JP2002142771A - ヒト腸内フローラ検出用プローブ又はプライマー - Google Patents
ヒト腸内フローラ検出用プローブ又はプライマーInfo
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【解決手段】 合成の、及びＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｃ
ｌｕｓｔｅｒ ＣＡ７５由来のものから選ばれる特定の
塩基配列又は該塩基配列に相補的な配列を有するヒト腸
内に存在するプレボテラ クラスター又はクロストリジ
ウム クラスターに属する未同定菌群検出用プローブ又
はプライマー。 【効果】 本発明のプローブ又はプライマーを使用すれ
ば、菌を培養することなく、迅速、簡便に腸内細菌叢の
解析等を行うことができる。更に、解析の結果から消化
管等の状態が把握できるため、種々疾病等の予防・治療
が容易になる。
ｌｕｓｔｅｒ ＣＡ７５由来のものから選ばれる特定の
塩基配列又は該塩基配列に相補的な配列を有するヒト腸
内に存在するプレボテラ クラスター又はクロストリジ
ウム クラスターに属する未同定菌群検出用プローブ又
はプライマー。 【効果】 本発明のプローブ又はプライマーを使用すれ
ば、菌を培養することなく、迅速、簡便に腸内細菌叢の
解析等を行うことができる。更に、解析の結果から消化
管等の状態が把握できるため、種々疾病等の予防・治療
が容易になる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒト腸内フローラ
の解析、評価に有用なヒト腸内に存在する未同定菌群検
出用プローブ及びプライマー及びこれを用いた当該菌の
検出方法に関する。
の解析、評価に有用なヒト腸内に存在する未同定菌群検
出用プローブ及びプライマー及びこれを用いた当該菌の
検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ヒト腸内フローラにはおよそ１００種の
バクテリアが存在し、健康者は常時ほぼ一定のバランス
を保っている。これらの細菌は、消化の補助、ビタミン
の合成、外来菌の感染に対する防御的役割等をしている
といわれている。これらの腸内フローラ構成細菌のう
ち、プレボテラ属（Prevotella）やクロストリジウム属
（Clostridium）は、ビフィドバクテリウム属の細菌と
同様にヒト腸内フローラにおける最優勢菌群である。
バクテリアが存在し、健康者は常時ほぼ一定のバランス
を保っている。これらの細菌は、消化の補助、ビタミン
の合成、外来菌の感染に対する防御的役割等をしている
といわれている。これらの腸内フローラ構成細菌のう
ち、プレボテラ属（Prevotella）やクロストリジウム属
（Clostridium）は、ビフィドバクテリウム属の細菌と
同様にヒト腸内フローラにおける最優勢菌群である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかし、これらの腸内
細菌は嫌気性菌であることから、その多くが未だに培養
困難であり、分離・同定されていない菌種が多い。従っ
て、既に同定されている菌種だけを検出したのでは、腸
内フローラのバランスを正確に把握したとは言えない。
特に前記のプレボテラ属やクロストリジウム属に属する
菌の解析、評価は、前述のようにこれらの菌が腸内の最
優勢菌であり、特に重要な役割をしていることから特に
重要であり、これらに属する未同定菌群を検出する方法
が望まれていた。従って、本発明の目的はヒト腸内フロ
ーラを構成する重要菌のうち未同定菌群を検出できるプ
ローブ、プライマー及びこれを用いた当該菌群の検出法
を提供することにある。
細菌は嫌気性菌であることから、その多くが未だに培養
困難であり、分離・同定されていない菌種が多い。従っ
て、既に同定されている菌種だけを検出したのでは、腸
内フローラのバランスを正確に把握したとは言えない。
特に前記のプレボテラ属やクロストリジウム属に属する
菌の解析、評価は、前述のようにこれらの菌が腸内の最
優勢菌であり、特に重要な役割をしていることから特に
重要であり、これらに属する未同定菌群を検出する方法
が望まれていた。従って、本発明の目的はヒト腸内フロ
ーラを構成する重要菌のうち未同定菌群を検出できるプ
ローブ、プライマー及びこれを用いた当該菌群の検出法
を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】そこで本発明者は、ヒト
糞便から得られたＤＮＡを用いて１６ＳｒＤＮＡクロー
ンライブラリー法によりクローニングしたところ、プレ
ボテラ クラスター、クロストリジウム クラスター
IV、クロストリジウム クラスター XIVに属する未同
定菌由来の配列が得られた。そしてさらに検討したとこ
ろ、これらの菌群に特異的なプローブ及びプライマーが
得られ、それを用いればこれらの未同定菌群が検出でき
ることを見出し、本発明を完成した。
糞便から得られたＤＮＡを用いて１６ＳｒＤＮＡクロー
ンライブラリー法によりクローニングしたところ、プレ
ボテラ クラスター、クロストリジウム クラスター
IV、クロストリジウム クラスター XIVに属する未同
定菌由来の配列が得られた。そしてさらに検討したとこ
ろ、これらの菌群に特異的なプローブ及びプライマーが
得られ、それを用いればこれらの未同定菌群が検出でき
ることを見出し、本発明を完成した。
【０００５】すなわち、本発明は、配列番号１及び２か
ら選ばれる塩基配列又は該塩基配列に相補的な配列を有
するヒト腸内に存在するプレボテラ クラスターに属す
る未同定菌群検出用プローブを提供するものである。ま
た、本発明は、配列番号８及び９から選ばれる塩基配列
又は該塩基配列に相補的な配列を有するヒト腸内に存在
するプレボテラ クラスターに属する未同定菌群検出用
プライマーを提供するものである。また、本発明は、上
記のプローブ又はプライマーを用いることを特徴とする
ヒト腸内に存在するプレボテラ クラスターに属する未
同定菌群の検出方法を提供するものである。また、本発
明は、配列番号３及び４から選ばれる塩基配列又は該塩
基配列に相補的な配列を有するヒト腸内に存在するクロ
ストリジウム クラスター IVに属する未同定菌群検出
用プローブを提供するものである。また、本発明は、配
列番号１０及び１１から選ばれる塩基配列又は該塩基配
列に相補的な配列を有するヒト腸内に存在するクロスト
リジウム クラスター IVに属する未同定菌群検出用プ
ライマーを提供するものである。また、本発明は、上記
のプローブ又はプライマーを用いることを特徴とするヒ
ト腸内に存在するクロストリジウム クラスター IVに
属する未同定菌群の検出方法を提供するものである。ま
た、本発明は、配列番号５〜７から選ばれる塩基配列又
は該塩基配列に相補的な配列を有するヒト腸内に存在す
るクロストリジウム クラスター XIVに属する未同定
菌群検出用プローブを提供するものである。また、本発
明は、配列番号１２〜１４から選ばれる塩基配列又は該
塩基配列に相補的な配列を有するヒト腸内に存在するク
ロストリジウム クラスター XIVに属する未同定菌群
検出用プライマーを提供するものである。さらに、本発
明は、上記のプローブ又はプライマーを用いることを特
徴とするヒト腸内に存在するクロストリジウム クラス
ター XIVに属する未同定菌群の検出方法を提供するも
のである。
ら選ばれる塩基配列又は該塩基配列に相補的な配列を有
するヒト腸内に存在するプレボテラ クラスターに属す
る未同定菌群検出用プローブを提供するものである。ま
た、本発明は、配列番号８及び９から選ばれる塩基配列
又は該塩基配列に相補的な配列を有するヒト腸内に存在
するプレボテラ クラスターに属する未同定菌群検出用
プライマーを提供するものである。また、本発明は、上
記のプローブ又はプライマーを用いることを特徴とする
ヒト腸内に存在するプレボテラ クラスターに属する未
同定菌群の検出方法を提供するものである。また、本発
明は、配列番号３及び４から選ばれる塩基配列又は該塩
基配列に相補的な配列を有するヒト腸内に存在するクロ
ストリジウム クラスター IVに属する未同定菌群検出
用プローブを提供するものである。また、本発明は、配
列番号１０及び１１から選ばれる塩基配列又は該塩基配
列に相補的な配列を有するヒト腸内に存在するクロスト
リジウム クラスター IVに属する未同定菌群検出用プ
ライマーを提供するものである。また、本発明は、上記
のプローブ又はプライマーを用いることを特徴とするヒ
ト腸内に存在するクロストリジウム クラスター IVに
属する未同定菌群の検出方法を提供するものである。ま
た、本発明は、配列番号５〜７から選ばれる塩基配列又
は該塩基配列に相補的な配列を有するヒト腸内に存在す
るクロストリジウム クラスター XIVに属する未同定
菌群検出用プローブを提供するものである。また、本発
明は、配列番号１２〜１４から選ばれる塩基配列又は該
塩基配列に相補的な配列を有するヒト腸内に存在するク
ロストリジウム クラスター XIVに属する未同定菌群
検出用プライマーを提供するものである。さらに、本発
明は、上記のプローブ又はプライマーを用いることを特
徴とするヒト腸内に存在するクロストリジウム クラス
ター XIVに属する未同定菌群の検出方法を提供するも
のである。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明のプローブ及びプライマー
は、ヒト糞便から抽出したＤＮＡについて１６ＳｒＤＮ
Ａクローンライブラリー法を実施し、得られたクローン
ＤＮＡの配列を解読し、データベースにより系統解析を
行い、未同定菌群に属する細菌の１６ＳｒＤＮＡ配列を
解析し、これをさらにデータベースに登録されている近
縁菌種の塩基配列を比較検討して設計することができ
る。
は、ヒト糞便から抽出したＤＮＡについて１６ＳｒＤＮ
Ａクローンライブラリー法を実施し、得られたクローン
ＤＮＡの配列を解読し、データベースにより系統解析を
行い、未同定菌群に属する細菌の１６ＳｒＤＮＡ配列を
解析し、これをさらにデータベースに登録されている近
縁菌種の塩基配列を比較検討して設計することができ
る。
【０００７】１６ＳｒＤＮＡクローンライブラリー法に
より解析した未同定菌群は、表２〜４に示す如く、プレ
ボテラ クラスターに属するクローンＣＡ７５とＣＢ０
３はＣＡ７５菌群に分類でき；クロストリジウム クラ
スター IVに属するクローンＣＢ２５はＣＢ２５菌群に
分類でき；クロストリジウム クラスター XIVに属す
るクローンＧＡ３６、ＣＡ１６及びＣＢ２９はＧＡ３６
菌群に分類でき；クロストリジウム クラスター XIV
に属するクローン、ＧＡ２１、ＣＢ１９、ＥＢ０６、Ｅ
Ａ２９及びＣＡ２３はＧＡ２１菌群に分類できた。これ
らの配列のうち、ＣＡ７５菌群の配列を配列番号１５
に、ＣＢ２５菌群の配列を配列番号１６に、ＧＡ３６菌
群の配列を配列番号１７に、ＧＡ２１菌群の配列を配列
番号１８にそれぞれ示した。これらの配列は、クローン
ライブラリー作成時に検体Ｃ、Ｅ、Ｇをそれぞれ用いた
ときの異なった系統プライマーペア（系統Ａ；８Ｆ／Ｂ
ｉ８と１５Ｒ、系統Ｂ；６３ＭＦと１３９１Ｒ）で得ら
れた独立したクローン配列である。また、配列表で示す
クローン配列とそれぞれの菌群内の細菌の配列とは、９
９％以上の相同性を示す。
より解析した未同定菌群は、表２〜４に示す如く、プレ
ボテラ クラスターに属するクローンＣＡ７５とＣＢ０
３はＣＡ７５菌群に分類でき；クロストリジウム クラ
スター IVに属するクローンＣＢ２５はＣＢ２５菌群に
分類でき；クロストリジウム クラスター XIVに属す
るクローンＧＡ３６、ＣＡ１６及びＣＢ２９はＧＡ３６
菌群に分類でき；クロストリジウム クラスター XIV
に属するクローン、ＧＡ２１、ＣＢ１９、ＥＢ０６、Ｅ
Ａ２９及びＣＡ２３はＧＡ２１菌群に分類できた。これ
らの配列のうち、ＣＡ７５菌群の配列を配列番号１５
に、ＣＢ２５菌群の配列を配列番号１６に、ＧＡ３６菌
群の配列を配列番号１７に、ＧＡ２１菌群の配列を配列
番号１８にそれぞれ示した。これらの配列は、クローン
ライブラリー作成時に検体Ｃ、Ｅ、Ｇをそれぞれ用いた
ときの異なった系統プライマーペア（系統Ａ；８Ｆ／Ｂ
ｉ８と１５Ｒ、系統Ｂ；６３ＭＦと１３９１Ｒ）で得ら
れた独立したクローン配列である。また、配列表で示す
クローン配列とそれぞれの菌群内の細菌の配列とは、９
９％以上の相同性を示す。
【０００８】これらの配列とデータベースに登録されて
いる近縁菌種の塩基配列との対比により、既知の菌種に
ない共通配列を設計したところ、表２記載の配列を有す
るプローブ及び表３記載のプライマーが得られた。
いる近縁菌種の塩基配列との対比により、既知の菌種に
ない共通配列を設計したところ、表２記載の配列を有す
るプローブ及び表３記載のプライマーが得られた。
【０００９】配列番号１及び２はプレボテラ クラスタ
ーに属するＣＡ７５菌群に特異的であり、当該ＣＡ７５
菌群の検出用プローブである。配列番号８及び９はプレ
ボテラ クラスターに属するＣＡ７５菌群に特異的であ
り、当該ＣＡ７５菌群の検出用プライマーである。
ーに属するＣＡ７５菌群に特異的であり、当該ＣＡ７５
菌群の検出用プローブである。配列番号８及び９はプレ
ボテラ クラスターに属するＣＡ７５菌群に特異的であ
り、当該ＣＡ７５菌群の検出用プライマーである。
【００１０】配列番号３及び４はクロストリジウム ク
ラスター IVに属するＣＢ２５菌群に特異的であり、当
該ＣＢ２５菌群の検出用プローブである。配列番号１０
及び１１はクロストリジウム クラスター IVに属する
ＣＢ２５菌群に特異的であり、当該ＣＢ２５菌群の検出
用プライマーである。
ラスター IVに属するＣＢ２５菌群に特異的であり、当
該ＣＢ２５菌群の検出用プローブである。配列番号１０
及び１１はクロストリジウム クラスター IVに属する
ＣＢ２５菌群に特異的であり、当該ＣＢ２５菌群の検出
用プライマーである。
【００１１】配列番号５はクロストリジウム クラスタ
ー XIVに属するＧＡ３６菌群に特異的であり、当該Ｇ
Ａ３６菌群検出用プローブである。配列番号６はクロス
トリジウム クラスター XIVに属するＧＡ２１菌群及
びＧＡ３６菌群に特異的であり、当該ＧＡ２１菌群及び
ＧＡ３６菌群検出用プローブである。配列番号７はクロ
ストリジウム クラスター XIVに属するＧＡ２１菌群
に特異的であり、当該ＧＡ２１菌群検出用プローブであ
る。配列番号１２及び１３はクロストリジウムクラスタ
ー XIVに属するＧＡ３６菌群に特異的であり、当該Ｇ
Ａ３６菌群検出用プライマーである。配列番号１２及び
１４はクロストリジウム クラスターXIVに属するＧＡ
２１菌群に特異的であり、当該ＧＡ２１菌群検出用プラ
イマーである。
ー XIVに属するＧＡ３６菌群に特異的であり、当該Ｇ
Ａ３６菌群検出用プローブである。配列番号６はクロス
トリジウム クラスター XIVに属するＧＡ２１菌群及
びＧＡ３６菌群に特異的であり、当該ＧＡ２１菌群及び
ＧＡ３６菌群検出用プローブである。配列番号７はクロ
ストリジウム クラスター XIVに属するＧＡ２１菌群
に特異的であり、当該ＧＡ２１菌群検出用プローブであ
る。配列番号１２及び１３はクロストリジウムクラスタ
ー XIVに属するＧＡ３６菌群に特異的であり、当該Ｇ
Ａ３６菌群検出用プライマーである。配列番号１２及び
１４はクロストリジウム クラスターXIVに属するＧＡ
２１菌群に特異的であり、当該ＧＡ２１菌群検出用プラ
イマーである。
【００１２】本発明のプローブ又はプライマーとして
は、上記配列に相補的な配列も使用可能であり、また上
記配列に１〜数個の塩基を付加させた配列でも使用可能
である。
は、上記配列に相補的な配列も使用可能であり、また上
記配列に１〜数個の塩基を付加させた配列でも使用可能
である。
【００１３】これらのプローブ及びプライマーは、前記
それぞれの未同定菌群のみに特異的であるので、糞便か
ら得たＤＮＡを対象にしてＰＣＲ反応やＦＩＳＨ（Fluo
rescence in situ hybridazation）を行うことにより、
これらの未同定菌群をそれぞれ容易に検出できる。
それぞれの未同定菌群のみに特異的であるので、糞便か
ら得たＤＮＡを対象にしてＰＣＲ反応やＦＩＳＨ（Fluo
rescence in situ hybridazation）を行うことにより、
これらの未同定菌群をそれぞれ容易に検出できる。
【００１４】ＰＣＲ反応は例えば次の如くして行うこと
ができる。
ができる。
【００１５】まず、糞便等からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ
のサンプルとする。糞便等の希釈液からＤＮＡを抽出す
る方法としては、定法であるMarmur法、その変法である
酵素法、及びベンジルクロライド法が好ましい。これら
の方法は多少煩雑になるものの、酵素法において、幅広
い菌種から収率よくＤＮＡを抽出できる。また、菌体の
一部をバッファー又は滅菌水に懸濁し、９５℃、１５分
程度加熱したものを、テンプレートとして、ＰＣＲに供
することも可能である。
のサンプルとする。糞便等の希釈液からＤＮＡを抽出す
る方法としては、定法であるMarmur法、その変法である
酵素法、及びベンジルクロライド法が好ましい。これら
の方法は多少煩雑になるものの、酵素法において、幅広
い菌種から収率よくＤＮＡを抽出できる。また、菌体の
一部をバッファー又は滅菌水に懸濁し、９５℃、１５分
程度加熱したものを、テンプレートとして、ＰＣＲに供
することも可能である。
【００１６】抽出されたＤＮＡに本発明のプライマーを
組み合わせ、増幅反応を行うことにより、特異的なＤＮ
Ａ配列（ＰＣＲ産物）を得ることができる。通常、ＰＣ
Ｒ法等にプライマーを使用する際には、２種類のプライ
マーを１組として用いることが好ましい。例えば、配列
番号８及び９に係るプライマーを用いれば、多種類存在
する細菌群のうち、プレボテラ クラスターに属するＣ
Ａ７５菌群のＤＮＡにおいてのみ、両者のプライマー間
で増幅反応が起こり、これを同定することができる。こ
のように２種類のプライマーを組にして用いる場合は、
両者がリーディング鎖とラギング鎖との組み合わせにな
るようにする必要がある。また、ＰＣＲ反応を行う際、
アニーリングの温度はほぼ一定に設定してあるので、複
数種類のプライマーを同時に検定することも可能であ
る。また、ＰＣＲを行う際に、予め鋳型のＤＮＡ量を段
階希釈し、検出限界を求め同様の解析を行えば、目的と
する菌群の定量化も可能である。
組み合わせ、増幅反応を行うことにより、特異的なＤＮ
Ａ配列（ＰＣＲ産物）を得ることができる。通常、ＰＣ
Ｒ法等にプライマーを使用する際には、２種類のプライ
マーを１組として用いることが好ましい。例えば、配列
番号８及び９に係るプライマーを用いれば、多種類存在
する細菌群のうち、プレボテラ クラスターに属するＣ
Ａ７５菌群のＤＮＡにおいてのみ、両者のプライマー間
で増幅反応が起こり、これを同定することができる。こ
のように２種類のプライマーを組にして用いる場合は、
両者がリーディング鎖とラギング鎖との組み合わせにな
るようにする必要がある。また、ＰＣＲ反応を行う際、
アニーリングの温度はほぼ一定に設定してあるので、複
数種類のプライマーを同時に検定することも可能であ
る。また、ＰＣＲを行う際に、予め鋳型のＤＮＡ量を段
階希釈し、検出限界を求め同様の解析を行えば、目的と
する菌群の定量化も可能である。
【００１７】このようにして得られたＤＮＡを電気泳動
すれば、バンドの有無と用いたプライマーから菌群を同
定することができる。
すれば、バンドの有無と用いたプライマーから菌群を同
定することができる。
【００１８】また、本発明のプライマーは、前記それぞ
れの未同定菌群特異的な配列を有しているため、単独で
もプローブとして使用できる。さらに、本発明のプライ
マー単独もしくは複数と他の公知のユニバーサルプライ
マーやオリゴヌクレオチドとを組み合わせても用いるこ
とができる。
れの未同定菌群特異的な配列を有しているため、単独で
もプローブとして使用できる。さらに、本発明のプライ
マー単独もしくは複数と他の公知のユニバーサルプライ
マーやオリゴヌクレオチドとを組み合わせても用いるこ
とができる。
【００１９】また、本発明のプローブを用いて、ＦＩＳ
Ｈを行うには、例えばまず糞便等をホモゲナイズ後、Ｐ
ＢＳバッファー等で洗浄後、適当に希釈を行う。その糞
便希釈液を４％ホルマリン溶液で１晩固定する。そのホ
ルマリン固定サンプルをスライドに塗抹し乾燥後、ＦＩ
ＳＨ用サンプルとした。スライドに固定された糞便サン
プルに蛍光ラベルしたプローブを組み合わせハイブリダ
イゼーションを行うことにより、蛍光顕微鏡下で特異的
なリポソームＲＮＡ配列を持つ細菌のみを検出すること
ができる。例えば配列番号１に係るプローブを用いれ
ば、多種類存在する細菌群のうち、プレボテラ クラス
ターに属する未同定菌ＣＡ７５菌群のリボソームＲＮＡ
においてのみハイブリダイゼーションが起こり、これを
同定することができる。また、それを計数することによ
り目的とする菌群の定量化も可能である。
Ｈを行うには、例えばまず糞便等をホモゲナイズ後、Ｐ
ＢＳバッファー等で洗浄後、適当に希釈を行う。その糞
便希釈液を４％ホルマリン溶液で１晩固定する。そのホ
ルマリン固定サンプルをスライドに塗抹し乾燥後、ＦＩ
ＳＨ用サンプルとした。スライドに固定された糞便サン
プルに蛍光ラベルしたプローブを組み合わせハイブリダ
イゼーションを行うことにより、蛍光顕微鏡下で特異的
なリポソームＲＮＡ配列を持つ細菌のみを検出すること
ができる。例えば配列番号１に係るプローブを用いれ
ば、多種類存在する細菌群のうち、プレボテラ クラス
ターに属する未同定菌ＣＡ７５菌群のリボソームＲＮＡ
においてのみハイブリダイゼーションが起こり、これを
同定することができる。また、それを計数することによ
り目的とする菌群の定量化も可能である。
【００２０】また、本発明のプローブ又はプライマーを
用いれば、ヒト、動物等の腸内等の解析が行える。さら
に、その他の多岐にわたる細菌のプローブ又はプライマ
ーと組み合わせて用いれば、細菌叢の全体像を把握する
ことも可能である。
用いれば、ヒト、動物等の腸内等の解析が行える。さら
に、その他の多岐にわたる細菌のプローブ又はプライマ
ーと組み合わせて用いれば、細菌叢の全体像を把握する
ことも可能である。
【００２１】
【実施例】次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれにより何ら制限されるものではない。
が、本発明はこれにより何ら制限されるものではない。
【００２２】 実施例１ １６ＳｒＤＮＡクローン ライブラリー法 健康成人３名（Ｃ、Ｇ、Ｅ）の糞便を用い、以下の手順
に従い、糞便中の菌の系統樹を作製した。 （１）糞便からのＤＮＡ抽出：２５mgの糞便をＰＢＳバ
ッファーに浮遊・遠心回収を３〜４回繰り返して洗浄
後、ＤＮＡ抽出バッファー（100mM Tris-HCl, 40mM EDT
A, pH9.0）に懸濁して総量を４５０μＬとし、５０μＬ
の１０％ＳＤＳ、５００μＬのＴＥ飽和フェノール、３
００mgのガラスビーズ（直径0.1mm）を加え、激しく振
とうし、菌体を破砕した。上清を別のチューブに移し、
フェノール・クロロホルム処理、イソプロパノール沈
殿、７０％エタノールでの洗浄を順に行い、風乾して最
後に１００μＬのＴＥ（10mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM ED
TA）に溶解した。 （２）１６ＳｒＤＮＡ増幅ＰＣＲ反応：増幅プライマー
の異なる２系統で行った。総量を２５μＬとし、１０mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(pH8.3)、５０mM ＫＣｌ、１．５mM
ＭｇＣｌ2、２００μＭ ｄＮＴＰ mixture、０．５
Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラ社製）、５０
ngの鋳型糞便ＤＮＡ、さらに系列Ａとして全生物に共通
なプライマー（表１）８ＦとＢｉ８をそれぞれ０．２μ
Ｍずつと１５Ｒを０．４μＭ、又は、系列Ｂとして全生
物に共通なプライマー（表１）６３ＭＦと１３９１ＭＲ
を０．４μＭを含む反応液でＤＮＡサーマルサイクラー
ＰＴＣ２００（MJ Research社）により、９４℃２０
秒、５５℃１５秒、７２℃１８０秒を２５サイクル、Ｐ
ＣＲ反応を行った。
に従い、糞便中の菌の系統樹を作製した。 （１）糞便からのＤＮＡ抽出：２５mgの糞便をＰＢＳバ
ッファーに浮遊・遠心回収を３〜４回繰り返して洗浄
後、ＤＮＡ抽出バッファー（100mM Tris-HCl, 40mM EDT
A, pH9.0）に懸濁して総量を４５０μＬとし、５０μＬ
の１０％ＳＤＳ、５００μＬのＴＥ飽和フェノール、３
００mgのガラスビーズ（直径0.1mm）を加え、激しく振
とうし、菌体を破砕した。上清を別のチューブに移し、
フェノール・クロロホルム処理、イソプロパノール沈
殿、７０％エタノールでの洗浄を順に行い、風乾して最
後に１００μＬのＴＥ（10mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM ED
TA）に溶解した。 （２）１６ＳｒＤＮＡ増幅ＰＣＲ反応：増幅プライマー
の異なる２系統で行った。総量を２５μＬとし、１０mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(pH8.3)、５０mM ＫＣｌ、１．５mM
ＭｇＣｌ2、２００μＭ ｄＮＴＰ mixture、０．５
Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラ社製）、５０
ngの鋳型糞便ＤＮＡ、さらに系列Ａとして全生物に共通
なプライマー（表１）８ＦとＢｉ８をそれぞれ０．２μ
Ｍずつと１５Ｒを０．４μＭ、又は、系列Ｂとして全生
物に共通なプライマー（表１）６３ＭＦと１３９１ＭＲ
を０．４μＭを含む反応液でＤＮＡサーマルサイクラー
ＰＴＣ２００（MJ Research社）により、９４℃２０
秒、５５℃１５秒、７２℃１８０秒を２５サイクル、Ｐ
ＣＲ反応を行った。
【００２３】
【表１】
【００２４】（３）増幅産物のクローニング：ＰＣＲ反
応によって得られた増幅産物をＴＡクローニングキット
（invitorogen社製）を用いて付属のマニュアル通りに
クローニングを行った。すなわちＰＣＲ２．１ベクター
にＰＣＲ増幅産物を挿入後、大腸菌に導入し形質転換さ
せた。その後、５０μｇ／mLのアンピシリンと４０mg／
mLのＸ−ｇａｌを含むＬＢ（Luria Bertani）寒天培地
上に塗抹し、形成した青色コロニーをＬＢ液体培地で増
菌後、ＤＮＡを抽出してクローンＤＮＡを得た。 （４）クローンＤＮＡ配列の系統解析：得られたクロー
ンＤＮＡの配列を解読後、ＤＤＢＪ等のデータベースよ
り得られた近縁な細菌の１６ＳｒＤＮＡ塩基配列と系統
解析を行った（図１）。
応によって得られた増幅産物をＴＡクローニングキット
（invitorogen社製）を用いて付属のマニュアル通りに
クローニングを行った。すなわちＰＣＲ２．１ベクター
にＰＣＲ増幅産物を挿入後、大腸菌に導入し形質転換さ
せた。その後、５０μｇ／mLのアンピシリンと４０mg／
mLのＸ−ｇａｌを含むＬＢ（Luria Bertani）寒天培地
上に塗抹し、形成した青色コロニーをＬＢ液体培地で増
菌後、ＤＮＡを抽出してクローンＤＮＡを得た。 （４）クローンＤＮＡ配列の系統解析：得られたクロー
ンＤＮＡの配列を解読後、ＤＤＢＪ等のデータベースよ
り得られた近縁な細菌の１６ＳｒＤＮＡ塩基配列と系統
解析を行った（図１）。
【００２５】実施例２ プライマー及びプローブの作成 （１）上記で得られたこれまでに分離・同定されていな
い未同定菌群に属する細菌の１６ＳｒＤＮＡ配列（配列
番号１５〜１８）とＤＤＢＪ等のデータベースに登録さ
れている近縁菌種の塩基配列を比較・検討して設計し
た。その結果、配列番号１〜１４の塩基配列を有するプ
ローブ（表２）及びプライマー（表３）が得られた。こ
うして設計した塩基配列に従い、ＤＮＡ合成機を用いて
プローブ又はプライマーを合成した。
い未同定菌群に属する細菌の１６ＳｒＤＮＡ配列（配列
番号１５〜１８）とＤＤＢＪ等のデータベースに登録さ
れている近縁菌種の塩基配列を比較・検討して設計し
た。その結果、配列番号１〜１４の塩基配列を有するプ
ローブ（表２）及びプライマー（表３）が得られた。こ
うして設計した塩基配列に従い、ＤＮＡ合成機を用いて
プローブ又はプライマーを合成した。
【００２６】
【表２】
【００２７】
【表３】
【００２８】実施例３ 特異性の確認 以下の方法により、設計したプローブ及びプライマーの
特異性を確認した。 （１）プライマーの特異性の確認 （１−１）菌株の純粋培養及びＤＮＡ抽出：表４に示
す、７菌属３５菌種の腸内細菌を１％グルコース添加の
ＧＡＭブロス（ニッスイ社製）を用いて３７℃、嫌気的
に一晩培養した。これらの菌体からそれぞれＤＮＡを実
施例１−（１）の方法で抽出した。 （１−２）ＰＣＲ反応：総量を２５μＬとし、１０mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH8.3）、５０mM ＫＣｌ、１．５m
M ＭｇＣｌ2、２００μＭ ｄＮＴＰ混合物、０．５Ｕ
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラ社製）、５０ng
の鋳型ＤＮＡ、さらにそれぞれ０．４μＭのプライマー
を含む反応液でＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ２００
（MJ Research社製）により、９４℃２０秒、５５℃１
５秒、７２℃２０秒を３０サイクルのＰＣＲ反応を行っ
た。 （１−３）プライマーの特異性の検討：ＰＣＲ反応によ
って得られた増幅産物を電気泳動し、バンドの有無によ
りプライマーの各菌種のＤＮＡとの結合能を確認するこ
とで、プライマーの特異性を判定した。すなわち１．５
％アガロース（Molecular Biology Certified Agaros
e；バイオラッド社）でＭｕｐｉｄ−２（コスモ・バイ
オ社）によりＴＡＥバッファー中で１００Ｖ、２０分電
気泳動し、エチヂウムプロマイド（0.5mg/mL）で染色
後、紫外線ランプ下でバンドを確認した。その結果を表
４に示す。
特異性を確認した。 （１）プライマーの特異性の確認 （１−１）菌株の純粋培養及びＤＮＡ抽出：表４に示
す、７菌属３５菌種の腸内細菌を１％グルコース添加の
ＧＡＭブロス（ニッスイ社製）を用いて３７℃、嫌気的
に一晩培養した。これらの菌体からそれぞれＤＮＡを実
施例１−（１）の方法で抽出した。 （１−２）ＰＣＲ反応：総量を２５μＬとし、１０mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH8.3）、５０mM ＫＣｌ、１．５m
M ＭｇＣｌ2、２００μＭ ｄＮＴＰ混合物、０．５Ｕ
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラ社製）、５０ng
の鋳型ＤＮＡ、さらにそれぞれ０．４μＭのプライマー
を含む反応液でＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ２００
（MJ Research社製）により、９４℃２０秒、５５℃１
５秒、７２℃２０秒を３０サイクルのＰＣＲ反応を行っ
た。 （１−３）プライマーの特異性の検討：ＰＣＲ反応によ
って得られた増幅産物を電気泳動し、バンドの有無によ
りプライマーの各菌種のＤＮＡとの結合能を確認するこ
とで、プライマーの特異性を判定した。すなわち１．５
％アガロース（Molecular Biology Certified Agaros
e；バイオラッド社）でＭｕｐｉｄ−２（コスモ・バイ
オ社）によりＴＡＥバッファー中で１００Ｖ、２０分電
気泳動し、エチヂウムプロマイド（0.5mg/mL）で染色
後、紫外線ランプ下でバンドを確認した。その結果を表
４に示す。
【００２９】
【表４】
【００３０】 （１−４）プライマーを用いた細菌叢の解析：実施例３
の（１−２）のＰＣＲ反応液に実施例１の（１）の方法
で抽出した健康成人５例の糞便ＤＮＡの５０ngを鋳型と
してそれぞれの未同定菌群特異的プライマー（表３）を
用いてＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ２００（MJ Res
earch社製）により、９４℃２０秒、５５℃１５秒、７
２℃２０秒を３０サイクルのＰＣＲ反応を行った。その
結果、全例にこれらの未同定菌の存在が確認された。
の（１−２）のＰＣＲ反応液に実施例１の（１）の方法
で抽出した健康成人５例の糞便ＤＮＡの５０ngを鋳型と
してそれぞれの未同定菌群特異的プライマー（表３）を
用いてＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ２００（MJ Res
earch社製）により、９４℃２０秒、５５℃１５秒、７
２℃２０秒を３０サイクルのＰＣＲ反応を行った。その
結果、全例にこれらの未同定菌の存在が確認された。
【００３１】（２）プローブの特異性の確認 （２−１）ホールセル ハイブリダイゼーション（Whol
e cell hybridization）の使用菌株及びサンプル調製
法：菌株は、表４に示した７菌属３５菌種を用いた。こ
れらの菌株を１％グルコース添加ＧＡＭブロス（ニッス
イ社製）で３７℃１０時間培養し、冷ＰＢＳにて２回洗
浄後３．７％ホルマリン加ＰＢＳに懸濁し、一晩固定し
た。そして、冷ＰＢＳにて２回洗浄後５０％エタノール
ＰＢＳに懸濁し、−２０℃にて３０分以上置いたものを
サンプルに供した。 （２−２）ホールセル ハイブリダイゼーション及び検
出：ホールセル ハイブリダイゼーションは、エッペン
ドルフチューブ内で固定菌液５μＬに未同定菌群特異的
ＤＮＡプローブ（表２）４５０ngを含むハイブリダイゼ
ーション溶液１００μＬ（750mM NaCl, 100mM Tris-HCl
(pH7.8), 5mM EDTA,0.01％ BSA, 0.2％ Poly-A, 10％
デキストラン硫酸）を加え、４０℃で一晩ハイブリダイ
ゼーション反応を行った。その後、４５℃の洗浄溶液
（50mM NaCl,４mM Tris-HCl(pH7.8), 0.02mM EDTA）中
で２０分間洗浄し、その一部をドットブロッターで０．
４μｍのアイソポアメンブレン（ミリポア）上に吸引塗
抹した。最後にこのメンブレンを風乾後、無蛍光のスラ
イドグラス上に置きＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（Vector L
aboratories）にて封入した。また、シグナルの有無の
判定は、蛍光顕微鏡（OLYMPUS BX-FLA）下でシグナルの
有無を観察した。実施した３５菌種からは、シグナルが
得られなかった。 （２−３）Fluorescence in situ hybridization(FISH)
法を用いた細菌叢の解析：試料には、健常成人５例の新
鮮大便を用いた。この大便を嫌気条件下で嫌気希釈液を
用いて１０倍希釈した。大便希釈液１mLと３mLの４％パ
ラホルムアルデヒド溶液を混合後、４℃で一晩静置し
た。ゼラチンコートスライドグラス（温浴中で完全に溶
解した0.1％ゼラチン水溶液に最終濃度0.01％のKCr(S
O4)212H2Oを添加したものに30分間スライドグラスを浸
し、風乾したもの）の１cm2の枡目上にサンプル１０μ
Ｌを均一に塗抹して風乾した。このスライドグラスを９
６％エタノールで１０分間処理し、風乾後サンプル塗抹
上にプローブ５００ngを含むハイブリダイゼーション溶
液１００μＬ（750mM NaCl, 100mM Tris-HCl(pH7.8), 5
mMEDTA, 0.01％BSA, 0.2％Poly-A, 10％ dextran sulfa
te）を滴下しカバーグラスを載せた後、湿潤下で４５℃
にて一晩ハイブリダイゼーションを行った。その後、４
５℃の洗浄溶液（50mM NaCl, 4mM Tris-HCl(pH7.8), 0.
02mM EDTA）中で２０分間洗浄し、さらに純水で一回洗
浄した。風乾後、スライドグラス上をＶＥＣＴＡＳＨＩ
ＥＬＤ（Vector Laboratories）にて封入した。標的で
ある未同定菌群の検出・計数には、蛍光顕微鏡（OLYMPU
S BX-FLA）とＣＣＤカメラ（FUJIXHC-2500）を用いた。
その結果を表５に示した。
e cell hybridization）の使用菌株及びサンプル調製
法：菌株は、表４に示した７菌属３５菌種を用いた。こ
れらの菌株を１％グルコース添加ＧＡＭブロス（ニッス
イ社製）で３７℃１０時間培養し、冷ＰＢＳにて２回洗
浄後３．７％ホルマリン加ＰＢＳに懸濁し、一晩固定し
た。そして、冷ＰＢＳにて２回洗浄後５０％エタノール
ＰＢＳに懸濁し、−２０℃にて３０分以上置いたものを
サンプルに供した。 （２−２）ホールセル ハイブリダイゼーション及び検
出：ホールセル ハイブリダイゼーションは、エッペン
ドルフチューブ内で固定菌液５μＬに未同定菌群特異的
ＤＮＡプローブ（表２）４５０ngを含むハイブリダイゼ
ーション溶液１００μＬ（750mM NaCl, 100mM Tris-HCl
(pH7.8), 5mM EDTA,0.01％ BSA, 0.2％ Poly-A, 10％
デキストラン硫酸）を加え、４０℃で一晩ハイブリダイ
ゼーション反応を行った。その後、４５℃の洗浄溶液
（50mM NaCl,４mM Tris-HCl(pH7.8), 0.02mM EDTA）中
で２０分間洗浄し、その一部をドットブロッターで０．
４μｍのアイソポアメンブレン（ミリポア）上に吸引塗
抹した。最後にこのメンブレンを風乾後、無蛍光のスラ
イドグラス上に置きＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（Vector L
aboratories）にて封入した。また、シグナルの有無の
判定は、蛍光顕微鏡（OLYMPUS BX-FLA）下でシグナルの
有無を観察した。実施した３５菌種からは、シグナルが
得られなかった。 （２−３）Fluorescence in situ hybridization(FISH)
法を用いた細菌叢の解析：試料には、健常成人５例の新
鮮大便を用いた。この大便を嫌気条件下で嫌気希釈液を
用いて１０倍希釈した。大便希釈液１mLと３mLの４％パ
ラホルムアルデヒド溶液を混合後、４℃で一晩静置し
た。ゼラチンコートスライドグラス（温浴中で完全に溶
解した0.1％ゼラチン水溶液に最終濃度0.01％のKCr(S
O4)212H2Oを添加したものに30分間スライドグラスを浸
し、風乾したもの）の１cm2の枡目上にサンプル１０μ
Ｌを均一に塗抹して風乾した。このスライドグラスを９
６％エタノールで１０分間処理し、風乾後サンプル塗抹
上にプローブ５００ngを含むハイブリダイゼーション溶
液１００μＬ（750mM NaCl, 100mM Tris-HCl(pH7.8), 5
mMEDTA, 0.01％BSA, 0.2％Poly-A, 10％ dextran sulfa
te）を滴下しカバーグラスを載せた後、湿潤下で４５℃
にて一晩ハイブリダイゼーションを行った。その後、４
５℃の洗浄溶液（50mM NaCl, 4mM Tris-HCl(pH7.8), 0.
02mM EDTA）中で２０分間洗浄し、さらに純水で一回洗
浄した。風乾後、スライドグラス上をＶＥＣＴＡＳＨＩ
ＥＬＤ（Vector Laboratories）にて封入した。標的で
ある未同定菌群の検出・計数には、蛍光顕微鏡（OLYMPU
S BX-FLA）とＣＣＤカメラ（FUJIXHC-2500）を用いた。
その結果を表５に示した。
【００３２】
【表５】
【００３３】
【発明の効果】本発明のプローブ又はプライマーを使用
すれば、菌を培養することなく、迅速、簡便に腸内細菌
叢の解析等を行うことができる。さらに、解析の結果か
ら消化管等の状態が把握できるため、種々疾病等の予防
・治療が容易になる。
すれば、菌を培養することなく、迅速、簡便に腸内細菌
叢の解析等を行うことができる。さらに、解析の結果か
ら消化管等の状態が把握できるため、種々疾病等の予防
・治療が容易になる。
【００３４】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> KABUSHIKI KAISHA YAKULT HONSHA <120> A probe or primer for detection of human intestinal bacterial flora <130> P05181211 <160> 18 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Designed DNA based on 16SrDNA of CA75 <400> 1 ctagggatat catcgggtat tag 23
【００３５】 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Designed DNA based on 16SrDNA of CA75 <400> 2 gatttgatcc cttttgcaag gg 22
【００３６】 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Designed DNA based on 16SrDNA of CB25 <400> 3 gtccatcctg aagcgaataa atc 23
【００３７】 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Designed DNA based on 16SrDNA of CB25 <400> 4 ccggtgcttt cttgttagg 19
【００３８】 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Designed DNA based on 16SrDNA of GA36 <400> 5 tcagacttgt ccatccgtct a 21
【００３９】 <210> 6 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Designed DNA based on 16SrDNA of GA21 and GA36 <400> 6 ccgagccatg cagctct 17
【００４０】 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Designed DNA based on 16SrDNA of GA21 <400> 7 aagagaaggc cccgttac 18
【００４１】 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Designed DNA based on 16SrDNA of CA75 <400> 8 ctgttggyct gaataggtca g 21
【００４２】 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Designed DNA based on 16SrDNA of CA75 <400> 9 gatttgatcc cttttgcaag gg 22
【００４３】 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Designed DNA based on 16SrDNA of CB25 <400> 10 gggaaaagga tttattcgct tcag 24
【００４４】 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Designed DNA based on 16SrDNA of CB25 <400> 11 tgcactactc aaggccag 18
【００４５】 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Designed DNA based on 16SrDNA of GA36 and GA21 <400> 12 cacagagctg catggctc 18
【００４６】 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Designed DNA based on 16SrDNA of GA36 <400> 13 cctttcacat cagacttgtc cat 23
【００４７】 <210> 14 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Designed DNA based on 16SrDNA of GA21 <400> 14 cggcactcga gccaga 16
【００４８】 <210> 15 <211> 1524 <212> DNA <213> Prevotella cluster CA75 <400> 15 gggtttcgat tctggctcag gatgaacgct agctacaggc ttaacacatg caagtcgagg 60 ggaaacgaca tcgaaagctt gcttttgatg ggcgtcgacc ggcgcacggg tgagtaacgc 120 gtatccaacc tgcccaccac ttggggataa ccttgcgaaa gtaagactaa tacccgatga 180 tatccctaga agacatctga aagggattaa agatttatcg gtgatggatg gggatgcgtc 240 tgattagctt gttggcgggg taacggccca ccaaggcaac gatcagtagg ggttctgaga 300 ggaaggtccc ccacattgga actgagacac ggtccaaact cctacgggag gcagcagtga 360 ggaatattgg tcaatgggcg agagcctgaa ccagccaagt agcgtgcagg acgacggccc 420 tatgggttgt aaactgcttt tataagggaa taaagtgagt ctcgtgagac tttttgcatg 480 taccttatga ataaggaccg gctaattccg tgccagcagc cgcggtaata cggaaggtcc 540 gggcgttatc cggatttatt gggtttaaag ggagcgtagg ccggagatta agcgtgttgt 600 gaaatgtaga cgctcaacgt ctgcactgca gcgcgaactg gtttccttga gtacgcacaa 660 agtgggcgga attcgtggtg tagcggtgaa atgcttagat atcacgaaga actccgattg 720 cgaaggcagc tcactggagc gcaactgacg ctgaagctcg aaagtgcggg tatcgaacag 780 gattagatac cctggtagtc cgcacggtaa acgatggatg cccgctgttg gcctgaatag 840 gtcagcggcc aagcgaaagc attaagcatc ccacctgggg agtacgccgg caacggtgaa 900 actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggaggaac atgtggttta attcgatgat 960 acgcgaggaa ccttacccgg gcttgaattg cagaggaagg atttggagac aatgacgccc 1020 ttcggggtct ctgtgaaggt gctgcatggt tgtcgtcagc tcgtgccgtg aggtgtcggc 1080 ttaagtgcca taacgagcgc aacccctctc ctcagttgcc atcaggtcat gctgggcact 1140 ctggggacac tgccaccgta aggtgtgagg aaggtgggga tgacgtcaaa tcagcacggc 1200 ccttacgtcc ggggctacac acgtgttaca atggcaggta cagagagacg gtcccttgca 1260 aaagggatca aatcctcaaa gcctgtctca gttcggactg gggtctgcaa cccgacccca 1320 cgaagctgga ttcgctagta atcgcgcatc acccatggcg cggtgaatac gttcccgggc 1380 cttgtacaca ccgcccgtca agccatgaaa gccgggggcg cctaaagtcc gtgaccgtaa 1440 ggagcggcct agggcgaaac tggtaattgg ggctaagtcg taacaaggta gccgtaccgg 1500 aaggtgcggc tggatcacct cctt 1524
【００４９】 <210> 16 <211> 1331 <212> DNA <213> Clostridium cluster IV CB25 <400> 16 aacacatgca agtcgaacgg agtcaagagg agcttgcttt tcttgactta gtggcgaacg 60 ggtgagtaac gcgtgagtaa cctgccctgg agtgggggac aacagttgga aacgactgct 120 aataccgcat aagcccacga tccggcatcg gattgaggga aaaggattta ttcgcttcag 180 gatggactcg cgtccaatta gctagttggt gaggtaacgg cccaccaagg cgacgattgg 240 tagccggact gagaggttga acggccacat tgggactgag acacggccca gactcctacg 300 ggaggcagca gtgggggata ttgcacaatg ggggaaaccc tgatgcagcg acgccgcgtg 360 gaggaagaag gttttcggat tgtaaactcc tgtcgttagg gacgataatg acggtaccta 420 acaagaaagc accggctaac tacgtgccag cagccgcggt aaaacgtagg gtgcaagcgt 480 tgtccggaat tactgggtgt aaagggagcg caggcggacc ggcaagttgg aagtgaaaac 540 tatgggctca acccataaat tgctttcaaa actgctggcc ttgagtagtg cagaggtagg 600 tggaattccc ggtgtagcgg tggaatgcgt agatatcggg aggaacacca gtggcgaagg 660 cgacctactg ggcaccaact gacgctgagg ctcgaaagca tgggtagcaa acaggattag 720 ataccctggt agtccatgcc gtaaacgatg attactaggt gttggaggat tgaccccttc 780 agtgccgcag ttaacacaat aagtaatcca cctggggagt acgaccgcaa ggttgaaact 840 caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagca gtggagtatg tggtttaatt cgaagcaacg 900 cgaagaacct taccaggtct tgacatccga tgcatagtgc agagatgcat gaagtccttc 960 gggacatcga gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta 1020 agtcccgcaa cgagcgcaac ccttattgcc agttactacg caagaggact ctggcgagac 1080 tgccgttgac aaaacggagg aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc ctttatgacc 1140 tgggctacac acgtactaca atggcgttta acaaagagag gcaagaccgc gaggtggagc 1200 aaaactcaaa aacaacgtct cagttcagat tgcaggctgc aactcgcctg catgaagtcg 1260 gaattgctag taatcgcgga tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac 1320 accgcccgtc a 1331
【００５０】 <210> 17 <211> 1522 <212> DNA <213> Clostridium cluster XIV GA36 <400> 17 agagtttgat catggctcag gatgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgaac 60 gggaattact ttattgaaac ttcggtcgat atgatttaat tctagtggcg gacgggtgag 120 taacgcgtgg gtaacctgcc ttatacaggg ggataacagt cagaaatgac tgctaatacc 180 gcataagcgc acagagctgc atggctcggt gtgaaaaact ccggtggtat aagatggacc 240 cgcgttggat tagctagttg gtgaggtaac ggcccaccaa ggcgacgatc catagccggc 300 ctgagagggt gaacggccac attgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag 360 cagtggggaa tattgcacaa tgggggaaac cctgatgcag cgacgccgcg tgaaggaaga 420 agtatctcgg tatgtaaact tctatcagca gggaagaaaa tgacggtacc tgactaagaa 480 gccccggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta gggggcaagc gttatccgga 540 tttactgggt gtaaagggag cgtagacgga tggacaagtc tgatgtgaaa ggctggggct 600 caaccccggg actgcattgg aaactgcccg tcttgagtgc cggagaggta agcggaattc 660 ctagtgtagc ggtgaaatgc gtagatatta ggaggaacac cagtggcgaa ggcggcttac 720 tggacggtaa ctgacgttga ggctcgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg 780 gtagtccacg cggtaaacga tgaatgctag gtgtcgggga gcaaagctct tcggtgccgc 840 cgcaaacgca ttaagcattc cacctgggga gtacgttcgc aagaatgaaa ctcaaaggaa 900 ttgacgggga cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac 960 cttaccaagt cttgacatcc ctctgaccgg aacttaaccg ttcctttcct ttgggacaga 1020 ggagacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg 1080 caacgagcgc aacccctatc cccagtagcc agcggttcgg ccgggcactc tgaggagact 1140 gccagggata acctggagga aggcggggat gacgtcaaat catcatgccc cttatgattt 1200 gggctacaca cgtgctacaa tggcgtaaac aaagggaggc gaacctgcga gggtgggcaa 1260 atcccaaaaa taacgtccca gttcggactg tagtctgcaa cccggctaca cgaagctgga 1320 atcgctagta atcgcggatc agaatgccgc ggtgaatacg ttcccgggtc ttgtacacac 1380 cgcccgtcac accatgggag tcagtaacgc ccgaagtcag tgacctaacc gcaaggaagg 1440 agctgccgaa ggcgggaccg atgactgggg tgaagtcgta acaaggtagc cgtatcggaa 1500 ggtgcggttg gatcacctcc tt 1522
【００５１】 <210> 18 <211> 1522 <212> DNA <213> Clostridium cluster XIV GA21 <400> 18 agagtttgat catggctcag gatgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgagc 60 gaagcagtta agaagattct tcggatgatt ctcaactgac tgagcggcgg acgggtgagt 120 aacgcgtggg tgacctgccc cataccgggg gataacagct ggaaacggct gctaataccg 180 cataagcgca cagagctgca tggctcggtg tgaaaaactc cggtggtatg ggatgggccc 240 gcgtctgatt aggtagttgg cggggtaacg gcccaccaaa ccgacgatca gtagccggcc 300 tgagagggcg accggccaca ttgggactga gacacggccc aaactcctac gggaggcagc 360 agtggggaat attgcacaat gggggaaacc ctgatgcagc gacgccgcgt gagcgaagaa 420 gtatttcggt atgtaaagct ctatcagcag ggaagataat gacggtacct gactaagaag 480 ccccggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag ggggcaagcg ttatccggat 540 ttactgggtg taaagggagc gtagacggca aggcaagtct gatgtgaaaa cccagggctt 600 aaccctggga ctgcattgga aactgtctgg ctcgagtgcc ggagaggtaa gcggaattcc 660 tagtgtagcg gtgaaatgcg tagatattag gaagaacacc agtggcgaag gcggcttact 720 ggacggtaac tgacgttgag gctcgaaagc gtggggagca aacaggatta gataccctgg 780 tagtccacgc cgtaaacgat gaatgctagg tgttggggag caaagctctt cggtgccgcc 840 gcaaacgcat taagcattcc acctggggag tacgttcgca agaatgaaac tcaaaggaat 900 tgacggggac ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc 960 ttaccaggtc ttgacatccc gatgaccggc ccgtaacggg gccttctctt cggagcattg 1020 gagacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc 1080 aacgagcgca acccttatcc tcagtagcca gcaggtaaag ctgggcactc tgtggagact 1140 gccagggata acctggaggg aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc cttatgatct 1200 gggctacaca cgtgctacaa tggcgtaaac aaagggaagc aaagccgcga ggtggagcaa 1260 atcccaaaaa taacgtctca gttcggactg cagtctgcaa ctcgactgca cgaagctgga 1320 atcgctagta atcgcgaatc agaatgtcgc ggtgaatacg ttcccgggtc ttgtacacac 1380 cgcccgtcac accatgggag ttggtaacgc ccgaagtcag tgacccaacc gaaaggaggg 1440 agctgccgaa ggcgggactg ataactgggg tgaagtcgta acaaggtagc cgtatcggaa 1500 ggtgcggctg gatcacctcc tt 1522
【図１】クローンライブラリー法で得られた未同定菌群
の系統樹を示す図である。
の系統樹を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 松木 隆広 東京都港区東新橋１丁目１番19号 株式会 社ヤクルト本社内 (72)発明者 松本 一政 東京都港区東新橋１丁目１番19号 株式会 社ヤクルト本社内 (72)発明者 高田 敏彦 東京都港区東新橋１丁目１番19号 株式会 社ヤクルト本社内 (72)発明者 渡辺 幸一 東京都港区東新橋１丁目１番19号 株式会 社ヤクルト本社内 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA01 CA09 DA06 HA14 4B063 QA01 QA18 QQ03 QQ06 QQ42 QR50 QR56 QR84 QS34 QS39 QX02
Claims (9)
- 【請求項１】 配列番号１及び２から選ばれる塩基配列
又は該塩基配列に相補的な配列を有するヒト腸内に存在
するプレボテラ クラスターに属する未同定菌群検出用
プローブ。 - 【請求項２】 配列番号８及び９から選ばれる塩基配列
又は該塩基配列に相補的な配列を有するヒト腸内に存在
するプレボテラ クラスターに属する未同定菌群検出用
プライマー。 - 【請求項３】 請求項１又は２記載のプローブ又はプラ
イマーを用いることを特徴とするヒト腸内に存在するプ
レボテラ クラスターに属する未同定菌群の検出方法。 - 【請求項４】 配列番号３及び４から選ばれる塩基配列
又は該塩基配列に相補的な配列を有するヒト腸内に存在
するクロストリジウム クラスター IVに属する未同定
菌群検出用プローブ。 - 【請求項５】 配列番号１０及び１１から選ばれる塩基
配列又は該塩基配列に相補的な配列を有するヒト腸内に
存在するクロストリジウム クラスター IVに属する未
同定菌群検出用プライマー。 - 【請求項６】 請求項４又は５記載のプローブ又はプラ
イマーを用いることを特徴とするヒト腸内に存在するク
ロストリジウム クラスター IVに属する未同定菌群の
検出方法。 - 【請求項７】 配列番号５〜７から選ばれる塩基配列又
は該塩基配列に相補的な配列を有するヒト腸内に存在す
るクロストリジウム クラスター XIVに属する未同定
菌群検出用プローブ。 - 【請求項８】 配列番号１２〜１４から選ばれる塩基配
列又は該塩基配列に相補的な配列を有するヒト腸内に存
在するクロストリジウム クラスター XIVに属する未
同定菌群検出用プライマー。 - 【請求項９】 請求項７又は８記載のプローブ又はプラ
イマーを用いることを特徴とするヒト腸内に存在するク
ロストリジウム クラスター XIVに属する未同定菌群
の検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000340874A JP2002142771A (ja) | 2000-11-08 | 2000-11-08 | ヒト腸内フローラ検出用プローブ又はプライマー |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000340874A JP2002142771A (ja) | 2000-11-08 | 2000-11-08 | ヒト腸内フローラ検出用プローブ又はプライマー |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002142771A true JP2002142771A (ja) | 2002-05-21 |
Family
ID=18815716
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000340874A Pending JP2002142771A (ja) | 2000-11-08 | 2000-11-08 | ヒト腸内フローラ検出用プローブ又はプライマー |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002142771A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007020423A (ja) * | 2005-07-12 | 2007-02-01 | Yakult Honsha Co Ltd | 腸内細菌群検出用核酸断片 |
| JP2015188359A (ja) * | 2014-03-27 | 2015-11-02 | 三菱重工業株式会社 | スフィンゴモナス属細菌の検出方法及びそのプライマー、生物処理槽の活性予測方法 |
| US11529380B2 (en) | 2016-12-23 | 2022-12-20 | MURDOCH CHILDREN'S RESEARCH INSTITUTE Parkville | Methods and compositions for determining, and for minimizing, the likelihood of development of allergy in infants |
-
2000
- 2000-11-08 JP JP2000340874A patent/JP2002142771A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007020423A (ja) * | 2005-07-12 | 2007-02-01 | Yakult Honsha Co Ltd | 腸内細菌群検出用核酸断片 |
| JP2015188359A (ja) * | 2014-03-27 | 2015-11-02 | 三菱重工業株式会社 | スフィンゴモナス属細菌の検出方法及びそのプライマー、生物処理槽の活性予測方法 |
| US11529380B2 (en) | 2016-12-23 | 2022-12-20 | MURDOCH CHILDREN'S RESEARCH INSTITUTE Parkville | Methods and compositions for determining, and for minimizing, the likelihood of development of allergy in infants |
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