JPH0690796A - カンピロバクター ジェジュニ及びコリ検出用プローブ及び検出方法 - Google Patents
カンピロバクター ジェジュニ及びコリ検出用プローブ及び検出方法Info
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- JPH0690796A JPH0690796A JP3718992A JP3718992A JPH0690796A JP H0690796 A JPH0690796 A JP H0690796A JP 3718992 A JP3718992 A JP 3718992A JP 3718992 A JP3718992 A JP 3718992A JP H0690796 A JPH0690796 A JP H0690796A
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- coli
- probe
- sequence
- campylobacter
- jejuni
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Abstract
(57)【要約】
【目的】臨床検査、事に食中毒にかかる検査、あるいは
食品検査における、カンピロバクタ− ジェジュニ（Ca
mpylobacter jejuni）及びコリ（coli）の検出を迅速か
つ正確に行うことを目的とするものである。 【構成】特定配列を有するＤＮＡ又はＲＮＡ核酸プロ−
ブからなるカンピロバクタ− ジェジュニ（Campylobac
ter jejuni）及びコリ（coli）検出用プロ−ブ及び該プ
ロ−ブを用いるカンピロバクタ− ジェジュニ（Campyl
obacter jejuni）及びコリ（coli）検出方法。 【効果】カンピロバクタ− ジェジュニ及びコリの検出
が迅速かつ正確に行えるほか、標本の輸送のための輸送
培地の必要性もない。
食品検査における、カンピロバクタ− ジェジュニ（Ca
mpylobacter jejuni）及びコリ（coli）の検出を迅速か
つ正確に行うことを目的とするものである。 【構成】特定配列を有するＤＮＡ又はＲＮＡ核酸プロ−
ブからなるカンピロバクタ− ジェジュニ（Campylobac
ter jejuni）及びコリ（coli）検出用プロ−ブ及び該プ
ロ−ブを用いるカンピロバクタ− ジェジュニ（Campyl
obacter jejuni）及びコリ（coli）検出方法。 【効果】カンピロバクタ− ジェジュニ及びコリの検出
が迅速かつ正確に行えるほか、標本の輸送のための輸送
培地の必要性もない。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、臨床検査、特に食中毒
にかかる検査、あるいは食品検査における、カンピロバ
クタ− ジェジュニ（Campylobacter jejuni）及びコリ
（coli）の検出に関するものである。
にかかる検査、あるいは食品検査における、カンピロバ
クタ− ジェジュニ（Campylobacter jejuni）及びコリ
（coli）の検出に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】カンピロバクタ−属は、人、あるいは動
物の流産、敗血症、及び増殖性回腸炎などの疾患の原因
に関連付けられるものであり、又、カンピロバクタ−と
は未だ確認はされていないが、カンピロバクタ−に類似
した微生物が、同性愛者の排泄物（Fennel et al,(198
4) J.Infec.Dis. 149 : 58）及び胃潰瘍生検(Kasper e
tal,(1984) Infection, 12: 179 ）から単離されてい
る。更に、カンピロバクタ− ジェジュニ及びコリは、
人の下痢（Blaser et al,(1979) Ann.Intern.Med.91; 1
79)及び肺炎（Morris et al,(1985) Manual of Medical
Microbiology,. Lennette et al, American Sciaty fo
r Microbiology, Wasington.D.C.)の原因となるもっと
も重要な菌種のひとつであるとされているものである。
物の流産、敗血症、及び増殖性回腸炎などの疾患の原因
に関連付けられるものであり、又、カンピロバクタ−と
は未だ確認はされていないが、カンピロバクタ−に類似
した微生物が、同性愛者の排泄物（Fennel et al,(198
4) J.Infec.Dis. 149 : 58）及び胃潰瘍生検(Kasper e
tal,(1984) Infection, 12: 179 ）から単離されてい
る。更に、カンピロバクタ− ジェジュニ及びコリは、
人の下痢（Blaser et al,(1979) Ann.Intern.Med.91; 1
79)及び肺炎（Morris et al,(1985) Manual of Medical
Microbiology,. Lennette et al, American Sciaty fo
r Microbiology, Wasington.D.C.)の原因となるもっと
も重要な菌種のひとつであるとされているものである。
【０００３】臨床標本中のカンピロバクタ−の存在は、
以下の方法で検出されている。即ち、まず、適切に調製
した試料を増殖に適した条件下の微生物学的培地上で培
養する。培養により得られたコロニ−について、一般的
に試料の採取後４８時間に開始し、終了するのに数日を
要する形態学的及び生物学的特徴を検査することによ
り、その存在を確認するという方法である。
以下の方法で検出されている。即ち、まず、適切に調製
した試料を増殖に適した条件下の微生物学的培地上で培
養する。培養により得られたコロニ−について、一般的
に試料の採取後４８時間に開始し、終了するのに数日を
要する形態学的及び生物学的特徴を検査することによ
り、その存在を確認するという方法である。
【０００４】しかし、上記の方法では、培養に微好気性
の環境が要求されるなど、時間が掛かり過ぎることの他
に、技術上にも困難な点が多いという問題を有してい
る。そこで、最近では、オリゴヌクレオチドを用いたＤ
ＮＡプロ−ブ法あるいはハイブリダイゼ−ション法が試
みられるようになってきた。例えば、Kohne[Biochemica
l Journal ８：1104-1118(1968)]らは、ｒＲＮＡ配列の
プロ−ブを調製する１つの方法について議論しており、
PaceおよびCampbell[Journal of Bacteriology 107 : 5
43-547(1971)] は、異なった細菌種からのｒＲＮＡの相
同性及びこれらの相同性の程度を定量化するためのハイ
ブリダイゼ−ション法について議論している。更に、So
gin[Journal of Molecular Evolution 1 : 173-184(19
72)]らは、系統発生論関係の評価のために異なったリボ
ゾ−ムＲＮＡ分子の一次構造特性を用いる論理的および
実際的観点について議論しており、Fox[International
Journal of Systematic Bacteriology 27 : 44-57(197
7)] らは、原核生物分類への比較カタログ法について議
論している。又、Kohne らは、Gen-Probe 社の出願特許
(1983)中で、リボゾ−ムＲＮＡ分子に対するプロ−ブと
して使用するための核酸断片を得るための戦略について
述べている。
の環境が要求されるなど、時間が掛かり過ぎることの他
に、技術上にも困難な点が多いという問題を有してい
る。そこで、最近では、オリゴヌクレオチドを用いたＤ
ＮＡプロ−ブ法あるいはハイブリダイゼ−ション法が試
みられるようになってきた。例えば、Kohne[Biochemica
l Journal ８：1104-1118(1968)]らは、ｒＲＮＡ配列の
プロ−ブを調製する１つの方法について議論しており、
PaceおよびCampbell[Journal of Bacteriology 107 : 5
43-547(1971)] は、異なった細菌種からのｒＲＮＡの相
同性及びこれらの相同性の程度を定量化するためのハイ
ブリダイゼ−ション法について議論している。更に、So
gin[Journal of Molecular Evolution 1 : 173-184(19
72)]らは、系統発生論関係の評価のために異なったリボ
ゾ−ムＲＮＡ分子の一次構造特性を用いる論理的および
実際的観点について議論しており、Fox[International
Journal of Systematic Bacteriology 27 : 44-57(197
7)] らは、原核生物分類への比較カタログ法について議
論している。又、Kohne らは、Gen-Probe 社の出願特許
(1983)中で、リボゾ−ムＲＮＡ分子に対するプロ−ブと
して使用するための核酸断片を得るための戦略について
述べている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、オリゴヌク
レオチドを用いたＤＮＡプロ−ブ法あるいはハイブリダ
イゼ−ション法に使用され得るＤＮＡ又はＲＮＡ、特に
カンピロバクタ− ジェジュニ及びコリ由来の１６Ｓｒ
ＲＮＡ遺伝子を検出するために用いられる、最初２重鎖
である場合に必要であれば、予め変性された同定される
べき株に属する相補的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列とハイブ
リッド形成するカンピロバクタ− ジェジュニ及びコリ
検出用オリゴヌクレオチドプロ−ブ及び食中毒菌検査に
おけるカンピロバクタ− ジェジュニ及びコリの簡便且
つ高感度な検査法を提供しようとするものである。
レオチドを用いたＤＮＡプロ−ブ法あるいはハイブリダ
イゼ−ション法に使用され得るＤＮＡ又はＲＮＡ、特に
カンピロバクタ− ジェジュニ及びコリ由来の１６Ｓｒ
ＲＮＡ遺伝子を検出するために用いられる、最初２重鎖
である場合に必要であれば、予め変性された同定される
べき株に属する相補的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列とハイブ
リッド形成するカンピロバクタ− ジェジュニ及びコリ
検出用オリゴヌクレオチドプロ−ブ及び食中毒菌検査に
おけるカンピロバクタ− ジェジュニ及びコリの簡便且
つ高感度な検査法を提供しようとするものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、オリゴヌ
クレオチドを用いたＤＮＡプロ−ブ法あるいはハイブリ
ダイゼ−ション法に使用され得るＤＮＡ又はＲＮＡにつ
いて広く探索し、カンピロバクタ− ジェジュニ及びコ
リの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子と選択的にハイブリダイズす
るオリゴヌクレオチドの作成に成功し本発明を完成させ
たのである。
クレオチドを用いたＤＮＡプロ−ブ法あるいはハイブリ
ダイゼ−ション法に使用され得るＤＮＡ又はＲＮＡにつ
いて広く探索し、カンピロバクタ− ジェジュニ及びコ
リの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子と選択的にハイブリダイズす
るオリゴヌクレオチドの作成に成功し本発明を完成させ
たのである。
【０００７】即ち、本発明は以下の３発明からなるもの
である。 下記配列又はその相補的配列を有するＤＮＡ又はＲ
ＮＡ核酸プロ−ブであることを特徴とするカンピロバク
タ− ジェジュニ（Campylobacter jejuni）及びコリ
（coli）検出用プロ−ブに関する発明。10 20
30 40 50XAAACGAXGX ACACXAG
XXG XXGGGGXGCX AGXCAXCXCA GXAAXGCAGC60 70X
AACGCAXXA AGXGXACCGC CXG（ＤＮＡ配列の場合 Ｘ＝
Ｔ：ＲＮＡ配列の場合 Ｘ＝Ｕ） 請求項１に記載された配列から誘導される１５〜３
５、好ましくは１８〜２４ヌクレオチドの配列又はその
相補的配列を有するＤＮＡ又はＲＮＡ核酸プロ−ブであ
ることを特徴とするカンピロバクタ− ジェジュニ（Ca
mpylobacter jejuni）及びコリ（coli）検出用プロ−ブ
に関する発明。 上記又はに記載されたカンピロバクタ− ジェ
ジュニ（Campylobacterjejuni）及びコリ（coli）検出
用プロ−ブを、最初二重鎖の場合に必要であれば変性し
た同定されるべき株に属する核酸とハイブリッド形成さ
せて選択的検出又は同定を行うことを特徴とするカンピ
ロバクタ− ジェジュニ（Campylobacterjejuni）及び
コリ（coli）検出方法に関する発明。
である。 下記配列又はその相補的配列を有するＤＮＡ又はＲ
ＮＡ核酸プロ−ブであることを特徴とするカンピロバク
タ− ジェジュニ（Campylobacter jejuni）及びコリ
（coli）検出用プロ−ブに関する発明。10 20
30 40 50XAAACGAXGX ACACXAG
XXG XXGGGGXGCX AGXCAXCXCA GXAAXGCAGC60 70X
AACGCAXXA AGXGXACCGC CXG（ＤＮＡ配列の場合 Ｘ＝
Ｔ：ＲＮＡ配列の場合 Ｘ＝Ｕ） 請求項１に記載された配列から誘導される１５〜３
５、好ましくは１８〜２４ヌクレオチドの配列又はその
相補的配列を有するＤＮＡ又はＲＮＡ核酸プロ−ブであ
ることを特徴とするカンピロバクタ− ジェジュニ（Ca
mpylobacter jejuni）及びコリ（coli）検出用プロ−ブ
に関する発明。 上記又はに記載されたカンピロバクタ− ジェ
ジュニ（Campylobacterjejuni）及びコリ（coli）検出
用プロ−ブを、最初二重鎖の場合に必要であれば変性し
た同定されるべき株に属する核酸とハイブリッド形成さ
せて選択的検出又は同定を行うことを特徴とするカンピ
ロバクタ− ジェジュニ（Campylobacterjejuni）及び
コリ（coli）検出方法に関する発明。
【０００８】本発明の理解のために以下に本発明をより
詳細に説明する。プロ−ブ 本発明におけるプロ−ブは、カンピロバクタ− ジェジ
ュニ又はコリＤＮＡ或いはリボゾ−ムから取得するか、
あるいはin vitroで合成することが出来る。検出アッセ
イに有効に使用するためには、プロ−ブの長さが１５塩
基以上のプロ−ブが好ましい。プロ−ブは一般的にそれ
らの検出を可能にする公知の方法により標識されている
ものが好ましく、好ましいＤＮＡプロ−ブは、例えば32
Ｐ等を用いて放射線標識がされたものとか、あるいは検
出可能な化合物又は複合体を形成する指示物質に選択的
に結合することのできる化合物を用いて非放射性標識を
施されたものである。前記複合体としては、アビジンと
ビオチン、抗原と抗体、及び酵素とそれに対応する基質
の様な化合物が挙げられる。別の非同位体標識として
は、蛍光化合物、電子密度の高い化合物、アクリジンエ
ステル類及び発光ランタニド類が挙げられる。
詳細に説明する。プロ−ブ 本発明におけるプロ−ブは、カンピロバクタ− ジェジ
ュニ又はコリＤＮＡ或いはリボゾ−ムから取得するか、
あるいはin vitroで合成することが出来る。検出アッセ
イに有効に使用するためには、プロ−ブの長さが１５塩
基以上のプロ−ブが好ましい。プロ−ブは一般的にそれ
らの検出を可能にする公知の方法により標識されている
ものが好ましく、好ましいＤＮＡプロ−ブは、例えば32
Ｐ等を用いて放射線標識がされたものとか、あるいは検
出可能な化合物又は複合体を形成する指示物質に選択的
に結合することのできる化合物を用いて非放射性標識を
施されたものである。前記複合体としては、アビジンと
ビオチン、抗原と抗体、及び酵素とそれに対応する基質
の様な化合物が挙げられる。別の非同位体標識として
は、蛍光化合物、電子密度の高い化合物、アクリジンエ
ステル類及び発光ランタニド類が挙げられる。
【０００９】本発明のプロ−ブは、カンピロバクタ−
ジェジュニ及びコリの細菌微生物の検出及び同定に用い
るための核酸プロ−ブであり、より正確には、本発明の
プロ−ブは、カンピロバクタ− ジェジュニ及びコリの
様々な細菌種を特異的に検出及び同定するために有用
な、各々好ましくは標識されたＤＮＡまたはＲＮＡの特
異配列からなるＤＮＡまたはＲＮＡ核酸プロ−ブ、即
ち、カンピロバクタ− ジェジュニ及びコリの特異的プ
ロ−ブである。本発明のカンピロバクタ− ジェジュニ
及びコリの特異的プロ−ブは、下記配列又はその相補的
配列（一方でＸ及びＡかつ他方でＣ及びＧを交換してな
る）を有することを特徴とするものである。 10 20 30 40 50 XAAACGAXGX ACACXAGXXG XXGGGGXGCX AGXCAXCXCA GXAAXGCAGC 60 70 XAACGCAXXA AGXGXACCGC CXG （ＤＮＡ配列の場合 Ｘ＝Ｔ：ＲＮＡ配列の場合 Ｘ＝
Ｕ） 並びに、上記に記載された配列から誘導される１５〜３
５、好ましくは１８〜２４ヌクレオチドの配列又はその
相補的配列（一方でＸ及びＡかつ他方でＣ及びＧを交換
してなる）を有することを特徴とするものである。上記
に記載された配列から誘導される１５〜３５、好ましく
は１８〜２４ヌクレオチドの標識オリゴマ−叉は相補的
オリゴマ−から構成されるプロ−ブは、本発明にとり好
ましいプロ−ブであり、具体的には、下記の配列が挙げ
られる。
ジェジュニ及びコリの細菌微生物の検出及び同定に用い
るための核酸プロ−ブであり、より正確には、本発明の
プロ−ブは、カンピロバクタ− ジェジュニ及びコリの
様々な細菌種を特異的に検出及び同定するために有用
な、各々好ましくは標識されたＤＮＡまたはＲＮＡの特
異配列からなるＤＮＡまたはＲＮＡ核酸プロ−ブ、即
ち、カンピロバクタ− ジェジュニ及びコリの特異的プ
ロ−ブである。本発明のカンピロバクタ− ジェジュニ
及びコリの特異的プロ−ブは、下記配列又はその相補的
配列（一方でＸ及びＡかつ他方でＣ及びＧを交換してな
る）を有することを特徴とするものである。 10 20 30 40 50 XAAACGAXGX ACACXAGXXG XXGGGGXGCX AGXCAXCXCA GXAAXGCAGC 60 70 XAACGCAXXA AGXGXACCGC CXG （ＤＮＡ配列の場合 Ｘ＝Ｔ：ＲＮＡ配列の場合 Ｘ＝
Ｕ） 並びに、上記に記載された配列から誘導される１５〜３
５、好ましくは１８〜２４ヌクレオチドの配列又はその
相補的配列（一方でＸ及びＡかつ他方でＣ及びＧを交換
してなる）を有することを特徴とするものである。上記
に記載された配列から誘導される１５〜３５、好ましく
は１８〜２４ヌクレオチドの標識オリゴマ−叉は相補的
オリゴマ−から構成されるプロ−ブは、本発明にとり好
ましいプロ−ブであり、具体的には、下記の配列が挙げ
られる。
【００１０】これらの核酸プロ−ブは周知の現状技術で
取得可能なものであって、様々なル−ト、特に遺伝子工
学又は直接的マニュアル、もしくは自動合成によって得
られる。
取得可能なものであって、様々なル−ト、特に遺伝子工
学又は直接的マニュアル、もしくは自動合成によって得
られる。
【００１１】プロ−ブの取得と合成 本発明者等は、まず、他の生物のｒＲＮＡとは相同性を
持たないカンピロバクタ− ジェジュニ及びコリのｒＲ
ＮＡと相補的なＤＮＡ配列を、逆転写酵素を使用して、
単離し同定した。逆転写酵素はＲＮＡを鋳型として使
い、それを転写して相補的なＤＮＡ鎖（ｃＤＮＡ）を作
る方法であり、この酵素を用いることにより、カンピロ
バクタ−ジェジュニ及びコリのｒＲＮＡからｃＤＮＡを
合成することが出来た。ハイブリッド形成により１６Ｓ
ｒＲＮＡをコ−ドするＤＮＡフラグメントを同定した
後、それらのＤＮＡのヌクレオチド配列を標準的方法
（例えばSanger etal, 74: 5453 (1977), Proc.Natl.Ac
ad.Sci）により決定した。このヌクレオチド配列を、次
に、公表されている他の種々のｒＲＮＡ配列と比較し、
相同性領域及び非相同性領域を決定した。公表されてい
る他の配列と相同性の無い領域をサブクロ−ン化又はオ
リゴヌクレオチド自動合成装置を用いてカンピロバクタ
− ジェジュニ及びコリのＤＮＡフラグメントを得た。
これらの特徴的なカンピロバクタ− ジェジュニ及びコ
リのＤＮＡフラグメントを32Ｐもしくは35Ｓを用いて標
識し、カンピロバクタ− ジェジュニ、コリ及び非カン
ピロバクタ− ジェジュニに対して試験するためのプロ
−ブとして使用することが出来る。又、必要なら、プロ
−ブ配列をベクタ−に組み込み、得られたベクタ−をプ
ロ−ブとして用いることも出来る。これに使用するベク
タ−は、試験される試料中に存在する可能性のある非カ
ンピロバクタ− ジェジュニのいずれにも相同性を有し
てはならない。
持たないカンピロバクタ− ジェジュニ及びコリのｒＲ
ＮＡと相補的なＤＮＡ配列を、逆転写酵素を使用して、
単離し同定した。逆転写酵素はＲＮＡを鋳型として使
い、それを転写して相補的なＤＮＡ鎖（ｃＤＮＡ）を作
る方法であり、この酵素を用いることにより、カンピロ
バクタ−ジェジュニ及びコリのｒＲＮＡからｃＤＮＡを
合成することが出来た。ハイブリッド形成により１６Ｓ
ｒＲＮＡをコ−ドするＤＮＡフラグメントを同定した
後、それらのＤＮＡのヌクレオチド配列を標準的方法
（例えばSanger etal, 74: 5453 (1977), Proc.Natl.Ac
ad.Sci）により決定した。このヌクレオチド配列を、次
に、公表されている他の種々のｒＲＮＡ配列と比較し、
相同性領域及び非相同性領域を決定した。公表されてい
る他の配列と相同性の無い領域をサブクロ−ン化又はオ
リゴヌクレオチド自動合成装置を用いてカンピロバクタ
− ジェジュニ及びコリのＤＮＡフラグメントを得た。
これらの特徴的なカンピロバクタ− ジェジュニ及びコ
リのＤＮＡフラグメントを32Ｐもしくは35Ｓを用いて標
識し、カンピロバクタ− ジェジュニ、コリ及び非カン
ピロバクタ− ジェジュニに対して試験するためのプロ
−ブとして使用することが出来る。又、必要なら、プロ
−ブ配列をベクタ−に組み込み、得られたベクタ−をプ
ロ−ブとして用いることも出来る。これに使用するベク
タ−は、試験される試料中に存在する可能性のある非カ
ンピロバクタ− ジェジュニのいずれにも相同性を有し
てはならない。
【００１２】カンピロバクタ− ジェジュニ及びコリに
特異的なプロ−ブの配列について以下に説明する。（配
列表）における配列番号１は、カンピロバクタ− ジェ
ジュニ及びコリの１６ＳｒＲＮＡの１部分のヌクレオチ
ド配列を示している。この配列はコンピュ−タ−プログ
ラム・ジェネティックス(GENETYX) を用いて、２種類の
デ−タバンク GenBank (the U.S. Department of Healt
h and HumanServices) とEMBL (European Molecular Bi
ology Laboratory)に記載されている核酸配列と比較し
た際、非カンピロバクタ− ジェジュニ及びコリと塩基
数個の領域で確実に異なることが確認された部分であ
る。
特異的なプロ−ブの配列について以下に説明する。（配
列表）における配列番号１は、カンピロバクタ− ジェ
ジュニ及びコリの１６ＳｒＲＮＡの１部分のヌクレオチ
ド配列を示している。この配列はコンピュ−タ−プログ
ラム・ジェネティックス(GENETYX) を用いて、２種類の
デ−タバンク GenBank (the U.S. Department of Healt
h and HumanServices) とEMBL (European Molecular Bi
ology Laboratory)に記載されている核酸配列と比較し
た際、非カンピロバクタ− ジェジュニ及びコリと塩基
数個の領域で確実に異なることが確認された部分であ
る。
【００１３】本発明のプローブは、上記配列を有するも
のであるが、それらだけに限定されるものではなく、配
列番号１に示した配列に加え、それらの配列から誘導さ
れる１５〜３５、好ましくは１８〜２４ヌクレオチドの
オリゴマ−または相補的オリゴマ−により構成される配
列を持つプロ−ブをも含むものである。これらのプロ−
ブは、２種類以上のプロ−ブを組み合わせて使用するこ
ともできる。
のであるが、それらだけに限定されるものではなく、配
列番号１に示した配列に加え、それらの配列から誘導さ
れる１５〜３５、好ましくは１８〜２４ヌクレオチドの
オリゴマ−または相補的オリゴマ−により構成される配
列を持つプロ−ブをも含むものである。これらのプロ−
ブは、２種類以上のプロ−ブを組み合わせて使用するこ
ともできる。
【００１４】オリゴヌクレオチド自動合成装置を用いて
ポリヌクレオチドプロ−ブを合成する方法を以下に説明
する。下記の規定配列を持つ３４ヌクレオチド鎖長のポ
リヌクレオチドプロ−ブをチオホスファイト法（特開昭
６１−１８０００２）によって合成した。合成が完了し
たら、ポリヌクレオチドを担体から分離し、既知のクロ
マトグラフィ−法によるＣ18カラムを用いたＨＰＬＣに
よって目的物を分取し、約９９％の純度を持つポリヌク
レオチドを得ることが出来た。作成したポリヌクレオチ
ドを、電気泳動で３５塩基の標準ポリヌクレオチドと比
較し生成を確認した。 5'- ACATGTGATC AACAACCCCA CGATCAGTAG AGTCA - 3' 上記の方法によって作成したポリヌクレオチドの塩基配
列が正しいことを、既知のジデオキシ法によって確認し
た後、このポリヌクレオチドがカンピロバクタ− ジェ
ジュニ及びコリの１６ＳｒＲＮＡに結合するかどうかを
調べた。まず、カンピロバクタ− ジェジュニから１６
ＳｒＲＮＡを、フェノ−ル・クロロホルム抽出や、エタ
ノ−ル沈澱などの操作を行なうことによって抽出した。
これと、作成したプロ−ブを混合し、α−35Ｓ−ｄＡＴ
Ｐ存在下で逆転写酵素を作用させ、このプロ−ブがプラ
イマ−となってｃＤＮＡ伸長反応が進行していたこと
を、電気泳動法及びオ−トラジオグラフィ−などの方法
を用いて確認した。この結果により、作成したポリヌク
レオチドプロ−ブは、標的としている１６ＳｒＲＮＡを
確認し、結合できることを確認した。
ポリヌクレオチドプロ−ブを合成する方法を以下に説明
する。下記の規定配列を持つ３４ヌクレオチド鎖長のポ
リヌクレオチドプロ−ブをチオホスファイト法（特開昭
６１−１８０００２）によって合成した。合成が完了し
たら、ポリヌクレオチドを担体から分離し、既知のクロ
マトグラフィ−法によるＣ18カラムを用いたＨＰＬＣに
よって目的物を分取し、約９９％の純度を持つポリヌク
レオチドを得ることが出来た。作成したポリヌクレオチ
ドを、電気泳動で３５塩基の標準ポリヌクレオチドと比
較し生成を確認した。 5'- ACATGTGATC AACAACCCCA CGATCAGTAG AGTCA - 3' 上記の方法によって作成したポリヌクレオチドの塩基配
列が正しいことを、既知のジデオキシ法によって確認し
た後、このポリヌクレオチドがカンピロバクタ− ジェ
ジュニ及びコリの１６ＳｒＲＮＡに結合するかどうかを
調べた。まず、カンピロバクタ− ジェジュニから１６
ＳｒＲＮＡを、フェノ−ル・クロロホルム抽出や、エタ
ノ−ル沈澱などの操作を行なうことによって抽出した。
これと、作成したプロ−ブを混合し、α−35Ｓ−ｄＡＴ
Ｐ存在下で逆転写酵素を作用させ、このプロ−ブがプラ
イマ−となってｃＤＮＡ伸長反応が進行していたこと
を、電気泳動法及びオ−トラジオグラフィ−などの方法
を用いて確認した。この結果により、作成したポリヌク
レオチドプロ−ブは、標的としている１６ＳｒＲＮＡを
確認し、結合できることを確認した。
【００１５】これらの核酸配列は、最初二重鎖である場
合に必要であれば、変性された相補的ＤＮＡまたはＲＮ
Ａ配列とハイブリッドを形成する性質を有している。核
酸の変性は、塩基性培地中でのインキュベ−ト、培地温
度の上昇、これら２プロセスの組合せまたは再度マイク
ロ波の作用によって行なうことが出来る。ハイブリッド
の形成は、様々な方法によって行なうことが出来る。
合に必要であれば、変性された相補的ＤＮＡまたはＲＮ
Ａ配列とハイブリッドを形成する性質を有している。核
酸の変性は、塩基性培地中でのインキュベ−ト、培地温
度の上昇、これら２プロセスの組合せまたは再度マイク
ロ波の作用によって行なうことが出来る。ハイブリッド
の形成は、様々な方法によって行なうことが出来る。
【００１６】本発明のプロ−ブは、核酸プロ−ブの標識
に関して当業者に公知の方法の一つによって標識され
る。例えば32Ｐ等の放射性同位元素で標識されるか、ま
たは酵素などの非放射性同位元素で標識されるが、これ
も公知である。あるケ−スでは、プロ−ブは酵素で標識
されないが、但し例えばハイブリッド形成後に存在可能
なビオチンで化学的に修飾される。
に関して当業者に公知の方法の一つによって標識され
る。例えば32Ｐ等の放射性同位元素で標識されるか、ま
たは酵素などの非放射性同位元素で標識されるが、これ
も公知である。あるケ−スでは、プロ−ブは酵素で標識
されないが、但し例えばハイブリッド形成後に存在可能
なビオチンで化学的に修飾される。
【００１７】
【作用】本発明のプロ−ブは、該プロ−ブが試料中に存
在するあらゆるカンピロバクタ− ジェジュニ及びコリ
のｒＲＮＡとハイブリッド形成可能となる条件下で、該
プロ−ブを試料中の細菌と接触させることにより、核酸
ハイブリッド複合体を形成し、該複合体を検出すること
により、試料中のカンピロバクタ− ジェジュニ及びコ
リの存在を検出することができ、試料中のカンピロバク
タ− ジェジュニ及びコリの存在を証拠だてることがで
きる。特に、ほとんどの遺伝子は、ｒＲＮＡ〔タンパク
質とＲＮＡの複合混合物からなり、すべての生物におい
て遺伝情報の翻訳に関与するものであり、細菌には３種
の異なったリボゾ−ムＲＮＡ分子が存在する（５Ｓ，１
６Ｓ，２３Ｓ）〕の多重コピ−を有し（Noller(1984) A
nn.Rev.Biochem. 53: 119）、各種細菌細胞は約1.２×
１０4 個のリボゾ−ムを含むため、いずれの細胞も少な
くとも1.２×１０4 分子の各ｒＲＮＡを含むのに対し、
細菌中の他の遺伝子は１細胞あたり１〜２コピ−存在す
るだけであり、しかも、そのｍＲＮＡ産物は安定ではな
く、常に転写されているわけではないため、ハイブリッ
ド形成によるｒＲＮＡの検出は、他の遺伝子のＤＮＡに
対するハイブリッド形成に対して約１０4 倍感度がよい
ことになる。
在するあらゆるカンピロバクタ− ジェジュニ及びコリ
のｒＲＮＡとハイブリッド形成可能となる条件下で、該
プロ−ブを試料中の細菌と接触させることにより、核酸
ハイブリッド複合体を形成し、該複合体を検出すること
により、試料中のカンピロバクタ− ジェジュニ及びコ
リの存在を検出することができ、試料中のカンピロバク
タ− ジェジュニ及びコリの存在を証拠だてることがで
きる。特に、ほとんどの遺伝子は、ｒＲＮＡ〔タンパク
質とＲＮＡの複合混合物からなり、すべての生物におい
て遺伝情報の翻訳に関与するものであり、細菌には３種
の異なったリボゾ−ムＲＮＡ分子が存在する（５Ｓ，１
６Ｓ，２３Ｓ）〕の多重コピ−を有し（Noller(1984) A
nn.Rev.Biochem. 53: 119）、各種細菌細胞は約1.２×
１０4 個のリボゾ−ムを含むため、いずれの細胞も少な
くとも1.２×１０4 分子の各ｒＲＮＡを含むのに対し、
細菌中の他の遺伝子は１細胞あたり１〜２コピ−存在す
るだけであり、しかも、そのｍＲＮＡ産物は安定ではな
く、常に転写されているわけではないため、ハイブリッ
ド形成によるｒＲＮＡの検出は、他の遺伝子のＤＮＡに
対するハイブリッド形成に対して約１０4 倍感度がよい
ことになる。
【００１８】
【実施例】配列番号１に示した配列と相同性を持つ以下
の配列を有する３種のプローブ（CCJ31,CCJ32,CCJ33 ）
を上記チオホスファイト方法で合成し、ハイブリッド形
成アッセイによりカンピロバクタ− ジェジュニ、コリ
及び非カンピロバクタ−ジェジュニ及びコリについて同
定試験をおこなった。 試験の結果を表１に示した。表１で明らかな様に、これ
らのプロ−ブは、カンピロバクタ− ジェジュニ及びコ
リに特異的であることが示され、非カンピロバクタ−
ジェジュニ及びコリ由来のＤＮＡあるいはＲＮＡとはほ
とんどハイブリッド形成を行なわなかった。なお、表１
に示した非カンピロバクタ− ジェジュニ及びコリの菌
は、カンピロバクタ− ジェジュニ及びコリの検査にお
いて、検査対象となり得る菌種のうちの一部である。
の配列を有する３種のプローブ（CCJ31,CCJ32,CCJ33 ）
を上記チオホスファイト方法で合成し、ハイブリッド形
成アッセイによりカンピロバクタ− ジェジュニ、コリ
及び非カンピロバクタ−ジェジュニ及びコリについて同
定試験をおこなった。 試験の結果を表１に示した。表１で明らかな様に、これ
らのプロ−ブは、カンピロバクタ− ジェジュニ及びコ
リに特異的であることが示され、非カンピロバクタ−
ジェジュニ及びコリ由来のＤＮＡあるいはＲＮＡとはほ
とんどハイブリッド形成を行なわなかった。なお、表１
に示した非カンピロバクタ− ジェジュニ及びコリの菌
は、カンピロバクタ− ジェジュニ及びコリの検査にお
いて、検査対象となり得る菌種のうちの一部である。
【００１９】
【表１】
【００２０】
【効果】本発明のプロ−ブを用いたカンピロバクタ−
ジェジュニ及びコリの検出は、迅速かつ正確な結果を与
え、臨床や食品の検査室で、短時間のうちに標本中のカ
ンピロバクタ− ジェジュニ及びコリの有無を調べるこ
とが出来る。又、本発明の検出方法は、他の様々な変動
の多い生物学的性質ではなく細菌の核酸含量に依存する
ため、カンピロバクタ− ジェジュニ及びコリの生物学
的に典型的な種のみならず、非典型的な種も検出可能で
あり、更に、本検出方法は検出に必ずしも生存している
細胞を必要としないため、検査室への標本の輸送のため
の輸送培地の必要性が除かれるという優れた効果を奏す
るものである。
ジェジュニ及びコリの検出は、迅速かつ正確な結果を与
え、臨床や食品の検査室で、短時間のうちに標本中のカ
ンピロバクタ− ジェジュニ及びコリの有無を調べるこ
とが出来る。又、本発明の検出方法は、他の様々な変動
の多い生物学的性質ではなく細菌の核酸含量に依存する
ため、カンピロバクタ− ジェジュニ及びコリの生物学
的に典型的な種のみならず、非典型的な種も検出可能で
あり、更に、本検出方法は検出に必ずしも生存している
細胞を必要としないため、検査室への標本の輸送のため
の輸送培地の必要性が除かれるという優れた効果を奏す
るものである。
【００２１】
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：７３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：１６ＳｒＲＮＡ 配列 XAAACGAXGX ACACXAGXXG XXGGGGXGCX AGXCAXCXCA GXAAXGCAGC XAACGCAXXA 60 AGXGXACCGC CXG 73
Claims (3)
- 【請求項１】 下記配列又はその相補的配列を有する
ＤＮＡ又はＲＮＡ核酸プロ−ブであることを特徴とする
カンピロバクタ− ジェジュニ（Campylobacterjejun
i）及びコリ（coli）検出用プロ−ブ。 10 20 30 40 50 XAAACGAXGX ACACXAGXXG XXGGGGXGCX AGXCAXCXCA GXAAXGCAGC 60 70 XAACGCAXXA AGXGXACCGC CXG （ＤＮＡ配列の場合 Ｘ＝Ｔ：ＲＮＡ配列の場合 Ｘ＝
Ｕ） - 【請求項２】 請求項１に記載された配列から誘導さ
れる１５〜３５、好ましくは１８〜２４ヌクレオチドの
配列又はその相補的配列を有するＤＮＡ又はＲＮＡ核酸
プロ−ブであることを特徴とするカンピロバクタ− ジ
ェジュニ（Campylobacter jejuni）及びコリ（coli）検
出用プロ−ブ。 - 【請求項３】 請求項１又は２に記載されたカンピロ
バクタ− ジェジュニ（Campylobacter jejuni）及びコ
リ（coli）検出用プロ−ブを、最初二重鎖の場合に必要
であれば変性した同定されるべき株に属する核酸とハイ
ブリッド形成させて選択的検出又は同定を行うことを特
徴とするカンピロバクタ− ジェジュニ（Campylobacte
r jejuni）及びコリ（coli）検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3718992A JPH0690796A (ja) | 1992-01-28 | 1992-01-28 | カンピロバクター ジェジュニ及びコリ検出用プローブ及び検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3718992A JPH0690796A (ja) | 1992-01-28 | 1992-01-28 | カンピロバクター ジェジュニ及びコリ検出用プローブ及び検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0690796A true JPH0690796A (ja) | 1994-04-05 |
Family
ID=12490635
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3718992A Pending JPH0690796A (ja) | 1992-01-28 | 1992-01-28 | カンピロバクター ジェジュニ及びコリ検出用プローブ及び検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0690796A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7563594B2 (en) | 2003-12-05 | 2009-07-21 | Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd. | Cytolethal distending toxins and detection of Campylobacter bacteria using the same as a target |
| US8586327B2 (en) | 2007-08-31 | 2013-11-19 | Osaka Prefecture University | Detection of bacteria belonging to the genus Campylobacter by targeting cytolethal distending toxin |
| US8637249B2 (en) | 2008-11-14 | 2014-01-28 | Gen-Probe Incorporated | Compositions, kits and methods for detection of Campylobacter nucleic acid |
| US9200330B2 (en) | 2007-08-24 | 2015-12-01 | Osaka Prefecture University | Detection of bacteria belonging to the genus Campylobacter by targeting cytolethal distending toxin |
-
1992
- 1992-01-28 JP JP3718992A patent/JPH0690796A/ja active Pending
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7563594B2 (en) | 2003-12-05 | 2009-07-21 | Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd. | Cytolethal distending toxins and detection of Campylobacter bacteria using the same as a target |
| US8168408B2 (en) | 2003-12-05 | 2012-05-01 | Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd. | Cytolethal distending toxins and detection of Campylobacter bacteria using the same as a target |
| US8343723B2 (en) | 2003-12-05 | 2013-01-01 | Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd. | Cytolethal distending toxins and detection of Campylobacter bacteria using the same as a target |
| US8354500B2 (en) | 2003-12-05 | 2013-01-15 | Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd. | Cytolethal distending toxins and detection of campylobacter bacteria using the same as a target |
| US9200330B2 (en) | 2007-08-24 | 2015-12-01 | Osaka Prefecture University | Detection of bacteria belonging to the genus Campylobacter by targeting cytolethal distending toxin |
| US8586327B2 (en) | 2007-08-31 | 2013-11-19 | Osaka Prefecture University | Detection of bacteria belonging to the genus Campylobacter by targeting cytolethal distending toxin |
| US9663828B2 (en) | 2007-08-31 | 2017-05-30 | Osaka Prefecture University Public Corporation | Detection of bacteria belonging to the genus Campylobacter by targeting cytolethal distending toxin |
| US8637249B2 (en) | 2008-11-14 | 2014-01-28 | Gen-Probe Incorporated | Compositions, kits and methods for detection of Campylobacter nucleic acid |
| US9175353B2 (en) | 2008-11-14 | 2015-11-03 | Gen-Probe Incorporated | Compositions, kits and methods for detection of campylobacter nucleic acid |
| US10829824B2 (en) | 2008-11-14 | 2020-11-10 | Gen-Probe Incorporated | Compositions, kits and methods for detection of campylobacter nucleic acid |
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