CN104531860A

CN104531860A - 一种志贺氏菌的分子检测方法及其应用

Info

Publication number: CN104531860A
Application number: CN201410803694.2A
Authority: CN
Inventors: 王建昌; 段永生; 李静; 孙晓霞; 胡连霞; 王金凤
Original assignee: Inspection And Quarantine Testing Center Of Hebei Entry-Exit Inspection And Quarantine Bureau
Current assignee: Inspection And Quarantine Testing Center Of Hebei Entry-Exit Inspection And Quarantine Bureau
Priority date: 2014-12-23
Filing date: 2014-12-23
Publication date: 2015-04-22
Anticipated expiration: 2034-12-23
Also published as: CN104531860B

Abstract

本发明涉及一种志贺氏菌的分子检测方法，采用单引物等温扩增方法，以志贺氏菌 ipaH 基因特异序列为靶序列，SYBER GreenⅡ为荧光染料，实时荧光定量PCR检测扩增信号；本发明还涉及其应用。本发明的检测方法灵敏度高，特异性和敏感性强，对模板DNA要求较低，耗时短，方法简便。

Description

一种志贺氏菌的分子检测方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种志贺氏菌的分子检测方法及其应用。

背景技术

志贺氏菌（Shigella）是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌，通称痢疾杆菌，是一类具有高度传染性和危害严重的革兰氏阴性杆菌，长约2～3μm，不形成芽胞，无荚膜，无鞭毛，有菌毛。志贺氏菌病常为食物爆发型或经水传播，人类对志贺氏菌普遍易感，每年全球有1.6亿人患病，约有110万人死亡，绝大多数为5岁以下儿童，10～100 cfu细菌即可致病。在发展中国家，由福氏志贺氏菌引起的感染性腹泻疾病高居首位。中国自2005 年开始，在全国范围内开展菌痢的监测，该病的报告病例数一直高居全国甲乙类法定传染病的前5位。

目前食品中志贺氏菌的传统检测方法主要依据国家标准GB 4789.5-2012，需要厌氧培养、分离、筛选和生化鉴定，检测结果虽准确，但操作繁琐、检测周期长，满足不了快速检测的需求。分子生物学技术因具有检测灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，在食源性致病菌的检测中发挥了巨大的作用，也被应用于志贺氏菌的检测。随着食品安全检测标准的提高，寻找更加快速、准确、便捷的检测技术显得至关重要。

根据 Igor G 等（Igor G, Anders S, Alexander M, et al. A method for allelic replacement in Francisella tularensis [J]. FEMS microbiology letters,2003,222(2): 273-280）研究，只要10 CFU～100 CFU的志贺氏菌就可通过感染肠道而致病，引发严重的炎症反应；在幼儿可引起急性中毒性菌痢，死亡率甚高。因此检测志贺氏菌的方法是否灵敏、特异及快速至关重要。吴平芳等（吴平芳,石晓路,郑琳琳,扈庆华,李庆阁,张佳峰,庄志雄,刘小立,张顺祥,王冰,贺连华,林一曼.PCR快速检测食品中志贺氏菌方法的建立[J].中国卫生检验杂志,2006,16,(4):394-395.）建立的改良分子信标-实时PCR反应体系DNA灵敏度为93 fg/μL，对菌液灵敏度为64 CFU/mL，或2 CFU/PCR反应体系，且无交叉反应。胡建华（胡建华，李洁莉，马兆飞，陆玲. 牛奶样品中志贺氏菌的快速PCR 检测技术研究[J]. 食品科学, 2007, 28(8):433-437.）采用快速常规PCR和定量实时PCR结合，对培养液中及牛奶阳性样品中的志贺氏菌进行检测，检测敏感度可达到2 CFU/ml，检出时间小于20h。徐义刚（徐义刚,崔丽春,张昕哲,等. 志贺氏菌属环介导恒温扩增快速检测方法的建立及初步应用[J]. 中国预防兽医学报,2010,9: 691-694.）对志贺氏菌纯培养菌的LAMP检测灵敏度为28 CFU/mL，对污染食品中志贺氏菌的检测灵敏度为35 CFU/mL。曾桂芬等（曾桂芬,龙北国,姜容,等. LAMP和PCR法检测痢疾志贺菌的特异性和灵敏性比较[J]. 热带医学杂志, 2012,12(5):547-549.）检测细菌纯培养物和模拟食品的灵敏度LAMP法分别为5.3×10¹CFU/ml、6.8×10¹CFU/ml。

单引物等温扩增技术（Single primer isothermal amplification，SPIA）是近年报道的一种新型线性核酸等温扩增技术。该技术具有操作设备简单、高忠实性、高效率和有效防污染等优点。目前应用较成熟的单引物等温扩增技术均以病毒作为对象，其扩增后的检测方法为聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用此种方法检出的灵敏度低，易产生沉淀，且结果假阳性高，尤其不适应于原核微生物的扩增检出。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简单、耗时短、特异性强、灵敏度高且便于实时监控的志贺氏菌的分子检测方法，本发明还提供所述分子检测方法的应用。

本发明解决其技术问题采用的技术方案为：一种志贺氏菌的分子检测方法，采用单引物等温扩增方法，以志贺氏菌ipaH基因特异序列为靶序列，SYBER GreenⅡ为荧光染料，实时荧光检测仪检测扩增的实时荧光信号，其具体过程包括如下步骤：

（1）取含志贺氏菌的待检样品，提取基因组DNA；

（2）建立志贺氏菌的实时荧光单引物等温扩增25 μL反应体系：

RNA/DNA组合引物 5.6μmol/L、Blocker 0.36μmol/L、10×Bst Buffer 2.5μL、Bst DNA polymerase 20U、10×RNaseH Buffer 2.5μL、RNaseH 5U、dNTPs 0.2 mmol/L、MgCl2 3.5mmol/L、RNase Inhibitor 16U、DNA模板1μL、SYBER GreenⅡ0.3μL，其余用灭菌DEPC水补足体系；

所述SYBER GreenⅡ为300倍稀释；

将DNA模板、组合引物、Blocker及反应缓冲液的混合液经99℃，90s处理后降温至60℃，迅速加入RNase H和Bst DNA聚合酶，在实时荧光定量PCR仪上58℃ 反应40min，反应过程中实时监测荧光信号；

（3）检测分析：分析检测数据。

优选的，所述引物选用GCUUAGUGA-TTTGATGGTGTC，5’端9nt合成为RNA序列，3’端12nt合成为DNA序列；Blocker选用TTAGATAATGTGGTA，3’端用生物素修饰，中间随机加上五个XNA修饰。

优选的，所述IXNA包括A，C，G，T，U，mC六种堿基中的一种。

优选的，步骤（1）所述提取DNA方法采用普通热裂解法、蛋白酶K法、饱和酚法或水洗法结合商业化试剂盒法。

优选的，所述提取DNA方法采用商业化试剂盒法。

优选的，步骤（2）在实时荧光定量PCR仪上反应为80个循环，每循环30s。

本发明还涉及所述的分子检测方法在食品中志贺氏菌检测的应用。

本发明的发明构思为：在单引物等温扩增技术的基础上加入荧光染料，建立实时荧光单引物等温扩增方法，可通过实时荧光检测仪对荧光信号进行实时检测，具有操作简单、耗时短、实时监控等优点。志贺氏菌属分为痢疾志贺氏菌（S.dysenteriae）、福氏志贺氏菌（S.flexneri）、鲍氏志贺氏菌（S.boy dii）和宋内氏志贺氏菌（S.sonnei）四个群。编码侵袭性质粒相关抗原H的片段基因（ipaH），决定志贺氏菌对大肠粘膜的上皮细胞侵袭能力，同时多拷贝存在于染色体和侵袭性大质粒上，不随传代而丢失。以志贺氏菌ipaH基因保守序列为靶基因可将其与其它致病菌种属区分开，又可以全部检测出志贺氏菌四个群。

本发明的积极效果在于：

SPIA技术相对于其它检测方法有明显优势，首先是等温扩增，其反应无需温度循环等温条件下即可实现扩增反应使反应更方便省时；其次SPIA扩增具有较高的效率，因为在同一个模板分子上RNase H不需要等前一次合成结束即可进行引物RNA切割，新引物可以不断结合引发多个合成反应同时进行；然后该方法可以有效防污染，扩增产物污染造成假阳性的现象是常规核酸扩增技术（如PCR）常常出现的问题，而SPIA能有效防止这种污染，因为SPIA的DNA扩增产物缺少5’端引物区大部分序列，因此这些产物无法与引物结合进行扩增反应，从而有效避免了扩增产物污染的可能性；最后SPIA独特的依赖RNase H的特点，使其对RNA序列无直接扩增作用，因此可以在存在大量mRNA的情况下特异扩增基因组DNA序列，可以用于基因量的准确定量。SPIA技术的缺点是其引物合成相对复杂，因为引物为DNA和RNA组成的混合引物，因此在合成时较常规的单纯DNA或RNA引物合成相对复杂；且需要碱基修饰，因为blocker需要对碱基修饰以增强其与模板的结合力。

本发明在普通SPIA的基础上，采用加入特异性结合单链DNA的荧光染料SYBER GreenⅡ，以志贺氏菌ipaH基因为靶序列，利用荧光仪进行实时监测扩增情况，建立了实时荧光SPIA检测方法。本发明可省去烦琐的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测过程，比PCR技术和普通SPIA技术省时省力，成为可以替代PCR的核酸扩增新技术。本发明应用实时荧光SPIA检测志贺氏菌，建立了一种更为特异、敏感的分子检测实际样品中副溶血性弧菌的新技术，反应时间仅为40min，对志贺氏菌纯培养的灵敏度为1.16fg/μL，在检测牛奶模拟污染样品时其检出限是1.8 CFU/ mL，比LAMP法对志贺氏菌灵敏度和检出限高10倍。本发明的实时荧光SPIA检测志贺氏菌灵敏度高，特异性和敏感性强，对模板DNA要求较低，耗时短，方法简便，易于在基层和现场快速检测。

本发明中，当反应体系中只添加组合引物时，SPIA反应仍然能进行。在一些不需要特定位点终止的扩增反应中，可以不加任何引起链终止的序列，如扩增较短的核酸序列时，DNA聚合酶到模板末端自然终止。

本发明选用XNA，即LNA，又称“锁核酸”（Locked nucleic acid，LNA），是一种经过修饰的类寡核苷酸衍生物，这类核酸可以增加引物或探针的融解温度，加强其稳定性。

附图说明

图1为选用本发明引物和Blocker的实时荧光SPIA反应结果；图1中，1: Pzrn+Bz; 2: DEPC H₂O。

图2-4为志贺氏菌实时荧光SPIA引物特异性检测结果；

图2中，1-4: 福氏志贺氏菌Shigella flexneri、鲍氏志贺氏菌Shigella boydii、宋内志贺氏菌Shigella sonnei、痢疾志贺氏菌Shigella dysenteriae; 5-7: 单核细胞增生李斯特氏菌Listeria monocytogenes、鼠伤寒沙门氏菌Salmonella ；typhimurium、大肠埃希氏菌O157:H7 Escherichia coli O157：H7；8: DEPC H₂O

图3中，1: 福氏志贺氏菌Shigella flexneri;2-7:蜡样芽胞杆菌Bacillus cereus、小肠结肠炎耶儿森氏菌Yersinia enterocolitica、大肠埃希氏菌Escherichia coli、金黄色葡萄球菌Staphyloccocus aureus、弗氏柠檬酸杆菌Citrobacter freundii、河生肠杆菌Enterobacter amnigenus;8: DEPCH₂O；

图4中，1: 福氏志贺氏菌Shigella flexneri;2-7: 粘质沙雷氏菌Serratia marcescens、粪肠球菌Enterococcus faecalis、乙型溶血性链球菌Streptococcus hemolytic-β、嗜麦芽寡养单胞菌Stenotrophomonas maltophilia、地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis、恶臭假单胞菌Pseudomonas putida; 8: DEPCH₂O。

图5为志贺氏菌实时荧光SPIA检测方法的灵敏性试验结果；图5中，1: Shigella flexneri; 2-5: 1.16×10²fg/μL、1.16×10¹fg/μL、1.16×10⁰fg/μL、1.16×10^-1fg/μL; 6: DEPC H₂O。

图6为志贺氏菌实时荧光SPIA检测方法对模拟样品中志贺氏菌的检出限分析结果；图6中，1: Shigella flexneri 阳性对照; 2-5: 1.8×10² CFU/ mL、1.8×10¹ CFU/ mL、1.8×10⁰ CFU/ mL、1.8×10^-1 CFU/ mL; 6: DEPC H₂O。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面将结合本发明实施例中的附图和具体实施方式，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下试验均由河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心生物实验室完成。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1试验菌株

本试验所用菌株见表1。

表 1试验用菌株

注：ATCC购自美国菌种保藏中心; CICC购自中国工业微生物菌种保藏中心; CMCC购自中国药检所。

1.1.2主要试剂

BstDNA聚合酶、RNase H、RNA酶抑制剂、MgcL₂、dNTPs、SYBER GreenⅡ等购自于上海生工生物工程有限公司；基因组DNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；试验中所有培养基均购自北京陆桥有限责任公司；试验中所用到的牛奶样品购自当地超市。

1.1.3主要设备

ABI7500扩增仪（美国AB公司）、Whatman T Gradient 基因扩增仪（德国Biometra公司）、核酸蛋白分析仪（Eppendorf Biophotometer plus，德国Eppendorf公司）等。

1.1.4RNA/DNA组合引物和Blocker的设计和合成

根据Genebank中志贺氏菌ipaH基因（EU340151）己知序列，对其进行同源性分析，确定其保守序列，用Primer premier5.0设计组合引物和相应链终止序列，如表2所示。组合引物和Blocker均由大连TAKARA公司合成。

表2实时荧光SPIA设计的引物

注：XNA，即LNA，又称“锁核酸”（Locked nucleic acid，LNA），是一种经过修饰的类寡核苷酸衍生物，包括A，C，G，T，U，mC六种堿基。

1.2 试验方法

1.2.1 志贺氏菌的培养

取保藏的福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)、鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)在XLD琼脂培养基中进行划线，培养箱36℃培养12h，传代培养2次。挑取传代培养菌落接种至新鲜无菌的营养肉汤培养基中，36℃过夜培养。

1.2.2 基因组DNA的提取

普通热裂解法：

（1）取1 mL菌液转入1.5 mL Eppendorf离心管中5000-8000 rpm，离心5 min，弃上清。

（2）加入200 uL无菌DEPC水，振荡混匀，5000-8000 rpm，离心5 min，弃上清，重复操作一次。

（3）加入100 uL无菌DEPC水，振荡混匀，100℃水浴10 min，12000 rpm离心10 min，取上清，-20 ℃保存备用。

商业化试剂盒法：选用天根细菌基因组DNA提取试剂盒，按试剂盒说明书进行基因组DNA的提取，并测定浓度。

⑴将1mL培养液10,000rpm，离心1min，尽量吸净上清液。

⑵向菌体沉淀中加入200μl 缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮。

⑶向管中加入20μlProteinase K 溶液，混匀。

⑷加入220μl缓冲液GB，振荡15sec，70℃放置10min, 溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

⑸加入220μl无水乙醇，充分振荡混匀15sec,此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

⑹将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12,000rpm离心30sec，弃去收集管中的全部废液。将吸附柱CB3放回收集管中。

⑺向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

⑻向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

⑼重复操作步骤⑻。

⑽将吸附柱CB3放入收集管中，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

⑾将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱冲液TE，室温放置2-5min，12,000离心,2min，将溶液收集到离心管中。-20℃保存备用。

1.2.3 志贺氏菌实时荧光SPIA检测方法的建立

建立志贺氏菌实时荧光SPIA检测25 μL反应体系，针对设计的引物和Blocker组合，优化反应体系中RNA/DNA组合引物、Blocker、Bst DNA polymerase、RNaseH、dNTPs、Mgcl₂、RNase Inhibitor和SYBER GreenⅡ的使用浓度，以期确定各组分的最佳工作浓度，建立志贺氏菌实时荧光SPIA最佳反应体系。

将志贺氏菌基因组DNA模板、组合引物、Blocker及反应缓冲液的混合液经99℃，90s处理后降温至60℃，迅速加入RNase H和Bst DNA聚合酶，在ABI7500实时荧光PCR 仪上55℃-65℃，反应40min（每循环30s，80个循环），反应过程中实时监测荧光信号，以期确定最佳反应温度，建立志贺氏菌实时荧光SPIA检测方法。

1.2.4志贺氏菌实时荧光SPIA检测方法的特异性分析

取表1中19株过夜培养菌悬液1 mL, 用热裂解法提取基因组DNA作为模板, 根据1.2.3中所建立的反应体系和条件进行检测，对所建立的实时荧光SPIA方法进行特异性分析。

1.2.5两种基因组DNA提取方法对实时荧光SPIA检测结果的影响

使用1.2.2中两种方法提取4株不同群志贺氏菌基因组DNA，每种方法各三个平行，作为模板进行实时荧光SPIA检测，以分析不同的DNA提取方法对检测结果的影响。

1.2.6志贺氏菌实时荧光SPIA检测方法的灵敏性分析

以福氏志贺氏菌为检测对象，对1.2.3中所建立方法的灵敏性分析。挑取营养琼脂上，36 °C培养12 h的福氏志贺氏菌单菌落，制备成一定浓度菌悬液。用生理盐水进行10倍系列稀释，采用稀释平板法，测定其纯培养物活菌数为1.3×10⁸CFU/mL；同时取1 mL纯培养物采用试剂盒法提取福氏志贺氏菌基因组DNA，测得DNA浓度为1.16×10²ng/μL，用灭菌DEPC水进行10倍系列稀释，进行志贺氏菌实时荧光SPIA方法的灵敏性试验。

1.2.7志贺氏菌实时荧光SPIA检测方法在模拟样品中检出限分析

在牛奶中添加福氏志贺氏菌作为模拟污染样品进行检出限分析。进行添加前，牛奶样品已按GB 4789.5-2012常规检验法证实志贺氏菌阴性。挑取营养琼脂上，36 °C培养12 h的福氏志贺氏菌单菌落，制备成一定浓度菌悬液，用生理盐水进行10倍系列稀释后，选取系列稀释浓度菌悬液1mL分别添加到99mL牛奶样品中，混匀，分别取1mL模拟样品，采用稀释平板法, 测定其活菌添加范围为1.8×10⁵CFU/mL-1.8×10^-2CFU/mL，直接用热裂解法提取志贺氏菌基因组DNA，进行志贺氏菌实时荧光SPIA方法对模拟污染牛奶样品的检出限分析。本实验重复3次。

2 结果与分析

2.1志贺氏菌实时荧光SPIA反应体系和反应条件的建立

如图1所示，经过各种反应体系和条件的优化，设计合成的组合引物及Blocker对志贺氏菌出现典型荧光扩增曲线，且最佳反应体系为：RNA/DNA组合Pirmer 5.6μmol/L、Blocker 0.36μmol/L、10×Bst Buffer 2.5μL、Bst DNA polymerase 20U、10×RNaseH Buffer 2.5μL、RNaseH 5U、dNTPs 0.2 mmol/L、Mgcl₂ 3.5mmol/L、RNase Inhibitor 16U、DNA模板1μL、SYBER GreenⅡ0.3μL（300×稀释），其余用灭菌DEPC水补足体系；最佳反应条件为58.0℃，反应40min。

2.2 志贺氏菌实时荧光SPIA检测方法的特异性分析

特异性试验结果显示，4株志贺氏菌均出现典型的荧光扩增曲线，其他细菌检测均未产生扩增曲线。结果表明建立的志贺氏菌实时荧光SPIA检测方法具有良好的特异性。具体结果如图2-4所示。

2.3不同模板DNA提取方法对志贺氏菌实时荧光SPIA检测结果的影响

四种不同群志贺氏菌分别用热裂解法、试剂盒两种方法提取模板DNA，应用实时荧光SPIA检测，每种方法各做三个平行，均出现典型的扩增曲线，Ct值没有没有明显差异，结果如表3所示。实验表明，实时荧光SPIA方法检测志贺氏菌对模板质量要求不苛刻，能适应广大的基层和现场检测。

表3不同模板DNA提取方法对志贺氏菌实时荧光SPIA检测结果的影响

2.5志贺氏菌实时荧光SPIA检测方法的灵敏性试验

如图5所示，当DNA模板用量为1.16×10²-1.16×10⁰fg/μL时，即志贺氏菌浓度为1.3×10²-1.3×10⁰CFU/mL时，均出现典型的扩增曲线；当模板用量为1.16×10^-1fg/μL时，即志贺氏菌浓度为1.3×10^-1CFU/mL则无扩增曲线。结果表明建立的实时荧光SPIA检测方法对志贺氏菌DNA的检测灵敏度为1.16×10⁰fg/μL，对志贺氏菌菌液的检测灵敏度为1.3×10⁰CFU/mL。

2.6志贺氏菌实时荧光SPIA检测方法在牛奶模拟样品中的检出限试验

如图6所示，当牛奶样品中志贺氏菌浓度为1.8×10⁰ CFU/ mL时，出现典型的扩增曲线；当牛奶样品中志贺氏菌浓度为1.8×10^-1CFU/ mL时，则无扩增曲线。所以志贺氏菌实时荧光SPIA检测方法在牛奶模拟样品中检出限为1.8CFU/ mL。三次重复试验结果一致。

Claims

1.一种志贺氏菌的分子检测方法，其特征在于，采用单引物等温扩增方法，以志贺氏菌ipaH基因特异序列为靶序列，SYBER GreenⅡ为荧光染料，实时荧光检测仪检测扩增的实时荧光信号。

2.根据权利要求1所述的一种志贺氏菌的分子检测方法，其特征在于，其具体过程包括如下步骤：

（1）取含志贺氏菌的待检样品，提取基因组DNA；

RNA/DNA组合引物 5.6μmol/L、Blocker 0.36μmol/L、10×Bst Buffer 2.5μL、Bst DNA polymerase 20U、10×RNaseH Buffer 2.5μL、RNaseH 5U、dNTPs 0.2 mmol/L、MgCl₂ 3.5mmol/L、RNase Inhibitor 16U、DNA模板1μL、SYBER GreenⅡ0.3μL，其余用灭菌DEPC水补足体系；

所述SYBER GreenⅡ为300倍稀释；

（3）检测分析：分析检测数据。

3.根据权利要求2所述的一种志贺氏菌的分子检测方法，其特征在于，所述引物选用GCUUAGUGA-TTTGATGGTGTC，5’端9nt合成为RNA序列，3’端12nt合成为DNA序列；Blocker选用TTAGATAATGTGGTA，3’端用生物素修饰，中间随机加上五个XNA修饰。

4.根据权利要求3所述的一种志贺氏菌的分子检测方法，其特征在于，所述IXNA包括A、C、G、T、U或mC六种堿基中的一种。

5.根据权利要求2所述的一种志贺氏菌的分子检测方法，其特征在于，步骤（1）所述提取DNA方法采用普通热裂解法、蛋白酶K法、饱和酚法或水洗法结合商业化试剂盒法。

6.根据权利要求5所述的一种志贺氏菌的分子检测方法，其特征在于，所述提取DNA方法采用商业化试剂盒法。

7.根据权利要求2所述的一种志贺氏菌的分子检测方法，其特征在于，步骤（2）在实时荧光定量PCR仪上反应为80个循环，每循环30s。

8.一种权利要求1-7任一项所述的分子检测方法在食品中志贺氏菌检测的应用。