CN103014156B - 粪肠球菌的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种粪肠球菌的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和试剂盒。该检测引物组为：上游外引物为F3：5’-GCCATTCCTCATGGAACAG-3’；下游外引物B3：5’-CCACGTTATCCATATCACTACA-3’；上游内引物FIP：5’-CGGTGCCAAAATTAACACCCTTTAGTGAAAAAATCAGGAATCTGTG-3’；下游内引物BIP：5’-TGCTACCGTATTATTTGGGATTGCAAAGTGCAATTTGTTGGACTA-3’。本发明的检测方法具有灵敏度高、特异性强、准确率好、检测时间短的优点，从样品处理到报告结果只需花12h，不需要PCR仪和电泳仪，操作过程简单，比其他PCR技术具有更高的特异性，适合基层检测机构和饮用水加工企业自检使用。
Description
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种粪肠球菌的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和试剂盒。
背景技术：
粪肠球菌（Enterococcus faecalis）又叫粪链球菌，是革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性的球菌，是肠球菌属的代表菌种，为条件致病菌，普遍存在于水环境中，由于其可以抵抗多边的不利环境如氯处理、城市污水处理、高盐和具有耐热性，因此可以在水中存活很长时间。粪肠球菌是水体受到粪便污染的重要指示菌，更能客观地反映水质的卫生状况，在各种淡水和海水中，粪肠球菌引起的疾病已超过了大肠菌群。为此，美国环境保护协会（USEPA）、国际食品法典委员会（CAC）、国际标准化组织（ISO）以及中华人民共和国城镇建设行业标准在对城市供水、饮用水水质监测中增加了水中粪肠球菌等致病菌检测指标。我国新修订的GB8537-2008《饮用天然矿泉水》亦明确规定粪肠球菌不得检出，即将出台的包装饮用水国家标准也需要检测该指标。
国内外已有因粪肠球菌污染引起的食物中毒报告，对粪肠球菌的耐药性机制亦进行了深入探索，但在饮用水中其污染状况和快速检测技术方面的研究报道相对较少。目前，国内外标准中通用的方法是KF链球菌培养基结合滤膜法。水样过滤后将滤膜转移到KF培养基上培养48h，若滤膜上有红色或粉红色菌落，进行纯培养基和进一步生化鉴定，检测方法繁琐，整个检测过程大约3-5天，灵敏度低，且不能满足现场快速检测的需要，特别是大批量水样的快速检测。因此，十分必要研制新型快速检测技术，缩短检测时间，提高水样检测效率。
LAMP技术是2000年Notomi等开发的一种新型核酸扩增技术，针对待测靶基因的6个区域设计4-6条特异性引物，在BstDNA聚合酶的作用下，在65℃左右等温条件1h内可以进行特异高效快速的核酸扩增，达到109拷贝，扩增结果可直接观察焦磷酸镁沉淀或者加入显色剂进行判断。LAMP方法与PCR技术相比，检测时间短，具有更高的灵敏度和特异性，操作简单，仅仅需要普通水浴锅就可以完成检测。近年来已广泛用于疾病预防和病原检测等方面。
发明内容：
本发明的第一目的是提供一种快速、特异好、灵敏高的应用环介导等温扩增检测粪肠球菌（Enterococcus faecalis）的检测引物组，利用该检测引物组可以特异性的检测粪肠球菌。
本发明在筛选粪肠球菌mtlF、EF0027和groES靶基因的基础上，通过筛选和优化引物，建立了一种LAMP扩增方法，通过摸索样品前处理条件（增菌），将样品处理技术结合LAMP技术有机结合，建立了粪肠球菌的快速检测方法，该方法的应用对于饮用水快速检测和保障饮用水质量安全具有重要意义，从而实现了本发明的目的。
本发明的应用环介导等温扩增检测粪肠球菌（Enterococcus faecalis）的检测引物组，其特征在于，由下列引物组成：
上游外引物为F3：5’-GCCATTCCTCATGGAACAG-3’（如SEQ ID NO.1所示）；
下游外引物B3：5’-CCACGTTATCCATATCACTACA-3’（如SEQ ID NO.2所示）；
上游内引物FIP：5’-CGGTGCCAAAATTAACACCCTTTAGTGAAAAAATCAGGAATCTGTG-3’（如SEQ ID NO.3所示）；
下游内引物BIP：5’-TGCTACCGTATTATTTGGGATTGCAAAGTGCAATTTGTTGGACTA-3’（如SEQ ID NO.4所示）。
本发明的第二个目的是提供一种非疾病的诊断和治疗目的的粪肠球菌的检测方法，其特征在于，对样品进行增菌培养获得增菌液，提取增菌液中的细菌DNA，然后通过环介导等温扩增的方法用上述检测引物组对细菌DNA进行选择性扩增，确认是否存在有扩增产物。
所述的样品优选为水样品，进一步优选为饮用水样品。
所述的对样品进行增菌培养优选是将饮用水样品过0.45μm的滤膜，将滤膜移至脑心浸液肉汤（BHI）中培养，36℃±1℃培养10h，获得增菌液。
所述的通过环介导等温扩增的方法用上述检测引物组对细菌DNA进行选择性扩增具体为：环介导等温扩增体系为体系总体积25μL，包括2.5μL 10×Thermopol反应缓冲液、0.4μL10mmol/LdNTPs、0.5μL 10μmol/L上游外引物F3、0.5μL 10μmol/L下游外引物B3、1μL40μmol/L上游内引物FIP、1μL 40μmol/L下游内引物BIP、0.6μL100mmol/L MgSO4、12.5μL2mol/L甜菜碱、2μL灭菌双蒸水ddH2O，1μL Bst DNA聚合酶（8U/μL）和3μL细菌DNA模板，反应条件为在温度为60~65℃孵育45~60min。
所述的确认是否存在有扩增产物可以利用电泳检测、荧光显色检测或浊度检测环介导等温扩增反应产物是否具有扩增产物，优选用荧光显色检测，具体是在80℃终止反应1~2min，在扩增反应管中加入SYBR Green Ⅰ显色剂，1~5min后观察结果，如果颜色为橙色，则样品粪肠球菌阴性，无粪肠球菌，如果颜色为绿色，则样品粪肠球菌阳性，含有粪肠球菌。
所述的10×Thermopol反应缓冲液是现有技术中的物质，可以从试剂公司购买到，其含有200mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl）、100mmol/L氯化钾（KCl）、100mmol/L硫酸铵（NH4）2SO4、20mmol/L硫酸镁（MgSO4）和1%曲拉通X-100（TtitonX-100），余量为水。
本发明的第三个目的是提供一种粪肠球菌的检测试剂盒，包括环介导等温扩增试剂和检测引物组，其特征在于，所述的检测引物组由下列引物组成：
上游外引物为F3：5’-GCCATTCCTCATGGAACAG-3’；
下游外引物B3：5’-CCACGTTATCCATATCACTACA-3’；
上游内引物FIP：5’-CGGTGCCAAAATTAACACCCTTTAGTGAAAAAATCAGGAATCTGTG-3’；
下游内引物BIP：5’-TGCTACCGTATTATTTGGGATTGCAAAGTGCAATTTGTTGGACTA-3’。
所述的粪肠球菌的检测试剂盒还包括脑心浸液肉汤（BHI）。
本发明针对粪肠球菌的mtlF特异性基因设计特异性引物，具有较强的特异性，适于粪肠球菌的检测。本发明针对粪肠球菌的mtlF基因，设计和筛选了一套特异性检测引物组以及含有该检测引物组的检测试剂盒和利用该检测试剂盒通过环介导等温扩增的检测方法，进而确定待检测样品中是否存在粪肠球菌的检测方法。本发明的检测试剂盒和检测方法具有灵敏度高、特异性强、准确率好、检测时间短的优点，从样品处理到报告结果只需花12h，不需要PCR仪和电泳仪，操作过程简单，比其他PCR技术具有更高的特异性（PCR不能屎肠球菌），特别适合基层检测机构和饮用水加工企业自检使用，对于饮用水快速检测和保障饮用水质量安全具有重要意义。
附图说明：
图1是纯菌灵敏度实验中的PCR扩增产物的电泳结果：1：阴性对照；2：7.4ⅹ100CFU/ml；3：7.4x101CFU/ml；4：7.4x102CFU/ml；5：7.4x103CFU/ml；6：7.4x104CFU/ml；7：7.4x105CFU/ml；8：阳性对照；9：DL2000；
图2是mtlF-PCR灵敏度实验的PCR扩增产物的电泳结果：1：7.4ⅹ100CFU/ml；2：7.4ⅹ101CFU/ml；3：7.4ⅹ102CFU/ml；4：7.4ⅹ103CFU/ml；5：7.4ⅹ104CFU/ml；6：7.4ⅹ105CFU/ml；7：DL2000；8：阳性对照；9：阴性对照。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：水源水中粪肠球菌检测
1、水样过滤
取250mL水样无菌操作滤过0.45μm滤膜，将滤膜转移到30ml脑心浸液肉汤（BHI）中培养，36℃±1℃培养10h，获得细菌培养物。
2、细菌DNA的提取
取1mL细菌培养物于12000r/min离心5min，弃上清，收集菌体，加入50μL TE充分悬浮混匀，于100℃水浴10min，冰浴3min，12000r/min离心5min，取上清备用，即得到细菌DNA。
3、LAMP扩增
环介导等温扩增体系为体系总体积25μL，包括2.5μL 10×Thermopol反应缓冲液、0.4μL10mmol/L dNTPs、0.5μL 10μmol/L上游外引物F3、0.5μL 10μmol/L下游外引物B3、1μL40μmol/L上游内引物FIP、1μL 40μmol/L下游内引物BIP、0.6μL100mmol/L MgSO4、12.5μL2mol/L甜菜碱、2μL灭菌双蒸水ddH2O，1μL Bst DNA聚合酶（8U/μL）和3μL细菌DNA模板，反应条件为在温度为60℃孵育60min。
LAMP检测引物为：
上游外引物为F3：5’-GCCATTCCTCATGGAACAG-3’
下游外引物B3：5’-CCACGTTATCCATATCACTACA-3’
上游内引物FIP：5’-CGGTGCCAAAATTAACACCCTTTAGTGAAAAAATCAGGAATCTGTG-3’
下游内引物BIP：5’-TGCTACCGTATTATTTGGGATTGCAAAGTGCAATTTGTTGGACTA-3’。
80℃终止反应1-2min，取出反应管。
4、显色剂观察
在反应管中加入1μL 10%的SYBR Green Ⅰ显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，反应管颜色变为绿色[阴性对照（大肠杆菌8099的基因组DNA）橙色，阳性对照（粪肠球菌ATCC29212的基因组DNA）绿色]，说明样品有粪肠球菌污染。这与传统生化鉴定方法检测结果吻合，证明此方法数据可靠。
实施例2：瓶装水中粪肠球菌检测
取250ml瓶装水水样按照实施例1的方法进行LAMP检测，只是LAMP的反应温度为65℃孵育45min，其他与实施例1相同。
结果为：反应管颜色变为橙色（阴性对照（大肠杆菌8099的基因组DNA）橙色，阳性对照（阳性菌株粪肠球菌ATCC29212的基因组DNA）绿色），说明样品没有粪肠球菌污染。这与传统生化方法检测结果吻合，证明此方法数据可靠。
实施例3：
一、LAMP方法靶基因的筛选
本发明以粪肠球菌的mtlF、EF0027和groES共3个靶基因设计LAMP引物，如表1所示，利用这些LAMP引物对粪肠球菌（CMCC32223、ATCC29212）和屎肠球菌（E.Faecium）ATCC19434进行环介导等温扩增，具体步骤如下：
表1：LAMP引物
对粪肠球菌（CMCC32223）、粪肠球菌（ATCC29212）和屎肠球菌（E.Faecium）ATCC19434分别用胰蛋白胨大豆肉汤TSB 37℃培养24h后得细菌培养物，参照实施例1的方法提取细菌DNA，由此分别得到粪肠球菌（CMCC32223）、粪肠球菌（ATCC29212）和屎肠球菌（E.Faecium）ATCC19434的细菌DNA。
LAMP扩增：环介导等温扩增（LAMP）反应体系为25μL，包括：2.5μL 10×Thermopol反应缓冲液、0.4μL 10mmol/LdNTPs、0.5μL 10μmol/L上游外引物F3、0.5μL 10μmol/L下游外引物B3、1μL 40μmol/L上游内引物FIP、1μL 40μmol/L下游内引物BIP、0.6μL100mmol/LMgSO4、12.5μL 2mol/L甜菜碱、2μL灭菌双蒸水ddH2O，1μL Bst DNA聚合酶（8U/μL）和3μL细菌DNA模板，反应条件为在温度为65℃孵育45min。80℃终止反应1-2min，取出反应管。本实施例中的上游外引物F3、下游外引物B3、上游内引物FIP、下游内引物BIP是表1中的相配套的针对mtlF、EF0027和groES共3个靶基因设计LAMP引物，用这些相配套的LAMP引物分别对粪肠球菌（CMCC32223）、粪肠球菌（ATCC29212）和屎肠球菌（E.Faecium）ATCC19434的细菌DNA进行环介导等温扩增（LAMP）扩增。
显色剂观察：在反应管中加入1μL10%的荧光染料SYBR GREEN Ⅰ显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，如颜色为橙色，阴性，如颜色变为绿色，阳性，检测结果如表2所示。
表2：LAMP靶基因的筛选
从表2可以看出，mtlF对2株粪肠球菌阳性，屎肠球菌阴性，可以用于粪肠球菌的检测；EF0027对2株粪肠球菌阳性，屎肠球菌弱阳性，不容易区分；groES虽然能检测粪肠球菌（CMCC32223）和屎肠球菌（ATCC19434），但对粪肠球菌（ATCC29212）阴性，容易造成漏检，因此，本发明选择基于mtlF基因建立LAMP快速检测方法。
二、LAMP方法的特异性
收集粪肠球菌及非粪肠球菌48株，其中2株粪肠球菌标准株和10株分离株。肠球菌属的屎肠球菌、耐久肠球菌等13株菌，非肠球菌属的其他23株菌。将菌株在胰蛋白胨大豆肉汤TSB（副溶血性弧菌在3.5%氯化钠营养肉汤）37℃培养24h后，分别取1mL细菌培养物于12000r/min离心5min，弃上清，收集菌体，加入50μL TE充分悬浮混匀，于100℃水浴10min，冰浴3min，12000r/min离心5min，取上清备用，由此分别得到48株的细菌DNA。
LAMP扩增：环介导等温扩增（LAMP）反应体系为25μL，包括：2.5μL10×Thermopol反应缓冲液、0.4μL 10mmol/LdNTPs、0.5μL 10μmol/L上游外引物F3、0.5μL 10μmol/L下游外引物B3、1μL 40μmol/L上游内引物FIP、1μL 40μmol/L下游内引物BIP、0.6μL100mmol/LMgSO4、12.5μL 2mol/L甜菜碱、2μL灭菌双蒸水ddH2O，1μL Bst DNA聚合酶（8U/μL）和3μL细菌DNA模板，反应条件为在温度为65℃孵育45min。80℃终止反应1-2min，取出反应管。
LAMP扩增所用的引物为：
上游外引物为F3：5’-GCCATTCCTCATGGAACAG-3’
下游外引物B3：5’-CCACGTTATCCATATCACTACA-3’
上游内引物FIP：5’-CGGTGCCAAAATTAACACCCTTTAGTGAAAAAATCAGGAATCTGTG-3’
下游内引物BIP：5’-TGCTACCGTATTATTTGGGATTGCAAAGTGCAATTTGTTGGACTA-3’。
分别以上述48株细菌的基因组DNA进行按照上述方法进行LAMP扩增，80℃终止反应1-2min，取出反应管。
显色剂观察：在反应管中加入1μL10%的荧光染料SYBR GREEN Ⅰ显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，如颜色为橙色，阴性，如颜色变为绿色，阳性。结果如表3所示，由表3可以看出，利用本发明的环介导等温扩增检测粪肠球菌（Enterococcus faecalis）的检测引物组，按照本发明的检测方法进行检测，其具有较好的特异性，对2株粪肠球菌标准株和10株分离株阳性；对肠球菌属的屎肠球菌、耐久肠球菌等13株菌阴性；对非肠球菌属的其他23株菌阴性，而利用PCR的方法（mtlF-PCR，PCR引物为F：5’-GCCATTCCTCATGGAACAG-3’；R：5’-CCACGTTATCCATATCACTACA-3’)不能区分屎肠球菌，由此可见，本发明的LAMP检测方法其特异性比PCR高。
表3：特异性试验所用菌株
ATCC，美国模式培养物集存库；CMCC，中国普通微生物菌种保藏管理中心；NCTC：国家标准菌库（英国）；GIM：广东省微生物研究所；CAS，中国科学院。
三、LAMP方法的灵敏度
（1）纯菌灵敏度
以粪肠球菌ATCC29212为参考菌株，将其在BHI增菌液中37℃培养24h后，取1mL菌液，用灭菌生理盐水进行10倍梯度稀释，选取适宜的3个稀释度进行平板计数，每个稀释度2个平板，试验重复3次。平板计数原始菌液的浓度为7.4×108CFU/ml，按步骤二的方法提取细菌DNA，进行LAMP和PCR（引物为：PCR引物为F：5’-GCCATTCCTCATGGAACAG-3’；R：5’-CCACGTTATCCATATCACTACA-3’）扩增。
LAMP扩增所用的引物为：
上游外引物为F3：5’-GCCATTCCTCATGGAACAG-3’
下游外引物B3：5’-CCACGTTATCCATATCACTACA-3’
上游内引物FIP：5’-CGGTGCCAAAATTAACACCCTTTAGTGAAAAAATCAGGAATCTGTG-3’
下游内引物BIP：5’-TGCTACCGTATTATTTGGGATTGCAAAGTGCAATTTGTTGGACTA-3’。
以验证本发明的环介导等温扩增检测方法和常规的PCR方法的灵敏度。其结果如图1所示，从图1可以看出，本发明的环介导等温扩增检测方法（mtlF-LAMP）的灵敏度为7.4x101CFU/ml。显色剂检测结果为：1：7.4x100CFU/ml（橙色）；2：7.4x101CFU/ml（绿色）；3：7.4x102CFU/ml（绿色）；4：7.4x103CFU/ml（绿色）；5：7.4x104CFU/ml（绿色）；6：7.4x105CFU/ml（绿色）；7：阳性对照（绿色）；8：阴性对照（橙色），由此说明，本发明的环介导等温扩增检测方法（mtlF-LAMP）的灵敏度为7.4x101CFU/ml。
阴性对照为：大肠杆菌8099的基因组DNA，阳性对照为：阳性菌株粪肠球菌ATCC29212的基因组DNA。
而PCR方法（mtlF-PCR）的灵敏度为7.4ⅹ103CFU/ml（图2，琼脂糖电泳检测）），LAMP灵敏度比PCR灵敏度高100倍。
（2）人工模拟样品灵敏度实验
接种粪肠球菌标准株ATCC29212进行过夜培养，梯度稀释，平板计数。将10-8和10-72个稀释度的1ml菌液接种至250ml水样，用0.45μm滤膜过滤，将过滤后的滤膜放至30ml BHI的培养液中37℃培养10h和24h，分别吸取1mL细菌培养物于12000r/min离心5min，弃上清，收集菌体，加入50μLTE充分悬浮混匀，于100℃水浴10min，冰浴3min，12000r/min离心5min，取上清备用，即得到细菌DNA，再按照步骤二的方法进行LAMP扩增。
LAMP扩增所用的引物为：
上游外引物为F3：5’-GCCATTCCTCATGGAACAG-3’
下游外引物B3：5’-CCACGTTATCCATATCACTACA-3’
上游内引物FIP：5’-CGGTGCCAAAATTAACACCCTTTAGTGAAAAAATCAGGAATCTGTG-3’
下游内引物BIP：5’-TGCTACCGTATTATTTGGGATTGCAAAGTGCAATTTGTTGGACTA-3’。
80℃终止反应1-2min，取出反应管。显色剂观察：在反应管中加入1μL 10%的荧光染料SYBR GREEN Ⅰ显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，如颜色为橙色，阴性，如颜色变为绿色，阳性。
其结果为：1、阴性对照（橙色，阴性）；2、阳性对照（绿色，阳性）；3：7.4x100 CFU/250ml增菌10h（绿色，阳性）；4：7.4x101 CFU/250ml增菌10h（绿色，阳性）；5：7.4x100 CFU/250ml增菌24h（绿色，阳性）；4：7.4x101 CFU/250ml增菌24h（绿色，阳性）。由此可见，起始菌液为7.4 CFU/250ml时，按照本发明的环介导等温扩增检测方法进行增菌10h能检出目标菌。综上所述，本发明的检测方法灵敏度高。
阴性对照为：大肠杆菌8099的基因组DNA，阳性对照为：阳性菌株粪肠球菌ATCC29212的基因组DNA。
Claims (9)
1.一种应用环介导等温扩增检测粪肠球菌（Enterococcus faecalis）的检测引物组，其特征在于，由下列引物组成：
上游外引物为F3：5’-GCCATTCCTCATGGAACAG-3’；
下游外引物B3：5’-CCACGTTATCCATATCACTACA-3’；
上游内引物FIP：5’-CGGTGCCAAAATTAACACCCTTTAGTGAAAAAATCAGGAATCTGTG-3’；
下游内引物BIP：5’-TGCTACCGTATTATTTGGGATTGCAAAGTGCAATTTGTTGGACTA-3’。
2.一种非疾病的诊断和治疗目的的粪肠球菌的检测方法，其特征在于，对样品进行增菌培养获得增菌液，提取增菌液中的细菌DNA，然后通过环介导等温扩增的方法用权利要求1所述的检测引物组对细菌DNA进行选择性扩增，确认是否存在有扩增产物。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的样品为水样品。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述的水样品为饮用水样品。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述的对样品进行增菌培养是将饮用水样品过0.45μm的滤膜，将滤膜移至脑心浸液肉汤中培养，36℃±1℃培养10h，获得增菌液。
6.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的通过环介导等温扩增的方法用权利要求1所述的检测引物组对细菌DNA进行选择性扩增具体为：环介导等温扩增体系为体系总体积25μL，包括2.5μL 10×Thermopol反应缓冲液、0.4μL 10mmol/LdNTPs、0.5μL10μmol/L上游外引物F3、0.5μL 10μmol/L下游外引物B3、1μL 40μmol/L上游内引物FIP、1μL 40μmol/L下游内引物BIP、0.6μL100mmol/L MgSO4、12.5μL 2mol/L甜菜碱、2μL灭菌双蒸水ddH2O，1μL 8U/μL Bst DNA聚合酶和3μL细菌DNA模板，反应条件为在温度为60~65℃孵育45~60min。
7.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的确认是否存在有扩增产物选用荧光显色检测，具体是在80℃终止反应1~2min，在扩增反应管中加入SYBR Green Ⅰ显色剂，1~5min后观察结果，如果颜色为橙色，则样品粪肠球菌阴性，无粪肠球菌，如果颜色为绿色，则样品粪肠球菌阳性，含有粪肠球菌。
8.一种粪肠球菌的检测试剂盒，包括环介导等温扩增试剂和检测引物组，其特征在于，所述的检测引物组由下列引物组成：
上游外引物为F3：5’-GCCATTCCTCATGGAACAG-3’；
下游外引物B3：5’-CCACGTTATCCATATCACTACA-3’；
上游内引物FIP：5’-CGGTGCCAAAATTAACACCCTTTAGTGAAAAAATCAGGAATCTGTG-3’；
下游内引物BIP：5’-TGCTACCGTATTATTTGGGATTGCAAAGTGCAATTTGTTGGACTA-3’。
9.根据权利要求8所述的粪肠球菌的检测试剂盒，其特征在于，所述的粪肠球菌的检测试剂盒还包括脑心浸液肉汤。
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