CN114317790B - 预包装饮用水中两种致病菌的双重荧光定量pcr检测方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了预包装饮用水中两种致病菌的双重荧光定量PCR检测方法及试剂盒。所述试剂盒包含检测铜绿假单胞菌和粪链球菌的引物及探针(SEQ ID NO:1‑6)。本发明试剂盒特异性好，检测方法快速简单，准确性高，灵敏度好，为预包装饮用水中铜绿假单胞菌和粪链球菌两种致病菌检测提供了新的方法。本发明提供的双重荧光定量PCR法可以准确快速地实现饮用水中铜绿假单胞菌和粪链球菌的检测，1天内即可完成检测，具有快速、特异、敏感、高通量、稳定性好、节约试剂成本等优点，适用于饮用水标准中铜绿假单胞菌和粪链球菌两种致病菌指标。
Description
技术领域
本发明涉及荧光定量PCR检测技术，具体地说，涉及预包装饮用水中两种致病菌(铜绿假单胞菌和粪链球菌)的双重荧光定量PCR检测方法及试剂盒。
背景技术
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种常见的水源性和食源性致病菌，其进入机体内经大量增殖后可生成诸如胞外酶、内毒素、肠毒素以及溶血素等多种有害物质，致使被感染人动物的组织器官病变甚至坏死，进而引起急性胃肠炎、败血症和脑膜炎等病症，严重威胁生命健康。在人们日常生产生活中，铜绿假单胞菌在各类型水中均存在，且其对水处理中使用的消毒剂、紫外线等理化手段具有较强的抵抗力，因而容易通过饮水进入人体内造成感染。粪肠球菌(Enterococcus faecalis)主要来自人类和温血动物的粪便，与其他肠道菌相比，它们在水中存活时间更长，因此被视为粪便污染指示菌。当前，各类包装饮用水与人们的日常生活息息相关，然而由于市场上出现的相关厂家众多、品类繁杂，其产品极易因生产环节不达标而受到此两种菌的污染，直接影响到广大消费者的身体健康。据统计，目前国内外有关包装饮用水中检出铜绿假单胞菌的报道日趋增多，其受该菌污染的概率高达1.4％。因此，有关包装饮用水中铜绿假单胞菌污染的问题越来越受到社会各界关注。我国在GB 19298-2014中明确规定了包装饮用水需采用三级取样法抽样检测铜绿假单胞菌和粪链球菌，而且必须参照GB 8538-2016严格检测该菌，并明确规定各类抽检水样品中均不得检出。上述标准中给出的检测方法仍为传统的分离培养、形态学镜检观察以及生化鉴定等，且该类检测必须依托实验室并由专业人员完成，普遍存在耗时长，可疑样品至少需要2天以上、流程繁琐等弊端。随着PCR技术的发展，采用该技术用于微生物种类的鉴定成为可选方法之一。特别是多重real-time PCR技术可针对多个不同菌种设计引物和探针，可实现多个菌种检测一次完成，具有操作流程简便、灵敏度高、耗时短以及检测费用低等优势，为微生物快速检测提供了一种快速便捷的技术手段。目前，在饮用水中微生物检测的专利主要有：(1)饮用水中主要病原微生物的基因芯片及检测用试剂盒(CN101748192B)。该方法采用基因芯片，基于杂交探针检测目标微生物(12种)。虽然检测的微生物种类多，但检测对象与预包装饮用水标准要求相差较大，试剂种类繁多且采用杂交探针法，步骤繁琐，耗时，灵敏度低。(2)检测饮用水中四种致病菌的四重荧光PCR引物组、探针组、试剂盒及方法(公布号为CN 108004334 A)。该方法采用四重荧光PCR检测饮用水中大肠杆菌、铜绿假单胞菌菌、粪链球菌和产气荚膜梭菌。取样体积为1L，检出限103CFU/L，检测时间为2～3天。取样体积与预包装饮用水标准要求(250mL)不相符；检出限无法满足该标准中对致病菌限量要求(致病菌不得检出)；检测时间较长(2～3天)。因此，开发一种与预包装饮用水标准相匹配的快速检测方法及试剂盒有非常重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供预包装饮用水中两种致病菌(铜绿假单胞菌和粪链球菌)的双重荧光定量PCR检测方法及试剂盒。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一对铜绿假单胞菌特异性PCR引物(根据铜绿假单胞菌gyrB基因设计)，包括如SEQ ID NO:1所示的上游引物和如SEQ ID NO:2所示的下游引物。铜绿假单胞菌gyrB基因在GenBank中的参考序列编号为AB005881.1，SEQID NO:1和2扩增的靶区段位于gyrB基因第2286bp～2352bp，扩增片段长度为67bp。
第二方面，本发明提供一对粪链球菌特异性PCR引物(根据粪链球菌23S rDNA基因设计)，包括如SEQ ID NO:4所示的上游引物和如SEQ ID NO:5所示的下游引物。粪链球菌23S rDNA基因在GenBank中的参考序列编号为LC089874.1，SEQ ID NO:4和5扩增的靶区段位于23S rDNA基因第777bp～921bp，扩增片段长度为144bp。
第三方面，本发明提供与所述引物配合使用的荧光探针，用于检测铜绿假单胞菌的荧光探针为5’-F1-TGCAGTGGAACGACA-Q1-3’(SEQ ID NO:3)，用于检测粪链球菌的荧光探针为5’-F2-TGGTTCTCTCCGAAATAGCTTTAGGGCTA-Q2-3’(SEQ ID NO:6)。
其中，F1、F2为不同的荧光基团；Q1、Q2为荧光淬灭基团。
优选地，F1为FAM，F2为VIC。
第四方面，本发明提供含有所述引物和/或所述荧光探针的检测试剂或试剂盒。
进一步地，所述试剂盒还包括阴性模板、阳性模板和空白模板。
所述阳性模板为铜绿假单胞菌DNA、粪链球菌DNA，所述阴性模板可以是大肠埃希氏菌DNA，所述空白模板可以是灭菌水。
试剂盒中除DNA模板外，其余组分均为预冻干粉。
第五方面，本发明提供所述引物和/或所述荧光探针的以下任一应用：
1)用于检测饮用水中铜绿假单胞菌和粪链球菌；
2)用于制备铜绿假单胞菌和粪链球菌的检测试剂或试剂盒。
第六方面，本发明提供预包装饮用水中两种致病菌--铜绿假单胞菌和粪链球菌的双重荧光定量PCR检测方法，利用所述试剂盒(包含SEQ ID NO:1-6所示的引物及探针)对饮用水样品进行荧光定量PCR检测。
所述方法包括以下步骤：
1)提取待测水样中的DNA；
2)以步骤1)中提取的DNA为模板，进行荧光定量PCR反应；
3)根据反应结果判定水样中含有的致病菌种类。
优选地，荧光定量PCR反应的反应体系为：2×qPCR Master Mix 25.0μL，10μM铜绿假单胞菌上游引物2.0μL，10μM铜绿假单胞菌下游引物2.0μL，10μM粪链球菌上游引物2.0μL，10μM粪链球菌下游引物2.0μL，10μM铜绿假单胞菌荧光探针1.0μL，10μM粪链球菌的荧光探针1.0μL，DNA模板50.0μL。
优选地，荧光定量PCR反应的反应程序为：95℃5min；95℃15s，60℃30s，50个循环。
反应结果的判定包括：
(1)质控标准：阳性对照的FAM和/或VIC均有荧光对数增长，且Ct值＜30.0，阴性对照和空白对照均无荧光信号和荧光对数增长，Ct值≥50(阴性对照和空白的限值)，可进行(2)的致病菌检测；
(2)结果判定：水样中FAM和/或VIC均有荧光对数增长，且Ct值＜45.0(水样检测结果的限值)时，表明待测水样中含有铜绿假单胞菌和/或粪链球菌；若上述荧光无信号及对数生长，且Ct值≥50.0时，则不含有相应的致病菌；45＜Ct值＜50时，则需复检，若Ct值≥50.0时，检测结果为阴性；若Ct值＜50时，检测结果为阳性。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
(一)本发明将铜绿假单胞菌和粪链球菌目标基因分别选择gyrB基因和23SrDNA来设计引物和探针。gyrB基因基因是蛋白编码基因的典型代表，在近缘种和菌株的区分及鉴定方面更具进化优势。23S rDNA的各个区域的保守性差异较大，保守区和变异区具有镶嵌排列的特点。依据此两种基因设计引物进行PCR扩增，引物分辨率高，特异性强，灵敏度高。所构建的试剂盒操作简单，可满足饮用水中铜绿假单胞菌和粪链球菌检测要求。
(二)本发明提供的两重荧光定量PCR检测技术可以准确快速地实现对饮用水中铜绿假单胞菌和粪链球菌同时检测。通过将培养时间、DNA沉降剂、免疫磁珠等技术手段优化组合，尽可能增加和保留检测样品中目标菌DNA含量，实现检出限达到1CFU/250mL；预混液预冻干既节约了检测时间同时满足DNA提取体积和real-time PCR反应体积需求，将常规检验周期缩短6小时以内。该发明具有快速、特异、敏感、高通量、稳定性好、试剂成本低等优点。
(三)本发明能满足预包装饮用水产品标准中致病菌限量要求，与产品标准相匹配，具有较高的实用价值。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中双重荧光定量PCR的检测结果图。
图2为本发明较佳实施例中RNA carrier沉降菌体DNA扩增效果图。其中，1为添加RNA carrier，2为未添加RNA carrier。
具体实施方式
本发明旨在提供一种快速准确检测饮用水中铜绿假单胞菌和粪链球菌的双重荧光定量PCR方法。
为了实现本发明目的，发明人从铜绿假单胞菌和粪链球菌细菌分类学背景分析入手，依据《伯杰氏细菌鉴定手册》(2004版)对该两种细菌在分类学上已有明确定位，可进行针对性鉴定。
本发明采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供一种饮用水样品中细菌DNA的前处理方法。考虑到real-time PCR方法检出限及水产品致病菌抽检结果数量范围，选择滤膜增菌法进行检测，提高目标菌数量，进而保障该两种致病菌检出率，检测时间缩短至6h。
第二方面，本发明提供一种检测试剂预混液(模板除外)的前处理方法。考虑到缩短检测时间及配合样品中细菌DNA提取方法，选择提前预冻干检测试剂预混液，并储藏于-20℃冰箱备用。
第三方面，本发明提供一种过滤膜上微生物DNA的提取方法。为了减少DNA损失，采用DNA沉降剂(RNA carrier)结合免疫磁珠，最大程度保留样品中模板DNA含量，极大提高目标菌检出率，可满足产品标准中致病菌限量要求。
第四方面，本发明提供检测铜绿假单胞菌和粪链球菌的特异性PCR引物，包括上游引物和下游引物。粪链球菌上游引物核苷酸序列为：5‘-GAGGACCGAACCCACGTA-3’，下游引物核苷酸序列为5‘-CAGTGCTCTACCTCCATCATT-3’(SEQ ID NO:4-5)；铜绿假单胞菌上游引物核苷酸序列为：5'-GGCGTGGGTGTGGAAGTC-3’，下游引物核苷酸序列为：5'-AGAACCTGCTCTGCTTCACCA-3’(SEQ ID NO:1-2)。
第五方面，本发明提供与上述引物配合使用的荧光探针，用于检测铜绿假单胞菌的荧光探针为5’-F1-TGCAGTGGAACGACA-Q1-3’(SEQ ID NO:3)，用于检测粪链球菌的荧光探针为5’-F2-TGGTTCTCTCCGAAATAGCTTTAGGGCTA-Q2-3’(SEQ ID NO:6)。
其中，F1、F2为不同的荧光基团，Q1、Q2为荧光淬灭基团。
在本发明的一个具体实施方式中，F1为FAM，F2为VIC；Q1为TAMRA，Q2为BHQ1。
第六方面，本发明提供一种检测饮用水中铜绿假单胞菌和粪链球菌的试剂盒，所述试剂盒中含有上述引物组和/或上述荧光探针组。
第七方面，本发明提供上述引物组或上述荧光探针组以下任一应用：
1)在检测饮用水中铜绿假单胞菌和粪链球菌的应用；
2)在制备饮用水中铜绿假单胞菌和粪链球菌试剂或试剂盒中的应用。
第八方面，本发明提供一种检测饮用水中铜绿假单胞菌和粪链球菌荧光定量PCR方法，利用上述引物组和上述荧光探针组对饮用水样品进行检测。
所述方法包括以下步骤：
(1)PCR预混液冻干
将除模板DNA以外的各种PCR反应组分混合后分装至100μL体积PCR管中，其中每管中包含25.0μL 2×SuperReal PreMix、上、下游引物各2.0μL(10μM)、探针1.0μL(10μM)，先置于-80℃冰箱10min后，置于冷冻真空干燥机内真空干燥处理，待管中组分呈干粉状，取出，密封后储存于-20℃冰箱中待用。
(2)DNA提取
将250mL水样过0.45μm滤膜，并将滤膜移至TSA琼脂培养基上，于36±1℃恒温培养箱中培养4h。将滤膜卷成圆筒塞入2.0mL离心管中，加入1.0mL无菌水，在组织破碎仪上震荡3min后置于100℃恒温加热板灭活15min，冷却至室温加入20.0μL磁珠(磁珠购自天根生化科技(北京)有限公司)，在组织破碎仪上震荡3min；12000rpm离心2min，将管中液体完全吸尽并转移至新的2.0mL离心管中，加入3.0μL RNA carrier(即DNA沉降剂，购自天根生化科技(北京)有限公司)，充分颠倒混匀1min，静置3min，反复三次。将离心管置于磁力架上，吸尽上清液，加入50.0μL无菌水，混匀，置于56℃恒温加热板加热10min，将离心管置于磁力架上，吸取50.0μL DNA提取液并加入至步骤(1)PCR管中，混匀后进行荧光定量PCR反应。
(3)根据扩增结果判定样品中含有的致病菌种类。
优选地，荧光定量PCR反应的反应体系为：25.0μL 2×SuperReal PreMix、上、下游引物各2.0μL(10μM)、探针各1.0μL(10μM)，已预先冻干，50.0μL DNA提取液。
荧光定量PCR反应的反应程序为：95℃5～10min；95℃15～30s，60℃30～45s，50个循环。
优选地，荧光定量PCR反应的反应程序为：95℃5min；95℃15s，60℃30s，50个循环。
本方法每次检测样本时须设立阴性对照和阳性对照和空白对照。阴性对照选择上述两种致病菌之外的细菌源性DNA，且无FAM和VIC荧光信号检出，无Ct值，无扩增曲线；阳性对照中，铜绿假单胞菌和粪链球菌阳性对照对应只出现FAM、VIC荧光信号，各荧光信号有明显扩增曲线，且Ct值<35.0；空白对照为无菌水，且无FAM和VIC荧光信号检出，无Ct值，无扩增曲线。如果阴性对照、阳性对照及空白对照条件不满足上述条件，此次实验视为无效。
步骤(3)扩增结果的判断标准如下：水样的FAM和/或VIC有荧光扩增曲线，且Ct值＜45.0，则含有相应的铜绿假单胞菌和/或粪链球菌；若上述两种荧光无信号检出及对应的扩增曲线，且Ct值≥50，则不含有相应的两种致病菌。若45＜Ct值＜50，需重复检测，若无荧光无信号检出及对应的扩增曲线，且Ct值≥50，则不含有相应的致病菌。若Ct值＜50，有荧光信号检出及对应的扩增曲线，则含有相应的致病菌。
第九方面，本发明提供一种检测铜绿假单胞菌和粪链球菌的冻干粉试剂盒，所述试剂盒中至少含有上述引物组、上述荧光探针组以及阳性模板，所述阳性模板为铜绿假单胞菌和粪链球菌DNA。
进一步地，本发明提供所述试剂盒在荧光定量PCR检测饮用水中铜绿假单胞菌和粪链球菌中应用。
本发明的试剂盒可由多个隔断所形成，这些容器之一或多个可以装有本发明的引物组、荧光探针组及荧光定量PCR反应所需其他所有试剂(SuperReal PreMix)，该预混液是以冻干形式保存。另外，本发明的试剂盒中还可以包括实施本发明所需要的其它成分及用具，如阴性模板、阳性模板，所述阴性模板为金黄色葡萄球菌DNA，所述阳性模板为铜绿假单胞菌DNA及粪链球菌DNA。
本发明提供一种检测饮用水中铜绿假单胞菌和粪链球菌双重荧光PCR方法，该方法以饮用水中铜绿假单胞菌和粪链球菌DNA为模板，利用引物组和荧光探针组进行双重荧光定量PCR扩增，根据Ct值判定结果。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1检测饮用水中两种致病菌(铜绿假单胞菌和粪链球菌)的双重荧光PCR试剂盒的构建及验证
1、引物和探针的设计
根据GenBank公布的铜绿假单胞菌特异性gyrB基因编码区序列，设计特异性的针对铜绿假单胞菌的引物和探针，序列如下(SEQ ID NO:1-3)：
上游引物PA-F：5'-GGCGTGGGTGTGGAAGTC-3'
下游引物PA-R：5'-AGAACCTGCTCTGCTTCACCA-3'
荧光探针PA-P：5'-FAM-TGCAGTGGAACGACA-MGB-3'
根据GenBank检索到的粪链球菌23S rDNA基因编码区序列，设计特异性的针对粪链球菌的引物和探针，序列如下(SEQ ID NO:4-6)：
上游引物EF-F：5‘-GAGGACCGAACCCACGTA-3’
下游引物EF-R：5‘-CAGTGCTCTACCTCCATCATT-3’
荧光探针EF-P：5‘-VIC-TGGTTCTCTCCGAAATAGCTTTAGGGCTA-BHQ1-3’
上述引物和探针均由北京生工生物工程技术服务有限公司合成。
2、反应体系的建立
采用实施例1的引物组和2条探针，以样品提取DNA为模板，以铜绿假单胞菌和粪链球菌DNA阳性对照，以无核酸双蒸水为空白对照，以非铜绿假单胞菌和粪链球菌的细菌源性DNA为阴性对照，建立50μL双重荧光定量PCR检测体系(表1)。
表1荧光定量PCR反应体系
反应程序为：50℃2min；95℃10min；95℃30s，60℃1min，50个循环。扩增结束后，扣除本底荧光信号后取同一阈值分析数据，确定各样本的Ct值。
3、实验结果的判定
本方法每次检测样本时须设立阴性对照空白对照和阳性对照。阴性对照和空白对照无FAM和VIC荧光信号检出，无Ct值，无扩增曲线；阳性对照中，铜绿假单胞和粪链球菌阳性对照对应只出现FAM、VIC荧光信号，各荧光信号有明显扩增曲线，且Ct值<35.0；水样的FAM和/或VIC有荧光扩增曲线，且Ct值＜45.0，则含有相应的铜绿假单胞菌和/或粪链球菌；若上述两种荧光无信号检出及对应的扩增曲线，且Ct值≥50，则不含有相应的两种致病菌。若45＜Ct值＜50，需重复检测，若无荧光无信号检出及对应的扩增曲线，且Ct值≥50，则不含有相应的致病菌。若Ct值＜50，有荧光信号检出及对应的扩增曲线，则含有相应的致病菌。
实施例2特异性及灵敏度考察
1、特异性试验
采用实施例1的引物组和探针组，以铜绿假单胞菌和粪链球菌DNA为阳性对照，以沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌、李斯特菌、变形杆菌、藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌、柠檬酸杆菌、大肠埃希氏菌的DNA为阴性对照，用PCR试剂盒进行检测，评价建立的荧光PCR方法的特异性。
实验结果如图1所示除铜绿假单胞菌和粪链球菌有扩增曲线且Ct值＜30，其他动物来源模板均无扩增。可见，本发明提供的引物和探针特异性良好，与其他微生物种属无交叉反应。
2、灵敏度试验
①分别挑取TSA琼脂培养基上生长24h的铜绿假单胞菌和粪链球菌菌落于3.0mL生理盐水中，制成麦氏浊度为0.5的菌悬液(菌数为108CFU/mL)。生理盐水10倍梯度稀释，取104、103、102、101及100CFU/mL五个稀释度菌悬液1.0mL，添加到250mL的灭菌水中。按照前述方法提取DNA并进行检测。每个稀释度设立2个平行样。每个稀释度同时平板培养计数。
实验结果表明，模拟样品直接过滤后采用双重荧光PCR法检测灵敏度为102CFU/250mL。无法满足水产品标准中对致病菌限量要求。
②将①中无法检出的稀释度(101和100CFU/250mL)样品滤膜直接贴于TSA琼脂培养基上，置于36±1℃培养箱中培养分别于2h、3h和4h取出，按照前述方法提取DNA并进行检测。每个稀释度设立2个平行样。每个稀释度同时平板培养计数。
实验结果表明，滤膜培养4h后的菌量完全能达到该方法检出限。本发明建立的双重荧光PCR法最低检出灵敏度为1CFU/250mL。完全满足水产品标准中对致病菌限量要求。
实施例3 DNA沉降剂沉降DNA效果评估
以铜绿假单胞菌为例，取104稀释度菌悬液1.0mL，添加到250mL的灭菌水中。过滤后，提取滤膜上菌体DNA。两个滤膜按照前述方法提取DNA并进行检测，另外两个滤膜按照前述方法(不添加RNA carrier)提取DNA并进行检测。结果如图2所示。添加RNA carrier滤膜样品Ct值为16.6，不添加RNA carrier滤膜样品Ct值为27.1。因此，通过添加RNA carrier能够提高菌体DNA得率。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 北京市食品安全监控和风险评估中心（北京市食品检验所）
<120> 预包装饮用水中两种致病菌的双重荧光定量PCR检测方法及试剂盒
<130> KHP211121872.5
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggcgtgggtg tggaagtc 18
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agaacctgct ctgcttcacc a 21
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgcagtggaa cgaca 15
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaggaccgaa cccacgta 18
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cagtgctcta cctccatcat t 21
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tggttctctc cgaaatagct ttagggcta 29
Claims (3)
1.预包装饮用水中两种致病菌--铜绿假单胞菌和粪链球菌的双重荧光定量PCR检测方法，其特征在于，利用SEQ ID NO:1-3和SEQ ID NO:4-6所示的引物和探针组合对饮用水样品进行荧光定量PCR检测；
包括以下步骤：
1)提取待测水样中的DNA；
2)以步骤1)中提取的DNA为模板，进行荧光定量PCR反应；
3)根据反应结果判定水样中含有的致病菌种类；
步骤1)中待测水样DNA的提取方法包括：将250mL水样过0.45μm滤膜，并将滤膜移至TSA琼脂培养基上，于36±1℃恒温培养箱中培养4h；将滤膜卷成圆筒塞入2.0mL离心管中，加入1.0mL无菌水，在组织破碎仪上震荡3min后置于100℃恒温加热板灭活15min，冷却至室温加入20.0μL磁珠，在组织破碎仪上震荡3min；12000rpm离心2min，将管中液体完全吸尽并转移至新的2.0mL离心管中，加入3.0μL RNAcarrier，充分颠倒混匀1min，静置3min，反复三次；将离心管置于磁力架上，吸尽上清液，加入50.0μL无菌水，混匀，置于56℃恒温加热板加热10min，将离心管置于磁力架上，得到DNA提取液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，荧光定量PCR反应的反应体系为：2×qPCRMaster Mix 25.0μL，10μM铜绿假单胞菌上游引物2.0μL，10μM铜绿假单胞菌下游引物2.0μL，10μM粪链球菌上游引物2.0μL，10μM粪链球菌下游引物2.0μL，10μM铜绿假单胞菌荧光探针1.0μL，10μM粪链球菌的荧光探针1.0μL，DNA模板50.0μL；
荧光定量PCR反应的反应程序为：95℃5～10min；95℃15～30s，60℃30～45s，50个循环。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，反应结果的判定包括：
(1)质控标准：阳性对照的FAM和/或VIC均有荧光对数增长，且Ct值＜30.0；阴性对照和空白对照均无荧光信号和荧光对数增长，Ct值≥50，可进行(2)的致病菌检测；
(2)结果判定：水样中FAM和/或VIC均有荧光对数增长，且Ct值＜45.0时，表明待测水样中含有铜绿假单胞菌和/或粪链球菌；若上述荧光无信号及对数生长，且Ct值≥50.0时，则不含有相应的致病菌；45＜Ct值＜50时，则需复检，若Ct值≥50.0时，检测结果为阴性；若Ct值＜50时，检测结果为阳性。
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