CN105087569B

CN105087569B - 对霍乱弧菌o18，o19，o23和o12特异的核苷酸及其应用

Info

Publication number: CN105087569B
Application number: CN201510562604.XA
Authority: CN
Inventors: 王磊; 许广楠; 张新杰; 王敏; 王来友
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2015-09-07
Filing date: 2015-09-07
Publication date: 2017-08-25
Anticipated expiration: 2035-09-07
Also published as: CN105087569A

Abstract

本发明涉及一种对霍乱弧菌(Vibro cholerae)O抗原特异的核苷酸及其应用，所述核苷酸包括1）SEQ ID NO:1‑8所示的核苷酸中的至少一种；2）与SEQ ID NO:1‑8所示的核苷酸互补的核苷酸中的至少一种。这些核苷酸可用于制备检测霍乱弧菌用PCR试剂盒和基因芯片。本发明的对霍乱弧菌O抗原特异的核苷酸及包含该核苷酸的PCR试剂盒、基因芯片的实用性强，PCR试剂盒配制方法简便，检测周期短、速度快，可操作性强，易于产业化生产，而检测成本却相对较低；准确性高；灵敏度高。

Description

对霍乱弧菌O18，O19，O23和O12特异的核苷酸及其应用

技术领域

本发明涉及对霍乱弧菌O18，O19，O23和O12血清型特异的核苷酸，尤其涉及对霍乱弧菌O18，O19，O12和O18血清型O抗原基因簇中单个基因特异的核苷酸及其应用。

背景技术

霍乱弧菌（Vibrio cholerae）属于弧菌属，是霍乱的病原菌，霍乱是一种烈性肠道传染病，是流传时间长、影响范围广的一种食源性疾病，其典型临床表现为腹泻、呕吐和由此引起的体液丢失、脱水、周身循环衰竭、电解质紊乱、低钾综合症、腹部痉挛甚至死亡，被世界卫生组织确定为必须国际检疫的传染病之一，《中华人民共和国传染病防治法》将其列为应实施“强制管理”的甲类传染病。

细菌分型与鉴定方法主要有传统的表型方法、血清学方法以及分子鉴定方法。然而，随着分子生物学的发展，传统的血清分型和鉴定方法存在着一定的问题，如血清分型这种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面血清分型方法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，不同的O抗原产生的抗血清之间经常存在交叉反应。因此，建立基于分子生物学技术的血清鉴定方法成为发展方向。

霍乱弧菌的分子鉴定越来越受到人们的重视，成为霍乱弧菌菌种与株型鉴定的重要依据，不少新菌也因此产生。对弧菌而言，生化反应主要是各种酶谱的表现，属于外部形态的内容，核酸的相似性才是弧菌种的界定最根本、最直接的特征。因此，霍乱弧菌的分型与鉴定最有效、最直接的方式应该从核酸的研究触发，通过比较核酸（包括基因组与核酸片段）的相似性确定霍乱弧菌的归属。

近年来，越来越多的分子技术用于病原菌的分型、鉴定、检测及病害诊断，包括转录间隔区(ITS)序列分析、随机扩增长度多态性(RAPD)分析、核糖体DNA限制性片段长度多态性(RFLP)分析等。分子生物学方法不仅可用于霍乱弧菌的快速血清分型筛查，稳定的鉴定结果可以弥补表型特征鉴定方法的不足。和传统检测技术相比，这些基于多聚酶链式反应(PCR)的分子检测技术，不需要经过病原菌的分离、纯培养等过程，而且具有快速、灵敏、特异性强等优点。

聚合酶链式反应技术(Polymerase chain reaction,简称PCR技术)作为微生物检测技术目前正在得到认同和推广，该技术相对于传统的方法有高通量、检测速度快、特异性强、灵敏度高等优点，只需对样品进行简单的预增菌或增菌过程，再通过离心及裂解制备细菌DNA模板，就可以在高特异性引物介导下的PCR过程中扩增目标序列，达到检测样品中是否含有待测的致病性微生物的目的。PCR的扩增过程仅需1个半小时。这对检验检疫部门和临床检验无疑极大提高了工作速度和降低了工作成本。

不论从国内和国际的角度来看，快速、准确地鉴定出血清类型，为霍乱弧菌的防控提供有效技术支持是十分重要的。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种对霍乱弧菌O抗原特异的核苷酸，其特征在于所述的核苷酸具有：

1）SEQ ID NO:1-8所示的核苷酸中的至少一种；

2）与SEQ ID NO:1-8所示的核苷酸互补的核苷酸中的至少一种；所述的SEQ IDNO:1-8如下：

本发明还提供了一种PCR试剂盒，包括PCR引物、dNTP、缓冲液和DNA聚合酶，所述PCR引物为如SEQ ID NO:1-8所示的核苷酸中的至少一种。所述的试剂盒，还包括如下试剂：10 mM dNTP 30μl；10×酶特异性反应缓冲液 50μl；5U/μl耐热DNA聚合酶5μl；引物混合物10μl；阳性对照品10μl；阴性对照品10μl；ddH₂O 5ml。

其中所述的PCR引物优选为所述如SEQ ID NO:1-8所示的核苷酸中的至少一种。

本发明进一步公开了一种对霍乱弧菌O抗原特异的SEQ ID NO:1-8核苷酸在制备用于检测霍乱弧菌O抗原PCR试剂盒、基因芯片或微阵列方面的应用。

本发明所述霍乱弧菌可以取样于自来水、霍乱水、海水、土壤的培养物的粗提液，或是霍乱弧菌的纯培养物的粗提液等。

收集霍乱弧菌提取基因组是采用常规方法制备获得。

针对霍乱弧菌的PCR试剂盒，整个检测步骤包括样品预处理—扩增—电泳检测结果。引物和PCR反应体系所需要的试剂已预先加入扩增管中，使用者只需将预处理后的样本加入扩增管启动扩增反应即可，简单快速的完成检测工作。

本发明还提供一种基因芯片，包括固相载体和固定在固相载体上的寡核苷酸探针，其中所述寡核苷酸探针包括上述的核苷酸；其中所述核苷酸优选为如SEQ ID NO:1-8所示的核苷酸。

本发明还提供一种微列阵，其包括上述的核苷酸；其中所述核苷酸优选为如SEQID NO:1-8所示的核苷酸。检测变形杆菌的基因芯片方面、检测变形杆菌微阵列方面的应用。所述的变形杆菌指的是检测霍乱弧菌指的是检测由于污染水源和未煮熟的食物中毒、腹泻、肠道传染病、医院内感染等多种混合型感染的细菌。

本发明公开的一种对霍乱弧菌O抗原特异的核苷酸与现有技术相比，本发明具有如下优点：

（1）实用性强：本发明建立的一种PCR反应体系，可检测霍乱弧菌，提供血清分型检测所用到的特异引物，利用该PCR方法可以对临床标本进行检测。

（2）准确性高：本发明通过对霍乱弧菌的各血清型特异的基因的PCR反应，每个样品得到一条目的条带，将得到目的片段与已知长度相比较，就可以得到霍乱弧菌所属的血清型。

（3）检测成本相对较低：可以推广应用于食品卫生监督、环境监测、尚品监测检验检疫等领域，并为其他不同致病菌检测组合提供技术模式。

以上所述，仅是本发明的操作和实施方法而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

附图说明：

图1表示本发明O18血清型特异引物检测霍乱弧菌其他血清型标准菌株电泳结果图，wzz基因P1和P2引物的筛选，目的条带为198bp，其余的血清型没有任何条带具体菌株信息见表2；

图2表示本发明O18血清型特异引物种特异性的鉴定电泳结果图，其中检测了6株弧菌以及1株沙门菌、1株大肠杆菌，均无任何条带，具体菌株信息见表2；

图3表示本发明O19血清型wzm基因P3和P4引物检测霍乱弧菌其他血清型标准菌株电泳结果图，wzm基因P3和P4引物的筛选，目的条带为264bp，其余的血清型没有任何条带。具体菌株信息见表2；

图4表示本发明O19血清型wzm基因P3和P4引物种特异性的鉴定电泳结果图，其中检测了6株弧菌以及1株沙门菌、1株大肠杆菌，均无任何条带。具体菌株信息见表2；

图5表示本发明O23血清型wzz基因P5和P6引物检测霍乱弧菌其他血清型标准菌株电泳结果图，wzz基因P5和P6引物的筛选，目的条带为250bp，其余的血清型没有任何条带，具体菌株信息见表2；

图6表示本发明O23血清型wzz基因P5和P6引物种特异性的鉴定；电泳结果图，其中检测了6株弧菌以及1株沙门菌、1株大肠杆菌，均无任何条带，具体菌株信息见表2；

图7表示本发明O12血清型wzm基因P7和P8引物检测霍乱弧菌其他血清型标准菌株电泳结果图，wzm基因P7和P8引物的筛选，目的条带为262bp，其余的血清型没有任何条带。具体菌株信息见表2；

图8表示本发明O12血清型wzm基因P7和P8引物种特异性的鉴定电泳结果图，其中检测了6株弧菌以及1株沙门菌、1株大肠杆菌，均无任何条带。具体菌株信息见表2；

图9表示分别用O18，O19，O23和O12特异引物扩增对应血清型的电泳结果图，具体菌株信息见表2；

其中O18、019、 023、0 12、和负对照(-)表示相应血清型引物扩增结果，第一个泳道H和最后一个泳道是2000bp ladder marker。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York: Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989）中所述的条件。其中霍乱弧菌来源于Japan Collection of Microorganisms（JCM）。

实施例1：基因组的提取

37℃ 营养肉汤培养基培养霍乱弧菌，收集细菌，提取基因组具体步骤如下：

用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul10%SDS，50℃温育2小时，再加入3 ul 10mg/ml 的RNase，65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清液，再用等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）溶液抽提两次，取上清液，再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚。上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70%乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中。基因组DNA通过0.4%的琼脂糖凝胶电泳检测。

实施例2:序列破译

提取霍乱弧菌各个血清型标准菌株的基因组，通过Solexa pair-end测序技术对霍乱弧菌各个血清型基因组进行全基因组测序获得该血清型的序列，运用Blast及PSI-Blast进行序列比对，采用TMHMM 2.0 program进行跨膜结构预测，运用ClustalW program进行序列对齐及筛选保守和特定基因片段，最终获得霍乱弧菌各个血清型的O抗原基因簇序列及破译结果。

实施例3：引物设计

霍乱弧菌各个血清型的O抗原基因簇序列是本实验室自测的，通过比对分析，我们选取Blast比对结果identity和similarity值相对较低的基因特异区段设计引物。其中O18血清型的wzz基因比对结果identity值和similarity值为91%和95%；O19血清型的wzm基因比对结果identity值和similarity值为84%和93%；O23血清型的wzz基因比对结果identity值和similarity值为90%和94%；O12血清型的wzm基因比对结果identity值和similarity值为100%和100%；所以各个血清型分别选取上述对应的基因作为该血清型的特异靶基因，针对各个血清型的基因特异区段分别设计特异引物。

引物设计是该发明的核心部分。将上述基因导入Primer Premier 5进行引物设计，每个基因设计一对引物，有单一目的条带。

引物设计之后在Genbank中进行BLAST，设计的引物不能与其它近缘细菌的序列相似性过高，这样就能确保该引物只在自己的预定位置进行扩增，而不与其它的近缘菌或者采集标本的环境中的近缘菌不产生阳性反应。这一点对于避免非特异条带的产生和实验的成败十分重要。

设计出的引物如表1所示。

表1 用于PCR的引物序列

实施例4：特异引物的筛选

收集了霍乱弧菌018、O19、O23及O12血清型的标准菌株，6株弧菌属其他菌株，1株沙门菌属菌株以及1株大肠杆菌菌株验证引物的特异性，菌株编号和来源见表2.

表2 用于特异性检测的菌株

基因鉴定引物筛选用到的PCR体系为5μM引物0.4μl、10×酶特异性反应缓冲液2.5μl、10mM dNTP 0.25μl、5U/μl耐热DNA聚合酶0.2μl及3μl的待测样品模板到0.2ml的薄壁PCR管中，最后ddH₂O补足到25μl。所有引物都在各自所对应的血清型中得到阳性结果，在其他组中没有得到任何PCR产物带。

这个步骤中的PCR仪上的反应循环参数包括DNA的变性、复性、延伸的温度和时间、循环次数，具体为：

前期为使变性能够达到所需的温度而必需的前期处理过程的一个循环为95℃，5分钟；

变性温度和时间为95℃，45秒；

复性温度和时间为55℃/68℃，1分钟；

延伸温度和时间为72℃，1分钟；

变性、复性、延伸的循环次数为35个循环；

为稳定扩增产物而进行一个循环的温度和时间为72℃，5分钟

其中，O18使用64℃扩增，O19使用61℃扩增，O23使用55-65℃扩增，O12使用55-58℃扩增均可。

上述步骤在电泳设备中电泳扩增产物，记录结果的具体步骤为：

取2～5μl扩增产物与6×溴酚蓝上样缓冲液以1：1的体积比混合；

将混合液上样于1.0％的琼脂糖凝胶上；

将琼脂糖凝胶电泳120v稳压电泳约20分钟，用DL2000 Marker进行对照；

观察并记录结果。

通过基本PCR反应之后引物筛选的工作基本结束，必要的长度调整对整体反应条件影响不大，本发明中用到的引物序列全部总结在表1中。

表1 用于PCR的引物序列

实施例5： PCR检测试剂盒的制备及应用

1、PCR试剂盒的组成：

dNTP(10mM) 30μl；

10×Buffer(10×酶特异性反应缓冲液) 50μl；

Taq聚合酶（5U/μl耐热DNA聚合酶） 5μl；

PCR引物混合物（5μM） 10μl；

阳性对照品(KP) 10μl；

阴性对照品（KN） 10μl；

ddH₂O 5ml；

每个试剂盒可用于检测10个样品。

其中10×Buffer 、dNTP、Taq聚合酶由宝生物工程有限公司提供；引物混合物为自行设计的序列提供给上海英骏生物技术公司合成；阳性对照品、阴性对照品和ddH₂O由我们自行制备。

2、仪器设备

其中10×Buffer 、dNTP、Taq聚合酶由上海生工提供；引物混合物为自行设计的序列提供给上海英骏生物技术公司合成；阳性对照品、阴性对照品和ddH2O由我们自行制备。实验的设备PCR仪（又名DNA热循环扩增仪）、电泳设备（包括电泳仪及电泳槽）、凝胶成像仪、-20℃冰箱、高速离心机、微量移液器和0.2ml PCR薄壁管。

3、PCR试剂盒的使用具体实例

使用上述的PCR试剂盒检测霍乱弧菌的PCR检测方法包括如下步骤：

（1）提取待测环境样品模板；

（2）在PCR薄壁管中加入、dNTP、10×Buffer 、Taq聚合酶、引物、待测样品模板和ddH₂O混匀；

（3）将薄壁PCR管中混匀的混合物在PCR仪上扩增；

（4）在电泳设备中电泳扩增产物，记录结果；

（5）分析并进行结果判断。

上述步骤(1)中的环境样品模板为自来水、霍乱水、海水等的培养物的粗提液，或是霍乱弧菌的纯培养物的粗提液或是纯DNA，或是阳性对照品和阴性对照品。

上述步骤（1）中的环境样品模板的提取方法为：

取1.5ml培养物，在12000rpm条件下离心1分钟，去掉上清液；

取500μl的ddH₂O重悬沉淀，在8000rpm条件下离心5分钟，去掉上清液，烘干；

取100μlddH₂O重悬沉淀，在100℃沸水中水浴10分钟；

再置于冰上10分钟后，在12000rpm条件下离心2分钟；

⑤ 取3μl中层上清作为PCR模板

上述步骤（3）中的PCR仪上的反应循环参数包括DNA的变性、复性、延伸的温度和时间、循环次数，具体为：

变性温度和时间为95℃，45秒；

复性温度和时间为55℃/68℃，1分钟；

延伸温度和时间为72℃，1分钟；

变性、复性、延伸的循环次数为35个循环；

为稳定扩增产物而进行一个循环的温度和时间为72℃，5分钟。

上述步骤（4）在电泳设备中电泳扩增产物，记录结果的具体步骤为：

取2～5μl扩增产物与6×溴酚蓝上样缓冲液以5：1的体积比混合；

将混合液上样于1.0％的琼脂糖凝胶上；

观察并记录结果。

本发明通过配置一种可检测霍乱弧菌的可产业化生产的PCR试剂盒，将PCR检测方法需要使用的组分组合在一起，使用时，提取待测样品，同时经过较为简单的操作层序就可以进行快速、灵敏、简便的检测，试剂盒中各组分的用量和浓度均为试验所得，用该试剂盒检测霍乱弧菌所使用的试验设备简单，检测成本低。

使用阳性和阴性对照品的目的是用于质控整个操作过程，以便得出准确的判断。若含有霍乱弧菌目的O抗原类型，则从电泳结果中可以观察到与阳性对照品相同位置的条带；若不含有霍乱弧菌目的O抗原类型，则与阴性对照品一样不具有这一条带。

本发明一次检测试验所使用的试剂盒中的试剂量见下表3所示，DNA模板量为3μl

表3 一次检测试验所使用的试剂盒中的试剂量

本发明中的耐热DNA聚合酶为Taq酶。

上述的阳性对照品为已确定是霍乱弧菌各个O抗原类型的样品，阴性对照品则为经实验室确定不是霍乱弧菌的样品。

本PCR试剂盒若用霍乱弧菌的菌悬液进行PCR扩增，与经提取得到的DNA作为模板所得结果一直。敏感度和特异性无差别，这样，可省去模板DNA的提取步骤，使操作方法得以简化。同时，相比常规生化检测方法而言，本方法所采用的待测样品可以直接是临床样品培养液，或者对检测样品进行简单分离培养就可以进行检测，因而节省了人力物力。

4、待测样品的提供

收集了霍乱O18、O19、O23、及O12血清型标准菌株，6株弧菌属其他菌株，1株沙门菌属菌株以及1株大肠杆菌菌株验证引物的特异性，菌株编号和来源见表2。

SEQUENCE LISTING

<110> 南开大学

<120> 对霍乱杆菌O18，O19，O23和12特异的核苷酸及其应用

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtgtggccgccatcggttat 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aatgagcttagggtcaatta 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aaaactcgctggggggatgg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aatagcactcagagcatttc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gttgagttagagcgtactca 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ttactgaccacttcgcttca 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aaatggggtgtagatacaaa 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ataactgggaaggctgtaat 20

Claims

1.一种对霍乱弧菌O抗原特异的核苷酸，其特征在于所述的核苷酸为：SEQ ID NO:1-4,SEQ ID NO:6-8所示核苷酸的至少一种。

2.权利要求1所述对霍乱弧菌O抗原特异的核苷酸，其特征在于上述核苷酸可以用于制备检测霍乱弧菌用基因芯片或微阵列；所述霍乱弧菌可以取样于自来水、霍乱水、海水的培养物的粗提液，或是霍乱弧菌的纯培养物的粗提液。

3.一种PCR试剂盒，其特征在于包括PCR引物、dNTP、缓冲液和DNA聚合酶，所述PCR引物为对应血清型O18的SEQ ID NO：1-2所示的核苷酸；

对应血清型O19的SEQ ID NO：3-4所示的核苷酸；

对应血清型O23的SEQ ID NO：5-6所示的核苷酸；或

对应血清型O12的SEQ ID NO：7-8所示的核苷酸。

4.权利要求3所述的试剂盒，还包括如下试剂：10 mM dNTP 30μl；10×酶特异性反应缓冲液 50μl；5U/μl耐热DNA聚合酶5μl；引物混合物10μl；阳性对照品10μl；阴性对照品10μl；ddH₂O 1ml。

5.权利要求1所述的核苷酸在制备用于检测霍乱弧菌的基因芯片方面的应用。

6.权利要求1所述的核苷酸在制备用于检测霍乱弧菌微阵列方面的应用。

7.权利要求5或6所述的应用，其中所述的检测霍乱弧菌指的是检测由于污染水源和未煮熟的食物中毒、腹泻、肠道传染病、医院内感染多种混合型感染的细菌。