293A (zh) * | 2009-05-22 | 2010-11-24 | 深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心 | 环介导等温扩增技术LAMP检测霍乱弧菌mdh基因及其检测试剂盒 |
| CN102851384A (zh) * | 2012-09-24 | 2013-01-02 | 黑龙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 四种致腹泻性大肠杆菌的多重pcr检测方法及其引物组 |
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2013
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Non-Patent Citations (2)
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|---|
| 杨小鹃: "环介导等温扩增核酸技术及其在食品安全检测领域的应用", 《微生物学通报》, vol. 37, no. 8, 20 August 2010 (2010-08-20) * |
| 王凤英等: "母乳及婴儿食品对致病性大肠杆菌粘附的影响", 《第三军医大学学报》, vol. 23, no. 4, 30 April 2001 (2001-04-30), pages 478 - 480 * |
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