JPH0690797A - サルモネラ検出用プローブ及び検出方法 - Google Patents
サルモネラ検出用プローブ及び検出方法Info
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- JPH0690797A JPH0690797A JP5423192A JP5423192A JPH0690797A JP H0690797 A JPH0690797 A JP H0690797A JP 5423192 A JP5423192 A JP 5423192A JP 5423192 A JP5423192 A JP 5423192A JP H0690797 A JPH0690797 A JP H0690797A
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- salmonella
- probe
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- nucleic acid
- dna
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Abstract
(57)【要約】
【目的】臨床検査、事に食中毒にかかる検査、あるいは
食品検査における、サルモネラ（Salmonella）の検出を
迅速かつ正確に行うことを目的とするものである。 【構成】特定配列を有するＤＮＡ又はＲＮＡ核酸プロ−
ブからなるサルモネラ（Salmonella）検出用プロ−ブ及
び該プロ−ブを用いるサルモネラ（Salmonella）検出方
法。 【効果】サルモネラ（Salmonella）の検出が迅速かつ正
確に行えるほか、標本の輸送のための輸送培地の必要性
もない。
食品検査における、サルモネラ（Salmonella）の検出を
迅速かつ正確に行うことを目的とするものである。 【構成】特定配列を有するＤＮＡ又はＲＮＡ核酸プロ−
ブからなるサルモネラ（Salmonella）検出用プロ−ブ及
び該プロ−ブを用いるサルモネラ（Salmonella）検出方
法。 【効果】サルモネラ（Salmonella）の検出が迅速かつ正
確に行えるほか、標本の輸送のための輸送培地の必要性
もない。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、臨床検査、特に食中毒
にかかる検査、あるいは食品検査における、サルモネラ
（Salmonella）の検出に関するものである。
にかかる検査、あるいは食品検査における、サルモネラ
（Salmonella）の検出に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】サルモネラ菌の検出は、多方面の医学及
び公衆衛生に関連して重要であり、ヒト疾病の観点から
は、サルモネラ種は最も重要な細菌のひとつである。サ
ルモネラ菌は軽い胃腸炎からより重度の範囲の種々の感
染症を起こすものであり、その検出は臨床検査、特に食
中毒にかかる検査、あるいは食品検査において重要な手
段である。
び公衆衛生に関連して重要であり、ヒト疾病の観点から
は、サルモネラ種は最も重要な細菌のひとつである。サ
ルモネラ菌は軽い胃腸炎からより重度の範囲の種々の感
染症を起こすものであり、その検出は臨床検査、特に食
中毒にかかる検査、あるいは食品検査において重要な手
段である。
【０００３】臨床標本中のサルモネラの存在は、以下の
方法で検出されている。即ち、適切に調製された材料を
微生物学的培地上でこれらの微生物の増殖に良好な条件
下培養する事により検出されるのであるが、得られたコ
ロニ−についての形態学的及び生化学的特性の試験は、
一般的には試料を得てから４８時間後に開始され、完了
するのに数日以上かかるものである。即ち、従来法では
検出するまでに何日も掛かるという問題点を有するもの
である。
方法で検出されている。即ち、適切に調製された材料を
微生物学的培地上でこれらの微生物の増殖に良好な条件
下培養する事により検出されるのであるが、得られたコ
ロニ−についての形態学的及び生化学的特性の試験は、
一般的には試料を得てから４８時間後に開始され、完了
するのに数日以上かかるものである。即ち、従来法では
検出するまでに何日も掛かるという問題点を有するもの
である。
【０００４】上記の問題点を解決するために、オリゴヌ
クレオチドを用いたＤＮＡプロ−ブ法あるいはハイブリ
ダイゼ−ション法が試みられるようになってきた。例え
ば、Kohne[Biochemical Journal ８：1104-1118(1968)]
らは、ｒＲＮＡ配列のプロ−ブを調製する１つの方法に
ついて議論しており、PaceおよびCampbell[Journal of
Bacteriology 107 : 543-547(1971)] は、異なった細菌
種からのｒＲＮＡの相同性及びこれらの相同性の程度を
定量化するためのハイブリダイゼ−ション法について議
論している。更に、Sogin[Journal of Molecular Evolu
tion 1 : 173-184(1972)]らは、系統発生論関係の評価
のために異なったリボゾ−ムＲＮＡ分子の一次構造特性
を用いる論理的および実際的観点について議論してお
り、Fox[International Journal of Systematic Bacter
iology 27 : 44-57(1977)] らは、原核生物分類への比
較カタログ法について議論している。又、Kohne らは、
Gen-Probe 社の出願特許(1983)中で、リボゾ−ムＲＮＡ
分子に対するプロ−ブとして使用するための核酸断片を
得るための戦略について述べている。
クレオチドを用いたＤＮＡプロ−ブ法あるいはハイブリ
ダイゼ−ション法が試みられるようになってきた。例え
ば、Kohne[Biochemical Journal ８：1104-1118(1968)]
らは、ｒＲＮＡ配列のプロ−ブを調製する１つの方法に
ついて議論しており、PaceおよびCampbell[Journal of
Bacteriology 107 : 543-547(1971)] は、異なった細菌
種からのｒＲＮＡの相同性及びこれらの相同性の程度を
定量化するためのハイブリダイゼ−ション法について議
論している。更に、Sogin[Journal of Molecular Evolu
tion 1 : 173-184(1972)]らは、系統発生論関係の評価
のために異なったリボゾ−ムＲＮＡ分子の一次構造特性
を用いる論理的および実際的観点について議論してお
り、Fox[International Journal of Systematic Bacter
iology 27 : 44-57(1977)] らは、原核生物分類への比
較カタログ法について議論している。又、Kohne らは、
Gen-Probe 社の出願特許(1983)中で、リボゾ−ムＲＮＡ
分子に対するプロ−ブとして使用するための核酸断片を
得るための戦略について述べている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、オリゴヌク
レオチドを用いたＤＮＡプロ−ブ法あるいはハイブリダ
イゼ−ション法に使用され得るＤＮＡ又はＲＮＡ、特に
サルモネラ由来の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出するため
に用いられる、最初２重鎖である場合に必要であれば、
予め変性された同定されるべき株に属する相補的ＤＮＡ
またはＲＮＡ配列とハイブリッド形成するサルモネラ検
出用オリゴヌクレオチドプロ−ブ及び食中毒菌検査、細
菌感染や汚染を検査する際のサルモネラの簡便且つ高感
度な検査法を提供しようとするものである。
レオチドを用いたＤＮＡプロ−ブ法あるいはハイブリダ
イゼ−ション法に使用され得るＤＮＡ又はＲＮＡ、特に
サルモネラ由来の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出するため
に用いられる、最初２重鎖である場合に必要であれば、
予め変性された同定されるべき株に属する相補的ＤＮＡ
またはＲＮＡ配列とハイブリッド形成するサルモネラ検
出用オリゴヌクレオチドプロ−ブ及び食中毒菌検査、細
菌感染や汚染を検査する際のサルモネラの簡便且つ高感
度な検査法を提供しようとするものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、オリゴヌ
クレオチドを用いたＤＮＡプロ−ブ法あるいはハイブリ
ダイゼ−ション法に使用され得るＤＮＡ又はＲＮＡにつ
いて広く探索し、サルモネラの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子と
選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの作成
に成功し本発明を完成させたのである。
クレオチドを用いたＤＮＡプロ−ブ法あるいはハイブリ
ダイゼ−ション法に使用され得るＤＮＡ又はＲＮＡにつ
いて広く探索し、サルモネラの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子と
選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの作成
に成功し本発明を完成させたのである。
【０００７】即ち、本発明は以下の３発明からなるもの
である。 １．下記乃至の配列又はその相補的配列を有するＤ
ＮＡ又はＲＮＡ核酸プロ−ブであることを特徴とするサ
ルモネラ（Salmonella）検出用プロ−ブに関する発明。 10 20 XXCGAAACXG GCAAGGCXXG AGXCXXGX 10 20 30 40 XCCGGAGCXA ACGCGXXAAG XAGAGGCCGC CXGGGGAGXA CGGCCGCAA 10 20 30 XCCACAGAGA XCCAGAGAXG GAXXXXCXXC GGAAC （いずれの配列もＤＮＡ配列の場合 Ｘ＝Ｔ：ＲＮＡ配
列の場合 Ｘ＝Ｕ） ２．上記発明１に記載された配列から誘導される１５〜
３５、好ましくは１８〜２４ヌクレオチドの配列又はそ
の相補的配列を有するＤＮＡ又はＲＮＡ核酸プロ−ブで
あることを特徴とするサルモネラ（Salmonella）検出用
プロ−ブに関する発明。 ３．上記発明１又は２に記載されたサルモネラ（Salmon
ella）検出用プロ−ブを、最初二重鎖の場合に必要であ
れば変性した同定されるべき株に属する核酸とハイブリ
ッド形成させて選択的検出又は同定を行うことを特徴と
するサルモネラ（Salmonella）検出方法に関する発明。
である。 １．下記乃至の配列又はその相補的配列を有するＤ
ＮＡ又はＲＮＡ核酸プロ−ブであることを特徴とするサ
ルモネラ（Salmonella）検出用プロ−ブに関する発明。 10 20 XXCGAAACXG GCAAGGCXXG AGXCXXGX 10 20 30 40 XCCGGAGCXA ACGCGXXAAG XAGAGGCCGC CXGGGGAGXA CGGCCGCAA 10 20 30 XCCACAGAGA XCCAGAGAXG GAXXXXCXXC GGAAC （いずれの配列もＤＮＡ配列の場合 Ｘ＝Ｔ：ＲＮＡ配
列の場合 Ｘ＝Ｕ） ２．上記発明１に記載された配列から誘導される１５〜
３５、好ましくは１８〜２４ヌクレオチドの配列又はそ
の相補的配列を有するＤＮＡ又はＲＮＡ核酸プロ−ブで
あることを特徴とするサルモネラ（Salmonella）検出用
プロ−ブに関する発明。 ３．上記発明１又は２に記載されたサルモネラ（Salmon
ella）検出用プロ−ブを、最初二重鎖の場合に必要であ
れば変性した同定されるべき株に属する核酸とハイブリ
ッド形成させて選択的検出又は同定を行うことを特徴と
するサルモネラ（Salmonella）検出方法に関する発明。
【０００８】本発明の理解のために以下に本発明をより
詳細に説明する。プロ−ブ 本発明におけるプロ−ブは、サルモネラＤＮＡ或いはリ
ボゾ−ムから取得するか、あるいはin vitroで合成する
ことが出来る。検出アッセイに有効に使用するために
は、プロ−ブの長さが１５塩基以上のプロ−ブが好まし
い。プロ−ブは一般的にそれらの検出を可能にする公知
の方法により標識されているものが好ましく、好ましい
ＤＮＡプロ−ブは、例えば32Ｐ等を用いて放射線標識が
されたものとか、あるいは検出可能な化合物又は複合体
を形成する指示物質に選択的に結合することのできる化
合物を用いて非放射性標識を施されたものである。前記
複合体としては、アビジンとビオチン、抗原と抗体、及
び酵素とそれに対応する基質の様な化合物が挙げられ
る。別の非同位体標識としては、蛍光化合物、電子密度
の高い化合物、アクリジンエステル類及び発光ランタニ
ド類が挙げられる。
詳細に説明する。プロ−ブ 本発明におけるプロ−ブは、サルモネラＤＮＡ或いはリ
ボゾ−ムから取得するか、あるいはin vitroで合成する
ことが出来る。検出アッセイに有効に使用するために
は、プロ−ブの長さが１５塩基以上のプロ−ブが好まし
い。プロ−ブは一般的にそれらの検出を可能にする公知
の方法により標識されているものが好ましく、好ましい
ＤＮＡプロ−ブは、例えば32Ｐ等を用いて放射線標識が
されたものとか、あるいは検出可能な化合物又は複合体
を形成する指示物質に選択的に結合することのできる化
合物を用いて非放射性標識を施されたものである。前記
複合体としては、アビジンとビオチン、抗原と抗体、及
び酵素とそれに対応する基質の様な化合物が挙げられ
る。別の非同位体標識としては、蛍光化合物、電子密度
の高い化合物、アクリジンエステル類及び発光ランタニ
ド類が挙げられる。
【０００９】本発明のプロ−ブは、サルモネラの細菌微
生物の検出及び同定に用いるための核酸プロ−ブであ
り、より正確には、本発明のプロ−ブは、サルモネラの
様々な細菌種を特異的に検出及び同定するために有用
な、各々好ましくは標識されたＤＮＡまたはＲＮＡの特
異配列からなるＤＮＡまたはＲＮＡ核酸プロ−ブ、即
ち、サルモネラの特異的プロ−ブである。本発明のサル
モネラの特異的プロ−ブは、下記乃至の配列又はそ
の相補的配列、即ち、下記乃至の配列において、Ｘ
とＡをＣとＧを交換してなる配列を有することを特徴と
するものである。 10 20 XXCGAAACXG GCAAGGCXXG AGXCXXGX 10 20 30 40 XCCGGAGCXA ACGCGXXAAG XAGAGGCCGC CXGGGGAGXA CGGCCGCAA 10 20 30 XCCACAGAGA XCCAGAGAXG GAXXXXCXXC GGAAC （いずれの配列もＤＮＡ配列の場合 Ｘ＝Ｔ：ＲＮＡ配
列の場合 Ｘ＝Ｕ） 更に、本発明のサルモネラの特異的プロ−ブとして、上
記に記載された配列から誘導される１５〜３５、好まし
くは１８〜２４ヌクレオチドの配列又はその相補的配列
を有するものを挙げることができる。上記に記載された
配列から誘導される１５〜３５、好ましくは１８〜２４
ヌクレオチドの標識オリゴマ−叉は相補的オリゴマ−か
ら構成されるプロ−ブは、本発明にとり好ましいプロ−
ブであり、具体的には、下記の配列が挙げられる。
生物の検出及び同定に用いるための核酸プロ−ブであ
り、より正確には、本発明のプロ−ブは、サルモネラの
様々な細菌種を特異的に検出及び同定するために有用
な、各々好ましくは標識されたＤＮＡまたはＲＮＡの特
異配列からなるＤＮＡまたはＲＮＡ核酸プロ−ブ、即
ち、サルモネラの特異的プロ−ブである。本発明のサル
モネラの特異的プロ−ブは、下記乃至の配列又はそ
の相補的配列、即ち、下記乃至の配列において、Ｘ
とＡをＣとＧを交換してなる配列を有することを特徴と
するものである。 10 20 XXCGAAACXG GCAAGGCXXG AGXCXXGX 10 20 30 40 XCCGGAGCXA ACGCGXXAAG XAGAGGCCGC CXGGGGAGXA CGGCCGCAA 10 20 30 XCCACAGAGA XCCAGAGAXG GAXXXXCXXC GGAAC （いずれの配列もＤＮＡ配列の場合 Ｘ＝Ｔ：ＲＮＡ配
列の場合 Ｘ＝Ｕ） 更に、本発明のサルモネラの特異的プロ−ブとして、上
記に記載された配列から誘導される１５〜３５、好まし
くは１８〜２４ヌクレオチドの配列又はその相補的配列
を有するものを挙げることができる。上記に記載された
配列から誘導される１５〜３５、好ましくは１８〜２４
ヌクレオチドの標識オリゴマ−叉は相補的オリゴマ−か
ら構成されるプロ−ブは、本発明にとり好ましいプロ−
ブであり、具体的には、下記の配列が挙げられる。
【００１０】これらの核酸プロ−ブは周知の現状技術で
取得可能なものであって、様々なル−ト、特に遺伝子工
学又は直接的マニュアル、もしくは自動合成によって得
られる。
取得可能なものであって、様々なル−ト、特に遺伝子工
学又は直接的マニュアル、もしくは自動合成によって得
られる。
【００１１】プロ−ブの取得と合成 本発明者等は、まず、他の生物のｒＲＮＡとは相同性を
持たないサルモネラのｒＲＮＡと相補的なＤＮＡ配列
を、逆転写酵素を使用して、単離し同定した。逆転写酵
素はＲＮＡを鋳型として使い、それを転写して相補的な
ＤＮＡ鎖（ｃＤＮＡ）を作る方法であり、この酵素を用
いることにより、サルモネラのｒＲＮＡからｃＤＮＡを
合成することが出来た。ハイブリッド形成により１６Ｓ
ｒＲＮＡをコ−ドするＤＮＡフラグメントを同定した
後、それらのＤＮＡのヌクレオチド配列を標準的方法
（例えばSanger etal, 74: 5453 (1977), Proc.Natl.Ac
ad.Sci ）により決定した。このヌクレオチド配列を、
次に、公表されている他の種々のｒＲＮＡ配列と比較
し、相同性領域及び非相同性領域を決定した。公表され
ている他の配列と相同性の無い領域をサブクロ−ン化又
はオリゴヌクレオチド自動合成装置を用いてサルモネラ
のＤＮＡフラグメントを得た。これらの特徴的なサルモ
ネラＤＮＡフラグメントを32Ｐもしくは35Ｓを用いて標
識し、サルモネラ及び非サルモネラの双方に対して試験
するためのプロ−ブとして使用することが出来る。又、
必要なら、プロ−ブ配列をベクタ−に組み込み、得られ
たベクタ−をプロ−ブとして用いることも出来る。これ
に使用するベクタ−は、試験される試料中に存在する可
能性のある非サルモネラのいずれにも相同性を有しては
ならない。
持たないサルモネラのｒＲＮＡと相補的なＤＮＡ配列
を、逆転写酵素を使用して、単離し同定した。逆転写酵
素はＲＮＡを鋳型として使い、それを転写して相補的な
ＤＮＡ鎖（ｃＤＮＡ）を作る方法であり、この酵素を用
いることにより、サルモネラのｒＲＮＡからｃＤＮＡを
合成することが出来た。ハイブリッド形成により１６Ｓ
ｒＲＮＡをコ−ドするＤＮＡフラグメントを同定した
後、それらのＤＮＡのヌクレオチド配列を標準的方法
（例えばSanger etal, 74: 5453 (1977), Proc.Natl.Ac
ad.Sci ）により決定した。このヌクレオチド配列を、
次に、公表されている他の種々のｒＲＮＡ配列と比較
し、相同性領域及び非相同性領域を決定した。公表され
ている他の配列と相同性の無い領域をサブクロ−ン化又
はオリゴヌクレオチド自動合成装置を用いてサルモネラ
のＤＮＡフラグメントを得た。これらの特徴的なサルモ
ネラＤＮＡフラグメントを32Ｐもしくは35Ｓを用いて標
識し、サルモネラ及び非サルモネラの双方に対して試験
するためのプロ−ブとして使用することが出来る。又、
必要なら、プロ−ブ配列をベクタ−に組み込み、得られ
たベクタ−をプロ−ブとして用いることも出来る。これ
に使用するベクタ−は、試験される試料中に存在する可
能性のある非サルモネラのいずれにも相同性を有しては
ならない。
【００１２】サルモネラに特異的なプロ−ブの配列につ
いて以下に説明する。（配列表）における配列番号１〜
３の配列は、サルモネラ１６ＳｒＲＮＡの３部分のヌク
レオチド配列を示している。この配列はコンピュ−タ−
プログラム・ジェネティックス(GENETYX) を用いて、２
種類のデ−タバンク GenBank (the U.S. Department of
Health and HumanServices) とEMBL (European Molecu
lar Biology Laboratory)に記載されている核酸配列と
比較した際、非サルモネラと塩基数個の領域で確実に異
なることが確認された部分である。
いて以下に説明する。（配列表）における配列番号１〜
３の配列は、サルモネラ１６ＳｒＲＮＡの３部分のヌク
レオチド配列を示している。この配列はコンピュ−タ−
プログラム・ジェネティックス(GENETYX) を用いて、２
種類のデ−タバンク GenBank (the U.S. Department of
Health and HumanServices) とEMBL (European Molecu
lar Biology Laboratory)に記載されている核酸配列と
比較した際、非サルモネラと塩基数個の領域で確実に異
なることが確認された部分である。
【００１３】本発明のプローブは、上記配列を有するも
のであるが、それらだけに限定されるものではなく、配
列表に示した配列に加え、それらの配列から誘導される
１５〜３５、好ましくは１８〜２４ヌクレオチドのオリ
ゴマ−または相補的オリゴマ−により構成される配列を
持つプロ−ブをも含むものである。これらのプロ−ブ
は、２種類以上のプロ−ブを組み合わせて使用すること
もできる。
のであるが、それらだけに限定されるものではなく、配
列表に示した配列に加え、それらの配列から誘導される
１５〜３５、好ましくは１８〜２４ヌクレオチドのオリ
ゴマ−または相補的オリゴマ−により構成される配列を
持つプロ−ブをも含むものである。これらのプロ−ブ
は、２種類以上のプロ−ブを組み合わせて使用すること
もできる。
【００１４】オリゴヌクレオチド自動合成装置を用いて
ポリヌクレオチドプロ−ブを合成する方法を以下に説明
する。下記の規定配列を持つ２８ヌクレオチド鎖長のポ
リヌクレオチドプロ−ブをチオホスファイト法（特開昭
６１−１８０００２）によって合成した。合成が完了し
たら、ポリヌクレオチドを担体から分離し、既知のクロ
マトグラフィ−法によるＣ18カラムを用いたＨＰＬＣに
よって目的物を分取し、約９９％の純度を持つポリヌク
レオチドを得ることが出来た。作成したポリヌクレオチ
ドを、電気泳動で２８塩基の標準ポリヌクレオチドと比
較し生成を確認した。 5'- AAGCTTTGAC CGTTCCGAAC TCAGAACA - 3' 上記の方法によって作成したポリヌクレオチドの塩基配
列が正しいことを、既知のジデオキシ法によって確認し
た後、このポリヌクレオチドがサルモネラの１６ＳｒＲ
ＮＡに結合するかどうかを調べた。まず、サルモネラか
ら１６ＳｒＲＮＡを、フェノ−ル・クロロホルム抽出
や、エタノ−ル沈澱などの操作を行なうことによって抽
出した。これと、作成したプロ−ブを混合し、α−35Ｓ
−ｄＡＴＰ存在下で逆転写酵素を作用させ、このプロ−
ブがプライマ−となってｃＤＮＡ伸長反応が進行してい
たことを、電気泳動法及びオ−トラジオグラフィ−など
の方法を用いて確認した。この結果により、作成したポ
リヌクレオチドプロ−ブは、標的としている１６ＳｒＲ
ＮＡを確認し、結合できることを確認した。
ポリヌクレオチドプロ−ブを合成する方法を以下に説明
する。下記の規定配列を持つ２８ヌクレオチド鎖長のポ
リヌクレオチドプロ−ブをチオホスファイト法（特開昭
６１−１８０００２）によって合成した。合成が完了し
たら、ポリヌクレオチドを担体から分離し、既知のクロ
マトグラフィ−法によるＣ18カラムを用いたＨＰＬＣに
よって目的物を分取し、約９９％の純度を持つポリヌク
レオチドを得ることが出来た。作成したポリヌクレオチ
ドを、電気泳動で２８塩基の標準ポリヌクレオチドと比
較し生成を確認した。 5'- AAGCTTTGAC CGTTCCGAAC TCAGAACA - 3' 上記の方法によって作成したポリヌクレオチドの塩基配
列が正しいことを、既知のジデオキシ法によって確認し
た後、このポリヌクレオチドがサルモネラの１６ＳｒＲ
ＮＡに結合するかどうかを調べた。まず、サルモネラか
ら１６ＳｒＲＮＡを、フェノ−ル・クロロホルム抽出
や、エタノ−ル沈澱などの操作を行なうことによって抽
出した。これと、作成したプロ−ブを混合し、α−35Ｓ
−ｄＡＴＰ存在下で逆転写酵素を作用させ、このプロ−
ブがプライマ−となってｃＤＮＡ伸長反応が進行してい
たことを、電気泳動法及びオ−トラジオグラフィ−など
の方法を用いて確認した。この結果により、作成したポ
リヌクレオチドプロ−ブは、標的としている１６ＳｒＲ
ＮＡを確認し、結合できることを確認した。
【００１５】これらの核酸配列は、最初二重鎖である場
合に必要であれば、変性された相補的ＤＮＡまたはＲＮ
Ａ配列とハイブリッドを形成する性質を有している。核
酸の変性は、塩基性培地中でのインキュベ−ト、培地温
度の上昇、これら２プロセスの組合せまたは再度マイク
ロ波の作用によって行なうことが出来る。ハイブリッド
の形成は、様々な方法によって行なうことが出来る。
合に必要であれば、変性された相補的ＤＮＡまたはＲＮ
Ａ配列とハイブリッドを形成する性質を有している。核
酸の変性は、塩基性培地中でのインキュベ−ト、培地温
度の上昇、これら２プロセスの組合せまたは再度マイク
ロ波の作用によって行なうことが出来る。ハイブリッド
の形成は、様々な方法によって行なうことが出来る。
【００１６】本発明のプロ−ブは、核酸プロ−ブの標識
に関して当業者に公知の方法の一つによって標識され
る。例えば32Ｐ等の放射性同位元素で標識されるか、ま
たは酵素などの非放射性同位元素で標識されるが、これ
も公知である。あるケ−スでは、プロ−ブは酵素で標識
されないが、但し例えばハイブリッド形成後に存在可能
なビオチンで化学的に修飾される。
に関して当業者に公知の方法の一つによって標識され
る。例えば32Ｐ等の放射性同位元素で標識されるか、ま
たは酵素などの非放射性同位元素で標識されるが、これ
も公知である。あるケ−スでは、プロ−ブは酵素で標識
されないが、但し例えばハイブリッド形成後に存在可能
なビオチンで化学的に修飾される。
【００１７】
【作用】本発明のプロ−ブは、該プロ−ブが試料中に存
在するあらゆるサルモネラのｒＲＮＡとハイブリッド形
成可能となる条件下で、該プロ−ブを試料中の細菌と接
触させることにより、核酸ハイブリッド複合体を形成
し、該複合体を検出することにより、試料中のサルモネ
ラの存在を検出することができ、試料中のサルモネラの
存在を証拠だてることができる。特に、ほとんどの遺伝
子は、ｒＲＮＡ〔タンパク質とＲＮＡの複合混合物から
なり、すべての生物において遺伝情報の翻訳に関与する
ものであり、細菌には３種の異なったリボゾ−ムＲＮＡ
分子が存在する（５Ｓ，１６Ｓ，２３Ｓ）〕の多重コピ
−を有し（Noller(1984) Ann.Rev.Biochem. 53: 119
）、各種細菌細胞は約1.２×１０4 個のリボゾ−ムを
含むため、いずれの細胞も少なくとも1.２×１０4 分子
の各ｒＲＮＡを含むのに対し、細菌中の他の遺伝子は１
細胞あたり１〜２コピ−存在するだけであり、しかも、
そのｍＲＮＡ産物は安定ではなく、常に転写されている
わけではないため、ハイブリッド形成によるｒＲＮＡの
検出は、他の遺伝子のＤＮＡに対するハイブリッド形成
に対して約１０4 倍感度がよいことになる。
在するあらゆるサルモネラのｒＲＮＡとハイブリッド形
成可能となる条件下で、該プロ−ブを試料中の細菌と接
触させることにより、核酸ハイブリッド複合体を形成
し、該複合体を検出することにより、試料中のサルモネ
ラの存在を検出することができ、試料中のサルモネラの
存在を証拠だてることができる。特に、ほとんどの遺伝
子は、ｒＲＮＡ〔タンパク質とＲＮＡの複合混合物から
なり、すべての生物において遺伝情報の翻訳に関与する
ものであり、細菌には３種の異なったリボゾ−ムＲＮＡ
分子が存在する（５Ｓ，１６Ｓ，２３Ｓ）〕の多重コピ
−を有し（Noller(1984) Ann.Rev.Biochem. 53: 119
）、各種細菌細胞は約1.２×１０4 個のリボゾ−ムを
含むため、いずれの細胞も少なくとも1.２×１０4 分子
の各ｒＲＮＡを含むのに対し、細菌中の他の遺伝子は１
細胞あたり１〜２コピ−存在するだけであり、しかも、
そのｍＲＮＡ産物は安定ではなく、常に転写されている
わけではないため、ハイブリッド形成によるｒＲＮＡの
検出は、他の遺伝子のＤＮＡに対するハイブリッド形成
に対して約１０4 倍感度がよいことになる。
【００１８】
【実施例】配列表に示した配列と相同性を持つ以下の配
列を有する３種のプローブ（SE31,SE41,SE51）を上記チ
オホスファイト方法で合成し、ハイブリッド形成アッセ
イによりリサルモネラ及び非サルモネラついて同定試験
をおこなった。 試験の結果を表１に示した。表１に示すように、これら
のプロ−ブのうちSE31,SE51 は、サルモネラに特異的で
あることが示され、非サルモネラ由来のＤＮＡあるいは
ＲＮＡとはほとんどハイブリッド形成を行なわなかっ
た。ただしSE41についてはかなりの擬陽性がみられた。
なお、表１に示した非サルモネラは、サルモネラ検査に
おいて、検査対象となり得る菌種のうちの一部である。
列を有する３種のプローブ（SE31,SE41,SE51）を上記チ
オホスファイト方法で合成し、ハイブリッド形成アッセ
イによりリサルモネラ及び非サルモネラついて同定試験
をおこなった。 試験の結果を表１に示した。表１に示すように、これら
のプロ−ブのうちSE31,SE51 は、サルモネラに特異的で
あることが示され、非サルモネラ由来のＤＮＡあるいは
ＲＮＡとはほとんどハイブリッド形成を行なわなかっ
た。ただしSE41についてはかなりの擬陽性がみられた。
なお、表１に示した非サルモネラは、サルモネラ検査に
おいて、検査対象となり得る菌種のうちの一部である。
【００１９】
【表１】
【００２０】
【効果】本発明のプロ−ブを用いたサルモネラの検出
は、迅速かつ正確な結果を与え、臨床や食品の検査室
で、短時間のうちに標本中のサルモネラの有無を調べる
ことが出来る。又、本発明の検出方法は、他の様々な変
動の多い生物学的性質ではなく細菌の核酸含量に依存す
るため、サルモネラの生物学的に典型的な種のみなら
ず、非典型的な種も検出可能であり、更に、本検出方法
は検出に必ずしも生存している細胞を必要としないた
め、検査室への標本の輸送のための輸送培地の必要性が
除かれるという優れた効果を奏するものである。
は、迅速かつ正確な結果を与え、臨床や食品の検査室
で、短時間のうちに標本中のサルモネラの有無を調べる
ことが出来る。又、本発明の検出方法は、他の様々な変
動の多い生物学的性質ではなく細菌の核酸含量に依存す
るため、サルモネラの生物学的に典型的な種のみなら
ず、非典型的な種も検出可能であり、更に、本検出方法
は検出に必ずしも生存している細胞を必要としないた
め、検査室への標本の輸送のための輸送培地の必要性が
除かれるという優れた効果を奏するものである。
【００２１】
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：１６ＳｒＲＮＡ 配列 XXCGAAACXG GCAAGGCXXG AGXCXXGX 28 配列番号：２ 配列の長さ：４９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：１６ＳｒＲＮＡ 配列 XCCGGAGCXA ACGCGXXAAG XAGAGGCCGC CXGGGGAGXA CGGCCGCAA 49 配列番号：３ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：１６ＳｒＲＮＡ 配列 XCCACAGAGA XCCAGAGAXG GAXXXXCXXC GGAAC 35
Claims (3)
- 【請求項１】 下記乃至の配列又はその相補的配
列を有するＤＮＡ又はＲＮＡ核酸プロ−ブであることを
特徴とするサルモネラ（Salmonella）検出用プロ−ブ。 10 20 XXCGAAACXG GCAAGGCXXG AGXCXXGX 10 20 30 40 XCCGGAGCXA ACGCGXXAAG XAGAGGCCGC CXGGGGAGXA CGGCCGCAA 10 20 30 XCCACAGAGA XCCAGAGAXG GAXXXXCXXC GGAAC （いずれの配列もＤＮＡ配列の場合 Ｘ＝Ｔ：ＲＮＡ配
列の場合 Ｘ＝Ｕ） - 【請求項２】 請求項１に記載された配列から誘導さ
れる１５〜３５、好ましくは１８〜２４ヌクレオチドの
配列又はその相補的配列を有するＤＮＡ又はＲＮＡ核酸
プロ−ブであることを特徴とするサルモネラ（Salmonel
la）検出用プロ−ブ。 - 【請求項３】 請求項１又は２に記載されたサルモネ
ラ（Salmonella）検出用プロ−ブを、最初二重鎖の場合
に必要であれば変性した同定されるべき株に属する核酸
とハイブリッド形成させて選択的検出又は同定を行うこ
とを特徴とするサルモネラ（Salmonella）検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5423192A JPH0690797A (ja) | 1992-02-05 | 1992-02-05 | サルモネラ検出用プローブ及び検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5423192A JPH0690797A (ja) | 1992-02-05 | 1992-02-05 | サルモネラ検出用プローブ及び検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0690797A true JPH0690797A (ja) | 1994-04-05 |
Family
ID=12964772
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5423192A Pending JPH0690797A (ja) | 1992-02-05 | 1992-02-05 | サルモネラ検出用プローブ及び検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0690797A (ja) |
-
1992
- 1992-02-05 JP JP5423192A patent/JPH0690797A/ja active Pending
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