CZ298165B6 - Oligonukleotidy a zpusob detekce Pectinatus frisingensis a Pectinatus cerevisiiphilus s pouzitím techto oligonukleotidu - Google Patents
Oligonukleotidy a zpusob detekce Pectinatus frisingensis a Pectinatus cerevisiiphilus s pouzitím techto oligonukleotidu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ298165B6 CZ298165B6 CZ20010542A CZ2001542A CZ298165B6 CZ 298165 B6 CZ298165 B6 CZ 298165B6 CZ 20010542 A CZ20010542 A CZ 20010542A CZ 2001542 A CZ2001542 A CZ 2001542A CZ 298165 B6 CZ298165 B6 CZ 298165B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- pectinatus
- rrna
- sequence
- minutes
- seq
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Resení se týká oligonukleotidu charakterizovanéhogenovou sekvencí mezerníkové oblasti mezi geny kódujícími 16S rRNA a 23S rRNA Pectinatus frisingensis mající alespon jednu z následujících sekvencních skupin nebo jí odpovídající komplementární sekvenci: 5' - CCATCCTCTTGAAAATCTC - 3' (SEQ ID NO:5) 5' - TCTCYTCTCACAAGTTTGGC - 3' (SEQ ID NO:6), a zpusobu detekce Pectinatus frisingensis s pouzitím oligonukleotidu vytvoreného podle této nekteré genové sekvence a nukleotidové sekvence kódující gen 16S rRNA Pectinatus frisingensis jako primeru pro syntézu nukleových kyselin pro genovou amplifikacik detekci bakterií. Dále se resení týká oligonukleotidu charakterizovaného genovou sekvencí mezerníkové oblasti mezi geny kódujícími 16S rRNA a 23S rRNA Pectinatus cerevisiiphilus mající alespon jednu z následujících sekvencních skupin nebo jí odpovídající komplementární sekvenci: 5' - CACTCTTACAAGTATCTAC - 3' (SEQ ID NO:7) 5' - CCACAATATTTCCGACCAGC - 3' (SEQ ID NO:8) 5' - AGTCTTCTCTACTGCCATGC -3' (SEQ ID NO:9), a zpusobu detekce Pectinatus cerevisiiphilus s pouzitím oligonukleotidu vytvoreného podle této nekteré genové sekvence a nukleotidové sekvence kódující gen 16S rRNA Pectinatus cerevisiiphilus jako primeru pro syntézu nukleových kyselin pro genovou amplifikaci k detekci bakterií.
Description
Oblast techniky
Vynález se týká oligonukleotidu a způsobu detekce Pectinatus frisingensis s použitím tohoto oligonukleotidu
Dosavadní stav techniky
Bakterie rodu Pectinatus byly poznány jako bakterie zhoršující jakost piva. Jsou známy dva druhy tohoto rodu - Pectinatus frisingensis a Pectinatus cerevisiiphilus. Pro detekci bakterií rodu 15 Pectinatus je nutné bakterii izolovat z multiplikační a separační kultury. To si vyžaduje alespoň sedm dní. Poté jsou izolované bakterie namnoženy a prověřovány celou řadou kvalitativních testů jako je např. morfologické sledování, Gramovo barvení, katalázový test, využití různých zdrojů uhlíku a podobně k identifikaci bakterií.
Tyto testy jsou dosti problémové a časově i finančně náročné. Kromě těchto běžných identifikačních testů existuje i metoda, při které je bakteriální DNA extrahována, fixována na membránu a je proveden hybridizační test využívající standardní bakteriální DNA jako sondy pro identifikaci třídy. Nicméně i tento postup zabírá několik dní a je těžké dosáhnout požadovanou citlivost a selektivitu detekce.
Později byla uveřejněna metoda detekce bakterií rodu Pectinatus využívající monoklonálních protilátek, které specificky reagují s Pectinatus cerevisiiphilus (ASBC Joumal: 51(4) 158-163, 1993). Ovšem metoda je nedostačující z hlediska detekční citlivosti. Problémem metody je, že Pectinatus frisingensis nemůže být detekován.
Byla popsána i další detekční metoda. Je schopna detekovat Pectinatus frisingensis a Pectinatus cerevsiiphilus tak zvanou ríbotypovou metodou, která zkoumá polymorfismus genu pro ribosomální RNA (J.Am.Soc.Chem. : 56 (1) 19-23, 1998). Jelikož však metoda zahrnuje operace izolace bakterií, má problémy s detekční citlivostí a rychlostí.
Po uvážení těchto problémů byly studovány další rychlé detekční metody. V dokumentu WO 97/20 071 je popsána metoda pro detekci Pectinatus zahrnující extrakci DNA zkoumaného mikroorganismu a využití metody PCR, kde komplementární oligonukleotid DNA má funkci primeru. Ovšem základní sekvence genu pro 16S rRNA používané touto technikou jsou občas 40 podobné mikroorganismům jiných rodů, a tak jsou tyto odlišné mikroorganismy detekovány společně s jednotlivými zkoumanými mikroorganismy, což představuje určitý problém.
Gen, nacházející se v mezerníku mezi 16S rRNA a 23S rRNA geny, má specifickou sekvenci. Přestože metody detekce mikroorganismů využívající genové sekvence jsou uveřejněny v 45 Japanese Jozo Ronbunshu 50, 22-31 (1995), APPL. ENVIRON. MICROBIOL, VOL, 62, NO.5,
1683-1688 (1996), FEMS MICROBIOL LETT. VOL. 84, NO. 3, 307-312 (1991) Japanese Patent Kokai Publication No. 6-98 800 a jinde, genové sekvence mezerníku rodu Pectinatus nebyly nalezeny.
Podstata vynálezu pfedk 1 ádaný vy nález uši 1 uje' o půskýf ňiití šek věnči'v“ób 1 ašti mezern íku nacházej í čí htfšěTnezi geny pro 16S rRNA a 23S rRNA specifických pro rod Pectinatus, spjatý se zhoršováním jakosti piva, a zajištění způsobu citlivé a rychlé detekce rodu s využitím genových sekvencí.
(1) Prvním předmětem vynálezu je genová sekvence mezemíkové oblasti mezi geny kódujícími 16S rRNA a 23S rRNA Pectinatus frisingensis obsahující část základní sekvence nebo celou základní sekvenci znázorněnou SEQ ID NO: 1.
(2) Druhým předmětem vynálezu je genová sekvence mezemíkové oblasti mezi geny kódujícími 16S rRNA a 23S rRNA Pectinatus frisingensis obsahující část základní sekvence nebo celou základní sekvenci znázorněnou SEQ ID NO: 2.
(3) Třetím předmětem vynálezu je genová sekvence mezemíkové oblastí mezi geny kódujícími 16S rRNA a 23S rRNA Pectinatus cerevisiiphilus obsahující Část základní sekvence nebo celou základní sekvenci znázorněnou SEQ ID NO: 3.
(4) Čtvrtým předmětem vynálezu je genová sekvence mezemíkové oblasti mezi geny kódujícími 16S rRNA a 23S rRNA Pectinatus cerevisiiphilus obsahující část základní sekvence nebo celou základní sekvenci znázorněnou SEQ ID NO: 4.
(5) Pátým předmětem vynálezu je oligonukleotid, který je charakterizován genovou sekvencí mezemíkové oblasti mezi geny kódujícími 16S rRNA a 23S rRNA Pectinatus frisingensis, obsahující alespoň jednu z následujících sekvenčních skupin nebojí odpovídající komplementární sekvenci:
5'A2CATCCTCTTGAAAATCTC-3' (1)
5-TCTCYTCTCACAAGTTTGGC-3' (2).
(6) Šestým předmětem vynálezu je oligonukleotid, který je charakterizován genovou sekvencí mezemíkové oblasti mezi geny kódujícími 16S rRNA a 23S rRNA Pectinatus cerevisiiphilus obsahující alespoň jednu z následujících sekvenčních skupin nebojí odpovídající komplementární sekvenci:
5'-CACTCTTACAAGTATCTAC-3'(3)
5'-CCACAATATTTCCGACCAGC-3’(4)
5-AGTCTTCTCTACTGCCATGC-3'(5) (7) Sedmým předmětem vynálezu je způsob detekce Pectinatus frisingensis, při kterém je oligonukleotid připravený z genových sekvencí popsaných v (1) nebo (2) použit jako primer pro syntézu nukleových kyselin a nukleové kyseliny jsou využity genovou amplifikací pro detekci bakterií.
(8) Osmým předmětem vynálezu je způsob detekce Pectinatus cerevisiiphilus, při kterém je oligonukleotid připravena z genových sekvencí popsaných v (3) nebo (4) použit jako primer pro syntézu nukleových kyselin a nukleové kyseliny jsou využity genovou amplifikací pro detekci bakterií.
(9) Devátým předmětem vynálezu je způsob detekce Pectinatus frisingensis, při kterém oligonukleotid vytvořený z genových sekvencí popsaných v (1) nebo (2) nebo oligonukleotid vytvořený z genové sekvence popsané v (5) a nukleotidová sekvence kódující gen 16S rRNA Pectinatus frisingensis jsou použity jako primery pro syntézu nukleových kyselin, které jsou genovou amplifikací využity pro detekci bakterií.
(10) Desátým předmětem vynálezu je způsob detekce Pectinatus cerevisiiphilus, při kterém oligonukleotid vytvořený z genových sekvencí popsaných v (3) nebo (4) nebo oligonukleotid vytvořený z genové sekvence popsané v (6) a nukleotidová sekvence kódující gen 16S rRNA Pectinatus cerevisiiphilus jsou použity jako primery pro syntézu nukleových kyselin, které jsou genovou amplifikací využity pro detekci bakterií.
(11) Jedenáctým předmětem vynálezu je způsob, při kterém nukleotidová sekvence kódující gen 16S rRNA Pectinatus frisingensis má následující sekvenci:
CL zva 105 bO
5' -CGTATCCAGAGATGGATATT-3' (6) (12) Dvanáctým vynálezem je způsob, při kterém nukleotidová sekvence kódující gen 16S rRNA Pectinatus cerevisiiphilus má následující sekvenci:
5’ -CGTATGCAGAGATGCATATT-3' (7)
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1. ukazuje elektroforeogram z pokusu 3.
Obr. 2. ukazuje elektroforeogram z pokusu 5.
Příklady provedení vynálezu
Jelikož je technika genové amplifikace dobře známá, je prováděna pomocí metody polymerázové řetězové reakce, která byla vyvinuta Saikim a kol. (zkráceně v následujícím textu jako PCR metoda, Science 230,1 350,1985).
Tato metoda je prováděna amplifikačními reakcemi jednotlivých genových sekvencí. Jelikož je reakce velmi rychlá, vysoce citlivá, specifická a vyhovující, její aplikace bylo využito při rychlém posuzování virů v medicíně nebo při rychlé detekci škodlivých bakterií v potravinách. Při metodě PCR je postačující přítomnost jen několika málo nukleotidových sekvencí v testovaném vzorku, neboť cílová sekvence mezi dvěma primery je mnohonásobně namnožena a kopie jsou produkovány v takovém množství, že je možná jejich detekce. Při provádění PCR reakce by testovaný vzorek měl obsahovat složku nukleové kyseliny oddělenou od bakterií. Nicméně při PCR metodě ani existence několika či více molekul v cílové sekvenci nezabrání uskutečnění amplifikační reakce. Proto tedy mohou být vzorky pro metodu PCR získávány jednoduchým zpracováním bakterií pomocí lytických enzymů nebo surfaktantu. Z tohoto důvodu má tato metoda detekce bakterií větší cenu než klasické metody.
Předkládaný vynález poskytuje genové sekvence mezemíkové oblasti mezi geny kódujícími 16S rRNA a 23S rRNA jak u Pectinatus frisingensis tak u Pectinatus cerevisiiphilus. S využitím nukleotidové sekvence kódující gen 16S rRNA nebo oligonukleotidu vytvořeného z této sekvence jako primerů pro syntézu nukleových kyselin metodou PCR a s využitím genové amplifikace, byla vyvinuta rychlá a vysoce citlivá metoda posouzení existence Pectinatus frisingensis nebo Pectinatus cerevisiiphilus ve vzorcích.
Zkoumanými vzorky může být pivo, pivní polotovary nebo vzorek extrahovaný z kalu apod. Oligonukleotid vystupující jako primer může být syntetizován chemicky‘nebo být přírodním produktem.
Jak je ukázáno níže, je při způsobu podle předkládaného vynálezu Pectinatus frisingensis nebo Pectinatus cerevisiiphilus detekován pomocí metody PCR. Základní sekvence použité v metodě PCR nejsou limitovány příklady uvedenými výše - (5), (6), (11) a (12). Délka primerů použitých v metodě PCR je 19-20 bázi ve výše uvedených bodech (5), (6), (11) a (12), což není limitující. Preferují se primery o délce mezi 10-50 bázemi.
V případě detekce Pectinatus frisingensis metodou PCR je na existenci bakterie usuzováno z toho, že amplifikované DNA fragmenty jsou v případě kombinace primerů (l) a (6) kolem 700 párů bází a 900 párů bází a DNA fragmenty amplifikované pomocí kombinace primerů (2) a (6) kolem 700 párů bází a 900 párů bází. Když jsou tyto pruhy detekovány elektroforézou, usuzuje se, zeje přítomen druh Pectinatus frisingensis. Jelikož je kombinace primerů v každém případe specifická pro Pectinatus frisingensis, může být detekován rod. Současným užitím dvou kombináčípřiměřu jemožno dosáhnout dalšího přesnějšího určení. Žměnou základní sekvence primerů použitých metodou PCR může být změněna délka amplifikovaných nukleotidových sekvencí.
-3CZ 298165 B6
Na druhé straně, při detekci Pectinatus cerevisiiphilus metodou PCR je na existenci bakterie usuzováno z toho, že amplifíkované DNA fragmenty jsou v případě kombinace primerů (3) a (7) kolem 600 párů bází, amplifíkované DNA fragmenty pomocí kombinace primerů (4) a (7) kolem 650 párů bází, a DNA fragmenty amplifíkované kombinací primerů (5) a (7) kolem 700 párů 5 bází. Když jsou tyto pruhy detekovány elektroforézou, usuzuje se, zeje přítomen druh Pectinatus cerevisiiphihis. Jelikož je kombinace primerů v každém případě specifická pro Pectinatus cerevisiiphilus, může být detekován rod. Současným užitím dvou kombinací primerů je možno dosáhnout dalšího přesnějšího určení. Změnou základní sekvence primerů použitých metodou PCR může být změněna délka amplifikovaných nukleotidových sekvencí.
Teplotní podmínky jednoho cyklu metody PCR jsou 90-98 °C při tepelné denaturaci, kdy se dvoj šrouboví cová DNA mění v jednošroubovicovou DNA, 37 - 65 °C při tak zvané annealingové reakci, kdy dochází k nasednutí primerů na templátovou molekulu DNA a 50-75 °C pro vlastní elongační reakci katalyzovanou DNA polymerázou. Cílová sekvence může být ámplifiko15 vána v několika desítkách cyklů. Po provedení PCR reakce jsou produkty elektroforeticky rozseparovány a nukleová kyselina je barvena ethidium bromidem či podobně. Pokud je délka amplifikovaných nukleotidových sekvencí shodná s délkou výše uvedených cílových sekvencí, lze usoudit, že detekovaná bakterie je v testovaném vzorku. K detekci amplifíkované nukleotidové sekvence je možno použít chromatografii.
Sekvence v předkládaném vynálezu jsou popsány následovně:
SEQ ID NO: 1 - délka sekvence - 624, typ sekvence - nukleová kyselina, typ vlákna - dvojité, topologie lineární, molekulový typ - genomová DNA a originálním zdrojem je Pectinatus frisingensis DSM 6306.
SEQ ID NO: 2 - délka sekvence - 442, typ sekvence - nukleová kyselina, typ vlákna - dvojité, topologie lineární, molekulový typ - genomová DNA a originálním zdrojem je Pectinatus frisingensis DSM 6306.
SEQ ID NO: 3 - délka sekvence - 724, typ sekvence - nukleová kyselina, typ vlákna - dvojité, topologie lineární, molekulový typ - genomová DNA a originálním zdrojem je Pectinatus cere30 visiiphilus DSM 20467.
SEQ ID NO: 4 - délka sekvence - 399, typ sekvence - nukleová kyselina, typ vlákna - dvojité, topologie lineární, molekulový typ - genomová DNA a originálním zdrojem je Pectinatus cerevisiiphilus DSM 20467.
SEQ ID NO: 5 - délka sekvence - 19, typ sekvence - nukleová kyselina, typ vlákna -jednodu35 ché, topologie lineární, molekulový typ - genomová DNA a originálním zdrojem je Pectinatus frisingensis DSM 6306.
SEQ ID NO: 6 - délka sekvence - 20, typ sekvence - nukleová kyselina, typ vlákna - jednoduché, topologie lineární, molekulový typ - genomová DNA a originálním zdrojem je Pectinatus frisingensis DSM 6306.
SEQ ID NO: 7 - délka sekvence - 19, typ sekvence - nukleová kyselina, typ vlákna - jednoduché, topologie lineární, molekulový typ - genomová DNA a originálním zdrojem je Pectinatus cerevisiiphilus DSM 20467.
SEQ ID NO: 8 - délka sekvence - 20, typ sekvence - nukleová kyselina, typ vlákna - jednoduché, topologie lineární, molekulový typ - genomová DNA a originálním zdrojem je Pectinatus 45 cerevisiiphilus DSM 20467.
SEQ ID NO: 9 - délka sekvence - 20, typ sekvence - nukleová kyselina, typ vlákna - jednoduché, topologie lineární, molekulový typ - genomová DNA a originálním zdrojem je Pectinatus cerevisiiphilus DSM 20467.
SEQ ID NO: 10 - délka sekvence - 20, typ_sekyence - nukleová kyselina, typ vlákna - jednodu“50 ”čhě/topologie lineární, molekulový typ - genomová DŇA a originálním zdrojem je Pectinatus frisingensis DSM 6306.
-4CZ 298165 B6
SEQ ID NO: 11 - délka sekvence - 20, typ sekvence - nukleová kyselina, typ vlákna - jednoduché, topologie lineární, molekulový typ - genomová DNA a originálním zdrojem je Pectinatus cerevisiiphilus DSM 20467.
Předkládaný vynález je popsán na následujících pracovních příkladech. Vynález není těmito příklady limitován.
Příklad 1
Příprava testovaných vzorků io
Pectinatus frisingensis DSM 6306 a Pectinatus cerevisiiphilus
DSM 20467 byly použity jako bakteriální kmeny náležející rodu Pectinatus. K potvrzení specifičnosti primerů Pectinatus frisingensis a Pectinatus cerevisiiphilus ukázaných v SEQ ID NO: 5, 15 6, 7, 8, 9, 10 a 11 předkládaného vynálezu byly použity ostatní bakterie uvedené v tabulce 1.
Tyto bakterie byly kultivovány ve vhodných živných mediích a kmeny byly odděleny centrifugací. DNA byla extrahována v souladu s popisem poskytnutým SHIN -SEIKAGAKU-JIKKENKOZA 2, Nucleic acid I, Separation and Purification, p.p. 20-21 (vydáno Japan Biochemical Leamed Society, Tokyo-Kagaku-Dojin) a byl získán roztok DNA.
Tabulka 1
| .Bakterie č. | Typ bakterie | Název kmene | Poznámka |
| 1 | Pectinatus frisingensis | DSM6306 | Typ kmene |
| 2 | Pectinatus cerevisi iphilus | DSM20467 | Typ kmene |
| 3 | Selěnotňonas lacticifex | DSM20757 | Typ kmene |
| 4 ' | Zymophilus raffinosivorans | DSM20765 | Typ kmene |
| S | Zymoph'i.l.us paučivbrans | DSM2Ó756 | Typ kmene |
| 6 | Escherichi a coli | IF03301. | K-12 |
| 7 | Megasphaerá cerevisiae | DSM20462 | Typ kmene |
| 8 | Láctobačillus acidophilus | IF0Í3951 | Typ kmene |
| 9 | Lactobacillus plantarum | JCMU49 | Typ kmene |
| 10 | Lactobacillus brevis | JCM1059 | Typ kmene |
| 11 | Lactococcus lactis | JCM5805 | Typ kmene |
| 12 ‘ | Leuconostoc mesenteřóides | JCM6124 | Typ kmene |
| 13 | PediococcuS damnosus | JCM5836 | Typ kmene |
CZ 2951Ď5 B6
Příklad 2
Klonování mezemíkové oblasti mezi geny kódujícími 16S rRNA a 23S rRNA Pectinatus 5 frisingensis a zjištění základních sekvencí.
(1) Výběr a syntéza oligonukleotidových primerů pro amplifikaci mezemíkové oblasti 16S/23S rRNA metodou PCR,
Protože byly základní sekvence genu 16S rRNA Pectinatus frisingensis známy (íntemational Journal of Systematic Bacteriology, Vol. 40, p.p. 19-27 (1990)), byly primery vybrány v oblasti 557-576. báze základní sekvence.
Protože byly základní sekvence genu 23S rRNA Pectinatus frisingensis známy (Systematic 15 Applied Microbiology, Vol. 15, p.p.487-501 (1990)), EMBL Accession Number X48423), byly primery vybrány v oblasti 1-20. báze základní sekvence s cílem získat odpovídající komplementární sekvence. Syntézou byla pověřena Sawady Technology Co., Ltd.
(2) Amplifikace 16S/23S rRNA mezemíkové oblasti metodou PCR.
0,1 pg, roztoku DNA Pectinatus frisingensis, který byl připraven v příkladu 1, bylo vloženo do 0,2 ml zkumavky (vyrobené firmou Perkin-Elmer). K roztoku bylo přidáno 5 pl lOx koncentrovaného pufru pro rTag polymerázu (rTag DNA Polymerace Kit - Toyobo Co., Ltd), 3 μΐ 25 mM MgCL, 5 μΐ 2 mM směsi DTP (dATP, dGTP, dCTP a dTTP), 0,5 μΐ 100 mM primerů připrave25 ných v příkladu 2(1). Nakonec byla přidána sterilní voda do výsledného objemu 50 pl. Zkumavka byla umístěna na automatický amplifikační termální cyklátor (Perkin-Elmer) a byla provedena vlastní amplifikační reakce. Reakce byla opakována ve 30 cyklech a každý z cyklů měl následující podmínky:
Denaturace při 94 °C po dobu 2,5 minuty, denaturace při 94 °C 30 sekund, annealing primerů při 55 °C po dobu 30 sekund a vlastní syntetická reakce při 72 °C 30 sekund. Po skončení reakce bylo použito 5 μΐ roztoku pro elektroforézu na agarózovém gelu. DNA byla barvena ethidium bromidem a byly pozorovány amplifikované úseky DNA. Výsledek ukazuje, že došlo k amplifikaci DNA úseků dlouhých kolem 1600 párů bází (v dalším textu zkráceně (dlouhé) a kolem 35 1400 párů bází (v dalším textu zkráceně (krátké).
(3) Klonování a sekvenování mezemíkové oblasti dlouhé
S použitím vysoce účinné purifíkační sady pro PCR produkty (Boehringer Manheim) byly 40 odstraněny nezreagované dNTPs ze směsi po PCR reakci. Ke 100 ng výsledné amplifikované
DNA byly přidány 2 μΐ plazmidu pCR 2.1 obsaženého v TA klonovací sadě (INVITROGEN), 1 μΐ ligázy, 1 μ! ligačního pufru a nakonec sterilní voda do výsledného objemu 10 μΐ. Lígační reakce probíhala při 14 °C po dobu 4 hodin. Poté byly 2 μΐ reakční směsi a 2 μΐ 0,5M (β-merkaptoethanolu přidány ke kompetentním buňkám Escherichia coli INV a'F a zkumavka byla 45 umístěna na led po dobu 30 minut. Poté byla směs zahřívána při 42 °C 30 sekund a byla provedena plazmidová transformace kompetentních buněk. K transformovaným bakteriím bylo přidáno 250 pl SOC média (2,0% Tryptone, 0,5% kvasničný extrakt, 10,0 mM NaCl, 2,5 mM KC1, 10,0 mM MgC12.6H2O a 20,0 mM glukóza) a proběhla inkubace při 37 °C po dobu 60 minut za neustálého třepání. Následně byla směs přenesena na LB plotnu s živným médiem obsahujícím 50 50 pg/ml ampicilinu a 40 pg/ml X-Gal. Plotny byly inkubovány přes noc při teplotě 37 °C.
Vytvořené bílé kolonie byly přeneseny do 3 ml tekutého LB média obsahujícího 50 pg/ml ampi_čiIinú“akultivace probíhalapřesnoc při’37’°C “ .....
-6CL ZV31D3 Βϋ
Po kultivaci byly plazmidy extrahovány z bakterií pomocí plazmidové minisoupravy (QIAGEN). Část získaných plazmidů byla odebrána a podrobena restrikční analýze s EcoRl (vyrobeným Takara Shuzo) při 37 °C po dobu 60 minut. Fragmenty DNA byly separovány agarózovou elektroforézou, DNA byla barvena ethidium bromidem a tím došlo k potvrzení inzerce dlouhé 5 formy mezemíkové oblasti do klonovacího plazmidového vektoru. 500 ng zbylého plazmidů reagovalo s restrikčním enzymem Srna I (vyrobeným Toyobo Co., Ltd) při 30 °C 60 minut. K reakční směsi byly poté přidány 2 μΐ 3M acetátu sodného a 500 μΐ 100 % ethanolu a směs byla umístěna na 15 minut na led. Následovala centrifugace (15 000 otáček/minutu, 15 minut) a odstranění supematantu. K peletě bylo přidáno 500 μΐ 70 % ethanolu a směs byla centrifugována 10 (15 000 otáček/minutu, 15 minut). Byl odstraněn supernatant a peleta byla sušena 10 minut za sníženého tlaku. Peleta byla rozpuštěna ve sterilní vodě a směs byla podrobena restrikčnímu štěpení restriktázou Xbal (Boehringer Manheim) při 37 °C po dobu 60 minut. K reakční směsi byl přidán ekvivalentní objem směsi fenol/chloroform (1 : 1) a směs byla jemně promíchána. Následovala centrifugace (15 000 otáček/minutu, 15 minut) a byla odebrána vodní fáze (horní vrstva).
K odebrané tekutině byl přidán ekvivalentní objem vodou saturovaného etheru, směs byla jemně promíchána a centrifugována (15 000 otáček/minutu, 15 minut). Byla odebrána etherová fáze (horní vrstva). Ke zbývající vodní fázi byly přidány 2 μΐ 3M acetátu sodného a 500 μΐ 100 % ethanolu a směs byla umístěna po dobu 15 minut na led. Proběhla centrifugace (15 000 otáček/20 minutu, 15 minut) a byl odebrán supernatant. K peletě bylo přidáno 500 μΐ 70 % ethanolu, směs byla centrifugována (15 000 otáček/minutu, 15 minut), odstranil se supernatant a peleta byla sušena 10 minut za sníženého tlaku. K rozpuštění bylo použito 20 μΐ sterilní destilované vody. K 5 μΐ směsi byl přidán 1 μΐ lOx koncentrovaného pufru obsaženého v zatupující sadě (Takara Shuzo co., Ltd.), 3 μΐ sterilní destilované vody a směs byla ponechána 5 minut při teplotě 70 °C. 25 Poté byl přidán 1 μΐ T4DNA polymerázy a směs byla ponechána 5 minut při teplotě 37 °C,.aby byly získány zatupené konce DNA. Po inaktivaci T4DNA polymerázy promícháním, bylo přidáno 40 μΐ ligačního roztoku A a 10 μΐ ligačního roztoku B a výsledná směs byla ponechána při teplotě 16 °C po dobu 30 minut, potřebných k provedení interní ligace.
2 μΐ reakční směsi a 2 μΐ 0,5M β-merkaptoethanolu byly přidány ke kompetentním buňkám
Escherichia coli INV a'F a směs byla inkubována 30 minut na ledu. Poté byl proveden tak zvaný teplotní šok (42 °C, 30 sekund) a plazmid byl transformován do Escherichia coli. Ke transformovaným buňkám Escherichia coli bylo přidáno 250 μΐ SOC média (2,0 % Tryptone, 0,5 % kvasničný extrakt, 10,0 mM NaCl, 2,5 mM KC1, 10,0 mM MgCl2.6H2O a 20,0 mM glukóza) a směs 35 byla třepána při 37 °C po dobu 60 minut. Nakonec došlo k rozetření na LB plotny s živným médiem obsahujícím 50 pg/ml ampicilinu. Proběhla inkubace přes noc při 37 °C. Vzniklé bílé kolonie byly přeneseny do 3 ml tekutého LB média obsahujícího 50 μg/ml ampicilinu a následovala kultivace přes noc při 37 °C. Po kultivaci byl plazmid extrahován z Escherichia coli pomocí plazmidové minisady (QIAGEN Co.)
Takto získané plazmidy byly použity jako templáty pro sekvenační reakci. Jako sekvenační příměry byly použity IRD41 Infrared Dye Labeled M13 Forward primer a IRD41 Infrared Dye Labeled M13 Reverse primer (vyrobené Nisshinbo, prodávané Aroka Co., Ltd.). Jako sekvenační sada byl použit SequiTherm ® Long-Read® Cycle Sequencing Kit-LC (vyrobený EPICENTRE 45 TECHNOLOGIES). Pro určení sekvence bází byl použit sekvenační systém 4 000L Long
ReadlR® DNA Sequencing Systém (vyrobený LI-COR).
Genová sekvence mezemíkové oblasti dlouhé mezi geny kódujícími 16S rRNA a 23S rRNA bakterie Pectinatus frisingensis DSM 6306 je uvedena v SEQ ID NO: 1.
(4) Klonování a sekvenace mezemíkové oblasti krátké.
S použitím vysoce účinné purifikační sady pro PCR produkty (Boehringer Manheim) byly odstraněny nezreagované dNTPs ze směsi po PCR reakci provedené v příkladu 2(2). Ke 100 ng
CZ 2y»I65 B6 výsledné amplifikované DNA byly přidány 2 μΐ plazmidů pCR 2.1 obsaženého v TA klonovací sadě (INVITROGEN), 1 μΐ ligázy, 1 μΐ ligačního pufru a nakonec sterilní voda do výsledného objemu 10 μΐ. Ligační reakce probíhala při 14 °C po dobu 4 hodin. Poté byly 2 μΐ reakční směsi a 2 μΐ 0,5 M β-merkaptoethanolu přidány ke kompetentním buňkám Escherichia coli INV a'F a 5 zkumavka byla umístěna na led po dobu 30 minut. Poté byla směs zahřívána při 42 °C po dobu sekund a byla provedena plazmidová transformace kompetentních buněk. K transformovaným bakteriím bylo přidáno 250 μΐ SOC média (2,0 % Tryptone, 0,5 % kvasničný extrakt, 10,0 mM NaCl, 2,5 mM KC1, 10,0 mM MgCl2.6H2O a 20,0 mM glukóza) a proběhla inkubace při 37 °C po dobu 60 minut za neustálého třepání. Následně byla směs přenesena na LB plotnu s živným 10 médiem obsahujícím 50 pg/ml ampicilinu a 40 pg/ml X-Gal. Plotny byly inkubovány přes noc při teplotě 37 °C. Vytvořené bílé kolonie byly přeneseny do 3 ml tekutého LB média obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu a kultivace probíhala přes noc při 37 °C. Po kultivaci byly plazmidy extrahovány z bakterií pomocí plazmidové minisoupravy (QIAGEN).
Část získaných plazmidů byla odebrána a podrobena restrikční analýze s EcoRI (vyrobeným Takara Shuzo) při 37 °C po dobu 60 minut. Fragmenty DNA byly separovány agarózovou elektroforézou, DNA byla barvena ethidium bromidem a tím došlo k potvrzení inzerce krátké formy mezemíkové oblasti do klonovacího plazmidového vektoru. 500 ng zbylého plazmidů reagovalo s restrikčním enzymem Smál (vyrobeným Toyobo Co., Ltd) při 30 °C po dobu 60 minut. K reakční směsi byly poté přidány 2 μΐ 3M acetátu sodného a 500 μΐ 100 % ethanolu a směs byla umístěna na 15 minut na led. Následovala centrifugace (15 000 otáček/minutu, 15 minut) a odstranění supematantu. K peletě bylo přidáno 500 μΐ 70 % ethanolu a směs byla centrifugo vána (15 000 otáček/minutu, 15 minut). Byl odstraněn supernatant a peleta byla sušena 10 minut za sníženého tlaku. Peleta byla rozpuštěna ve sterilní vodě a směs byla podrobena restrikčnímu ště25 pění restriktázou Xbal (Boehringer Manheim) při 37 °C po dobu 60 minut. K reakční směsi byl přidán ekvivalentní objem směsi fenol/chloroform (1 : 1) a směs byla jemně promíchána. Následovala centrifugace (15 000 otáček/minutu, 15 minut) a byla odebrána vodní fáze (horní vrstva). K odebrané tekutině byl přidán ekvivalentní objem vodou saturovaného etheru, směs byla jemně promíchána a centrifugována (15 000 otáček/minutu, 15 minut). Byla odebrána etherová fáze 30 (horní vrstva). Ke zbývající vodní fázi byly přidány 2 μΐ 3M acetátu sodného a 500 μΐ 100 % ethanolu a směs byla umístěna 15 minut na led. Proběhla centrifugace (15 000 otáček/minutu, 15 minut) a byl odebrán v supernatant. K peletě bylo přidáno 500 μΐ 70 % ethanolu, směs byla centrifugována (15 000 otáček/minutu, 15 minut), odstranil se supernatant a peleta byla sušena 10 minut za sníženého tlaku. K rozpuštění bylo použito 20 μΐ sterilní destilované vody. K 5 μΐ 35 směsi byl přidán 1 μΐ lOx koncentrovaného pufru obsaženého v zatupující sadě (Takara Shuzo co., Ltd.), 3 μΐ sterilní destilovaného vody a směs byla ponechána 5 minut při teplotě 70 °C. Poté byl přidán 1 μΐ T4DNA polymerázy a směs byla ponechána 5 minut při teplotě 37 °C, aby byly získány zatupené konce DNA. Po inaktivaci T4DNA polymerázy promícháním bylo přidáno 40 μΐ ligačního roztoku A a 10 μΐ ligačního roztoku B a výsledná směs byla ponechána při teplotě 40 16 °C po dobu 30 minut, potřebných k provedení interní ligace. 2 μΐ reakční směsi a 2 μΐ 0,5 M β-merkaptoethanolu byly přidány ke kompetentním buňkám Escherichia coli INV cc'F a směs byla inkubována 30 minut na ledu. Poté byl proveden tak zvaný teplotní šok (42 °C, 30 sekund) a plazmid byl transformován do Escherichia coli.
Ke transformovaným buňkám Escherichia coli bylo přidáno 250 μΐ SOC média (2,0 % Tryptone, 0,5 % kvasničný extrakt, 10,0 mM NaCl, 2,5 mM KC1, 10,0 mM MgCl2.6H2O a 20,0 mM glukóza) a směs byla třepána při 37 °C po dobu 60 minut. Nakonec došlo k rozetření na LB plotny s živným médiem obsahujícím 50 pg/ml ampicilinu. Proběhla inkubace přes noc při 37 °C. Vzniklé bílé kolonie byly přeneseny do 3 ml tekutého LB média obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu a následovala kultivace přes noc při 37 °C. Po kultivaci byl plazmid extrahován z Escherichia coli ____^pomocí pl_azmidpyAminisady_(QlAGEN_Co.)___,______________________________.
-8Takto získané plazmidy byly použity jako templáty pro sekvenační reakci. Jako sekvenační příměry byly použity IRD41 Infrared Dye Labeled M13 Forward primer a IRD41 Infrared Dye Labeled M13 Reverse primer (vyrobené Nisshinbo, prodávané Aroka Co./Ltd.). Jako sekvenační sada byl použit SequiTherm® Long-Read® Cycle Sequencing Kit-LC (vyrobený EPICENTRE 5 TECHNOLOGIES). Pro určení sekvence bází byl použit sekvenační systém 4 000L Long ReadlR® DNA Sequencing Systém (vyrobený LI-COR).
Genová sekvence mezemíkové oblasti krátké mezi geny kódujícími 16S rRNA a 23S rRNA bakterie Pectinatus frisingensis DSM 6306 je uvedena v SEQ ID NO:2.
Příklad 3
Detekce Pectinatus frisingensis metodou PCR (1) Výběr a syntéza primerů pro Pectinatus frisingensis
Na základě sekvenci SEQ ID NO:I a SEQ ID NO:2 byly analyzovány specifické sekvence pro
Pectinatus frisingensis s pomocí DNASIS (tradename Hitachi Soft Engineering Ltd., Co.).
Výsledkem byl výběr sekvence mezi 377-395. bází genové sekvence mezemíkové oblasti mezi geny kódujícími 16S rRNA a 23S rRNA Pectinatus frisingensis představované SEQ ID NO:1 a výběr sekvence mezi 195—213—tou bází genové sekvence mezemíkové oblasti mezi geny kódujícími 16S rRNA a 23S rRNA Pectinatus frisingensis představované SEQ ID NO:2. (SEQ ID NO:5)
Kromě toho byla podobnou analýzou vybrána sekvence mezi 361-380. bází genové sekvence mezemíkové oblasti mezi geny kódujícími 16S rRNA a 23S rRNA Pectinatus frisingensis představované SEQ ID NO:1 a sekvence mezi 179-198. bází genové sekvence mezemíkové oblasti mezi geny kódujícími 16S rRNA a 23S rRNA Pectinatus frisingensis představované SÉQ ID 30 NO:2. (SEQ IDNO:6)
Dále byl vybrán specifický primer na základě genové sekvence kódující 16S rRNA Pectinatus frisingensis jak ukazuje SEQ ID NO: 10. Oligonukleotidy byly chemicky syntetizovány stejnou metodoujako v příkladu 2(1).
(2) Detekce a identifikace Pectinatus frisingensis pomocí primerů majících sekvence SEQ ID
NO:6aSEQ ID NO: 10
Roztok bakteriální DNA připravený v příkladu 1 byl použit k PCR reakci s využitím primerů 40 syntetizovaných v příkladu 3(1) (SEQ ID NO:6 a SEQ ID NO: 10). Teplotní podmínky PCR byly následovně:
Tepelná denaturace: 94 °C, 30 sekund.
Annealing; 55 eC, 30 sekund.
Řetězová elongační reakce: 72 °C, 30 sekund.
Reakce proběhla v 35 cyklech. Po skončení PCR byla reakční směs elektroforeticky separována na agarózovém gelu při konstantním napětí 100 V po dobu 30 minut. Při elektroforéze byl rovněž použit markér molekulové hmotnosti - pHY markér. Po ukončení elektroforézy byl agarózový gel barven v roztoku ethidium bromidu (0,5 μg/ml) po dobu 20 minut a pomocí ultrafialového 50 světla byl gel pozorován a vyfotografován. Z výsledků pozorování a fotografie gelu byla určena základní délka amplifikovaných produktů na základě relativní migrační vzdálenosti molekulo-------véhomarkerib-----------------------------------------—-----------------------9LL ZVeiDD BO
Jak ukazuje obr. 1, pouze v případě Pectinatus frisingensis byly pozorovány pruhy kolem 700 párů bází a 900 párů bází.
Z výsledků vyplývá, že při použití oligonukleotidů charakterizovaných sekvencemi SEQ ID
NO:6 a SEQ ID NO: 10 jako primerů pro PCR reakci, byly zjištěny pruhy objektivní délky pouze v případě Pectinatus frisingensis. Tím bylo ukázáno, že každý oligonukleotid předkládaného vynálezu správně rozeznává genovou sekvenci mezemíkové oblasti mezi geny kódujícími 16S rRNA a 23S rRNA Pectinatus frisingensis a cílovou základní sekvenci genu kódujícího 16S rRNA. Navíc pruhy požadované délky nebyly pozorovány u stejného rodu, u druhu Pectinatus cerevisiiphilus, což je relativně přísně anaerobní a grampozitivní bakterie. Proto tedy může být Pectinatus frisingensis specificky detekován a zároveň určen předkládaným vynálezem.
Příklad 4
Klonování mezemíkové oblasti mezi geny kódujícími 16S rRNA a 23S rRNA Pectinatus cerevisiiphilus a zjištění základních sekvencí.
(1) Výběr a syntéza oligonukleotidových primerů pro amplifikaci mezemíkové oblasti 16S/23S rRNA metodou PCR.
Jelikož je sekvence genu pro 16S rRNA Pectinatus cerevisiiphilus uveřejněná v Intemational
Joumal of Systematic Bacteriology, Vol.40, 19-27 (1990) byly primery vybrány na základě sek-ύ vence mezi 557-576. bází.;
I!
25Základní sekvence genu pro 23S rRNA Pectinatus cerevisiiphilus nebyla zveřejněna, ale základníi sekvence genu pro 23S rRNA Pectinatus frisingensis byla uveřejněna v Systematic Applied Microbiology, Vol.15, p.p. 487-501 (1990), EMBL Accession Number X48423. Primery byly vybrány jako komplementární sekvence odpovídající sekvenci mezi 1-20. bází genu pro 23S rRNA Pectinatusfrisingensis. Syntéza primerů byla svěřena Sawaday Technology.
(2) Amplifikace 16S/23S rRNA mezemíkové oblasti metodou PCR
0,1 μ§ roztoku DNA Pectinatus cerevisiiphilus, který byl připraven v příkladu 1, byl vložen do
0,2 ml zkumavky (vyrobené Perkin-Elmer). K roztoku bylo přidáno 5 μΐ lOx koncentrovaného pufru pro rTag polymerázu (rTag DNA Polymerase Kit - Toyobo Co., Ltd), 3 μΐ 25 mM MgCl2, 5 μΐ 2 mM směsi dNTP (dATP, dGTP, dCTP a dTTP), 0,5 μΐ 100 mM primerů připravených v příkladu 2(1). Nakonec byla přidána sterilní voda do výsledného objemu 50 μΐ. Zkumavka byla umístěna na automatický amplifikační termální cyklátor (Perkin-Elmer) a byla provedena vlastní amplifikační reakce. Reakce byla opakována ve 30 cyklech a každý z cyklů měl následující podmínky:
Denaturace při 94 °C po dobu 2,5 minuty, denaturace při 94 °C po dobu 30 sekund, annealing primerů při 55 °C po dobu 30 sekund a vlastní syntetická reakce při 72 °C po dobu 30 sekund. Po skončení reakce bylo použito 5 μΙ roztoku pro elektroforézu na agarózovém gelu. DNA byla barvena ethidium bromidem a byly pozorovány amplifíkované úseky DNA. Výsledek ukazuje, že došlo k amplifikaci DNA úseků dlouhých kolem 1 700 párů bází (zkráceně dlouhé) a kolem 1 400 párů bází (zkráceně krátké).
(3) Klonování a sekvenování mezemíkové oblasti dlouhé” _______S použitím vysoce účinné purifikační sady pro _PCR_produkty_(B.oehringer_Manheim)..byly_______ _____ odstraněny nezreagované dNTPs ze směsi po PCR reakci. Ke 100 ng výsledné amplifíkované DNA byly přidány 2 μΐ plazmidů pCR 2.1 obsaženého v TA klonovací sadě (INVITROGEN),
-10cz. zvaιοο bo μΐ ligázy, 1 μΙ ligačního pufru a nakonec sterilní voda do výsledného objemu 10 μΐ. Ligační reakce probíhala při 14 °C po dobu 4 hodin. Poté byly 2 μΐ reakční směsi a 2 μΐ 0,5 M β-merkaptoethanolu přidány ke kompetentním buňkám Escherichia coli INV a'F a zkumavka byla umístěna na led po dobu 30 minut. Poté byla směs zahřívána při 42 °C po dobu 30 sekund a byla 5 provedena plazmidová transformace kompetentních buněk. K transformovaným bakteriím bylo přidáno 250 μΐ SOC média (2,0 % Tíyptone, 0,5 % kvasničný extrakt, 10,0 mM NaCl, 2,5 mM KC1, 10,0 mM MgCl2..6H2O a 20,0 mM glukóza) a proběhla inkubace při 37 °C po dobu 60 minut za neustálého třepání. Následně byla směs přenesena na LB plotnu s živným médiem obsahujícím 50 pg/ml ampicilinu a 40 pg/ml X-Gal. Plotny byly inkubovány přes noc při teplotě io 37 °C. Vytvořené bílé kolonie byly přeneseny do 3 ml tekutého LB média obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu a kultivace probíhala přes noc při 37 °C.
Po kultivaci byly plazmidy extrahovány z bakterií pomocí plazmidové min i soupravy (QIAGEN). Část získaných plazmidů byla odebrána a podrobena restrikční analýze s EcoRI (vyrobeným 15 Takara Shuzo) při 37 °C po dobu 60 minut. Fragmenty DNA byly separovány agarózovou elektroforézou, DNA byla barvena ethidium bromidem a tím došlo k potvrzení inzerce dlouhé formy mezemíkové oblasti do klonovacího plazmidového vektoru. 500 ng zbylého plazmidů reagovalo s restrikčním enzymem Smál (vyrobeným Toyobo Co., Ltd) při 30 °C po dobu 60 minut. K reakční směsi byly poté přidány 2 μΐ 3 M acetátu sodného a 500 μΐ 100 % ethanolu a 20 směs byla umístěna na 15 minut na led. Následovala centrifugace (15 000 v otáček/minutu, 15 minut) a odstranění supernatantu. K peletě bylo přidáno 500 μΙ 70 % ethanolu a směs byla centrifugována (15 000 otáček/minutu, 15 minut). Byl odstraněn supematant a peleta byla sušena 10 minut za sníženého tlaku. Peleta byla rozpuštěna ve sterilní vodě a směs byla podrobena restrikčnímu štěpení restriktázou Xbal (Boehringer Manheim) při 37 °C po dobu 60 minut. K reakční 25 směsi byl přidán ekvivalentní objem směsi fenol/chloroform (1 ; 1) a směs byla jemně promíchána. Následovala centrifugace (15 000 otáček/minutu, 15 minut) a byla odebrána vodní fáze (horní vrstva). K odebrané tekutině byl přidán ekvivalentní objem vodou saturovaného etheru, směs byla jemně promíchána a centrifugo ván a (15 000 otáček/minutu, 15 minut). Byla odebrána etherová fáze (horní vrstva). Ke zbývající vodní fázi byly přidány 2 μΐ 3 M acetátu sodného a 30 5 00 μΐ 100 % ethanolu a směs byla umístěna 15 minut na led. Proběhla centrifugace (15 000 otáček/minutu, 15 minut) a byl odebrán supernatant.
K peletě bylo přidáno 500 μΐ 70 % ethanolu, směs byla centrifugována (15 000 otáček/minutu, 15 minut), odstranil se supematant a peleta byla sušena 10 minut za sníženého tlaku. K rozpuštění 35 bylo použito 20 μΐ sterilní destilované vody. K 5 μΐ směsi byl přidán 1 μΐ lOx koncentrovaného pufru obsaženého v žatupující sadě (Takara Shuzo co., Ltd.), 3 μΐ sterilní destilovaného vody a směs byla ponechána 5 minut při teplotě 70 °C. Poté byl přidán 1 μΐ T4DNA polymerázy a směs byla ponechána 5 minut při teplotě 37 °C, aby byly získány zatupené konce DNA. Po inaktivaci T4DNA polymerázy promícháním bylo přidáno 40 μΐ ligačního roztoku A a 10 μΐ ligačního roz40 toku B a výsledná směs byla ponechána při teplotě 16 °C po dobu 30 minut, potřebných k provedení interní ligace. 2 μΐ reakční směsi a 2 μΐ 0,5 M β-merkaptoethanolu byly přidány ke kompetentním buňkám Escherichia coli INV a'F a směs byla inkubována 30 minut na ledu. Poté byl proveden tak zvaný teplotní šok (42 °C, 30 sekund) a plazmid byl transformován do Escherichia coli.
Ke transformovaným buňkám Escherichia coli bylo přidáno 250 μΐ SOC média (2,0 % Tryptone, 0,5 % kvasničný extrakt, 10,0 mM NaCl, 2,5 mM KC1, 10,0 mM MgCl2..6H2O a 20,0 mM glukóza) a směs byla třepána při 37 °C po dobu 60 minut. Nakonec došlo k rozetření na LB plotny s živným médiem obsahujícím 50 pg/ml ampicilinu. Proběhla inkubace přes noc při 37 °C. Vzniklé 50 bílé kolonie byly přeneseny do 3 ml tekutého LB média obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu a _ následovala kultivace přes noc při 37 °C. Po kultivaci_by_l.plazmid. extrahov^ pomocí plazmidové mini sady (QIÁGEN Co.)
Takto získané plazmidy byly použity jako templáty pro sekvenační reakci. Jako sekvenační příměry byly použity IRD41 ínfrared Dye Labeled M13 Forward primer a IRD41 Infrared Dye Labeled Ml3 Reverse primer (vyrobené Nisshinbo, prodávané Aroka Co.,Ltd.). Jako sekvenační sada byl použit SequiTherm® Long-Read® Cycle Sequencing Kit-LC (vyrobený EPICENTRE 5 TECHNOLOGIES). Pro určení sekvence bází byl použit sekvenační systém 4 000L Long ReadlR® DNA Sequencing Systém (vyrobený LI-COR),
Genová sekvence mezemíkové oblasti dlouhé” mezi geny kódujícími 16S rRNA a 23S rRNA bakterie Pectinatus cerevisiiphilus je uvedena v SEQ ID NO:3.
(4) Klonování a sekvenace mezemíkové oblasti krátké”.
S použitím vysoce účinné puriftkacní sady pro PCR produkty (Boehringer Manheim) byly odstraněny nezreagované dNTPs ze směsi po PCR reakci provedené v příkladu 2(2). Ke 100 ng 15 výsledné amplifikované DNA byly přidány 2 μΐ plazmidů pCR 2.1 obsaženého v TA klonovací sadě (INVITROGEN), 1 μΐ ligázy, 1 μΐ ligačního pufru a nakonec sterilní voda do výsledného objemu 10 μΐ. Ligační reakce probíhala při 14 °C po dobu 4 hodin. Poté byly 2 μΐ reakční směsi a 2 μΐ 0.5 M β-merkaptoethanolu přidány ke kompetentním buňkám Escherichia coli INV a'F a zkumavka byla umístěna na led po dobu 30 minut. Poté byla směs zahřívána při 42 °C po dobu 20 30 sekund a byla provedena plazmidová transformace kompetentních buněk. K transformovaným bakteriím bylo přidáno 250 μΐ SOC média (2,0 % Tryptone, 0,5 % kvasničný extrakt, 10,0 mM NaCI, 2,5 mM KC1, 10,0 mM MgCl2.6H2O a 20,0 mM glukóza) a proběhla inkubace při 37 °C po dobu 60 minut za neustálého třepání, Následně byla směs přenesena na LB plotnu s živným médiem obsahujícím 50 μ§/ηι1 ampicílinu a 40 pg/ml X-Gal. Plotny byly inkubovány přes noc 25 při teplotě 37 °C. Vytvořené bílé kolonie byly přeneseny do 3 ml tekutého LB média obsahujícího 50 pg/ml ampicílinu a kultivace probíhala přes noc při 37 °C. Po kultivaci byly plazmidy extrahovány z bakterií pomocí plazmidové minisoupravy (QIAGEN).
Část získaných plazmidů bylo odebrána a podrobena restrikční analýze s EcoRI (vyrobeným 30 Takara Shuzo) při 37 °C po dobu 60 minut. Fragmenty DNA byly separovány agarózovou elektroforézou, DNA byla barvena ethidium bromidem a tím došlo k potvrzení inzerce krátké formy mezemíkové oblasti do klonovacího plazmidového vektoru. 500 ng zbylého plazmidů reagovalo s restrikčním enzymem Smál (vyrobeným Toyobo Co., Ltd) při 30 °C 60 minut. K reakční směsi byly poté přidány 2 μΐ 3 M acetátu sodného a 500 μΐ 100 % ethanolu a směs byla 35 umístěna na 15 minut na led. Následovala centrifugace (15 000 otáček/minutu, 15 minut) a odstranění supernatantu. K peletě bylo přidáno 500 μΐ 70 % ethanolu a směs byla centrifugována (15 000 otáček/minutu, 15 minut). Byl odstraněn supernatant a peleta byla sušena 10 minut za sníženého tlaku. Peleta byla rozpuštěna ve sterilní vodě a směs byla podrobena restrikčnímu štěpení restriktázou BamHI (Takara Shází Co.) při 37 °C po dobu 60 minut. K reakční směsi byl 40 přidán ekvivalentní objem směsi fenol/chlóroform (1 : 1) a směs byla jemně promíchána. Následovala centrifugace (15 000 otáček/minutu, 15 minut) a byla odebrána vodní fáze (horní vrstva), K odebrané tekutině byl přidán ekvivalentní objem vodou saturovaného etheru, směs byla jemně promíchána a centrifugována (15 000 otáček/minutu, 15 minut). Byla odebrána etherová fáze (horní vrstva). Ke zbývající vodní fázi byly přidány 2 μΐ 3 M acetátu sodného a 500 μΙ 100 % 45 ethanolu a směs byla umístěna 15 minut na led. Proběhla centrifugace (15 000 otáček/minutu, 15 minut) a byl odebrán supernatant.
K peletě bylo přidáno 500 μΐ 70 % ethanolu, směs byla centrifugována (15 000 otáček/minutu, 15 minut), odstranil se supernatant a peleta byla sušena 10 minut za sníženého tlaku. K rozpuštění 50 bylo použito 20 μΐ sterilní destilované vody. K 5 μ směsi byl přidán 1 μΐ lOx koncentrovaného pufru obsaženého v zatupující sadě (Takara Shuzo co., Ltd.), 3 μΐ sterilní destilovaného vody a ----- ---------------smgs. byla-ponechána-5-mínut pn-teplotě70 0C.“Poté_bylpřidán_l úl’T4DNA_polyřňčražy'a směs byla ponechána 5 minut při teplotě 37 °C, aby byly získány zatupené konce DNA. Po inaktivaci T4DNA polymerázy promícháním bylo přidáno 40 μΐ ligačního roztoku A a 1,0 μΐ ligačního roz
-12toku B a výsledná směs byla ponechána při teplotě 16 °C po dobu 30 minut, potřebných k provedení interní ligace. 2 μΐ reakční směsi a 2 μΐ 0,5 M β-merkaptoethanolu byly přidány ke kompetentním buňkám Escherichia coli INV a’F a směs byla inkubována 30 minut na ledu. Poté byl proveden tak zvaný teplotní šok (42 °C, 30 sekund) a plazmid byl transformován do Escherichia coli. Ke transformovaným buňkám Escherichia coli bylo přidáno 250 μΐ SOC média (2,0 % Tryptone, 0,5 % kvasničný extrakt, 10,0 mM NaCl, 2,5 mM KC1, 10,0 mM MgCl2..6H2O a 20,0 mM glukóza) a směs byla třepána při 37 QC po dobu 60 minut. Nakonec došlo k rozetření na LB plotny s živným médiem obsahujícím 50 pg/ml ampicilinu. Proběhla inkubace přes noc při 37 °C. Vzniklé bílé kolonie byly přeneseny do 3 ml tekutého LB média obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu a následovala kultivace pres noc při 37 °C. Po kultivaci byl plazmid extrahován z Escherichia coli pomocí plazmidové minisady (QIAGEN Co.)
Takto získané plazmidy byly použity jako templáty pro sekvenační reakci. Jako sekvenační primery byly použity IRD41 Infrared Dye Labeled Ml3 Forward primer a IRD41 Infrared Dye Labe led Ml 3 Reverse primer (vyrobené Nisshinbo, prodávané Aroka Co,,Ltd,). Jako sekvenační sada byl použit SequiTherm® Long-Read® Cycle Sequencing Kit-LC (vyrobený EPICENTRE TECHNOLOGIES). Pro určení sekvence bází byl použit sekvenační systém 4 000L Long ReadlR® DNA Sequencing Systém (vyrobený LI-COR).
Genová sekvence mezemíkové oblasti krátké mezi geny kódujícími 16S rRNA a 23S rRNA bakterie Pectinatus cerevisiiphilus je uvedena v SEQ ID NO:4.
Příklad 5
Detekce Pectinatus cerevisiiphilus metodou PCR (1) Výběr a syntéza primerů pro Pectinatus cerevisiiphilus
Na základě sekvence SEQ ID NO:3 byly analyzovány specifické sekvence pro Pectinatus cerevisiiphilus s pomocí DNASIS (obchodní značka Hitachi Soft Engineering Ltd., Co.). Výsledkem byl výběr sekvence mezi 135—153. bází genové sekvence mezerníkové oblasti mezi geny kódujícími 16S rRNA a 23S rRNA Pectinatus cerevisiiphilus představované SEQ ID NO:3 (SEQ ID N0:7).
Mimo to byla podobnou analýzou vybrána sekvence mezi 172-191. bází genové sekvence mezemíkové oblasti mezi geny kódujícími 16S rRNA a 23S rRNA Pectinatus cerevisiiphilus představované SEQ ID NO:3 (SEQ ID NO:8).
Podobnou analýzou byla rovněž vybrána sekvence mezi 203-222. bází genové sekvence mezerníkové oblasti mezi geny kódujícími 16S rRNA a 23S rRNA Pectinatus cerevisiiphilus představované SEQ ID NO:3 (SEQ ID NO:9).
Dále byl vybrán specifický primer na základě genové sekvence kóduj ící 16S rRNA Pectinatus cerevisiiphilus jak. ukazuje SEQ ID NO:11. Oligonukleotidy byly chemicky syntetizovány stejnou metodou jako v příkladu 2(1), (2) Detekce a identifikace Pectinatus cerevisiiphilus pomocí primerů majících sekvence SEQ ID NO:7 a SEQ IDNOil 1.
Roztok bakteriální DNA připravený v příkladu 1 byl použit k PCR reakci s využitím primerů ^syntetizovaných v_příkladu_5(l) (SEQ ID NO:7 a SEQ_ID ΝΟΠ1). Teplotnj podmínky PCR byjy_. následovně:
Tepelná denaturace: 94 °C, 30 sekund.
- 13A70JUJ DU
Annealing: 55 °C, 30 sekund.
Řetězová elongační reakce; 72 °C, 30 sekund.
Reakce proběhla ve 35 cyklech. Po skončení PCR byla reakční směs elektroforeticky separována na agarózovém gelu při konstantním napětí 100 V po dobu 30 minut. Při elektroforéze byl rovněž použit markér molekulové hmotnosti - pHY markér. Po ukončení elektroforézy byl agarózový gel barven v roztoku ethidium bromidu (0,5 ug/ml) po dobu 20 minut a pomocí ultrafialového světla byl gel pozorován a vyfotografován. Z výsledků pozorování a fotografie gelu byla určena základní délka amplifikovaných produktů na základě relativní migrační vzdálenosti molekuloio vého markéru.
Jak ukazuje obr. 2, pouze v případě Pectinatus cerevisiiphilus byl pozorován pruh kolem 600 párů bází.
Z výsledků vyplývá, že při použiti oligonukleotidů charakterizovaných sekvencemi SEQ ID NO:7 a SEQ ID NO: 11 jako primerů pro PCR reakci, byl zjištěn pruh objektivní délky pouze v případě Pectinatus cerevisiiphilus. Tím bylo ukázáno, že každý oligonukleotid podle předkládaného vynálezu správně rozeznává genovou sekvenci mezemíkové oblasti mezi geny kódujícími 16S rRNA a 23S rRNA Pectinatus cerevisiiphilus a cílovou základní sekvenci genu kódujícího 20 16S rRNA, Navíc pruhy požadované délky nebyly pozorovány u stejného rodu, u druhu
Pectinatus frisingensis, což je relativně přísně anaerobní a gram-pozitivní bakterie. Proto tedy může být Pectinatus cerevisiiphilus specificky detekován a zároveň určen podle předloženého vynálezu.
Předloženým vynálezem byly prokázány genové sekvence mezemíkové oblasti mezi geny pro 16S rRNA a 23S rRNA Pectinatus frisingensis a Pectinatus cerevisiiphilus a rychlá spolehlivá metoda detekce Pectinatus frisingensis a Pectinatus cerevisiiphilus je umožněna užitím části nebo užitím celých zjištěných genových sekvencí.
- 14XsL· A7OIUD DO
Seznam sekvencí <110> Ašahi Brewenes, Ltd.
< 1-2.0> Geny pro detekci bakterií a detekční metoda využívající tyto geny <130> 98T3-10 <160> 11 <210> 1.
<2Í1> 624:.
<212> DNA <213> Pectinatus frisingensis <400> 1
| gáag.tcgtaa | caaggtagcc | gtatcggaag | |
| ttctaaggať | 60 | ||
| taaaacaatc | cgtcgagcac | atccggaaca | |
| gtttctccct | 120 | ||
| caaaaaaaťa | gatagaacta. | atgggggcgt | |
| ťgccttgcaa | 180 | ||
| gcagggggtc | ággágttcáa | atctcctčgt | |
| gcctatagct | 240 | ||
| cagctggtta | gagcgcacgc | ctgataagcg | |
| tácttággcc | 300 | ||
| caccataatt | gcacattgaa | aactacacag | |
| aatčac.caat | 360 | ||
| gccaaacttg | tgagaggaga | ttttcaagag | |
| 5 | ccaágcacaá | 420 |
| gtgcggctgg tgtáttgttt | atcacctcct ggttttgagg | k-: |
| agctcagctg | ggagagcacc | |
| ctccaccaga | agagaaatgg | |
| ťgaggtcagt | agttcáagtc | |
| aagaaaagca | aagaacaatt | |
| gatggcgggg | aatagttgga |
-15\;L· A70103 DO
| tťaggaaačt | aaaaacaagc | taagacaaaa | catataaact | taágctaaag |
| gtgatattct | 480 | |||
| ggaggágáct | cgagaatata | ataaacttác | cagaagcgtt | cagatgcaag |
| gaagčatgáa | 540 | |||
| agcgaatgaa | gaaggcgtat | tagtatacgc | cgatgagtaga | gctgaaatga |
| tgacgáágca | 600 | |||
| gatgagcggt | tatggaaagt | ttaa 624 |
<210> 2 <211> 442 <212> DNA <2I3> Pectinatus frisingensis <400> 2
| gaagtcgtaa | caaggtagcc | gtatcggaag | gtgcggctgg | atcacctcct |
| t.tčtaággat | 60 | |||
| taaaacáatc | Cgtcgagcac | átccggaaca | tgtattgttt | ggttttgagg |
| gtttctccct | 120 | |||
| caaatattgc | acattgaaaa | ctacacagaa | gaaaagcaaa | gaacaattaa |
| tcaccaátgc | 180 | |||
| caaacttgtg | agaagagatt | ttcaagagga | tggcggggáa | tagttggácc |
| aagcacaatt | 240 | |||
| aggaaactaa | aáacaagcta | agacaaaaca | tataaactta | agctaaaggt |
| gatattqtgg | 300· | |||
| ággagactčg | agaatataat | aaacttacca | gaagcgttca | gatgcaagga |
| agcatgaaag | 360 | |||
| cgaatga.aga | aggcgtatta | .gtatacgccg | atgagtgagc | tgaaatgatg |
| acgaagcagá | .420 | |||
| tgagcggttá | tggaáágttt | aa 442 |
<210> 3 <211> 724 <212> DNA
-16CL ZVBI03 DO <213> Pectinacus cerevisiiphiluš <400> 3
| gaagtcgtaa | caaggtagcc | gtaťcggaag | gtgcggctgg | atcacctcct |
| ttctaaggat | 60 | |||
| t.tgacaaaáa | tctgtcgagt | aca.tccggaa | tatgtaťtgt | ttggttttga |
| gggtttctcc. | 120 | |||
| ctcataaata | tatagtagat | acttgtáágá | qtgtttatgg | tagtttaaá |
| agctggtcgg | 180 | |||
| aaatattgtg | gtgcaaaaaa | atgcatggca | gtagagaaga | ctggtaaaaa |
| aagaatgaác | 240 | |||
| taatgggggc | gtagctcága | tgggagagca | cctgccttgč | aagcaggggg |
| tcaggagttc | 300 | |||
| aactctcctč | gtctccacca | gaágagáaag | ggcctatagc | tcagctggtt |
| agagcgcacg | 360 | |||
| cctgataagc | gtgaggtcag | tagttcaagt | ctacttaggc | cčaccaatat |
| tgcacattga | 420 | |||
| aaactacaca | gaagaaagca | aagaaca.att | atcaccaatg | ccaaacttgt |
| aagagaaatc | 4B0 | |||
| gaggagagaá | tggčggggaa | tagttggacc | aagcáčáaat | taggaaaagá |
| aacaaacgct | 540 | |||
| aagaaacaaa | catataaact | taagcgaaaa | gg.tgatattc | tggaggáaac |
| ttcagágtat. | 600 | |||
| ataaacttac | cagaagcgtt | cagatgcgag | gaagggcaaa | gctgagagaa |
| gaaagčgtat | 660 | |||
| taatatacgc | tgatgaacga | ágcaaagcac | ťgacaaagca | gatggatggt |
| tatgggaagt | 720 | |||
| táca | 724 |
<210> 4 <211> 399 <212> DNA <213> Pectinatus cerevisiiphílus
- 17VZ, ZVOI03 KO <400> 4 gaagtcgtaa ttctaaggat ttgacaaaaa gggtttctcc ctcataaata tatcaccaaf gcčaaacttg atagttggac ttaggaaaag aggtgatatt ctggaggaaa ggaagggcaa agcactgaca caaggtagcc tctgtcgagt ttgcacattg ťaagagaaat čaagcácaáa aaacaaacga ct.tčagágta aagtagatgg.
gtatcggaag acatccggaa
120 aaaactacac
180 cgagaagagga
240 taagaaacaá
300 táfaaacťtá
360 atggttatgg gťgcggctgg tátgtattgt agaagaaagc atggcggggá acatataaac čcagaágcgt ^gaagttaca atcacctcct ttggttttga aaagaacaat ttaagcgaaa tcágatgcga
399 <21.0> 5 <211> 19 <2,12> DNA <213> Pectinatus frisingensis <400>- 5 ccatcctctt gaaaatctc •<21.0>· 6 <2’11> 20 <212> DNÁ <213> Pectinatus frisingensis <400> 6 tctcytctca caagtttggc '20 <210> 7 <2.11> 19 <212> DNA
-18A7OIUU DO <213> Pectinatus cerevisiiphiluš <400> 7 cactcttaca agtatctac 19 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Pectinatus cerevisiiphilus <400> 8 ccacaatatt tccgaccagc 20^ <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Pectinatus cerevisiiphilus <400> 9 agtcttctct actgccatgc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <21.3> Pectinatus frisingensis <4ÓÓ> 10 cgťatccaga gatggatatt 20 <21Ó> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Pectinatus cerevisiiphilus <40.0> 11 cgtatgcaga gatggatatt 20
-19ΕΔ Z7OID3 DD
Claims (6)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Oligonukleotid charakterizovaný genovou sekvencí mezemíkové oblasti mezi geny kódujícími 16S rRNA a 23S rRNA Pectinatus frisingensis mající alespoň jednu z následujících sekvenčních skupin nebojí odpovídající komplementární sekvenci:5'- CCATCCTCTTGAAAATCTC - 3’ (SEQ ID NO:5) ίο 5’- TCTCYTCTCACAAGTTTGGC - 3' (SEQ ID NO:6),
- 2. Oligonukleotid charakterizovaný genovou sekvencí mezemíkové oblasti mezi geny kódujícími 16S rRNA a 23S rRNA Pectinatus cerevisiiphilus mající alespoň jednu z následujících sekvenčních skupin nebojí odpovídající komplementární sekvenci:15 5' - CACTCTTACAAGTATCTAC - 3’ (SEQ ID NO:7)5’ - CC AC A AT ATTTCCG ACC AGG - 3’ (SEQ ID NO; 8)5' - AGTCTTCTCTACTGCCATGC - 3' (SEQ ID NO:9)
- 3. Způsob detekce Pectinatus frisingensis, vyznačující se tím, že se použije oligo-20 nukleotid vytvořený podle genové sekvence popsané v nároku 1 a nukleotidová sekvence kódující gen 16S rRNA Pectinatus frisingensis jako primery pro syntézu nukleových kyselin a využití nukleových kyselin genovou amplifikací k detekci bakterií,
- 4. Způsob detekce Pectinatus cerevisiiphilus, vyznačující se tí m , že se použije oli-25 gonukleotid vytvořený, podle genové sekvence popsané v nároku 2 a nukleotidová sekvence kódující gen 16S rRNA Pectinatus cerevisiiphilus jako primery pro syntézu nukleových kyselin a využití nukleových kyselin genovou amplifikací k detekci bakterií.
- 5. Způsob podle nároku3, vyznačující se tím, že nukleotidová sekvence kódující30 gen 16S rRNA Pectinatusfrisingensis má následující sekvenci:5’ - CGTATCCAG AGATGG ATATT - 3’ (SEQ ID NO: 10).
- 6. Způsob podle nároku4, vyznačující se tím, že nukleotidová sekvence kódující gen 16S rRNA Pectinatus cerevisiiphilus má následující sekvenci:35 5 - CGTATGCAGAGATGCATATT - 3' (SEQ ID NO: 11).
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22717798 | 1998-08-11 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2001542A3 CZ2001542A3 (en) | 2001-06-13 |
| CZ298165B6 true CZ298165B6 (cs) | 2007-07-11 |
Family
ID=16856702
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20010542A CZ298165B6 (cs) | 1998-08-11 | 1999-08-11 | Oligonukleotidy a zpusob detekce Pectinatus frisingensis a Pectinatus cerevisiiphilus s pouzitím techto oligonukleotidu |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6632642B1 (cs) |
| EP (1) | EP1106688A4 (cs) |
| JP (1) | JP4022045B2 (cs) |
| KR (1) | KR100436741B1 (cs) |
| CN (1) | CN1195850C (cs) |
| AU (1) | AU5196199A (cs) |
| CA (1) | CA2338015A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ298165B6 (cs) |
| TW (1) | TW577919B (cs) |
| WO (1) | WO2000009683A1 (cs) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002017356A (ja) * | 2000-07-03 | 2002-01-22 | Asahi Breweries Ltd | ペクチネータス属菌検出のための核酸プローブ、およびその細菌に由来する核酸の検出方法 |
| CN102337209A (zh) * | 2004-02-25 | 2012-02-01 | 三得利控股株式会社 | 细菌检测器具、细菌检测方法及细菌检测试剂盒 |
| JPWO2005093059A1 (ja) * | 2004-03-25 | 2008-02-14 | サッポロビール株式会社 | 酵母、乳酸菌及び偏性嫌気性菌検出・識別のためのプライマー及びプライマーセット並びにそれらを用いた検出・識別方法 |
| EP2703499A1 (en) | 2005-06-02 | 2014-03-05 | Fluidigm Corporation | Analysis using microfluidic partitioning devices to generate single cell samples |
| CN101469327B (zh) * | 2007-12-25 | 2011-02-02 | 天津生物芯片技术有限责任公司 | 对肺炎克雷伯氏菌肺炎或臭鼻亚种特异的its序列及应用 |
| EP2852682B1 (en) | 2012-05-21 | 2017-10-04 | Fluidigm Corporation | Single-particle analysis of particle populations |
| US9303281B2 (en) | 2012-07-23 | 2016-04-05 | Pall Corporation | Compositions for detecting foodstuff spoilage microorganisms |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0698800A (ja) * | 1992-09-21 | 1994-04-12 | Takara Shuzo Co Ltd | アコレプラズマの検出方法 |
| EP0806483A1 (en) * | 1995-11-28 | 1997-11-12 | Asahi Breweries, Ltd. | Detection of bacterium belonging to the genus pectinatus |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0452596A1 (en) * | 1990-04-18 | 1991-10-23 | N.V. Innogenetics S.A. | Hybridization probes derived from the spacer region between the 16S and 23S rRNA genes for the detection of non-viral microorganisms |
| JP3107904B2 (ja) * | 1992-04-07 | 2000-11-13 | 寳酒造株式会社 | ラクトバチルス属細菌の検出方法 |
| JP2935791B2 (ja) * | 1993-08-10 | 1999-08-16 | 寳酒造株式会社 | ラクトバチルス属細菌の検出プライマー |
| FI102298B (fi) * | 1995-09-07 | 1998-11-13 | Oulutech Oy | Menetelmä maitohappobakteerilajien määrittämiseksi ja menetelmään sove ltuvia oligonukleotideja |
| US6628535B1 (en) * | 2002-03-20 | 2003-09-30 | Formosa Electronic Industries Inc. | Voltage converter with selectable DC output voltage level |
-
1999
- 1999-08-11 CZ CZ20010542A patent/CZ298165B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1999-08-11 KR KR10-2001-7001697A patent/KR100436741B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1999-08-11 TW TW088113741A patent/TW577919B/zh not_active IP Right Cessation
- 1999-08-11 EP EP99937021A patent/EP1106688A4/en not_active Withdrawn
- 1999-08-11 WO PCT/JP1999/004341 patent/WO2000009683A1/ja active IP Right Grant
- 1999-08-11 CA CA002338015A patent/CA2338015A1/en not_active Abandoned
- 1999-08-11 JP JP2000565120A patent/JP4022045B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1999-08-11 US US09/762,633 patent/US6632642B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-08-11 CN CNB998113212A patent/CN1195850C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-11 AU AU51961/99A patent/AU5196199A/en not_active Abandoned
-
2003
- 2003-06-23 US US10/600,642 patent/US7160701B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0698800A (ja) * | 1992-09-21 | 1994-04-12 | Takara Shuzo Co Ltd | アコレプラズマの検出方法 |
| EP0806483A1 (en) * | 1995-11-28 | 1997-11-12 | Asahi Breweries, Ltd. | Detection of bacterium belonging to the genus pectinatus |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| EBI An CJ16SRNA (1995) * |
| EBI An LGU78983 (1997) * |
| EBI An Z29060 (10.10.1993) * |
| Ludwig,W. et al, Syst. Appl. Microbiol. 15:487-501,1992 * |
| Schleifer,K.H. et al., Int.J.System.Bact., vol.40, 19-27, 1990 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4022045B2 (ja) | 2007-12-12 |
| US7160701B2 (en) | 2007-01-09 |
| EP1106688A4 (en) | 2005-03-02 |
| US6632642B1 (en) | 2003-10-14 |
| TW577919B (en) | 2004-03-01 |
| EP1106688A1 (en) | 2001-06-13 |
| KR100436741B1 (ko) | 2004-06-22 |
| US20040018537A1 (en) | 2004-01-29 |
| CN1319136A (zh) | 2001-10-24 |
| CA2338015A1 (en) | 2000-02-24 |
| WO2000009683A1 (fr) | 2000-02-24 |
| CN1195850C (zh) | 2005-04-06 |
| KR20010072357A (ko) | 2001-07-31 |
| AU5196199A (en) | 2000-03-06 |
| CZ2001542A3 (en) | 2001-06-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Whittington et al. | Polymorphisms in IS1311, an insertion sequence common toMycobacterium aviumandM. aviumsubsp. paratuberculosis, can be used to distinguish between and within these species | |
| Johnson et al. | Natural atypical Listeria innocua strains with Listeria monocytogenes pathogenicity island 1 genes | |
| CN101113475B (zh) | 病原微生物检测用引物和使用所述引物的多重扩增 | |
| EP0581171B1 (en) | Species-specific oligonucleotides for bifidobacteria and a method of detection using the same | |
| EP0395292A2 (en) | Generation of specific probes for target nucleotide sequences | |
| Liu et al. | Use of the dnaJ gene for the detection and identification of all Legionella pneumophila serogroups and description of the primers used to detect 16S rDNA gene sequences of major members of the genus Legionella | |
| CZ298165B6 (cs) | Oligonukleotidy a zpusob detekce Pectinatus frisingensis a Pectinatus cerevisiiphilus s pouzitím techto oligonukleotidu | |
| Kim et al. | Development of Multiplex PCR assays to identify Escherichia Coli pathogenic genes in food | |
| US5869642A (en) | Detection of the genus pectinatus | |
| CN105256041B (zh) | 对亲水气单胞菌o44，o24，o25和o28特异的核苷酸及应用 | |
| CN105200045B (zh) | 对河流弧菌o11，o14,o16和o17特异的核苷酸及其应用 | |
| JP2010517584A (ja) | カンピロバクターの種同定のための遺伝的方法 | |
| KR19990088425A (ko) | 장관출혈성대장균검출을위한올리고뉴클레오티드및이를이용한검출방법 | |
| WO2019221219A1 (ja) | 細菌の検査方法、細菌の検査用マイクロアレイ、細菌の検査用キット、細菌の検査用プローブセット、及び細菌の検査用プライマーセット | |
| CN105256042B (zh) | 对亲水气单胞菌o13，o36，o16和o19特异的核苷酸及应用 | |
| Schoepe et al. | Controlled multiplex PCR of enterotoxigenicClostridium perfringensstrains in food samples | |
| CN105087569B (zh) | 对霍乱弧菌o18，o19，o23和o12特异的核苷酸及其应用 | |
| KR100812795B1 (ko) | 탄저균 검출용 프라이머, 프로브 및 이를 이용한 탄저균의검출방법 | |
| EP1321530B1 (en) | Method for detecting Escherichia coli | |
| JP2005160333A (ja) | オリゴヌクレオチド及びこれをプライマーとして用いたラクトバチルス属細菌の検出方法 | |
| AU2003220730B2 (en) | Genes for detecting bacteria and detection method by using the same | |
| CN105177133B (zh) | 对霍乱弧菌o6，o4，o7和o15特异的核苷酸及其应用 | |
| CN105256043B (zh) | 对亲水气单胞菌o29，o30，o33和o35特异的核苷酸及应用 | |
| CN105255871B (zh) | 对亲水气单胞菌o7，o8，o9和o10特异的核苷酸及应用 | |
| JPH07114719B2 (ja) | 細菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20100811 |