JPH0690795A - カンピロバクター ジェジュニ検出用プローブ及び検出方法 - Google Patents
カンピロバクター ジェジュニ検出用プローブ及び検出方法Info
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- JPH0690795A JPH0690795A JP3446492A JP3446492A JPH0690795A JP H0690795 A JPH0690795 A JP H0690795A JP 3446492 A JP3446492 A JP 3446492A JP 3446492 A JP3446492 A JP 3446492A JP H0690795 A JPH0690795 A JP H0690795A
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- JP
- Japan
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- probe
- sequence
- campylobacter jejuni
- dna
- nucleic acid
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Abstract
(57)【要約】
【目的】臨床検査、事に食中毒にかかる検査、あるいは
食品検査における、カンピロバクタ− ジェジュニ（Ca
mpylobacter jejuni）の検出を迅速かつ正確に行うこと
を目的とするものである。 【構成】特定配列を有するＤＮＡ又はＲＮＡ核酸プロ−
ブからなるカンピロバクタ− ジェジュニ（Campylobac
ter jejuni）検出用プロ−ブ及び該プロ−ブを用いるカ
ンピロバクタ− ジェジュニ（Campylobacter jejuni）
検出方法。 【効果】カンピロバクタ− ジェジュニの検出が迅速か
つ正確に行えるほか、標本の輸送のための輸送培地の必
要性もない。
食品検査における、カンピロバクタ− ジェジュニ（Ca
mpylobacter jejuni）の検出を迅速かつ正確に行うこと
を目的とするものである。 【構成】特定配列を有するＤＮＡ又はＲＮＡ核酸プロ−
ブからなるカンピロバクタ− ジェジュニ（Campylobac
ter jejuni）検出用プロ−ブ及び該プロ−ブを用いるカ
ンピロバクタ− ジェジュニ（Campylobacter jejuni）
検出方法。 【効果】カンピロバクタ− ジェジュニの検出が迅速か
つ正確に行えるほか、標本の輸送のための輸送培地の必
要性もない。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、臨床検査、特に食中毒
にかかる検査、あるいは食品検査における、カンピロバ
クタ− ジェジュニ（Campylobacter jejuni）の検出に
関するものである。
にかかる検査、あるいは食品検査における、カンピロバ
クタ− ジェジュニ（Campylobacter jejuni）の検出に
関するものである。
【０００２】
【従来の技術】カンピロバクタ−属は、人、あるいは動
物の流産、敗血症、及び増殖性回腸炎などの疾患の原因
に関連付けられるものであり、又、カンピロバクタ−と
は未だ確認はされていないが、カンピロバクタ−に類似
した微生物が、同性愛者の排泄物（Fennel et al,(198
4) J.Infec.Dis. 149 : 58）及び胃潰瘍生検(Kasper e
tal,(1984) Infection, 12: 179 ）から単離されてい
る。更に、カンピロバクタ− ジェジュニは、人の下痢
（Blaser et al,(1979) Ann.Intern.Med. 91; 179)及び
肺炎（Morris et al,(1985) Manual of Medical Microb
iology,. Lennetteet al, American Sciaty for Microb
iology, Wasington.D.C.)の原因となるもっとも重要な
菌種のひとつであるとされているものである。
物の流産、敗血症、及び増殖性回腸炎などの疾患の原因
に関連付けられるものであり、又、カンピロバクタ−と
は未だ確認はされていないが、カンピロバクタ−に類似
した微生物が、同性愛者の排泄物（Fennel et al,(198
4) J.Infec.Dis. 149 : 58）及び胃潰瘍生検(Kasper e
tal,(1984) Infection, 12: 179 ）から単離されてい
る。更に、カンピロバクタ− ジェジュニは、人の下痢
（Blaser et al,(1979) Ann.Intern.Med. 91; 179)及び
肺炎（Morris et al,(1985) Manual of Medical Microb
iology,. Lennetteet al, American Sciaty for Microb
iology, Wasington.D.C.)の原因となるもっとも重要な
菌種のひとつであるとされているものである。
【０００３】臨床標本中のカンピロバクタ− ジェジュ
ニの存在は、以下の方法で検出されている。即ち、ま
ず、適切に調製した試料を増殖に適した条件下の微生物
学的培地上で培養する。培養により得られたコロニ−に
ついて、一般的に試料の採取後４８時間に開始し、終了
するのに数日を要する形態学的及び生物学的特徴を検査
することにより、その存在を確認するという方法であ
る。
ニの存在は、以下の方法で検出されている。即ち、ま
ず、適切に調製した試料を増殖に適した条件下の微生物
学的培地上で培養する。培養により得られたコロニ−に
ついて、一般的に試料の採取後４８時間に開始し、終了
するのに数日を要する形態学的及び生物学的特徴を検査
することにより、その存在を確認するという方法であ
る。
【０００４】しかし、上記の方法では、培養に微好気性
の環境が要求されるなど、時間が掛かり過ぎることの他
に、技術上にも困難な点が多いという問題を有してい
る。そこで、最近では、オリゴヌクレオチドを用いたＤ
ＮＡプロ−ブ法あるいはハイブリダイゼ−ション法が試
みられるようになってきた。例えば、Kohne[Biochemica
l Journal ８：1104-1118(1968)]らは、ｒＲＮＡ配列の
プロ−ブを調製する１つの方法について議論しており、
PaceおよびCampbell[Journal of Bacteriology 107 : 5
43-547(1971)] は、異なった細菌種からのｒＲＮＡの相
同性及びこれらの相同性の程度を定量化するためのハイ
ブリダイゼ−ション法について議論している。更に、So
gin[Journal of Molecular Evolution 1 : 173-184(19
72)]らは、系統発生論関係の評価のために異なったリボ
ゾ−ムＲＮＡ分子の一次構造特性を用いる論理的および
実際的観点について議論しており、Fox[International
Journal of Systematic Bacteriology 27 : 44-57(197
7)] らは、原核生物分類への比較カタログ法について議
論している。又、Kohne らは、Gen-Probe 社の出願特許
(1983)中で、リボゾ−ムＲＮＡ分子に対するプロ−ブと
して使用するための核酸断片を得るための戦略について
述べている。
の環境が要求されるなど、時間が掛かり過ぎることの他
に、技術上にも困難な点が多いという問題を有してい
る。そこで、最近では、オリゴヌクレオチドを用いたＤ
ＮＡプロ−ブ法あるいはハイブリダイゼ−ション法が試
みられるようになってきた。例えば、Kohne[Biochemica
l Journal ８：1104-1118(1968)]らは、ｒＲＮＡ配列の
プロ−ブを調製する１つの方法について議論しており、
PaceおよびCampbell[Journal of Bacteriology 107 : 5
43-547(1971)] は、異なった細菌種からのｒＲＮＡの相
同性及びこれらの相同性の程度を定量化するためのハイ
ブリダイゼ−ション法について議論している。更に、So
gin[Journal of Molecular Evolution 1 : 173-184(19
72)]らは、系統発生論関係の評価のために異なったリボ
ゾ−ムＲＮＡ分子の一次構造特性を用いる論理的および
実際的観点について議論しており、Fox[International
Journal of Systematic Bacteriology 27 : 44-57(197
7)] らは、原核生物分類への比較カタログ法について議
論している。又、Kohne らは、Gen-Probe 社の出願特許
(1983)中で、リボゾ−ムＲＮＡ分子に対するプロ−ブと
して使用するための核酸断片を得るための戦略について
述べている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、オリゴヌク
レオチドを用いたＤＮＡプロ−ブ法あるいはハイブリダ
イゼ−ション法に使用され得るＤＮＡ又はＲＮＡ、特に
カンピロバクタ− ジェジュニ由来の１６ＳｒＲＮＡ遺
伝子を検出するために用いられる、最初２重鎖である場
合に必要であれば、予め変性された同定されるべき株に
属する相補的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列とハイブリッド形
成するカンピロバクタ− ジェジュニ検出用オリゴヌク
レオチドプロ−ブ及び食中毒菌検査におけるカンピロバ
クタ− ジェジュニの簡便且つ高感度な検査法を提供し
ようとするものである。
レオチドを用いたＤＮＡプロ−ブ法あるいはハイブリダ
イゼ−ション法に使用され得るＤＮＡ又はＲＮＡ、特に
カンピロバクタ− ジェジュニ由来の１６ＳｒＲＮＡ遺
伝子を検出するために用いられる、最初２重鎖である場
合に必要であれば、予め変性された同定されるべき株に
属する相補的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列とハイブリッド形
成するカンピロバクタ− ジェジュニ検出用オリゴヌク
レオチドプロ−ブ及び食中毒菌検査におけるカンピロバ
クタ− ジェジュニの簡便且つ高感度な検査法を提供し
ようとするものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、オリゴヌ
クレオチドを用いたＤＮＡプロ−ブ法あるいはハイブリ
ダイゼ−ション法に使用され得るＤＮＡ又はＲＮＡにつ
いて広く探索し、カンピロバクタ− ジェジュニの１６
ＳｒＲＮＡ遺伝子と選択的にハイブリダイズするオリゴ
ヌクレオチドの作成に成功し本発明を完成させたのであ
る。
クレオチドを用いたＤＮＡプロ−ブ法あるいはハイブリ
ダイゼ−ション法に使用され得るＤＮＡ又はＲＮＡにつ
いて広く探索し、カンピロバクタ− ジェジュニの１６
ＳｒＲＮＡ遺伝子と選択的にハイブリダイズするオリゴ
ヌクレオチドの作成に成功し本発明を完成させたのであ
る。
【０００７】即ち、本発明は以下の４発明からなるもの
である。 下記配列又はその相補的配列を有するＤＮＡ又はＲ
ＮＡ核酸プロ−ブであることを特徴とするカンピロバク
タ− ジェジュニ（Campylobacter jejuni）検出用プロ
−ブに関する発明。 10 20 30 40 50 GAXACGCXAG CGCGCCAGGC CCAXGCAAXA CACXGCAAGX GCAAGCGAAC 60 70 GAXGGAAGCA GCXAGCXXGC XAGAXGA （ただしＤＮＡ配列の場合 Ｘ＝Ｔ：ＲＮＡ配列の場合
Ｘ＝Ｕ） 下記配列又はその相補的配列を有するＤＮＡ又はＲ
ＮＡ核酸プロ−ブであることを特徴とするカンピロバク
タ− ジェジュニ（Campylobacter jejuni）検出用プロ
−ブに関する発明。 10 20 30 40 XGACGGXACC XAAGGAAXAA CGCCACGGXA ACXCCGXGCC AGCACCGCG （ただしＤＮＡ配列の場合 Ｘ＝Ｔ：ＲＮＡ配列の場合
Ｘ＝Ｕ） 上記またはに記載された配列から誘導される１
５〜３５、好ましくは１８〜２４ヌクレオチドの配列又
はその相補的配列を有するＤＮＡ又はＲＮＡ核酸プロ−
ブであることを特徴とするカンピロバクタ− ジェジュ
ニ（Campylobacter jejuni）検出用プロ−ブに関する発
明。 上記、又はに記載されたカンピロバクタ−
ジェジュニ（Campylobacter jejuni）検出用プロ−ブ
を、最初二重鎖の場合に必要であれば変性した同定され
るべき株に属する核酸とハイブリッド形成させて選択的
検出又は同定を行うことを特徴とするカンピロバクタ−
ジェジュニ（Campylobacter jejuni）検出方法に関す
る発明。
である。 下記配列又はその相補的配列を有するＤＮＡ又はＲ
ＮＡ核酸プロ−ブであることを特徴とするカンピロバク
タ− ジェジュニ（Campylobacter jejuni）検出用プロ
−ブに関する発明。 10 20 30 40 50 GAXACGCXAG CGCGCCAGGC CCAXGCAAXA CACXGCAAGX GCAAGCGAAC 60 70 GAXGGAAGCA GCXAGCXXGC XAGAXGA （ただしＤＮＡ配列の場合 Ｘ＝Ｔ：ＲＮＡ配列の場合
Ｘ＝Ｕ） 下記配列又はその相補的配列を有するＤＮＡ又はＲ
ＮＡ核酸プロ−ブであることを特徴とするカンピロバク
タ− ジェジュニ（Campylobacter jejuni）検出用プロ
−ブに関する発明。 10 20 30 40 XGACGGXACC XAAGGAAXAA CGCCACGGXA ACXCCGXGCC AGCACCGCG （ただしＤＮＡ配列の場合 Ｘ＝Ｔ：ＲＮＡ配列の場合
Ｘ＝Ｕ） 上記またはに記載された配列から誘導される１
５〜３５、好ましくは１８〜２４ヌクレオチドの配列又
はその相補的配列を有するＤＮＡ又はＲＮＡ核酸プロ−
ブであることを特徴とするカンピロバクタ− ジェジュ
ニ（Campylobacter jejuni）検出用プロ−ブに関する発
明。 上記、又はに記載されたカンピロバクタ−
ジェジュニ（Campylobacter jejuni）検出用プロ−ブ
を、最初二重鎖の場合に必要であれば変性した同定され
るべき株に属する核酸とハイブリッド形成させて選択的
検出又は同定を行うことを特徴とするカンピロバクタ−
ジェジュニ（Campylobacter jejuni）検出方法に関す
る発明。
【０００８】本発明の理解のために以下に本発明をより
詳細に説明する。プロ−ブ 本発明におけるプロ−ブは、カンピロバクタ− ジェジ
ュニＤＮＡあるいはリボゾ−ムから取得するか、あるい
はin vitroで合成することが出来る。検出アッセイに有
効に使用するためには、プロ−ブの長さが１５塩基以上
のプロ−ブが好ましい。プロ−ブは一般的にそれらの検
出を可能にする公知の方法により標識されているものが
好ましく、好ましいＤＮＡプロ−ブは、例えば32Ｐ等を
用いて放射線標識がされたものとか、あるいは検出可能
な化合物又は複合体を形成する指示物質に選択的に結合
することのできる化合物を用いて非放射性標識を施され
たものである。前記複合体としては、アビジンとビオチ
ン、抗原と抗体、及び酵素とそれに対応する基質の様な
化合物が挙げられる。別の非同位体標識としては、蛍光
化合物、電子密度の高い化合物、アクリジンエステル類
及び発光ランタニド類が挙げられる。
詳細に説明する。プロ−ブ 本発明におけるプロ−ブは、カンピロバクタ− ジェジ
ュニＤＮＡあるいはリボゾ−ムから取得するか、あるい
はin vitroで合成することが出来る。検出アッセイに有
効に使用するためには、プロ−ブの長さが１５塩基以上
のプロ−ブが好ましい。プロ−ブは一般的にそれらの検
出を可能にする公知の方法により標識されているものが
好ましく、好ましいＤＮＡプロ−ブは、例えば32Ｐ等を
用いて放射線標識がされたものとか、あるいは検出可能
な化合物又は複合体を形成する指示物質に選択的に結合
することのできる化合物を用いて非放射性標識を施され
たものである。前記複合体としては、アビジンとビオチ
ン、抗原と抗体、及び酵素とそれに対応する基質の様な
化合物が挙げられる。別の非同位体標識としては、蛍光
化合物、電子密度の高い化合物、アクリジンエステル類
及び発光ランタニド類が挙げられる。
【０００９】本発明のプロ−ブは、カンピロバクタ−
ジェジュニの細菌微生物の検出及び同定に用いるための
核酸プロ−ブであり、より正確には、本発明のプロ−ブ
は、カンピロバクタ− ジェジュニの様々な細菌種を特
異的に検出及び同定するために有用な、各々好ましくは
標識されたＤＮＡまたはＲＮＡの特異配列からなるＤＮ
ＡまたはＲＮＡ核酸プロ−ブ、即ち、カンピロバクタ−
ジェジュニの特異的プロ−ブである。。本発明のカン
ピロバクタ− ジェジュニの特異的プロ−ブは、下記配
列又はその相補的配列を有することを特徴とするもので
ある。 10 20 30 40 50 GAXACGCXAG CGCGCCAGGC CCAXGCAAXA CACXGCAAGX GCAAGCGAAC 60 70 GAXGGAAGCA GCXAGCXXGC XAGAXGA （ただしＤＮＡ配列の場合 Ｘ＝Ｔ：ＲＮＡ配列の場合
Ｘ＝Ｕ） 又は、 10 20 30 40 XGACGGXACC XAAGGAAXAA CGCCACGGXA ACXCCGXGCC AGCACCGCG （ただしＤＮＡ配列の場合 Ｘ＝Ｔ：ＲＮＡ配列の場合
Ｘ＝Ｕ） 並びに、上記に記載された配列から誘導される１５〜３
５、好ましくは１８〜２４ヌクレオチドの配列又はその
相補的配列を有することを特徴とするものである。上記
に記載された配列から誘導される１５〜３５、好ましく
は１８〜２４ヌクレオチドの標識オリゴマ−叉は相補的
オリゴマ−から構成されるプロ−ブは、本発明にとり好
ましいプロ−ブであり、具体的には、下記の配列が挙げ
られる。
ジェジュニの細菌微生物の検出及び同定に用いるための
核酸プロ−ブであり、より正確には、本発明のプロ−ブ
は、カンピロバクタ− ジェジュニの様々な細菌種を特
異的に検出及び同定するために有用な、各々好ましくは
標識されたＤＮＡまたはＲＮＡの特異配列からなるＤＮ
ＡまたはＲＮＡ核酸プロ−ブ、即ち、カンピロバクタ−
ジェジュニの特異的プロ−ブである。。本発明のカン
ピロバクタ− ジェジュニの特異的プロ−ブは、下記配
列又はその相補的配列を有することを特徴とするもので
ある。 10 20 30 40 50 GAXACGCXAG CGCGCCAGGC CCAXGCAAXA CACXGCAAGX GCAAGCGAAC 60 70 GAXGGAAGCA GCXAGCXXGC XAGAXGA （ただしＤＮＡ配列の場合 Ｘ＝Ｔ：ＲＮＡ配列の場合
Ｘ＝Ｕ） 又は、 10 20 30 40 XGACGGXACC XAAGGAAXAA CGCCACGGXA ACXCCGXGCC AGCACCGCG （ただしＤＮＡ配列の場合 Ｘ＝Ｔ：ＲＮＡ配列の場合
Ｘ＝Ｕ） 並びに、上記に記載された配列から誘導される１５〜３
５、好ましくは１８〜２４ヌクレオチドの配列又はその
相補的配列を有することを特徴とするものである。上記
に記載された配列から誘導される１５〜３５、好ましく
は１８〜２４ヌクレオチドの標識オリゴマ−叉は相補的
オリゴマ−から構成されるプロ−ブは、本発明にとり好
ましいプロ−ブであり、具体的には、下記の配列が挙げ
られる。
【００１０】これらの核酸プロ−ブは周知の現状技術で
取得可能なものであって、様々なル−ト、特に遺伝子工
学又は直接的マニュアル、もしくは自動合成によって得
られる。
取得可能なものであって、様々なル−ト、特に遺伝子工
学又は直接的マニュアル、もしくは自動合成によって得
られる。
【００１１】プロ−ブの取得と合成 本発明者等は、まず、他の生物のｒＲＮＡとは相同性を
持たないカンピロバクタ− ジェジュニのｒＲＮＡと相
補的なＤＮＡ配列を、逆転写酵素を使用して、単離し同
定した。逆転写酵素はＲＮＡを鋳型として使い、それを
転写して相補的なＤＮＡ鎖（ｃＤＮＡ）を作る方法であ
り、この酵素を用いることにより、カンピロバクタ−ジ
ェジュニのｒＲＮＡからｃＤＮＡを合成することが出来
た。ハイブリッド形成により１６ＳｒＲＮＡをコ−ドす
るＤＮＡフラグメントを同定した後、それらのＤＮＡの
ヌクレオチド配列を標準的方法（例えばSanger etal, 7
4: 5453 (1977), Proc.Natl.Acad.Sci）により決定し
た。このヌクレオチド配列を、次に、公表されている他
の種々のｒＲＮＡ配列と比較し、相同性領域及び非相同
性領域を決定した。公表されている他の配列と相同性の
無い領域をサブクロ−ン化又はオリゴヌクレオチド自動
合成装置を用いてカンピロバクタ− ジェジュニＤＮＡ
フラグメントを得た。これらの特徴的なカンピロバクタ
− ジェジュニＤＮＡフラグメントを32Ｐもしくは35Ｓ
を用いて標識し、カンピロバクタ− ジェジュニ及び非
カンピロバクタ− ジェジュニの双方に対して試験する
ためのプロ−ブとして使用することが出来る。又、必要
なら、プロ−ブ配列をベクタ−に組み込み、得られたベ
クタ−をプロ−ブとして用いることも出来る。これに使
用するベクタ−は、試験される試料中に存在する可能性
のある非カンピロバクタ−．ジェジュニのいずれにも相
同性を有してはならない。
持たないカンピロバクタ− ジェジュニのｒＲＮＡと相
補的なＤＮＡ配列を、逆転写酵素を使用して、単離し同
定した。逆転写酵素はＲＮＡを鋳型として使い、それを
転写して相補的なＤＮＡ鎖（ｃＤＮＡ）を作る方法であ
り、この酵素を用いることにより、カンピロバクタ−ジ
ェジュニのｒＲＮＡからｃＤＮＡを合成することが出来
た。ハイブリッド形成により１６ＳｒＲＮＡをコ−ドす
るＤＮＡフラグメントを同定した後、それらのＤＮＡの
ヌクレオチド配列を標準的方法（例えばSanger etal, 7
4: 5453 (1977), Proc.Natl.Acad.Sci）により決定し
た。このヌクレオチド配列を、次に、公表されている他
の種々のｒＲＮＡ配列と比較し、相同性領域及び非相同
性領域を決定した。公表されている他の配列と相同性の
無い領域をサブクロ−ン化又はオリゴヌクレオチド自動
合成装置を用いてカンピロバクタ− ジェジュニＤＮＡ
フラグメントを得た。これらの特徴的なカンピロバクタ
− ジェジュニＤＮＡフラグメントを32Ｐもしくは35Ｓ
を用いて標識し、カンピロバクタ− ジェジュニ及び非
カンピロバクタ− ジェジュニの双方に対して試験する
ためのプロ−ブとして使用することが出来る。又、必要
なら、プロ−ブ配列をベクタ−に組み込み、得られたベ
クタ−をプロ−ブとして用いることも出来る。これに使
用するベクタ−は、試験される試料中に存在する可能性
のある非カンピロバクタ−．ジェジュニのいずれにも相
同性を有してはならない。
【００１２】カンピロバクタ− ジェジュニに特異的な
プロ−ブの配列について以下に説明する。（配列表）に
おける配列番号１及び２は、カンピロバクタ− ジェジ
ュニ１６ＳｒＲＮＡの２部分のヌクレオチド配列を示し
ている。この配列はコンピュ−タ−プログラム・ジェネ
ティックス(GENETYX) を用いて、２種類のデ−タバンク
GenBank (the U.S. Department of Health and HumanS
ervices) とEMBL (European Molecular Biology Labora
tory)に記載されている核酸配列と比較した際、非カン
ピロバクタ− ジェジュニと塩基数個の領域で確実に異
なることが確認された部分である。
プロ−ブの配列について以下に説明する。（配列表）に
おける配列番号１及び２は、カンピロバクタ− ジェジ
ュニ１６ＳｒＲＮＡの２部分のヌクレオチド配列を示し
ている。この配列はコンピュ−タ−プログラム・ジェネ
ティックス(GENETYX) を用いて、２種類のデ−タバンク
GenBank (the U.S. Department of Health and HumanS
ervices) とEMBL (European Molecular Biology Labora
tory)に記載されている核酸配列と比較した際、非カン
ピロバクタ− ジェジュニと塩基数個の領域で確実に異
なることが確認された部分である。
【００１３】本発明のプローブは、上記配列を有するも
のであるが、それらだけに限定されるものではなく、配
列番号１及び２に示した配列に加え、それらの配列から
誘導される１５〜３５、好ましくは１８〜２４ヌクレオ
チドのオリゴマ−または相補的オリゴマ−により構成さ
れる配列を持つプロ−ブをも含むものである。これらの
プロ−ブは、２種類以上のプロ−ブを組み合わせて使用
することもできる。
のであるが、それらだけに限定されるものではなく、配
列番号１及び２に示した配列に加え、それらの配列から
誘導される１５〜３５、好ましくは１８〜２４ヌクレオ
チドのオリゴマ−または相補的オリゴマ−により構成さ
れる配列を持つプロ−ブをも含むものである。これらの
プロ−ブは、２種類以上のプロ−ブを組み合わせて使用
することもできる。
【００１４】オリゴヌクレオチド自動合成装置を用いて
ポリヌクレオチドプロ−ブを合成する方法を以下に説明
する。下記の規定配列を持つ３４ヌクレオチド鎖長のポ
リヌクレオチドプロ−ブをチオホスファイト法（特開昭
６１−１８０００２）によって合成した。合成が完了し
たら、ポリヌクレオチドを担体から分離し、既知のクロ
マトグラフィ−法によるＣ18カラムを用いたＨＰＬＣに
よって目的物を分取し、約９９％の純度を持つポリヌク
レオチドを得ることが出来た。作成したポリヌクレオチ
ドを、電気泳動で３４塩基の標準ポリヌクレオチドと比
較し生成を確認した。 5'- CTATGCGATC GCGCGGTCCG GGTACGTTAT GTGA - 3' 上記の方法によって作成したポリヌクレオチドの塩基配
列が正しいことを、既知のジデオキシ法によって確認し
た後、このポリヌクレオチドがカンピロバクタ− ジェ
ジュニの１６ＳｒＲＮＡに結合するかどうかを調べた。
まず、カンピロバクタ− ジェジュニから１６ＳｒＲＮ
Ａを、フェノ−ル・クロロホルム抽出や、エタノ−ル沈
澱などの操作を行なうことによって抽出した。これと、
作成したプロ−ブを混合し、α−35Ｓ−ｄＡＴＰ存在下
で逆転写酵素を作用させ、このプロ−ブがプライマ−と
なってｃＤＮＡ伸長反応が進行していたことを、電気泳
動法及びオ−トラジオグラフィ−などの方法を用いて確
認した。この結果により、作成したポリヌクレオチドプ
ロ−ブは、標的としている１６ＳｒＲＮＡを確認し、結
合できることを確認した。
ポリヌクレオチドプロ−ブを合成する方法を以下に説明
する。下記の規定配列を持つ３４ヌクレオチド鎖長のポ
リヌクレオチドプロ−ブをチオホスファイト法（特開昭
６１−１８０００２）によって合成した。合成が完了し
たら、ポリヌクレオチドを担体から分離し、既知のクロ
マトグラフィ−法によるＣ18カラムを用いたＨＰＬＣに
よって目的物を分取し、約９９％の純度を持つポリヌク
レオチドを得ることが出来た。作成したポリヌクレオチ
ドを、電気泳動で３４塩基の標準ポリヌクレオチドと比
較し生成を確認した。 5'- CTATGCGATC GCGCGGTCCG GGTACGTTAT GTGA - 3' 上記の方法によって作成したポリヌクレオチドの塩基配
列が正しいことを、既知のジデオキシ法によって確認し
た後、このポリヌクレオチドがカンピロバクタ− ジェ
ジュニの１６ＳｒＲＮＡに結合するかどうかを調べた。
まず、カンピロバクタ− ジェジュニから１６ＳｒＲＮ
Ａを、フェノ−ル・クロロホルム抽出や、エタノ−ル沈
澱などの操作を行なうことによって抽出した。これと、
作成したプロ−ブを混合し、α−35Ｓ−ｄＡＴＰ存在下
で逆転写酵素を作用させ、このプロ−ブがプライマ−と
なってｃＤＮＡ伸長反応が進行していたことを、電気泳
動法及びオ−トラジオグラフィ−などの方法を用いて確
認した。この結果により、作成したポリヌクレオチドプ
ロ−ブは、標的としている１６ＳｒＲＮＡを確認し、結
合できることを確認した。
【００１５】これらの核酸配列は、最初二重鎖である場
合に必要であれば、変性された相補的ＤＮＡまたはＲＮ
Ａ配列とハイブリッドを形成する性質を有している。核
酸の変性は、塩基性培地中でのインキュベ−ト、培地温
度の上昇、これら２プロセスの組合せまたは再度マイク
ロ波の作用によって行なうことが出来る。ハイブリッド
の形成は、様々な方法によって行なうことが出来る。
合に必要であれば、変性された相補的ＤＮＡまたはＲＮ
Ａ配列とハイブリッドを形成する性質を有している。核
酸の変性は、塩基性培地中でのインキュベ−ト、培地温
度の上昇、これら２プロセスの組合せまたは再度マイク
ロ波の作用によって行なうことが出来る。ハイブリッド
の形成は、様々な方法によって行なうことが出来る。
【００１６】本発明のプロ−ブは、核酸プロ−ブの標識
に関して当業者に公知の方法の一つによって標識され
る。例えば32Ｐ等の放射性同位元素で標識されるか、ま
たは酵素などの非放射性同位元素で標識されるが、これ
も公知である。あるケ−スでは、プロ−ブは酵素で標識
されないが、但し例えばハイブリッド形成後に存在可能
なビオチンで化学的に修飾される。
に関して当業者に公知の方法の一つによって標識され
る。例えば32Ｐ等の放射性同位元素で標識されるか、ま
たは酵素などの非放射性同位元素で標識されるが、これ
も公知である。あるケ−スでは、プロ−ブは酵素で標識
されないが、但し例えばハイブリッド形成後に存在可能
なビオチンで化学的に修飾される。
【００１７】
【作用】本発明のプロ−ブは、該プロ−ブが試料中に存
在するあらゆるカンピロバクタ− ジェジュニのｒＲＮ
Ａとハイブリッド形成可能となる条件下で、該プロ−ブ
を試料中の細菌と接触させることにより、核酸ハイブリ
ッド複合体を形成し、該複合体を検出することにより、
試料中のカンピロバクタ− ジェジュニの存在を検出す
ることができ、試料中のカンピロバクタ− ジェジュニ
の存在を証拠だてることができる。特に、ほとんどの遺
伝子は、ｒＲＮＡ〔タンパク質とＲＮＡの複合混合物か
らなり、すべての生物において遺伝情報の翻訳に関与す
るものであり、細菌には３種の異なったリボゾ−ムＲＮ
Ａ分子が存在する（５Ｓ，１６Ｓ，２３Ｓ）〕の多重コ
ピ−を有し（Noller(1984) Ann.Rev.Biochem. 53: 11
9）、各種細菌細胞は約1.２×１０4 個のリボゾ−ムを
含むため、いずれの細胞も少なくとも1.２×１０4 分子
の各ｒＲＮＡを含むのに対し、細菌中の他の遺伝子は１
細胞あたり１〜２コピ−存在するだけであり、しかも、
そのｍＲＮＡ産物は安定ではなく、常に転写されている
わけではないため、ハイブリッド形成によるｒＲＮＡの
検出は、他の遺伝子のＤＮＡに対するハイブリッド形成
に対して約１０4 倍感度がよいことになる。
在するあらゆるカンピロバクタ− ジェジュニのｒＲＮ
Ａとハイブリッド形成可能となる条件下で、該プロ−ブ
を試料中の細菌と接触させることにより、核酸ハイブリ
ッド複合体を形成し、該複合体を検出することにより、
試料中のカンピロバクタ− ジェジュニの存在を検出す
ることができ、試料中のカンピロバクタ− ジェジュニ
の存在を証拠だてることができる。特に、ほとんどの遺
伝子は、ｒＲＮＡ〔タンパク質とＲＮＡの複合混合物か
らなり、すべての生物において遺伝情報の翻訳に関与す
るものであり、細菌には３種の異なったリボゾ−ムＲＮ
Ａ分子が存在する（５Ｓ，１６Ｓ，２３Ｓ）〕の多重コ
ピ−を有し（Noller(1984) Ann.Rev.Biochem. 53: 11
9）、各種細菌細胞は約1.２×１０4 個のリボゾ−ムを
含むため、いずれの細胞も少なくとも1.２×１０4 分子
の各ｒＲＮＡを含むのに対し、細菌中の他の遺伝子は１
細胞あたり１〜２コピ−存在するだけであり、しかも、
そのｍＲＮＡ産物は安定ではなく、常に転写されている
わけではないため、ハイブリッド形成によるｒＲＮＡの
検出は、他の遺伝子のＤＮＡに対するハイブリッド形成
に対して約１０4 倍感度がよいことになる。
【００１８】
【実施例】配列番号１又は２に示した配列と相同性を持
つ以下の配列を有する３種のプローブ（CJ31,CJ32,CJ4
1）を上記チオホスファイト方法で合成し、ハイブリッ
ド形成アッセイによりカンピロバクタ− ジェジュニ及
び非カンピロバクタ− ジェジュニについて同定試験を
おこなった。 試験の結果を表１に示した。表１で明らかな様に、これ
らのプロ−ブのうち、CJ31,CJ41 は、カンピロバクタ−
ジェジュニに特異的であることが示され、非カンピロ
バクタ− ジェジュニ由来のＤＮＡあるいはＲＮＡとは
ほとんどハイブリッド形成を行なわなかった。ただしCJ
32についてはかなりの擬陽性がみられ、CJ31について
は、カンピロバクタ− ジェジュニの一部しか検出でき
ない可能性が示された。なお、表１に示した非カンピロ
バクタ− ジェジュニの菌は、カンピロバクタ− ジェ
ジュニ検査において、検査対象となり得る菌種のうちの
一部である。
つ以下の配列を有する３種のプローブ（CJ31,CJ32,CJ4
1）を上記チオホスファイト方法で合成し、ハイブリッ
ド形成アッセイによりカンピロバクタ− ジェジュニ及
び非カンピロバクタ− ジェジュニについて同定試験を
おこなった。 試験の結果を表１に示した。表１で明らかな様に、これ
らのプロ−ブのうち、CJ31,CJ41 は、カンピロバクタ−
ジェジュニに特異的であることが示され、非カンピロ
バクタ− ジェジュニ由来のＤＮＡあるいはＲＮＡとは
ほとんどハイブリッド形成を行なわなかった。ただしCJ
32についてはかなりの擬陽性がみられ、CJ31について
は、カンピロバクタ− ジェジュニの一部しか検出でき
ない可能性が示された。なお、表１に示した非カンピロ
バクタ− ジェジュニの菌は、カンピロバクタ− ジェ
ジュニ検査において、検査対象となり得る菌種のうちの
一部である。
【００１９】
【表１】
【００２０】
【効果】本発明のプロ−ブを用いたカンピロバクタ−
ジェジュニの検出は、迅速かつ正確な結果を与え、臨床
や食品の検査室で、短時間のうちに標本中のカンピロバ
クタ− ジェジュニの有無を調べることが出来る。又、
本発明の検出方法は、他の様々な変動の多い生物学的性
質ではなく細菌の核酸含量に依存するため、カンピロバ
クタ− ジェジュニの生物学的に典型的な種のみなら
ず、非典型的な種も検出可能であり、更に、本検出方法
は検出に必ずしも生存している細胞を必要としないた
め、検査室への標本の輸送のための輸送培地の必要性が
除かれるという優れた効果を奏するものである。
ジェジュニの検出は、迅速かつ正確な結果を与え、臨床
や食品の検査室で、短時間のうちに標本中のカンピロバ
クタ− ジェジュニの有無を調べることが出来る。又、
本発明の検出方法は、他の様々な変動の多い生物学的性
質ではなく細菌の核酸含量に依存するため、カンピロバ
クタ− ジェジュニの生物学的に典型的な種のみなら
ず、非典型的な種も検出可能であり、更に、本検出方法
は検出に必ずしも生存している細胞を必要としないた
め、検査室への標本の輸送のための輸送培地の必要性が
除かれるという優れた効果を奏するものである。
【００２１】
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：７７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：１６ＳｒＲＮＡ 配列 GAXACGCXAG CGCGCCAGGC CCAXGCAAXA CACXGCAAGX GCAAGCGAAC GAXGGAAGCA 60 GCXAGCXXGC XAGAXGA 77 配列番号：2 配列の長さ：４９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：１６ＳｒＲＮＡ 配列 XGACGGXACC XAAGGAAXAA CGCCACGGXA ACXCCGXGCC AGCACCGCG 49
Claims (4)
- 【請求項１】 下記配列又はその相補的配列を有する
ＤＮＡ又はＲＮＡ核酸プロ−ブであることを特徴とする
カンピロバクタ− ジェジュニ（Campylobacterjejun
i）検出用プロ−ブ。 10 20 30 40 50 GAXACGCXAG CGCGCCAGGC CCAXGCAAXA CACXGCAAGX GCAAGCGAAC 60 70 GAXGGAAGCA GCXAGCXXGC XAGAXGA （ただしＤＮＡ配列の場合 Ｘ＝Ｔ：ＲＮＡ配列の場合
Ｘ＝Ｕ） - 【請求項２】 下記配列又はその相補的配列を有する
ＤＮＡ又はＲＮＡ核酸プロ−ブであることを特徴とする
カンピロバクタ− ジェジュニ（Campylobacterjejun
i）検出用プロ−ブ。 10 20 30 40 XGACGGXACC XAAGGAAXAA CGCCACGGXA ACXCCGXGCC AGCACCGCG （ただしＤＮＡ配列の場合 Ｘ＝Ｔ：ＲＮＡ配列の場合
Ｘ＝Ｕ） - 【請求項３】 請求項１または２に記載された配列か
ら誘導される１５〜３５、好ましくは１８〜２４ヌクレ
オチドの配列又はその相補的配列を有するＤＮＡ又はＲ
ＮＡ核酸プロ−ブであることを特徴とするカンピロバク
タ− ジェジュニ（Campylobacter jejuni）検出用プロ
−ブ。 - 【請求項４】 請求項１、２又は３に記載されたカン
ピロバクタ− ジェジュニ（Campylobacter jejuni）検
出用プロ−ブを、最初二重鎖の場合に必要であれば変性
した同定されるべき株に属する核酸とハイブリッド形成
させて選択的検出又は同定を行うことを特徴とするカン
ピロバクタ− ジェジュニ（Campylobacter jejuni）検
出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3446492A JPH0690795A (ja) | 1992-01-24 | 1992-01-24 | カンピロバクター ジェジュニ検出用プローブ及び検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3446492A JPH0690795A (ja) | 1992-01-24 | 1992-01-24 | カンピロバクター ジェジュニ検出用プローブ及び検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0690795A true JPH0690795A (ja) | 1994-04-05 |
Family
ID=12414977
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3446492A Pending JPH0690795A (ja) | 1992-01-24 | 1992-01-24 | カンピロバクター ジェジュニ検出用プローブ及び検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0690795A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006336924A (ja) * | 2005-06-01 | 2006-12-14 | Michihisa Tsutahara | 真空乾燥装置 |
| US7563594B2 (en) | 2003-12-05 | 2009-07-21 | Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd. | Cytolethal distending toxins and detection of Campylobacter bacteria using the same as a target |
| US8586327B2 (en) | 2007-08-31 | 2013-11-19 | Osaka Prefecture University | Detection of bacteria belonging to the genus Campylobacter by targeting cytolethal distending toxin |
| US8637249B2 (en) | 2008-11-14 | 2014-01-28 | Gen-Probe Incorporated | Compositions, kits and methods for detection of Campylobacter nucleic acid |
| US9200330B2 (en) | 2007-08-24 | 2015-12-01 | Osaka Prefecture University | Detection of bacteria belonging to the genus Campylobacter by targeting cytolethal distending toxin |
-
1992
- 1992-01-24 JP JP3446492A patent/JPH0690795A/ja active Pending
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7563594B2 (en) | 2003-12-05 | 2009-07-21 | Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd. | Cytolethal distending toxins and detection of Campylobacter bacteria using the same as a target |
| US8168408B2 (en) | 2003-12-05 | 2012-05-01 | Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd. | Cytolethal distending toxins and detection of Campylobacter bacteria using the same as a target |
| US8343723B2 (en) | 2003-12-05 | 2013-01-01 | Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd. | Cytolethal distending toxins and detection of Campylobacter bacteria using the same as a target |
| US8354500B2 (en) | 2003-12-05 | 2013-01-15 | Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd. | Cytolethal distending toxins and detection of campylobacter bacteria using the same as a target |
| JP2006336924A (ja) * | 2005-06-01 | 2006-12-14 | Michihisa Tsutahara | 真空乾燥装置 |
| JP4598605B2 (ja) * | 2005-06-01 | 2010-12-15 | 道久 蔦原 | 真空乾燥装置 |
| US9200330B2 (en) | 2007-08-24 | 2015-12-01 | Osaka Prefecture University | Detection of bacteria belonging to the genus Campylobacter by targeting cytolethal distending toxin |
| US8586327B2 (en) | 2007-08-31 | 2013-11-19 | Osaka Prefecture University | Detection of bacteria belonging to the genus Campylobacter by targeting cytolethal distending toxin |
| US9663828B2 (en) | 2007-08-31 | 2017-05-30 | Osaka Prefecture University Public Corporation | Detection of bacteria belonging to the genus Campylobacter by targeting cytolethal distending toxin |
| US8637249B2 (en) | 2008-11-14 | 2014-01-28 | Gen-Probe Incorporated | Compositions, kits and methods for detection of Campylobacter nucleic acid |
| US9175353B2 (en) | 2008-11-14 | 2015-11-03 | Gen-Probe Incorporated | Compositions, kits and methods for detection of campylobacter nucleic acid |
| US10829824B2 (en) | 2008-11-14 | 2020-11-10 | Gen-Probe Incorporated | Compositions, kits and methods for detection of campylobacter nucleic acid |
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