JPH11137259A - 細菌同定のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた細菌の同定方法 - Google Patents
細菌同定のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた細菌の同定方法Info
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- JPH11137259A JPH11137259A JP9317741A JP31774197A JPH11137259A JP H11137259 A JPH11137259 A JP H11137259A JP 9317741 A JP9317741 A JP 9317741A JP 31774197 A JP31774197 A JP 31774197A JP H11137259 A JPH11137259 A JP H11137259A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 簡便で、誤差も少なく、短時間に実施でき、
しかも試験方法が統一された細菌の分離、同定法を開発
すること。 【解決手段】 配列表の配列番号１〜４に記載の塩基配
列または該配列の１個もしくは数個の塩基が置換、付加
もしくは欠失した塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
並びに被検菌より抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、請
求項１記載のオリゴヌクレオチドおよび請求項２記載の
オリゴヌクレオチドの組み合わせ（但し、配列表の配列
番号１と３および配列番号４と２の組み合わせを除く）
からなる１対のオリゴヌクレオチドをプライマーとして
用いたポリメラーゼ連鎖反応法により細菌の１６Ｓ−リ
ボソームＲＮＡをコードする遺伝子の５’末端領域のＤ
ＮＡの増幅を行い、得られた増幅産物の塩基配列を常法
により決定し、該配列を既知のＤＮＡ塩基配列と比較
し、被検菌が最も高い相同性を有する細菌種として同定
することを特徴とする細菌の同定方法。
しかも試験方法が統一された細菌の分離、同定法を開発
すること。 【解決手段】 配列表の配列番号１〜４に記載の塩基配
列または該配列の１個もしくは数個の塩基が置換、付加
もしくは欠失した塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
並びに被検菌より抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、請
求項１記載のオリゴヌクレオチドおよび請求項２記載の
オリゴヌクレオチドの組み合わせ（但し、配列表の配列
番号１と３および配列番号４と２の組み合わせを除く）
からなる１対のオリゴヌクレオチドをプライマーとして
用いたポリメラーゼ連鎖反応法により細菌の１６Ｓ−リ
ボソームＲＮＡをコードする遺伝子の５’末端領域のＤ
ＮＡの増幅を行い、得られた増幅産物の塩基配列を常法
により決定し、該配列を既知のＤＮＡ塩基配列と比較
し、被検菌が最も高い相同性を有する細菌種として同定
することを特徴とする細菌の同定方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、細菌同定のための
オリゴヌクレオチドおよびそれを用いた細菌の同定方法
に関し、詳しくは細菌の１６Ｓ−リボソームＲＮＡ（以
下、１６Ｓ−ｒＲＮＡと略すことがある。）をコードす
る遺伝子の５’上流域に特異的な塩基配列およびそれを
用いて特定の細菌を迅速、かつ正確に同定する方法に関
する。
オリゴヌクレオチドおよびそれを用いた細菌の同定方法
に関し、詳しくは細菌の１６Ｓ−リボソームＲＮＡ（以
下、１６Ｓ−ｒＲＮＡと略すことがある。）をコードす
る遺伝子の５’上流域に特異的な塩基配列およびそれを
用いて特定の細菌を迅速、かつ正確に同定する方法に関
する。
【０００２】
【従来の技術】細菌は古くから人間と密接な関係があ
り、食品工業、医薬品工業などの様々な分野で幅広く研
究の対象として注目されている。これらの細菌の中に
は、人間に対して有用なものが多く存在するが、人間に
疾患等を引き起こす原因菌（例えばセレウス菌、ボツリ
ヌス菌、コレラ菌、大腸菌、サルモネラ菌、黄色ブドウ
球菌、赤痢菌など）も自然界に存在し、該原因菌による
疾患等の予防や治療に関する研究は現在でも精力的に行
われている。このような背景のもとで、細菌がいかなる
種類に属しているかを同定することは、疾患や食品の変
敗等の原因究明あるいは伝搬経路の解明などに大きく寄
与するものである。
り、食品工業、医薬品工業などの様々な分野で幅広く研
究の対象として注目されている。これらの細菌の中に
は、人間に対して有用なものが多く存在するが、人間に
疾患等を引き起こす原因菌（例えばセレウス菌、ボツリ
ヌス菌、コレラ菌、大腸菌、サルモネラ菌、黄色ブドウ
球菌、赤痢菌など）も自然界に存在し、該原因菌による
疾患等の予防や治療に関する研究は現在でも精力的に行
われている。このような背景のもとで、細菌がいかなる
種類に属しているかを同定することは、疾患や食品の変
敗等の原因究明あるいは伝搬経路の解明などに大きく寄
与するものである。
【０００３】細菌の同定は、古くは肉眼または顕微鏡で
形態を観察することや培養所見で行われてきたが、その
後染色法が開発され、グラム陽性、グラム陰性またはそ
のいずれにも属さないグラム不定の３形態に大別される
ようになった。さらに、細菌学や生化学などの進歩で細
菌の生理・生化学的性質により細分化されることとな
り、これらの性状による区分は細菌の分類に大きく貢献
した。また、機器分析の技術向上に伴い菌体脂肪酸、細
胞壁の主要構成アミノ酸、キノン系、ＤＮＡの塩基組成
等が明らかにされ、より正確な細菌の同定、分類が可能
になった。さらに近年、分子生物学の急速な進歩によ
り、細菌の遺伝子の相同性は容易に検査できるようにな
り、細菌の同定、分類に必要不可欠なデータとされてい
る。
形態を観察することや培養所見で行われてきたが、その
後染色法が開発され、グラム陽性、グラム陰性またはそ
のいずれにも属さないグラム不定の３形態に大別される
ようになった。さらに、細菌学や生化学などの進歩で細
菌の生理・生化学的性質により細分化されることとな
り、これらの性状による区分は細菌の分類に大きく貢献
した。また、機器分析の技術向上に伴い菌体脂肪酸、細
胞壁の主要構成アミノ酸、キノン系、ＤＮＡの塩基組成
等が明らかにされ、より正確な細菌の同定、分類が可能
になった。さらに近年、分子生物学の急速な進歩によ
り、細菌の遺伝子の相同性は容易に検査できるようにな
り、細菌の同定、分類に必要不可欠なデータとされてい
る。
【０００４】一般的に、食品分野において細菌を同定す
る場合、Bergy's manual of systematic bacteriology
に従って被検菌となる細菌の形態観察および生理・生化
学的性質によって分類される。しかしながら、これらの
作業は非常に煩雑で判定に熟練と技量を要し、かつ日数
も多くかかるため、迅速に結果が要求される場合には不
向きである。そのため、最近では簡易キットも多く発売
され汎用化されているものの、同定可能な菌種の範囲が
狭く、かつ人為的または菌株による誤差が多い等の問題
があり、広範囲な細菌の同定に応用するには多くの課題
が残されている。また、菌体脂肪酸、細胞壁の主要構成
アミノ酸、キノン系などの化学分類的手法も多数報告さ
れているが、菌種間の相違が顕著でないため、これらは
補足または追加的なデータにとどまり、細菌の同定に大
きく貢献するには至っていないのが現状である。
る場合、Bergy's manual of systematic bacteriology
に従って被検菌となる細菌の形態観察および生理・生化
学的性質によって分類される。しかしながら、これらの
作業は非常に煩雑で判定に熟練と技量を要し、かつ日数
も多くかかるため、迅速に結果が要求される場合には不
向きである。そのため、最近では簡易キットも多く発売
され汎用化されているものの、同定可能な菌種の範囲が
狭く、かつ人為的または菌株による誤差が多い等の問題
があり、広範囲な細菌の同定に応用するには多くの課題
が残されている。また、菌体脂肪酸、細胞壁の主要構成
アミノ酸、キノン系などの化学分類的手法も多数報告さ
れているが、菌種間の相違が顕著でないため、これらは
補足または追加的なデータにとどまり、細菌の同定に大
きく貢献するには至っていないのが現状である。
【０００５】一方、近年の遺伝子工学技術の急速な進歩
に伴い、細菌の同定においても遺伝子解析などの技術
が、上記した従来の手法に付加されるようになってき
た。芽胞を形成する細菌への応用例としては、極めて性
質の類似しているバチラス・セレウス（Bacillus cere
us) とバチラス・シュリンジエンシス（Bacillusthurin
giensis)との鑑別に、後者の持つクリスタル毒素遺伝子
をポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）により増幅さ
せ、両菌を区別する方法〔日本食品微生物学会雑誌、11
巻、４号、第223 〜225 頁(1995)、北大農邦文紀要、19
巻、７号、第529 〜563 頁(1996)〕が挙げられる。ま
た、同様に芽胞を形成するウエルシュ菌(Clostridium
perfringens)の毒素であるエンテロトキシン（ＣＰＥ）
をコードする遺伝子に着目し、ＰＣＲ法やＲＦＬＰ法(R
andom Amplified Polymorphic DNA)により、迅速に食品
素材から検出・同定する方法もある（日本食品微生物学
会雑誌、第14巻、１号、第35〜42頁(1997)。さらに、２
３Ｓ−リボソームＲＮＡ（以下、リボソームＲＮＡをｒ
ＲＮＡと略すことがある。）を標的としたプローブを用
いたハイブリダイゼーション法によりバチラス属細菌を
分類する方法〔J. Dairy Res., 61, 4, p.529-535 (199
4)〕などが報告されている。
に伴い、細菌の同定においても遺伝子解析などの技術
が、上記した従来の手法に付加されるようになってき
た。芽胞を形成する細菌への応用例としては、極めて性
質の類似しているバチラス・セレウス（Bacillus cere
us) とバチラス・シュリンジエンシス（Bacillusthurin
giensis)との鑑別に、後者の持つクリスタル毒素遺伝子
をポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）により増幅さ
せ、両菌を区別する方法〔日本食品微生物学会雑誌、11
巻、４号、第223 〜225 頁(1995)、北大農邦文紀要、19
巻、７号、第529 〜563 頁(1996)〕が挙げられる。ま
た、同様に芽胞を形成するウエルシュ菌(Clostridium
perfringens)の毒素であるエンテロトキシン（ＣＰＥ）
をコードする遺伝子に着目し、ＰＣＲ法やＲＦＬＰ法(R
andom Amplified Polymorphic DNA)により、迅速に食品
素材から検出・同定する方法もある（日本食品微生物学
会雑誌、第14巻、１号、第35〜42頁(1997)。さらに、２
３Ｓ−リボソームＲＮＡ（以下、リボソームＲＮＡをｒ
ＲＮＡと略すことがある。）を標的としたプローブを用
いたハイブリダイゼーション法によりバチラス属細菌を
分類する方法〔J. Dairy Res., 61, 4, p.529-535 (199
4)〕などが報告されている。
【０００６】これらの手法は芽胞形成菌にとどまらず、
例えば腸内細菌であるビブリオ属細菌の鑑別〔FEMS Mic
robiol. Lett., 152, p.125-132(1997) 、Res. Microbi
ol.,145, p.151-156(1994) 〕や、グラム陽性球菌の同
定〔J. of Bcateriol., 175,7483-7487(1993)、FEMS Mi
crobiol. Lett., 151, 231-236(1997) 〕にも応用され
ている。このように、微生物の分類や同定の分野への遺
伝子工学の導入は、前記した細菌類にとどまらず普遍的
に行われるようになってきた。しかし、上記の方法は菌
種によっては特定のプライマーやプローブなどを必要と
するため、極めて限られた範囲の細菌にしか有効でな
く、ある程度の範囲に被検菌を絞り込むまでは、従来か
ら行われている生理・生化学的手法に頼らざるを得ない
のが現状である。
例えば腸内細菌であるビブリオ属細菌の鑑別〔FEMS Mic
robiol. Lett., 152, p.125-132(1997) 、Res. Microbi
ol.,145, p.151-156(1994) 〕や、グラム陽性球菌の同
定〔J. of Bcateriol., 175,7483-7487(1993)、FEMS Mi
crobiol. Lett., 151, 231-236(1997) 〕にも応用され
ている。このように、微生物の分類や同定の分野への遺
伝子工学の導入は、前記した細菌類にとどまらず普遍的
に行われるようになってきた。しかし、上記の方法は菌
種によっては特定のプライマーやプローブなどを必要と
するため、極めて限られた範囲の細菌にしか有効でな
く、ある程度の範囲に被検菌を絞り込むまでは、従来か
ら行われている生理・生化学的手法に頼らざるを得ない
のが現状である。
【０００７】一方、情報網の発達により、既に解析され
ている遺伝子情報は容易に入手することができ、これを
利用して未知の遺伝子の検索を行ったり、生物間での遺
伝子の相同性を検討する等に利用することができる。こ
のうち、細菌の遺伝子に関して最も多く解析・登録され
ているものの１つがｒＲＮＡをコードしている遺伝子で
ある。リボソームは、ウイルスなどを除く全ての生物に
存在しており、細菌の場合は３種類のＲＮＡと５２種類
のタンパク質からなる分子量 2,520,000（沈降速度７０
Ｓ）で、菌種間で微妙な違いはあるもののその大きさは
ほとんど共通している。
ている遺伝子情報は容易に入手することができ、これを
利用して未知の遺伝子の検索を行ったり、生物間での遺
伝子の相同性を検討する等に利用することができる。こ
のうち、細菌の遺伝子に関して最も多く解析・登録され
ているものの１つがｒＲＮＡをコードしている遺伝子で
ある。リボソームは、ウイルスなどを除く全ての生物に
存在しており、細菌の場合は３種類のＲＮＡと５２種類
のタンパク質からなる分子量 2,520,000（沈降速度７０
Ｓ）で、菌種間で微妙な違いはあるもののその大きさは
ほとんど共通している。
【０００８】リボソームは、５Ｓ−および２３Ｓ−ｒＲ
ＮＡと２１種のタンパク質からなる大きなサブユニット
と１６Ｓ−ｒＲＮＡと３１種のタンパク質からなる小さ
なサブユニットから構成されており、２３Ｓ−ｒＲＮＡ
は約２９００塩基、１６Ｓ−ｒＲＮＡは約１５００塩
基、５Ｓ−ｒＲＮＡは約１２０塩基でそれぞれ構成され
ている。これらの塩基配列は、細菌の種類によって相違
が見られるため、これらの情報は細菌の分類に大きく貢
献することになり、それぞれの塩基配列に基づく系統分
類が行われている。中でも、最も情報量が多く存在し、
普遍的に活用されているのが１６Ｓ−ｒＲＮＡである。
これまでは、細菌同定の最終項目として該１６Ｓ−ｒＲ
ＮＡ遺伝子の全塩基配列を決定し、それまでに得られた
生理・生化学的性状やその他の化学分析とを併せて細菌
を同定するのが、細菌同定の流れとして受入れられてい
る。しかしながら、１６Ｓ−ｒＲＮＡをコードする遺伝
子の塩基配列から細菌を同定しようとする試みは、塩基
配列を容易に決められなかったり、データベースの不足
等の理由から、まだ十分には浸透していない。さらに、
１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子の一部の塩基配列を用いた細菌
の系統分類は、酢酸菌について報告〔Biosci. Biotech.
Biochem., 61, 1244 〜1251 (1997) 〕があるが、その
他の細菌に関しては皆無である。
ＮＡと２１種のタンパク質からなる大きなサブユニット
と１６Ｓ−ｒＲＮＡと３１種のタンパク質からなる小さ
なサブユニットから構成されており、２３Ｓ−ｒＲＮＡ
は約２９００塩基、１６Ｓ−ｒＲＮＡは約１５００塩
基、５Ｓ−ｒＲＮＡは約１２０塩基でそれぞれ構成され
ている。これらの塩基配列は、細菌の種類によって相違
が見られるため、これらの情報は細菌の分類に大きく貢
献することになり、それぞれの塩基配列に基づく系統分
類が行われている。中でも、最も情報量が多く存在し、
普遍的に活用されているのが１６Ｓ−ｒＲＮＡである。
これまでは、細菌同定の最終項目として該１６Ｓ−ｒＲ
ＮＡ遺伝子の全塩基配列を決定し、それまでに得られた
生理・生化学的性状やその他の化学分析とを併せて細菌
を同定するのが、細菌同定の流れとして受入れられてい
る。しかしながら、１６Ｓ−ｒＲＮＡをコードする遺伝
子の塩基配列から細菌を同定しようとする試みは、塩基
配列を容易に決められなかったり、データベースの不足
等の理由から、まだ十分には浸透していない。さらに、
１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子の一部の塩基配列を用いた細菌
の系統分類は、酢酸菌について報告〔Biosci. Biotech.
Biochem., 61, 1244 〜1251 (1997) 〕があるが、その
他の細菌に関しては皆無である。
【０００９】遺伝子の塩基配列の決定に際しては、従来
Maxam-Gilbert 法が行われていたが、現在ではヌクレオ
チドアナログとＤＮＡポリメラーゼとを用いたダイデオ
キシ(dideoxy) 法、蛍光ラベルしたプライマーまたはダ
イデオキシヌクレオチドを用いた塩基配列決定法、自動
ＤＮＡシーケンサーを用いる方法などが挙げられる。こ
れらの方法は、解析時間の短縮や再現性の向上などにつ
いても改善がなされており、容易、かつ短時間で目的と
する塩基配列を決定することが可能である。しかし、こ
れらの方法の中には、放射性同位元素を利用しているた
めに特殊な施設や試薬、さらには技量が要求されたり、
解析のためには高価な機器が必要であるものもある。こ
のため、専門機関を除いては、依然として細菌の分類・
同定は煩雑で時間がかかる形態や生理・生化学的手法か
らのアプローチが中心となっている。加えて、これまで
に開発されたいずれの遺伝子工学的な手法によっても、
被検菌となる菌株がどの属に属する細菌であるかといっ
た情報を、生理・生化学的手法により得ていなければ有
効に活用することができないといった問題を抱えてい
る。さらに、現在行われている１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子
の塩基配列をもとに細菌を同定する方法は、該塩基配列
のほぼ全領域を系統分類の対象としているために複数回
のシークエンス解析が必要であり、経費や時間などの面
で従来の生理・生化学的手法に取って代わるには至って
いない。
Maxam-Gilbert 法が行われていたが、現在ではヌクレオ
チドアナログとＤＮＡポリメラーゼとを用いたダイデオ
キシ(dideoxy) 法、蛍光ラベルしたプライマーまたはダ
イデオキシヌクレオチドを用いた塩基配列決定法、自動
ＤＮＡシーケンサーを用いる方法などが挙げられる。こ
れらの方法は、解析時間の短縮や再現性の向上などにつ
いても改善がなされており、容易、かつ短時間で目的と
する塩基配列を決定することが可能である。しかし、こ
れらの方法の中には、放射性同位元素を利用しているた
めに特殊な施設や試薬、さらには技量が要求されたり、
解析のためには高価な機器が必要であるものもある。こ
のため、専門機関を除いては、依然として細菌の分類・
同定は煩雑で時間がかかる形態や生理・生化学的手法か
らのアプローチが中心となっている。加えて、これまで
に開発されたいずれの遺伝子工学的な手法によっても、
被検菌となる菌株がどの属に属する細菌であるかといっ
た情報を、生理・生化学的手法により得ていなければ有
効に活用することができないといった問題を抱えてい
る。さらに、現在行われている１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子
の塩基配列をもとに細菌を同定する方法は、該塩基配列
のほぼ全領域を系統分類の対象としているために複数回
のシークエンス解析が必要であり、経費や時間などの面
で従来の生理・生化学的手法に取って代わるには至って
いない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】そのため、簡便で、誤
差も少なく、短時間に実施でき、しかも試験方法が統一
された細菌の分離、同定法の開発が望まれていた。そこ
で本発明者らは、迅速、簡便、かつ確実に特定の細菌、
例えば腸内細菌科（Enterobacteriaceae）やビブリオ科
（Vibrionaceae）に属する細菌、芽胞を形成するグラム
陽性細菌およびグラム陽性球菌などの細菌を同定するた
めに、最もデータ量の豊富な１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子に
着目し、その塩基配列の相同性に基づく細菌の同定アプ
ローチを試みた。すなわち、１回のシークエンス解析で
決定できる配列数（約３００塩基程度）であること、決
定した配列が属間および種間において変化に富んでいる
ことを基本条件とし、前記した細菌に共通なプライマー
領域の検索を行ったところ、１対のプライマー配列がこ
れらの条件を満たしていることを見出した。そこで、こ
の配列に相補的なＤＮＡ断片を合成して、これら細菌に
対するプライマーとしての評価を行うため、特定の細菌
のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法を行ったところ、
約３００塩基からなるＤＮＡ断片が増幅されていること
が電気泳動法によって確認された。これらの増幅したＤ
ＮＡの塩基配列を決定し、コンピュータによる相同性解
析またはインターネットによる相同性検索を行ったとこ
ろ、該配列は鋳型として用いた細菌の同じ領域の塩基配
列と最も高い相同性で一致した。本発明は、かかる知見
に基づいて完成されたものである。
差も少なく、短時間に実施でき、しかも試験方法が統一
された細菌の分離、同定法の開発が望まれていた。そこ
で本発明者らは、迅速、簡便、かつ確実に特定の細菌、
例えば腸内細菌科（Enterobacteriaceae）やビブリオ科
（Vibrionaceae）に属する細菌、芽胞を形成するグラム
陽性細菌およびグラム陽性球菌などの細菌を同定するた
めに、最もデータ量の豊富な１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子に
着目し、その塩基配列の相同性に基づく細菌の同定アプ
ローチを試みた。すなわち、１回のシークエンス解析で
決定できる配列数（約３００塩基程度）であること、決
定した配列が属間および種間において変化に富んでいる
ことを基本条件とし、前記した細菌に共通なプライマー
領域の検索を行ったところ、１対のプライマー配列がこ
れらの条件を満たしていることを見出した。そこで、こ
の配列に相補的なＤＮＡ断片を合成して、これら細菌に
対するプライマーとしての評価を行うため、特定の細菌
のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法を行ったところ、
約３００塩基からなるＤＮＡ断片が増幅されていること
が電気泳動法によって確認された。これらの増幅したＤ
ＮＡの塩基配列を決定し、コンピュータによる相同性解
析またはインターネットによる相同性検索を行ったとこ
ろ、該配列は鋳型として用いた細菌の同じ領域の塩基配
列と最も高い相同性で一致した。本発明は、かかる知見
に基づいて完成されたものである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】請求項１に記載の本発明
は、配列表の配列番号１またはその相補鎖である配列表
の配列番号４に記載の塩基配列または該配列の１個もし
くは数個の塩基が置換、付加もしくは欠失した塩基配列
からなるオリゴヌクレオチドである。請求項２に記載の
本発明は、配列表の配列番号２またはその相補鎖である
配列表の配列番号３に記載の塩基配列または該配列の１
個もしくは数個の塩基が置換、付加もしくは欠失した塩
基配列からなるオリゴヌクレオチドである。請求項３に
記載の本発明は、被検菌より抽出したゲノムＤＮＡを鋳
型とし、請求項１記載のオリゴヌクレオチドおよび請求
項２記載のオリゴヌクレオチドの組み合わせ（但し、配
列表の配列番号１と３および配列番号４と２の組み合わ
せを除く）からなる１対のオリゴヌクレオチドをプライ
マーとして用いたポリメラーゼ連鎖反応法により細菌の
１６Ｓ−リボソームＲＮＡをコードする遺伝子の５’末
端領域のＤＮＡの増幅を行い、得られた増幅産物の塩基
配列を常法により決定し、該配列を既知のＤＮＡ塩基配
列と比較し、被検菌が最も高い相同性を有する細菌種と
して同定することを特徴とする細菌の同定方法である。
請求項１０に記載の本発明は、請求項１記載のオリゴヌ
クレオチドおよび請求項２記載のオリゴヌクレオチドか
らなる１対のプライマーを含む細菌同定用キットであ
る。
は、配列表の配列番号１またはその相補鎖である配列表
の配列番号４に記載の塩基配列または該配列の１個もし
くは数個の塩基が置換、付加もしくは欠失した塩基配列
からなるオリゴヌクレオチドである。請求項２に記載の
本発明は、配列表の配列番号２またはその相補鎖である
配列表の配列番号３に記載の塩基配列または該配列の１
個もしくは数個の塩基が置換、付加もしくは欠失した塩
基配列からなるオリゴヌクレオチドである。請求項３に
記載の本発明は、被検菌より抽出したゲノムＤＮＡを鋳
型とし、請求項１記載のオリゴヌクレオチドおよび請求
項２記載のオリゴヌクレオチドの組み合わせ（但し、配
列表の配列番号１と３および配列番号４と２の組み合わ
せを除く）からなる１対のオリゴヌクレオチドをプライ
マーとして用いたポリメラーゼ連鎖反応法により細菌の
１６Ｓ−リボソームＲＮＡをコードする遺伝子の５’末
端領域のＤＮＡの増幅を行い、得られた増幅産物の塩基
配列を常法により決定し、該配列を既知のＤＮＡ塩基配
列と比較し、被検菌が最も高い相同性を有する細菌種と
して同定することを特徴とする細菌の同定方法である。
請求項１０に記載の本発明は、請求項１記載のオリゴヌ
クレオチドおよび請求項２記載のオリゴヌクレオチドか
らなる１対のプライマーを含む細菌同定用キットであ
る。
【００１２】
【発明の実施の形態】以下に、本発明を詳しく説明す
る。本発明の方法により被検菌の同定対象とされる細菌
は、既に１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列が解析さ
れ、データベース等に登録されているものである。この
ような細菌の具体例としては、第１表に示した４４種の
腸内細菌科に属する細菌、第２表に示した４２種のビブ
リオ科に属する細菌、第３表に示した１４８種の芽胞を
形成するグラム陽性細菌および第４表に示した１０２種
のグラム陽性球菌等が挙げられる。
る。本発明の方法により被検菌の同定対象とされる細菌
は、既に１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列が解析さ
れ、データベース等に登録されているものである。この
ような細菌の具体例としては、第１表に示した４４種の
腸内細菌科に属する細菌、第２表に示した４２種のビブ
リオ科に属する細菌、第３表に示した１４８種の芽胞を
形成するグラム陽性細菌および第４表に示した１０２種
のグラム陽性球菌等が挙げられる。
【００１３】
【表１】
【００１４】
【表２】
【００１５】
【表３】
【００１６】
【表４】
【００１７】
【表５】
【００１８】ところで、１６Ｓ−ｒＲＮＡをコードする
遺伝子は細菌の科間または属間では相違が多いけれど
も、種間では比較的よく保存されていることが知られて
おり、このような塩基配列の相同または相違により細菌
は系統分類されている。しかし、従来は１６Ｓ−ｒＲＮ
Ａのほぼ全領域（約１．５ｋｂｐ）のみを系統分類の対
象として利用しており、該遺伝子の部分領域により細菌
を系統分類する試みは殆ど行われていない。細菌全種に
共通となるプライマーとしての条件を満たす領域は見出
すことができないが、本発明者らの研究の結果、上記の
第１〜４表に示した菌種の範囲においては、共通となる
プライマーとしての条件を満たすような非常に類似した
配列を見出すことができた。
遺伝子は細菌の科間または属間では相違が多いけれど
も、種間では比較的よく保存されていることが知られて
おり、このような塩基配列の相同または相違により細菌
は系統分類されている。しかし、従来は１６Ｓ−ｒＲＮ
Ａのほぼ全領域（約１．５ｋｂｐ）のみを系統分類の対
象として利用しており、該遺伝子の部分領域により細菌
を系統分類する試みは殆ど行われていない。細菌全種に
共通となるプライマーとしての条件を満たす領域は見出
すことができないが、本発明者らの研究の結果、上記の
第１〜４表に示した菌種の範囲においては、共通となる
プライマーとしての条件を満たすような非常に類似した
配列を見出すことができた。
【００１９】配列表の配列番号１〜４に示した合成オリ
ゴヌクレオチドは、上記した細菌の１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺
伝子の塩基配列を検索し、細菌の属間および種間におい
て変化に富んでいる５’末端領域の約３００塩基程度の
配列を増幅することが可能な領域をコードするように設
計されたものである。被検菌より抽出したゲノムＤＮＡ
を鋳型として、該配列番号１または４に記載のオリゴヌ
クレオチドと配列番号２または３に記載のオリゴヌクレ
オチドよりなる１対のプライマーを用いてＰＣＲ法を行
って得られた増幅産物は、１回のシークエンス解析によ
り塩基配列を決定することが可能である。これらのプラ
イマーは、ＤＮＡ合成装置を用いて合成することがで
き、そのままもしくはＨＰＬＣ等で適宜精製して使用す
ることができる。また、本発明においては、該プライマ
ーの全長または前記したように該配列の１個もしくは数
個の塩基が置換、付加もしくは欠失したものを用いる。
これらの具体例としては、例えば配列番号１に関して説
明すると、配列番号６の如く、配列番号１の５’末端側
から７番目の塩基（Ｔ）がＣに置換したものでもよい
し、配列番号１の５’末端側に１８塩基を付加した配列
（配列番号５）でもよいし、配列番号１の３’末端側の
２塩基（ＣＧ）が欠落したものでもよい。配列番号１以
外の配列についても同様に配列の１個もしくは数個の塩
基が置換、付加もしくは欠失したものであってもよい。
ゴヌクレオチドは、上記した細菌の１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺
伝子の塩基配列を検索し、細菌の属間および種間におい
て変化に富んでいる５’末端領域の約３００塩基程度の
配列を増幅することが可能な領域をコードするように設
計されたものである。被検菌より抽出したゲノムＤＮＡ
を鋳型として、該配列番号１または４に記載のオリゴヌ
クレオチドと配列番号２または３に記載のオリゴヌクレ
オチドよりなる１対のプライマーを用いてＰＣＲ法を行
って得られた増幅産物は、１回のシークエンス解析によ
り塩基配列を決定することが可能である。これらのプラ
イマーは、ＤＮＡ合成装置を用いて合成することがで
き、そのままもしくはＨＰＬＣ等で適宜精製して使用す
ることができる。また、本発明においては、該プライマ
ーの全長または前記したように該配列の１個もしくは数
個の塩基が置換、付加もしくは欠失したものを用いる。
これらの具体例としては、例えば配列番号１に関して説
明すると、配列番号６の如く、配列番号１の５’末端側
から７番目の塩基（Ｔ）がＣに置換したものでもよい
し、配列番号１の５’末端側に１８塩基を付加した配列
（配列番号５）でもよいし、配列番号１の３’末端側の
２塩基（ＣＧ）が欠落したものでもよい。配列番号１以
外の配列についても同様に配列の１個もしくは数個の塩
基が置換、付加もしくは欠失したものであってもよい。
【００２０】本発明においては、配列表の配列番号１〜
４に示したオリゴヌクレオチド（これらの配列の１個も
しくは数個の塩基が置換、付加もしくは欠失した塩基配
列からなるオリゴヌクレオチドを含む。）を組み合わせ
て１対のプライマーとして用いるが、５’末端側のプラ
イマーと３’末端側のプライマーを組み合わせて用い、
具体的には配列番号１または４に記載のプライマーと配
列番号２または３に記載のプライマーの組み合わせから
なる１対のプライマーを使用する。配列表の配列番号６
〜２１に記載した塩基配列は、本発明に用いられるプラ
イマーの１例を示したものである。特定の細菌種の同定
に使用される、これらプライマーの組み合わせの１例を
第５表に示す。
４に示したオリゴヌクレオチド（これらの配列の１個も
しくは数個の塩基が置換、付加もしくは欠失した塩基配
列からなるオリゴヌクレオチドを含む。）を組み合わせ
て１対のプライマーとして用いるが、５’末端側のプラ
イマーと３’末端側のプライマーを組み合わせて用い、
具体的には配列番号１または４に記載のプライマーと配
列番号２または３に記載のプライマーの組み合わせから
なる１対のプライマーを使用する。配列表の配列番号６
〜２１に記載した塩基配列は、本発明に用いられるプラ
イマーの１例を示したものである。特定の細菌種の同定
に使用される、これらプライマーの組み合わせの１例を
第５表に示す。
【００２１】
【表６】
【００２２】本発明のプライマーは、前記したように、
細菌全種に完全に共通となる塩基配列を持つものではな
いが、第１〜４表に示した菌種の範囲においては共通な
プライマーとしての諸条件を満たす非常に類似した配列
である。つまり、菌種によってはプライマー配列のうち
の幾つかの塩基が異なるものも存在するが、そのような
菌種についても本発明のプライマーを用いて所期の配列
を増幅することができる。例えば、Ｂ−Ｆ０１プライマ
ー（配列番号１４）とＢ−Ｒ０１プライマー（配列番号
１５）、またはＢ−Ｆ０２プライマー（配列番号１７）
とＢ−Ｒ０２プライマー（配列番号１６）の組み合わせ
に関して、該プライマー配列と一部が一致しない場合に
ついて第６〜７表（２塩基以上の不一致がプライマー配
列上に存在する菌種およびそのオリゴヌクレオチド配
列）に示す。表中、＊は欠損を示す。
細菌全種に完全に共通となる塩基配列を持つものではな
いが、第１〜４表に示した菌種の範囲においては共通な
プライマーとしての諸条件を満たす非常に類似した配列
である。つまり、菌種によってはプライマー配列のうち
の幾つかの塩基が異なるものも存在するが、そのような
菌種についても本発明のプライマーを用いて所期の配列
を増幅することができる。例えば、Ｂ−Ｆ０１プライマ
ー（配列番号１４）とＢ−Ｒ０１プライマー（配列番号
１５）、またはＢ−Ｆ０２プライマー（配列番号１７）
とＢ−Ｒ０２プライマー（配列番号１６）の組み合わせ
に関して、該プライマー配列と一部が一致しない場合に
ついて第６〜７表（２塩基以上の不一致がプライマー配
列上に存在する菌種およびそのオリゴヌクレオチド配
列）に示す。表中、＊は欠損を示す。
【００２３】
【表７】
【００２４】
【表８】
【００２５】
【表９】
【００２６】Ｂ−Ｆ０１プライマーまたはその相補鎖Ｂ
−Ｒ０２プライマーと全く同じ配列である細菌種は３３
６種中１５１種、１塩基の不一致がある菌種は１１１
種、２塩基の不一致がある菌種は６０種、３塩基以上の
不一致を持つ菌種は１４種である（第６表）。また、Ｂ
−Ｆ０２プライマーまたはその相補鎖Ｂ−Ｒ０１プライ
マーと全く同じ配列である細菌種は３３６種中３２０
種、１塩基の不一致がある菌種は１３種、２塩基の不一
致がある菌種は３種である（第７表）。
−Ｒ０２プライマーと全く同じ配列である細菌種は３３
６種中１５１種、１塩基の不一致がある菌種は１１１
種、２塩基の不一致がある菌種は６０種、３塩基以上の
不一致を持つ菌種は１４種である（第６表）。また、Ｂ
−Ｆ０２プライマーまたはその相補鎖Ｂ−Ｒ０１プライ
マーと全く同じ配列である細菌種は３３６種中３２０
種、１塩基の不一致がある菌種は１３種、２塩基の不一
致がある菌種は３種である（第７表）。
【００２７】次に、本発明による細菌の同定方法につい
て説明する。まず、被検菌より常法に従ってゲノムＤＮ
Ａを抽出する。これを鋳型として上記の１対のプライマ
ーを用いてＰＣＲ法を行い、該細菌の１６Ｓ−リボソー
ムＲＮＡをコードする遺伝子の５’末端領域の約３００
塩基を増幅する。ＰＣＲ法については、パーキンエルマ
ー社や宝酒造社などから市販されているタックＤＮＡポ
リメラーゼを含む遺伝子増幅キットおよび自動遺伝子増
幅装置を用いて行うことができる。反応は常法により行
えばよいが、好ましい反応条件の１例は、変性９５℃で
０．５分間、アニーリング５０℃で０．５分間、伸長反
応７２℃で２分間の合成反応のサイクルを３０サイクル
行う方法である。
て説明する。まず、被検菌より常法に従ってゲノムＤＮ
Ａを抽出する。これを鋳型として上記の１対のプライマ
ーを用いてＰＣＲ法を行い、該細菌の１６Ｓ−リボソー
ムＲＮＡをコードする遺伝子の５’末端領域の約３００
塩基を増幅する。ＰＣＲ法については、パーキンエルマ
ー社や宝酒造社などから市販されているタックＤＮＡポ
リメラーゼを含む遺伝子増幅キットおよび自動遺伝子増
幅装置を用いて行うことができる。反応は常法により行
えばよいが、好ましい反応条件の１例は、変性９５℃で
０．５分間、アニーリング５０℃で０．５分間、伸長反
応７２℃で２分間の合成反応のサイクルを３０サイクル
行う方法である。
【００２８】続いて、上記で得たＰＣＲ増幅産物の塩基
配列を決定するため、目的とするＰＣＲ増幅産物を検出
する。検出方法としては、アガロースゲル電気泳動また
はポリアクリルアミド電気泳動、スポット法またはサザ
ンブロット法などの常法が挙げられる。なお、スポット
法およびサザンブロット法において、該ＰＣＲ増幅産物
を検出するためのプローブＤＮＡは、増幅した塩基配列
領域内で適宜選択すればよい。ＰＣＲ増幅産物の塩基配
列を決定する方法としては、特に限定されないが、ＰＣ
Ｒ増幅産物をパーキンエルマー社やファルマシア社など
から市販されている塩基配列決定キットを用いた自動Ｄ
ＮＡシーケンサーによって決定する方法や、ＰＣＲ増幅
産物をＭ１３ファージベクターにクローニングしファー
ジＤＮＡを調製した後にサンガー法により決定する方法
などが挙げられる。
配列を決定するため、目的とするＰＣＲ増幅産物を検出
する。検出方法としては、アガロースゲル電気泳動また
はポリアクリルアミド電気泳動、スポット法またはサザ
ンブロット法などの常法が挙げられる。なお、スポット
法およびサザンブロット法において、該ＰＣＲ増幅産物
を検出するためのプローブＤＮＡは、増幅した塩基配列
領域内で適宜選択すればよい。ＰＣＲ増幅産物の塩基配
列を決定する方法としては、特に限定されないが、ＰＣ
Ｒ増幅産物をパーキンエルマー社やファルマシア社など
から市販されている塩基配列決定キットを用いた自動Ｄ
ＮＡシーケンサーによって決定する方法や、ＰＣＲ増幅
産物をＭ１３ファージベクターにクローニングしファー
ジＤＮＡを調製した後にサンガー法により決定する方法
などが挙げられる。
【００２９】このようにして決定した１６Ｓ−ｒＲＮＡ
遺伝子の５’末端領域の約３００塩基の塩基配列を、既
知のデータベース等に登録されている塩基配列との相同
性を比較することによって、被検菌の同定を行う。具体
的には、該塩基配列をGene Works（帝人システムテクノ
ロジー社）やＤＮＡＳＩＳシステム（宝酒造社）などか
ら市販されている遺伝子解析ソフトを使用して解析する
ことができ、インターネットを用いてＤＤＢＪ（日本Ｄ
ＮＡデータバンク）などのシステムにより、決定したこ
れら細菌の塩基配列の相同性検索を行う。また、本発明
の方法により細菌の同定を行うにあたり、細菌群の１６
Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子の５’末端領域を増幅させるための
プライマー対を細菌同定キットとしておくことにより、
これら細菌の検出・同定を迅速、かつ簡便に実施するこ
とができる。なお、その際に用いる試薬は溶液状、粉末
状などいずれの形態をとってもよい。さらに、未知の細
菌についても、本発明の方法に従い、１対のプライマー
を使用してＰＣＲ法により増幅し、その塩基配列を決定
することにより、該細菌を同定することができる。
遺伝子の５’末端領域の約３００塩基の塩基配列を、既
知のデータベース等に登録されている塩基配列との相同
性を比較することによって、被検菌の同定を行う。具体
的には、該塩基配列をGene Works（帝人システムテクノ
ロジー社）やＤＮＡＳＩＳシステム（宝酒造社）などか
ら市販されている遺伝子解析ソフトを使用して解析する
ことができ、インターネットを用いてＤＤＢＪ（日本Ｄ
ＮＡデータバンク）などのシステムにより、決定したこ
れら細菌の塩基配列の相同性検索を行う。また、本発明
の方法により細菌の同定を行うにあたり、細菌群の１６
Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子の５’末端領域を増幅させるための
プライマー対を細菌同定キットとしておくことにより、
これら細菌の検出・同定を迅速、かつ簡便に実施するこ
とができる。なお、その際に用いる試薬は溶液状、粉末
状などいずれの形態をとってもよい。さらに、未知の細
菌についても、本発明の方法に従い、１対のプライマー
を使用してＰＣＲ法により増幅し、その塩基配列を決定
することにより、該細菌を同定することができる。
【００３０】
【実施例】以下、本発明を実施例により詳しく説明する
が、本発明はこれらに限定されるものではない。 実施例１ 芽胞形成グラム陽性菌の同定 （１）被検菌のゲノムＤＮＡの調製 芽胞形成グラム陽性細菌を被検菌として、該細菌をそれ
ぞれの至適条件下で培養した。例えば、偏性嫌気菌は嫌
気培養したり、微生物保存機関から入手した菌株につい
ては、該機関の推奨する条件を採用した。培養条件につ
いては、通常ブレインハートインフュージョン寒天培地
を用いて３５℃で２４時間で培養した。なお、以下にお
いて、ゲノムＤＮＡの調製は、すべてInstaGene Matrix
(BIO-RAD社製) を用いて行った。
が、本発明はこれらに限定されるものではない。 実施例１ 芽胞形成グラム陽性菌の同定 （１）被検菌のゲノムＤＮＡの調製 芽胞形成グラム陽性細菌を被検菌として、該細菌をそれ
ぞれの至適条件下で培養した。例えば、偏性嫌気菌は嫌
気培養したり、微生物保存機関から入手した菌株につい
ては、該機関の推奨する条件を採用した。培養条件につ
いては、通常ブレインハートインフュージョン寒天培地
を用いて３５℃で２４時間で培養した。なお、以下にお
いて、ゲノムＤＮＡの調製は、すべてInstaGene Matrix
(BIO-RAD社製) を用いて行った。
【００３１】（２）ＰＣＲ法 （１）において得たゲノムＤＮＡ０．１μｇを鋳型と
し、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラー（宝酒造社
製）を用いてＰＣＲ法を行った。プライマーは、配列番
号１および配列番号２に記載のオリゴヌクレオチドを使
用した。このプライマーは、すべてオリゴサービスつく
ば研究所に合成委託した。なお、ＰＣＲ法の反応液は、
ゲノムＤＮＡ０．１μｇを含む溶液を０．２ｍｌのエッ
ペンチューブにとり、１０μｌの１０×ＰＣＲバッファ
ー（100mM トリス−HCl(pH8.3),500mM KCl,15mM MgC
l2)、８μｌのｄＮＴＰ混合液（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、
ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰを各２．５ｍＭ）、０．５μｌの５
ユニット／μｌのタックＤＮＡポリメラーゼ、各５μｌ
のプライマー、これに滅菌水を加えて１００μｌの溶液
とした。
し、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラー（宝酒造社
製）を用いてＰＣＲ法を行った。プライマーは、配列番
号１および配列番号２に記載のオリゴヌクレオチドを使
用した。このプライマーは、すべてオリゴサービスつく
ば研究所に合成委託した。なお、ＰＣＲ法の反応液は、
ゲノムＤＮＡ０．１μｇを含む溶液を０．２ｍｌのエッ
ペンチューブにとり、１０μｌの１０×ＰＣＲバッファ
ー（100mM トリス−HCl(pH8.3),500mM KCl,15mM MgC
l2)、８μｌのｄＮＴＰ混合液（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、
ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰを各２．５ｍＭ）、０．５μｌの５
ユニット／μｌのタックＤＮＡポリメラーゼ、各５μｌ
のプライマー、これに滅菌水を加えて１００μｌの溶液
とした。
【００３２】ＰＣＲの反応条件は、変性９５℃で０．５
分間、アニーリング５０℃で０．５分間、伸長反応７２
℃で２分間の合成反応サイクルを３０サイクル行った。
反応終了後、ＰＣＲ増幅産物を含む反応液１０μｌを試
料として、１％ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ社製）ゲル電
気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色して増幅さ
れた約３００塩基のＤＮＡを確認した。
分間、アニーリング５０℃で０．５分間、伸長反応７２
℃で２分間の合成反応サイクルを３０サイクル行った。
反応終了後、ＰＣＲ増幅産物を含む反応液１０μｌを試
料として、１％ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ社製）ゲル電
気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色して増幅さ
れた約３００塩基のＤＮＡを確認した。
【００３３】（３）ＰＣＲ増幅産物の塩基配列の決定 上記の（２）によって得られた増幅産物反応液９０μｌ
に、２０％ＰＥＧ溶液（２０％ＰＥＧ 6000(ｗ／ｖ）,
2.5Ｍ NaCl)を６７μｌ加えてよく撹拌した後、氷上に
て１時間放置した。その後、１５０００ｒｐｍで２０分
間遠心分離し、沈殿物を７０％エタノールで洗浄後、再
度同じ条件で遠心分離した後、風乾した。こうして得た
ＰＣＲ増幅産物を、滅菌蒸留水に５０μｇ／μｌとなる
ように溶解させた。続いて、該ＰＣＲ増幅産物溶液６μ
ｌを試料として用い、ダイターミネーターサイクルシー
クエンスキット（パーキンエルマー社製）により目的と
する領域の塩基配列を決定した。その結果、２７５塩基
の配列が決定された。
に、２０％ＰＥＧ溶液（２０％ＰＥＧ 6000(ｗ／ｖ）,
2.5Ｍ NaCl)を６７μｌ加えてよく撹拌した後、氷上に
て１時間放置した。その後、１５０００ｒｐｍで２０分
間遠心分離し、沈殿物を７０％エタノールで洗浄後、再
度同じ条件で遠心分離した後、風乾した。こうして得た
ＰＣＲ増幅産物を、滅菌蒸留水に５０μｇ／μｌとなる
ように溶解させた。続いて、該ＰＣＲ増幅産物溶液６μ
ｌを試料として用い、ダイターミネーターサイクルシー
クエンスキット（パーキンエルマー社製）により目的と
する領域の塩基配列を決定した。その結果、２７５塩基
の配列が決定された。
【００３４】（４）被検菌の同定 （３）において決定した塩基配列から、プライマー領域
をGene Works（帝人システムテクノロジー社）を用いて
修飾し、その塩基配列について、DDBJのホモロジーサー
チシステム（ｂｌａｓｔｎ）により相同性を検索した。
結果を第８表に示す。表中には、被検菌の塩基配列と相
同性の高い配列を与えるものを順に５種まで記載した。
但し、相同性が８０％以下のものは記載していない。表
示したように、芽胞を形成する被検菌は１００％の相同
性を示したバチラス・ズブチリスであると同定された。
をGene Works（帝人システムテクノロジー社）を用いて
修飾し、その塩基配列について、DDBJのホモロジーサー
チシステム（ｂｌａｓｔｎ）により相同性を検索した。
結果を第８表に示す。表中には、被検菌の塩基配列と相
同性の高い配列を与えるものを順に５種まで記載した。
但し、相同性が８０％以下のものは記載していない。表
示したように、芽胞を形成する被検菌は１００％の相同
性を示したバチラス・ズブチリスであると同定された。
【００３５】
【表１０】
【００３６】実施例２ 芽胞形成グラム陽性菌の同定 芽胞形成グラム陽性菌に属する細菌を被検菌として、該
細菌の同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同
じ条件で行った。結果を第８表に示す。この結果、ＰＣ
Ｒ法によって増幅した２６３塩基の配列が決定され、DD
BJのホモロジーサーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）を用い
て該塩基配列の相同性について検索し、芽胞を形成する
被検菌は９９％の相同性を示したブレビバチルス・ブレ
ビスであると同定された。被検菌の塩基配列を配列表の
配列番号２２に、データベースに登録されているブレビ
バチルス・ブレビスの塩基配列２３に示す。また、被検
菌の塩基配列およびデータベースに登録されているブレ
ビバチルス・ブレビスの塩基配列の比較を図１に示し
た。図中、Ａは被検菌、Ｂはブレビバチルス・ブレビス
を示している。また、該配列中において不一致の塩基を
下線で示す。
細菌の同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同
じ条件で行った。結果を第８表に示す。この結果、ＰＣ
Ｒ法によって増幅した２６３塩基の配列が決定され、DD
BJのホモロジーサーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）を用い
て該塩基配列の相同性について検索し、芽胞を形成する
被検菌は９９％の相同性を示したブレビバチルス・ブレ
ビスであると同定された。被検菌の塩基配列を配列表の
配列番号２２に、データベースに登録されているブレビ
バチルス・ブレビスの塩基配列２３に示す。また、被検
菌の塩基配列およびデータベースに登録されているブレ
ビバチルス・ブレビスの塩基配列の比較を図１に示し
た。図中、Ａは被検菌、Ｂはブレビバチルス・ブレビス
を示している。また、該配列中において不一致の塩基を
下線で示す。
【００３７】実施例３ 芽胞形成グラム陽性菌の同定 芽胞形成グラム陽性菌に属する細菌を被検菌として、該
細菌の同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同
じ条件で行った。結果を第８表に示す。この結果、ＰＣ
Ｒ法によって増幅した２７９塩基の配列が決定され、DD
BJのホモロジーサーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）を用い
て該塩基配列の相同性について検索し、芽胞を形成する
被検菌は相同性９９％、配列中の不一致の塩基数２を示
したパエニバチルス・ポリミキサと同定された。被検菌
の塩基配列を配列表の配列番号２４に、データベースに
登録されているパエニバチルス・ポリミキサの塩基配列
２５に示す。また、被検菌の塩基配列とデータベースに
登録されているパエニバチルス・ポリミキサの塩基配列
の比較を図２に示した。図中、Ａは被検菌、Ｃはパエニ
バチルス・ポリミキサを示している。該配列中において
不一致の塩基を下線で示す。
細菌の同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同
じ条件で行った。結果を第８表に示す。この結果、ＰＣ
Ｒ法によって増幅した２７９塩基の配列が決定され、DD
BJのホモロジーサーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）を用い
て該塩基配列の相同性について検索し、芽胞を形成する
被検菌は相同性９９％、配列中の不一致の塩基数２を示
したパエニバチルス・ポリミキサと同定された。被検菌
の塩基配列を配列表の配列番号２４に、データベースに
登録されているパエニバチルス・ポリミキサの塩基配列
２５に示す。また、被検菌の塩基配列とデータベースに
登録されているパエニバチルス・ポリミキサの塩基配列
の比較を図２に示した。図中、Ａは被検菌、Ｃはパエニ
バチルス・ポリミキサを示している。該配列中において
不一致の塩基を下線で示す。
【００３８】実施例４ 芽胞形成グラム陽性菌の同定 芽胞形成グラム陽性菌に属する細菌を被検菌として、該
細菌の同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同
じ条件で行った。結果を第８表に示す。この結果、ＰＣ
Ｒ法によって増幅した２７６塩基の配列が決定され、DD
BJのホモロジーサーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）を用い
て該塩基配列の相同性について検索し、芽胞を形成する
被検菌はスポロラクトバチルス・イヌリヌスと１００％
の相同性で一致した。このため、該細菌をスポロラクト
バチルス・イヌリヌスと同定した。
細菌の同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同
じ条件で行った。結果を第８表に示す。この結果、ＰＣ
Ｒ法によって増幅した２７６塩基の配列が決定され、DD
BJのホモロジーサーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）を用い
て該塩基配列の相同性について検索し、芽胞を形成する
被検菌はスポロラクトバチルス・イヌリヌスと１００％
の相同性で一致した。このため、該細菌をスポロラクト
バチルス・イヌリヌスと同定した。
【００３９】実施例５ 芽胞形成グラム陽性菌の同定 芽胞形成グラム陽性菌に属する細菌を被検菌として、該
細菌の同定を行った。なお、該菌の培養を嫌気的に行っ
たこと以外は、すべて実施例１と同じ条件で行った。結
果を第８表に示す。この結果、ＰＣＲ法によって増幅し
た２６４塩基の配列が決定され、DDBJのホモロジーサー
チシステム（ｂｌａｓｔｎ）を用いて該塩基配列の相同
性について検索し、芽胞を形成する被検菌はクロストリ
ジウム・ラモザムと１００％の相同性で一致した。この
ため、該細菌をクロストリジウム・ラモザムと同定し
た。
細菌の同定を行った。なお、該菌の培養を嫌気的に行っ
たこと以外は、すべて実施例１と同じ条件で行った。結
果を第８表に示す。この結果、ＰＣＲ法によって増幅し
た２６４塩基の配列が決定され、DDBJのホモロジーサー
チシステム（ｂｌａｓｔｎ）を用いて該塩基配列の相同
性について検索し、芽胞を形成する被検菌はクロストリ
ジウム・ラモザムと１００％の相同性で一致した。この
ため、該細菌をクロストリジウム・ラモザムと同定し
た。
【００４０】実施例６ グラム陰性桿菌の同定 グラム陰性桿菌に属する細菌を被検菌として、該細菌の
同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同じ条件
で行った。結果を第８表に示す。この結果、ＰＣＲ法に
よって増幅した２６９塩基の配列が決定され、DDBJのホ
モロジーサーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）を用いて該塩
基配列の相同性について検索し、グラム陰性桿菌である
被検菌はエシェリヒア・コリと１００％の相同性で一致
した。このため、該細菌をエシェリヒア・コリと同定し
た。
同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同じ条件
で行った。結果を第８表に示す。この結果、ＰＣＲ法に
よって増幅した２６９塩基の配列が決定され、DDBJのホ
モロジーサーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）を用いて該塩
基配列の相同性について検索し、グラム陰性桿菌である
被検菌はエシェリヒア・コリと１００％の相同性で一致
した。このため、該細菌をエシェリヒア・コリと同定し
た。
【００４１】実施例７ グラム陰性桿菌の同定 グラム陰性桿菌に属する細菌を被検菌として、該細菌の
同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同じ条件
で行った。結果を第８表に示す。この結果、ＰＣＲ法に
よって増幅した２６８塩基の配列が決定され、DDBJのホ
モロジーサーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）を用いて該塩
基配列の相同性について検索し、グラム陰性桿菌である
被検菌はクレブシェラ・ニュウモニアと１００％の相同
性で一致した。このため、該細菌をクレブシェラ・ニュ
ウモニアと同定した。
同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同じ条件
で行った。結果を第８表に示す。この結果、ＰＣＲ法に
よって増幅した２６８塩基の配列が決定され、DDBJのホ
モロジーサーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）を用いて該塩
基配列の相同性について検索し、グラム陰性桿菌である
被検菌はクレブシェラ・ニュウモニアと１００％の相同
性で一致した。このため、該細菌をクレブシェラ・ニュ
ウモニアと同定した。
【００４２】実施例８ グラム陰性桿菌の同定 グラム陰性桿菌に属する細菌を被検菌として、該細菌の
同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同じ条件
で行った。結果を第８表に示す。この被検菌について、
ＰＣＲ法によって増幅した２６９塩基の配列を決定し、
DDBJのホモロジーサーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）を用
いて該塩基配列の相同性について検索した結果、被検菌
はエンテロバクター・サカザキと１００％の相同性で一
致したため、該細菌をエンテロバクター・サカザキと同
定した。
同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同じ条件
で行った。結果を第８表に示す。この被検菌について、
ＰＣＲ法によって増幅した２６９塩基の配列を決定し、
DDBJのホモロジーサーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）を用
いて該塩基配列の相同性について検索した結果、被検菌
はエンテロバクター・サカザキと１００％の相同性で一
致したため、該細菌をエンテロバクター・サカザキと同
定した。
【００４３】実施例９ グラム陰性桿菌の同定 グラム陰性桿菌に属する細菌を被検菌として、該細菌の
同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同じ条件
で行った。結果を第９表に示す。
同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同じ条件
で行った。結果を第９表に示す。
【００４４】
【表１１】
【００４５】この被検菌について、ＰＣＲ法によって増
幅した２６９塩基の配列を決定し、DDBJのホモロジーサ
ーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）を用いて該塩基配列の相
同性について検索した結果、被検菌はセラチア・マルセ
ッセンスと相同性９９％、不一致の塩基数１を示したセ
ラチア・マルセッセンスと同定された。
幅した２６９塩基の配列を決定し、DDBJのホモロジーサ
ーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）を用いて該塩基配列の相
同性について検索した結果、被検菌はセラチア・マルセ
ッセンスと相同性９９％、不一致の塩基数１を示したセ
ラチア・マルセッセンスと同定された。
【００４６】実施例１０ グラム陰性桿菌の同定 グラム陰性桿菌に属する細菌を被検菌として、該細菌の
同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同じ条件
で行った。結果を第９表に示す。この被検菌について、
ＰＣＲ法によって増幅した２６９塩基の配列を決定し、
DDBJのホモロジーサーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）を用
いて該塩基配列の相同性について検索した。その結果、
被検菌は相同性９９％、不一致の塩基数１でエルシニア
・クリステンセニと同定された。
同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同じ条件
で行った。結果を第９表に示す。この被検菌について、
ＰＣＲ法によって増幅した２６９塩基の配列を決定し、
DDBJのホモロジーサーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）を用
いて該塩基配列の相同性について検索した。その結果、
被検菌は相同性９９％、不一致の塩基数１でエルシニア
・クリステンセニと同定された。
【００４７】実施例１１ グラム陰性桿菌の同定 グラム陰性桿菌に属する細菌を被検菌として、該細菌の
同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同じ条件
で行った。結果を第９表に示す。この被検菌について、
ＰＣＲ法によって増幅した２７１塩基の配列を決定し、
DDBJのホモロジーサーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）を用
いて該塩基配列の相同性について検索した。その結果、
被検菌は相同性９９％、不一致の塩基数１でフォトバク
テリウム・フォスフォレウムと同定された。
同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同じ条件
で行った。結果を第９表に示す。この被検菌について、
ＰＣＲ法によって増幅した２７１塩基の配列を決定し、
DDBJのホモロジーサーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）を用
いて該塩基配列の相同性について検索した。その結果、
被検菌は相同性９９％、不一致の塩基数１でフォトバク
テリウム・フォスフォレウムと同定された。
【００４８】実施例１２ グラム陰性桿菌の同定 グラム陰性桿菌に属する細菌を被検菌として、該細菌の
同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同じ条件
で行った。結果を第９表に示す。この被検菌について、
ＰＣＲ法によって増幅した２７９塩基の配列を決定し、
DDBJのホモロジーサーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）を用
いて該塩基配列の相同性について検索した。この結果、
グラム陰性桿菌である被検菌は相同性９９％、不一致の
塩基数１でビブリオ・ホリサエと同定された。
同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同じ条件
で行った。結果を第９表に示す。この被検菌について、
ＰＣＲ法によって増幅した２７９塩基の配列を決定し、
DDBJのホモロジーサーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）を用
いて該塩基配列の相同性について検索した。この結果、
グラム陰性桿菌である被検菌は相同性９９％、不一致の
塩基数１でビブリオ・ホリサエと同定された。
【００４９】実施例１３ グラム陰性桿菌の同定 グラム陰性桿菌に属する細菌を被検菌として、該細菌の
同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同じ条件
で行った。結果を第９表に示す。この被検菌について、
ＰＣＲ法によって増幅した２６９塩基の配列を決定し、
DDBJのホモロジーサーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）を用
いて該塩基配列の相同性について検索した結果、被検菌
は相同性１００％でプレシオモナス・シゲロイデスと同
定された。
同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同じ条件
で行った。結果を第９表に示す。この被検菌について、
ＰＣＲ法によって増幅した２６９塩基の配列を決定し、
DDBJのホモロジーサーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）を用
いて該塩基配列の相同性について検索した結果、被検菌
は相同性１００％でプレシオモナス・シゲロイデスと同
定された。
【００５０】実施例１４ グラム陰性桿菌の同定 グラム陰性桿菌に属する細菌を被検菌として、該細菌の
同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同じ条件
で行った。結果を第９表に示す。被検菌であるグラム陰
性桿菌について、ＰＣＲ法によって増幅した２６９塩基
の配列が決定され、DDBJのホモロジーサーチシステム
（ｂｌａｓｔｎ）を用いて該塩基配列の相同性について
検索した結果、この被検菌は相同性９８％、不一致の塩
基数４でシトロバクター・フロインディと同定された。
被検菌の塩基配列を配列表の配列番号２６に、データベ
ースに登録されているシトロバクター・フロインディの
塩基配列２７に示す。また、この被検菌とデータベース
に登録されているシトロバクター・フロインディの塩基
配列の比較を図３に示した。図中、Ａは被検菌、Ｄはシ
トロバクター・フロインディを示している。また、該配
列中において不一致の塩基を下線で示す。
同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同じ条件
で行った。結果を第９表に示す。被検菌であるグラム陰
性桿菌について、ＰＣＲ法によって増幅した２６９塩基
の配列が決定され、DDBJのホモロジーサーチシステム
（ｂｌａｓｔｎ）を用いて該塩基配列の相同性について
検索した結果、この被検菌は相同性９８％、不一致の塩
基数４でシトロバクター・フロインディと同定された。
被検菌の塩基配列を配列表の配列番号２６に、データベ
ースに登録されているシトロバクター・フロインディの
塩基配列２７に示す。また、この被検菌とデータベース
に登録されているシトロバクター・フロインディの塩基
配列の比較を図３に示した。図中、Ａは被検菌、Ｄはシ
トロバクター・フロインディを示している。また、該配
列中において不一致の塩基を下線で示す。
【００５１】実施例１５ グラム陽性球菌の同定 グラム陽性球菌に属する細菌を被検菌として、該細菌の
同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同じ条件
で行った。結果を第９表に示す。この被検菌について、
ＰＣＲ法によって増幅した２５０塩基の配列が決定さ
れ、DDBJのホモロジーサーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）
を用いて該塩基配列の相同性について検索した結果、被
検菌は相同性１００％でデイノコッカス・ラジオデュラ
ンと同定された。
同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同じ条件
で行った。結果を第９表に示す。この被検菌について、
ＰＣＲ法によって増幅した２５０塩基の配列が決定さ
れ、DDBJのホモロジーサーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）
を用いて該塩基配列の相同性について検索した結果、被
検菌は相同性１００％でデイノコッカス・ラジオデュラ
ンと同定された。
【００５２】実施例１６ グラム陽性球菌の同定 グラム陽性球菌に属する細菌を被検菌として、該細菌の
同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同じ条件
で行った。結果を第９表に示す。この被検菌について、
ＰＣＲ法によって増幅した２７５塩基の配列を決定し、
DDBJのホモロジーサーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）を用
いて該塩基配列の相同性について検索した結果、被検菌
を相同性１００％でラクトコッカス・ラクチスと同定し
た。
同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同じ条件
で行った。結果を第９表に示す。この被検菌について、
ＰＣＲ法によって増幅した２７５塩基の配列を決定し、
DDBJのホモロジーサーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）を用
いて該塩基配列の相同性について検索した結果、被検菌
を相同性１００％でラクトコッカス・ラクチスと同定し
た。
【００５３】実施例１７ グラム陽性球菌の同定 グラム陽性球菌に属する細菌を被検菌として、該細菌の
同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同じ条件
で行った。結果を第１０表に示す。この被検菌につい
て、ＰＣＲ法によって増幅した２５０塩基の配列を決定
し、DDBJのホモロジーサーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）
を用いて該塩基配列の相同性について検索した。その結
果、被検菌は相同性９９％、不一致の塩基数１でペディ
オコッカス・ダムノザスと同定された。被検菌の塩基配
列を配列表の配列番号２８に、データベースに登録され
ているペディオコッカス・ダムノザスの塩基配列２９に
示す。また、被検菌の塩基配列とペディオコッカス・ダ
ムノザスの塩基配列の比較を図４に示した。図中、Ａは
被検菌、Ｅはペディオコッカス・ダムノザスを示してお
り、該配列中において不一致の塩基は下線で示した。
同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同じ条件
で行った。結果を第１０表に示す。この被検菌につい
て、ＰＣＲ法によって増幅した２５０塩基の配列を決定
し、DDBJのホモロジーサーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）
を用いて該塩基配列の相同性について検索した。その結
果、被検菌は相同性９９％、不一致の塩基数１でペディ
オコッカス・ダムノザスと同定された。被検菌の塩基配
列を配列表の配列番号２８に、データベースに登録され
ているペディオコッカス・ダムノザスの塩基配列２９に
示す。また、被検菌の塩基配列とペディオコッカス・ダ
ムノザスの塩基配列の比較を図４に示した。図中、Ａは
被検菌、Ｅはペディオコッカス・ダムノザスを示してお
り、該配列中において不一致の塩基は下線で示した。
【００５４】
【表１２】
【００５５】実施例１８ グラム陽性球菌の同定 グラム陽性球菌に属する細菌を被検菌として、該細菌の
同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同じ条件
で行った。結果を第１０表に示す。被検菌であるグラム
陽性球菌について、ＰＣＲ法によって増幅した２７１塩
基の配列が決定され、DDBJのホモロジーサーチシステム
（ｂｌａｓｔｎ）を用いて該塩基配列の相同性について
検索した結果、被検菌は相同性９９％、不一致の塩基数
１でサッカロコッカス・サーモフィルスであると同定さ
れた。
同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同じ条件
で行った。結果を第１０表に示す。被検菌であるグラム
陽性球菌について、ＰＣＲ法によって増幅した２７１塩
基の配列が決定され、DDBJのホモロジーサーチシステム
（ｂｌａｓｔｎ）を用いて該塩基配列の相同性について
検索した結果、被検菌は相同性９９％、不一致の塩基数
１でサッカロコッカス・サーモフィルスであると同定さ
れた。
【００５６】実施例１９ グラム陽性球菌の同定 グラム陽性球菌に属する細菌を被検菌として、該細菌の
同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同じ条件
で行った。結果を第１０表に示す。この被検菌につい
て、ＰＣＲ法によって増幅した２７６塩基の配列を決定
し、DDBJのホモロジーサーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）
を用いて該塩基配列の相同性について検索した結果、被
検菌は相同性１００％でスタフィロコッカス・アウレウ
スと同定された。
同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同じ条件
で行った。結果を第１０表に示す。この被検菌につい
て、ＰＣＲ法によって増幅した２７６塩基の配列を決定
し、DDBJのホモロジーサーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）
を用いて該塩基配列の相同性について検索した結果、被
検菌は相同性１００％でスタフィロコッカス・アウレウ
スと同定された。
【００５７】実施例２０ グラム陽性球菌の同定 グラム陽性球菌に属する細菌を被検菌として、該細菌の
同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同じ条件
で行った。結果を第１０表に示す。この被検菌につい
て、ＰＣＲ法によって増幅した２８３塩基の配列を決定
し、DDBJのホモロジーサーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）
を用いて該塩基配列の相同性について検索した結果、被
検菌は相同性１００％でストレプトコッカス・ピオゲネ
スと同定された。
同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同じ条件
で行った。結果を第１０表に示す。この被検菌につい
て、ＰＣＲ法によって増幅した２８３塩基の配列を決定
し、DDBJのホモロジーサーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）
を用いて該塩基配列の相同性について検索した結果、被
検菌は相同性１００％でストレプトコッカス・ピオゲネ
スと同定された。
【００５８】
【発明の効果】本発明により、各種の細菌を迅速、かつ
正確に同定できるプライマーが提供される。さらに、特
定の細菌のゲノムＤＮＡを鋳型として該プライマーを用
いたＰＣＲ法を行い、得られた増幅産物についてＤＮＡ
塩基配列を決定し、該配列を既知のＤＮＡ塩基配列との
相同性を比較することによって、該細菌を同定する方法
が提供される。この方法は、同じ細菌群においては統一
された試験方法で実施することができ、簡便な方法で細
菌を同定できる。したがって、本発明はヒトの疾患や食
品の変敗等の原因究明あるいは伝搬経路の解明などに大
きく寄与するものである。
正確に同定できるプライマーが提供される。さらに、特
定の細菌のゲノムＤＮＡを鋳型として該プライマーを用
いたＰＣＲ法を行い、得られた増幅産物についてＤＮＡ
塩基配列を決定し、該配列を既知のＤＮＡ塩基配列との
相同性を比較することによって、該細菌を同定する方法
が提供される。この方法は、同じ細菌群においては統一
された試験方法で実施することができ、簡便な方法で細
菌を同定できる。したがって、本発明はヒトの疾患や食
品の変敗等の原因究明あるいは伝搬経路の解明などに大
きく寄与するものである。
【００５９】
【００６０】配列番号：１ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を示す記号：ｒＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 GCC TAA TAC ATG CAA GTC GAG CG
【００６１】配列番号：２ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を示す記号：ｒＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 ACT GCT GCC TCC CGT AGG AGT
【００６２】配列番号：３ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を示す記号：ｒＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 ACT CCT ACG GGA GGC AGC AGT
【００６３】配列番号：４ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を示す記号：ｒＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 CGC TCG ACT TGC ATG TAT TAG GC
【００６４】配列番号：５ 配列の長さ：４１ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を示す記号：ｒＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 TGT AAA ACG ACG GCC AGT GCC TAA TAC ATG CAA GTC GAG CG
【００６５】配列番号：６ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を示す記号：ｒＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 GCC TAA CAC ATG CAA GTC GAG CG
【００６６】配列番号：７ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を示す記号：ｒＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 ACT GCT GCC TCC CGT AGG AGT
【００６７】配列番号：８ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を示す記号：ｒＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 CGC TCG ACT TGC ATG TGT TAG GC
【００６８】配列番号：９ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を示す記号：ｒＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 ACT CCT ACG GGA GGC AGC AGT
【００６９】配列番号：１０ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を示す記号：ｒＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 GCC TAA CAC ATG CAA GTC GAG CG
【００７０】配列番号：１１ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を示す記号：ｒＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 ACT GCT GCC TCC CGT AGG AGT
【００７１】配列番号：１２ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を示す記号：ｒＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 CGC TCG ACT TGC ATG TGT TAG GC
【００７２】配列番号：１３ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を示す記号：ｒＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 ACT CCT ACG GGA GGC AGC AGT
【００７３】配列番号：１４ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を示す記号：ｒＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 GCC TAA TAC ATG CAA GTC GAG CG
【００７４】配列番号：１５ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を示す記号：ｒＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 ACT GCT GCC TCC CGT AGG AGT
【００７５】配列番号：１６ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を示す記号：ｒＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 CGC TCG ACT TGC ATG TAT TAG GC
【００７６】配列番号：１７ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を示す記号：ｒＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 ACT CCT ACG GGA GGC AGC AGT
【００７７】配列番号：１８ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を示す記号：ｒＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 GCC TAA TAC ATG CAA GTC GAG CG
【００７８】配列番号：１９ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を示す記号：ｒＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 ACT GCT GCC TCC CGT AGG AGT
【００７９】配列番号：２０ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を示す記号：ｒＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 CGC TCG ACT TGC ATG TGT TAG GC
【００８０】配列番号：２１ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を示す記号：ｒＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 ACT CCT ACG GGA GGC AGC AGT
【００８１】配列番号：２２ 配列の長さ：２６３ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｒＲＮＡ 起源 生物名：B. brevis 株名：B-041 配列の特徴 特徴を示す記号：ｒＲＮＡ 存在位置：１．．２６３ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 AGGGTCTTCG GACCCTAGCG GCGGACGGGT GAGTAACACG TAGGCAACCT GCCTCTCAGA 60 CCGGGATAAC ATAGGGAAAC TTATGCTAAT ACCGGATAGG TTTTTGGATC GCATGATCCG 120 AAAAGAAAAG GCGGCTTCGG CTGTCACTGG GAGATGGGCC TGCGGCGCAT TAGCTAGTTG 180 GTGGGGTAAC GGCCTACCAA GGCGACGATG CGTAGCCGAC CTGAGAGGGT GACCGGACAC 240 ACTGGGACTG AGACACGGCC CAG 263
【００８２】配列番号：２３ 配列の長さ：２６３ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｒＲＮＡ 起源 生物名：Bb. brevis 株名：JCM 2503 配列の特徴： 特徴を示す記号：ｒＲＮＡ 存在位置：６３．．３２５ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 63 AGGGTCTTCG GACCCTAGCG GCGGACGGGT GAGTAACACG TAGGCAACCT GCCTCTCAGA 122 CCGGGATAAC ATAGGGAAAC TTATGCTAAT ACCGGATAGG TTTNTGGATC GCATGATCCG 182 AAAAGAAAAG GCGGCTTCGG CTGTCACTGG GAGATGGGCC TGCGGCGCAT TAGCTAGTTG 242 GTGGGGTAAC GGCCTACCAA GGCGACGATG CGTAGCCGAC CTGAGAGGGT GACCGGACAC 302 ACTGGGACTG AGACACGGCC CAG 325
【００８３】配列番号：２４ 配列の長さ：２７９ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｒＲＮＡ 起源 生物名：Pae. polymyxa 株名：B-014 配列の特徴： 特徴を示す記号：ｒＲＮＡ 存在位置：１．．２７９ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 GGGTTAATTA GAAGCTTGCT TCTAACTAAC CTAGCGGCGG ACGGGTGAGT AACACGTAGG 60 CAACCTGCCC ACAAGACAGG GATAACTACC GGAAACGGTA GCTAATACCC GATGCATCCT 120 TTTCCTGCAT GGGAGAAGGA GGAAAGGCGG AGCAATCTGT CACTTGTGGA TGGGCCTGCG 180 GCGCATTAGC TAGTTGGTGG GGTAAAGGCC TACCAAGGCG ACGATGCGTA GCCGACCTGA 240 GAGGGTGATC GGCCACACTG GGACTGAGAC ACGGCCCAG 279
【００８４】配列番号：２５ 配列の長さ：２７９ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｒＲＮＡ 起源 生物名：Pae. polymyxa 株名：IAM 12075 配列の特徴： 特徴を示す記号：ｒＲＮＡ 存在位置：４２．．３２０ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 42 GGGTTAATTA GAAGCTTGCT TCTAACTAAC CTAGCGGCGG ACGGGTGAGT AACACGTAGG 101 CAACCTGCCC ACAAGACTGG GATAACTACC GGAAACGGTA GCTAATACCC GATGCCTCCT 161 TTTCCTGCAT GGGAGAAGGA GGAAAGGCGG AGCAATCTGT CACTTGTGGA TGGGCCTGCG 221 GCGCATTAGC TAGTTGGTGG GGTAAAGGCC TACCAAGGCG ACGATGCGTA GCCGACCTGA 281 GAGGGTGATC GGCCACACTG GGACTGAGAC ACGGCCCAG 320
【００８５】配列番号：２６ 配列の長さ：２６９ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｒＲＮＡ 起源 生物名：C. freundi 株名：C-009 配列の特徴： 特徴を示す記号：ｒＲＮＡ 存在位置：１．．２６９ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 GTAGCACAGA GGAGCTTGCT CCTTGGGTGA CGAGTGGCGG ACGGGTGAGT AATGTCTGGG 60 AAACTGCCTG ATGGAGGGGG ATAACTACTG GAAACGGTAG CTAATACCGC ATAACGTCGC 120 AAGACCAAAG AGGGGGACCT TCGGGCCTCT TGCCATCAGA TGTGCCCAGA TGGGATTAGC 180 TAGTAGGTGG GGTAACGGCT CACCTAGGCG ACGATCCCTA GCTGGTCTGA GAGGATGACC 240 AGCCACACTG GAACTGAGAC ACGGTCCAG 269
【００８６】配列番号：２７ 配列の長さ：２６９ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｒＲＮＡ 起源 生物名：C. freundi 株名：ATCC 29935 配列の特徴： 特徴を示す記号：ｒＲＮＡ 存在位置：７０．．３３８ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 70 GTAGCACAGA GGAGCTTGCT CCTTGGGTGA CGAGTGGCGG ACGGGTGAGTA ATGTCTGGG 129 AAACTGCNTG ATGGAGGGGG ATAACTACTG GAAACGGTAG CTAATACCGCA TAACGTCGC 189 AAGACCAAAG AGGGGGACCT TCGGGCCTCT TGCCATCNNA TGTGCCCAGAT GGGATTAGC 249 TAGTAGGTGG GGTAACGGCT CACCTAGGCG ACGATCCCTA GCTGGTCTGA GAGGATGACC 309 AGCCACACTG GAACTGAGAC ACGGTCNAG 338
【００８７】配列番号：２８ 配列の長さ：３０５ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｒＲＮＡ 起源 生物名：P. damnosus 株名：G-073 配列の特徴： 特徴を示す記号：ｒＲＮＡ 存在位置：１．．３０５ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 CACTTTCGTT GATTGAATTA GAGATGCTTG CATCGAAGCT GATTTCAACT ATAAAGTGAG 60 TGGCGAACGG GTGAGTAACA CGTGGGTAAC CTGCCCAGAA GTGGGGGATA ACACCTGGAA 120 ACAGATGCTA ATACCGCATA ATAAAATGAA CCGCATGGTT TATTTTTAAA AGATGGCTTC 180 GGCTATCACT TCTGGATGGA CCCGCGGCGT ATTAGCTAGT TGGTGAGATA AAGGCTCACC 240 AAGGCTGTGA TACGTAGCCG ACCTGAGAGG GTAATCGGCC ACATTGGGAC TGAGACACGG 300 CCCAG 305
【００８８】配列番号：２９ 配列の長さ：３０５ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｒＲＮＡ 起源 生物名：P. damnosus 株名：JCM 5886 配列の特徴： 特徴を示す記号：ｒＲＮＡ 存在位置：４１．．３４５ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 41 CACTTTCGTT GATTGAATTA GAGATGCTTG CATCGAAGCT GATTTCAACT ATAAAGTGAG 100 TGGCGAACGG GTGAGTAACA CGTGGGTAAC CTGCCCAGAA GTGGGGGATA ACACCTGGAA 160 ACAGATGCTA ATACCGCATA ATAAAATGAA CCGCATGGTT TATTTTTAAA AGATGGCTTC 220 GNCTATCACT TCTGGATGGA CCCGCGGCGT ATTAGCTAGT TGGTGAGATA AAGGCTCACC 280 AAGGCTGTGA TACGTAGCCG ACCTGAGAGG GTAATCGGCC ACATTGGGAC TGAGACACGG 340 CCCAG 345
【図１】 実施例２の被検菌の塩基配列とデータベース
に登録されているBb. brevisの塩基配列の相同性を示し
たものである。
に登録されているBb. brevisの塩基配列の相同性を示し
たものである。
【図２】 実施例３の被検菌の塩基配列とデータベース
に登録されているPae. polymyxaの塩基配列の相同性を
示したものである。
に登録されているPae. polymyxaの塩基配列の相同性を
示したものである。
【図３】 実施例１４の被検菌の塩基配列とデータベー
スに登録されているC. freundiの塩基配列の相同性を示
したものである。
スに登録されているC. freundiの塩基配列の相同性を示
したものである。
【図４】 実施例１７の被検菌の塩基配列とデータベー
スに登録されているP. damnosusの塩基配列の相同性を
示したものである。
スに登録されているP. damnosusの塩基配列の相同性を
示したものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 定家 義人 静岡県三島市谷田1111番 国立遺伝学研究 所ＲＩセンター内
Claims (10)
- 【請求項１】 配列表の配列番号１または４に記載の塩
基配列または該配列の１個もしくは数個の塩基が置換、
付加もしくは欠失した塩基配列からなるオリゴヌクレオ
チド。 - 【請求項２】 配列表の配列番号２または３に記載の塩
基配列または該配列の１個もしくは数個の塩基が置換、
付加もしくは欠失した塩基配列からなるオリゴヌクレオ
チド。 - 【請求項３】 被検菌より抽出したゲノムＤＮＡを鋳型
とし、請求項１記載のオリゴヌクレオチドおよび請求項
２記載のオリゴヌクレオチドの組み合わせ（但し、配列
表の配列番号１と３および配列番号４と２の組み合わせ
を除く）からなる１対のオリゴヌクレオチドをプライマ
ーとして用いたポリメラーゼ連鎖反応法により細菌の１
６Ｓ−リボソームＲＮＡをコードする遺伝子の５’末端
領域のＤＮＡの増幅を行い、得られた増幅産物の塩基配
列を常法により決定し、該配列を既知のＤＮＡ塩基配列
と比較し、被検菌が最も高い相同性を有する細菌種とし
て同定することを特徴とする細菌の同定方法。 - 【請求項４】 細菌が芽胞を形成するグラム陽性細菌で
あることを特徴とする請求項３記載の細菌の同定方法。 - 【請求項５】 グラム陽性細菌がアリシクロバチルス
属、バチルス属、ブレビバチルス属、クロストリディウ
ム属、デスルフォトマクラム属、パエニバチルス属、ス
ポロハロバクター属、スポロラクトバチルス属、スポロ
サルチナ属およびシントロフォスポラ属のいずれかであ
る請求項４記載の細菌の同定法。 - 【請求項６】 細菌がグラム陽性球菌であることを特徴
とする請求項３記載の細菌の同定方法。 - 【請求項７】 グラム陽性球菌がアビオトロフィア属、
コプロコッカス属、デニコッカス属、エンテロコッカス
属、ゲメラ属、ラクトコッカス属、ロイコノストック
属、マリノコッカス属、ミクロコッカス属、ペディオコ
ッカス属、プラノコッカス属、ルミノコッカス属、サッ
カロコッカス属、サリニコッカス属、サルシナ属、スタ
フィロコッカス属、ストレプトコッカス属およびバゴコ
ッカス属のいずれかである請求項６記載の細菌の同定方
法。 - 【請求項８】 細菌がグラム陰性桿菌であることを特徴
とする請求項３記載の細菌の同定方法。 - 【請求項９】 グラム陰性桿菌がアレセノフォナス属、
シトロバクター属、エンテロバクター属、エルシニア
属、エシェリヒア属、エウィンゲラ属、ハフィニア属、
クレブシエラ属、クルイベラ属、フォトラブダス属、プ
ロテウス属、サルモネラ属、セラチア属、シゲラ属、フ
ォトバクテリウム属、プレシオモナス属およびビブリオ
属のいずれかである請求項８記載の細菌の同定法。 - 【請求項１０】 請求項１記載のオリゴヌクレオチドお
よび請求項２記載のオリゴヌクレオチドからなる１対の
プライマーを含む細菌同定用キット。
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