JPH1189600A - 核酸配列の増幅および検出 - Google Patents
核酸配列の増幅および検出Info
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- JPH1189600A JPH1189600A JP10210957A JP21095798A JPH1189600A JP H1189600 A JPH1189600 A JP H1189600A JP 10210957 A JP10210957 A JP 10210957A JP 21095798 A JP21095798 A JP 21095798A JP H1189600 A JPH1189600 A JP H1189600A
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
- C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Abstract
(57)【要約】
【課題】 迅速かつ簡便に被検試料中の特定の核酸配列
を検出する方法を提供する。 【解決手段】 検出すべき配列に操作可能に結合したプ
ロモーターを含む２本鎖核酸の製造方法であって、 （a）オリゴヌクレオチドプロモーター−プライマーを
得； （b）プロモーター−プライマーと検出すべき核酸配列
とがハイブリダイズする条件下で、該プロモーター−プ
ライマーと該検出すべき配列を含有する核酸とを接触さ
せ、 （c）プロモーター−プライマーの３’末端から、検出
すべき核酸配列に相補的な伸長産物を製造させ； （d）工程(c)の産物を３'−５'エキソヌクレアーゼ活性
を有する物質と接触させ； （e)プロモーター−プライマーのプロモーターと相補的
な伸長産物を、検出すべき配列の３’末端から合成する
ことからなる方法。
を検出する方法を提供する。 【解決手段】 検出すべき配列に操作可能に結合したプ
ロモーターを含む２本鎖核酸の製造方法であって、 （a）オリゴヌクレオチドプロモーター−プライマーを
得； （b）プロモーター−プライマーと検出すべき核酸配列
とがハイブリダイズする条件下で、該プロモーター−プ
ライマーと該検出すべき配列を含有する核酸とを接触さ
せ、 （c）プロモーター−プライマーの３’末端から、検出
すべき核酸配列に相補的な伸長産物を製造させ； （d）工程(c)の産物を３'−５'エキソヌクレアーゼ活性
を有する物質と接触させ； （e)プロモーター−プライマーのプロモーターと相補的
な伸長産物を、検出すべき配列の３’末端から合成する
ことからなる方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、核酸配列の増幅お
よび検出方法、さらに詳しくは、被検試料中の核酸配列
を特異的かつ定量的に増幅させることにより、偽陽性お
よび、さもなくば既存の方法に付随する不正確な結果等
の問題を回避し、所望の配列の検出感度を向上させるこ
とを特徴とする核酸配列の増幅および検出方法に関す
る。
よび検出方法、さらに詳しくは、被検試料中の核酸配列
を特異的かつ定量的に増幅させることにより、偽陽性お
よび、さもなくば既存の方法に付随する不正確な結果等
の問題を回避し、所望の配列の検出感度を向上させるこ
とを特徴とする核酸配列の増幅および検出方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】最近の分子生物学の一般的な分野におけ
る発達により臨床および商業上重要な特定の核酸配列を
検出することが可能となった。例えば、様々なヒト遺伝
子の核酸配列の分析によって、特定の疾患と関連して特
有の変化が存在することが明らかになった。同様に、各
微生物を特異的に特徴づけ、それらを極く近縁種のもの
からさえも区別し得る、種々の病原体ゲノムの配列が同
定された。それらの配列に関する情報を利用すること
で、遺伝子レベルでの疾患の診断が可能となった。特定
の核酸配列を検出する最も一般的な方法はハイブリダイ
ゼーション(ハイブリッド形成法)である。この方法は核
酸が相補的な核酸配列と安定な非共有結合性の複合体
(コンプレックス)を形成し得るという点を利用したもの
である。被検試料中に特定の核酸配列が存在するか否か
を決定するには、相補的な核酸プローブを調製し、検出
可能な化学的修飾によって標識した後、被検試料に加え
る。検出すべき配列が存在する場合、標識したプローブ
がそれとハイブリダイズし、その標識が、ハイブリダイ
ゼーションの生起の有無および程度を既知の方法で決定
する手段を与える。
る発達により臨床および商業上重要な特定の核酸配列を
検出することが可能となった。例えば、様々なヒト遺伝
子の核酸配列の分析によって、特定の疾患と関連して特
有の変化が存在することが明らかになった。同様に、各
微生物を特異的に特徴づけ、それらを極く近縁種のもの
からさえも区別し得る、種々の病原体ゲノムの配列が同
定された。それらの配列に関する情報を利用すること
で、遺伝子レベルでの疾患の診断が可能となった。特定
の核酸配列を検出する最も一般的な方法はハイブリダイ
ゼーション(ハイブリッド形成法)である。この方法は核
酸が相補的な核酸配列と安定な非共有結合性の複合体
(コンプレックス)を形成し得るという点を利用したもの
である。被検試料中に特定の核酸配列が存在するか否か
を決定するには、相補的な核酸プローブを調製し、検出
可能な化学的修飾によって標識した後、被検試料に加え
る。検出すべき配列が存在する場合、標識したプローブ
がそれとハイブリダイズし、その標識が、ハイブリダイ
ゼーションの生起の有無および程度を既知の方法で決定
する手段を与える。
【０００３】現在のハイブリダイセーション法を被検試
料中の核酸配列を決定するために用いることは、それが
充分に高感度でなく特定の核酸配列の存在を正確に証明
するにはかなり多量の被検試料を要するという点で根本
的に限界がある。このような限界は、通常、分析用とし
て得られる試料の量が限られている臨床面での実用化に
とって重大な限界である。従って、被検試料中の特定の
核酸配列を検出するためのハイブリダイセーション法の
感度を高める方法を開発し、該方法の診断技術面での利
用を拡大することが注目されていた。一般的なハイブリ
ダイセーション法の感度の改善法の１つはハイブリダイ
ゼーションプローブによって生成されるシグナルを増大
することであった。例えば、ニックトランスレーション
［リグビィら(Ｒigby)、ジャーナル・オブ・モレキュラ
ー・バイオロジー(Ｊ.Ｍol.Ｂiol.)、１１３：２３７
(１９７７)]またはＳＰ６転写[メルトンら(Ｍelton)、
ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Ｎuc.ＡcidsＲe
s.)、１２：７０３５(１９８４)]により、高い比活性の
放射能で標識された核酸プローブの調製法が報告されて
いる。
料中の核酸配列を決定するために用いることは、それが
充分に高感度でなく特定の核酸配列の存在を正確に証明
するにはかなり多量の被検試料を要するという点で根本
的に限界がある。このような限界は、通常、分析用とし
て得られる試料の量が限られている臨床面での実用化に
とって重大な限界である。従って、被検試料中の特定の
核酸配列を検出するためのハイブリダイセーション法の
感度を高める方法を開発し、該方法の診断技術面での利
用を拡大することが注目されていた。一般的なハイブリ
ダイセーション法の感度の改善法の１つはハイブリダイ
ゼーションプローブによって生成されるシグナルを増大
することであった。例えば、ニックトランスレーション
［リグビィら(Ｒigby)、ジャーナル・オブ・モレキュラ
ー・バイオロジー(Ｊ.Ｍol.Ｂiol.)、１１３：２３７
(１９７７)]またはＳＰ６転写[メルトンら(Ｍelton)、
ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Ｎuc.ＡcidsＲe
s.)、１２：７０３５(１９８４)]により、高い比活性の
放射能で標識された核酸プローブの調製法が報告されて
いる。
【０００４】シナイダーら(Ｓchneider)[ＰＣＴ国際特
許出願公開Ｎo.ＷＯ８７／０３６２２]は、ハイブリダ
イゼーションにより生成したシグナルを増幅する手段と
して、目的のＤＮＡまたはＲＮＡ配列とハイブリダイズ
している第１プローブの各々と結合可能な複数のシグナ
ル産生性第２プローブ群を使用することについて報告し
ている。チュら(Ｃhu)[ＰＣＴ国際特許出願公開Ｎo.ＷＯ
８７／０６２７０]は核酸ハイブリダイゼーションプロ
ーブとして“複製可能なＲＮＡ"を単独で、または親和
性分子と一緒に使用し、さらに、ＲＮＡを複製し、それ
によって産生されるシグナルを増加するためにＲＮＡ依
存性のＲＮＡポリメラーゼを使用することについて報告
している。
許出願公開Ｎo.ＷＯ８７／０３６２２]は、ハイブリダ
イゼーションにより生成したシグナルを増幅する手段と
して、目的のＤＮＡまたはＲＮＡ配列とハイブリダイズ
している第１プローブの各々と結合可能な複数のシグナ
ル産生性第２プローブ群を使用することについて報告し
ている。チュら(Ｃhu)[ＰＣＴ国際特許出願公開Ｎo.ＷＯ
８７／０６２７０]は核酸ハイブリダイゼーションプロ
ーブとして“複製可能なＲＮＡ"を単独で、または親和
性分子と一緒に使用し、さらに、ＲＮＡを複製し、それ
によって産生されるシグナルを増加するためにＲＮＡ依
存性のＲＮＡポリメラーゼを使用することについて報告
している。
【０００５】ロドランドら(Ｒodland)[米国特許出願Ｎ
o.第４,６４７,５２９号]はハイブリダイゼーションプ
ローブに取り込まれた場合にプローブと検出すべき核酸
配列との結合量を増加させるチオヌクレオチドの使用に
ついて報告している。プローブ検出法の感度の向上にか
なりの努力が払われたのに対して被検試料中の検出すべ
き核酸配列を増幅させて現在利用可能なハイブリダイゼ
ーション法によって検出するのに充分な量の配列を生産
する方法に向けてなされた研究は殆どなかった。ムリス
ら(Ｍullis)[米国特許出願Ｎo.第４,６８３,１９５号]
は２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて被検試
料中の特定の核酸配列を増幅する方法およびプライマー
伸長産物の合成に関して教示している。１つのプライマ
ーの伸長産物は、もう１つのプライマーとハイブリダイ
ズした場合に所望の特定の核酸配列を生産するための鋳
型となり、またその逆の関係が成り立ち、特定の配列が
所望の量、生産されるまでこの工程が繰り返される。
o.第４,６４７,５２９号]はハイブリダイゼーションプ
ローブに取り込まれた場合にプローブと検出すべき核酸
配列との結合量を増加させるチオヌクレオチドの使用に
ついて報告している。プローブ検出法の感度の向上にか
なりの努力が払われたのに対して被検試料中の検出すべ
き核酸配列を増幅させて現在利用可能なハイブリダイゼ
ーション法によって検出するのに充分な量の配列を生産
する方法に向けてなされた研究は殆どなかった。ムリス
ら(Ｍullis)[米国特許出願Ｎo.第４,６８３,１９５号]
は２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて被検試
料中の特定の核酸配列を増幅する方法およびプライマー
伸長産物の合成に関して教示している。１つのプライマ
ーの伸長産物は、もう１つのプライマーとハイブリダイ
ズした場合に所望の特定の核酸配列を生産するための鋳
型となり、またその逆の関係が成り立ち、特定の配列が
所望の量、生産されるまでこの工程が繰り返される。
【０００６】ムリスらは、非相補配列と結合したプライ
マーを用い、この増幅法によって大量の組換え核酸を調
製することも教示している。ムリスらはプロモーター、
リンカーまたは暗号配列のための核酸配列をプライマー
の１方または両方に連結し、被検試料の核酸配列と非相
補性配列とを一緒に増幅させる方法を開示した。このよ
うにして、選択された外因性の核酸配列と結合した既存
の被検核酸配列からなる組換え核酸が大量に生産され
る。従って、ムリスらの方法の原理は、相補的なプライ
マー伸長産物の形で所望の核酸配列を増幅することにあ
る。形成された各プライマー伸長産物がさらに他のプラ
イマー伸長生産における鋳型となるので、ムリスらのプ
ライマー伸長法を複数回繰り返すことにより、理論上、
反応サイクルの回数に対して指数関数的な速度で所望の
配列が蓄積されることになる。これに対し、目的物でな
い、プライマーハイブリダイゼーション副産物は自己触
媒作用をしないと思われるので、直線的な速度で蓄積さ
れる。このように、ムリスらの方法の特異性および精度
は、厳密に、副産物の合成速度に対する所望の核酸配列
の相対的合成速度の実質的な増大にかかっている。しか
しながら、実際には、副産物の蓄積は理論的な計算から
予測される速度よりもはるかに早く進むことが観察され
ている。例えばムリスらはヒトゲノムＤＮＡを含有する
試料中に存在するヒトベータ−ヘモグロビン遺伝子部分
を増幅させるためにこの方法を用い、ゲノム内の他の配
列の増幅により、所望の配列に相当する増幅配列の最終
的な割合は１％にすぎないという結果を認めた。
マーを用い、この増幅法によって大量の組換え核酸を調
製することも教示している。ムリスらはプロモーター、
リンカーまたは暗号配列のための核酸配列をプライマー
の１方または両方に連結し、被検試料の核酸配列と非相
補性配列とを一緒に増幅させる方法を開示した。このよ
うにして、選択された外因性の核酸配列と結合した既存
の被検核酸配列からなる組換え核酸が大量に生産され
る。従って、ムリスらの方法の原理は、相補的なプライ
マー伸長産物の形で所望の核酸配列を増幅することにあ
る。形成された各プライマー伸長産物がさらに他のプラ
イマー伸長生産における鋳型となるので、ムリスらのプ
ライマー伸長法を複数回繰り返すことにより、理論上、
反応サイクルの回数に対して指数関数的な速度で所望の
配列が蓄積されることになる。これに対し、目的物でな
い、プライマーハイブリダイゼーション副産物は自己触
媒作用をしないと思われるので、直線的な速度で蓄積さ
れる。このように、ムリスらの方法の特異性および精度
は、厳密に、副産物の合成速度に対する所望の核酸配列
の相対的合成速度の実質的な増大にかかっている。しか
しながら、実際には、副産物の蓄積は理論的な計算から
予測される速度よりもはるかに早く進むことが観察され
ている。例えばムリスらはヒトゲノムＤＮＡを含有する
試料中に存在するヒトベータ−ヘモグロビン遺伝子部分
を増幅させるためにこの方法を用い、ゲノム内の他の配
列の増幅により、所望の配列に相当する増幅配列の最終
的な割合は１％にすぎないという結果を認めた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】ムリスらの方法で所望
の核酸配列以外の核酸配列が増幅した程度から、この方
法は実際に被検試料中に存在する所望の核酸配列よりも
多くを検出し、偽陽性の結果を与えることになる。従っ
て、本発明は被検試料中の核酸配列を特異的かつ定量的
に増幅させることにより、偽陽性および、さもなくば既
存の方法に付随する不正確な結果等の問題を回避し、所
望の配列の検出感度を向上させる方法を提供することを
目的とするものである。さらにムリスらの方法は複数回
のプライマーハイブリダイゼーションおよびプライマー
伸長合成のサイクルを想定したものであるために面倒な
作業を要するかまたは自動化(オートメーション化)のた
めの経費が必要である。ムリスらの方法の自動化には、
特殊な装置のみならず特殊な試薬、熱的に安定なＤＮＡ
ポリメラーゼを必要とし、さらにプライマーハイブリダ
イゼーションおよびプライマー伸長合成工程を連続的に
行うために、各分析試験系に合わせて反応条件を設定す
る必要がある。従って、本発明は、費用および工程の繰
り返し、特別の装置および試薬、あるいは異なる被検試
料ごとに反応条件を変更しなければならない繁雑さを必
要とせず、迅速かつ簡便に被検試料中の特定の核酸配列
を検出する方法を提供することを目的とするものであ
る。
の核酸配列以外の核酸配列が増幅した程度から、この方
法は実際に被検試料中に存在する所望の核酸配列よりも
多くを検出し、偽陽性の結果を与えることになる。従っ
て、本発明は被検試料中の核酸配列を特異的かつ定量的
に増幅させることにより、偽陽性および、さもなくば既
存の方法に付随する不正確な結果等の問題を回避し、所
望の配列の検出感度を向上させる方法を提供することを
目的とするものである。さらにムリスらの方法は複数回
のプライマーハイブリダイゼーションおよびプライマー
伸長合成のサイクルを想定したものであるために面倒な
作業を要するかまたは自動化(オートメーション化)のた
めの経費が必要である。ムリスらの方法の自動化には、
特殊な装置のみならず特殊な試薬、熱的に安定なＤＮＡ
ポリメラーゼを必要とし、さらにプライマーハイブリダ
イゼーションおよびプライマー伸長合成工程を連続的に
行うために、各分析試験系に合わせて反応条件を設定す
る必要がある。従って、本発明は、費用および工程の繰
り返し、特別の装置および試薬、あるいは異なる被検試
料ごとに反応条件を変更しなければならない繁雑さを必
要とせず、迅速かつ簡便に被検試料中の特定の核酸配列
を検出する方法を提供することを目的とするものであ
る。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明の目的は、（a）
検出すべき配列とプロモーターとを含有する２本鎖核酸
を合成し、（b）該プロモーターのコントロール下で該
２本鎖核酸から複数個のＲＮＡ転写物を合成し、（c）
工程(b)で得たＲＮＡ転写物の存在を測定し、さらに
（d）該ＲＮＡ転写物の存在を、検出すべき核酸配列の
存在に関係づけることからなる方法によって達成され
た。さらに実施態様において、上記工程(a)の核酸を、
（１）プライマーと結合したプロモーターを含むオリゴ
ヌクレオチド、プロモーター−プライマーを得、（２）
検出すべき核酸配列にプロモーター−プライマーがハイ
ブリダイズする条件下で被検試料とプロモーター−プラ
イマーとを接触させ、さらに（３）工程(２)においてプ
ロモーター−プライマーがハイブリダイズした被検試料
核酸配列を鋳型とし、検出すべき核酸配列と相補的な伸
長産物をプロモーター−プライマーから合成することか
らなる方法で調製することを含む方法によって本発明目
的はより高く、達成される。
検出すべき配列とプロモーターとを含有する２本鎖核酸
を合成し、（b）該プロモーターのコントロール下で該
２本鎖核酸から複数個のＲＮＡ転写物を合成し、（c）
工程(b)で得たＲＮＡ転写物の存在を測定し、さらに
（d）該ＲＮＡ転写物の存在を、検出すべき核酸配列の
存在に関係づけることからなる方法によって達成され
た。さらに実施態様において、上記工程(a)の核酸を、
（１）プライマーと結合したプロモーターを含むオリゴ
ヌクレオチド、プロモーター−プライマーを得、（２）
検出すべき核酸配列にプロモーター−プライマーがハイ
ブリダイズする条件下で被検試料とプロモーター−プラ
イマーとを接触させ、さらに（３）工程(２)においてプ
ロモーター−プライマーがハイブリダイズした被検試料
核酸配列を鋳型とし、検出すべき核酸配列と相補的な伸
長産物をプロモーター−プライマーから合成することか
らなる方法で調製することを含む方法によって本発明目
的はより高く、達成される。
【０００９】さらに他の実施態様として、工程(a)の核
酸を、（１）プライマーと結合したプロモーターからな
るオリゴヌクレオチド、プロモーター−プライマーおよ
びオリゴヌクレオチド第２プライマーであって、これら
プライマーは互いに相補的でなく、しかも１方のプライ
マーから合成された伸長産物をその相補体から分離した
ときに、それがもう１方のプライマーの伸長産物の合成
における鋳型となるよう選択されているものを得、
（２）プロモーター−プライマー伸長産物が合成される
ハイブリダイゼーション条件下でプロモーター−プライ
マーに被検試料を接触させ、さらに（３）第２プライマ
ーの伸長産物が合成されるハイブリダイゼーション条件
下で被検試料を接触させることからなる方法で得ること
からなる方法によっても、本発明の目的は達成される。
酸を、（１）プライマーと結合したプロモーターからな
るオリゴヌクレオチド、プロモーター−プライマーおよ
びオリゴヌクレオチド第２プライマーであって、これら
プライマーは互いに相補的でなく、しかも１方のプライ
マーから合成された伸長産物をその相補体から分離した
ときに、それがもう１方のプライマーの伸長産物の合成
における鋳型となるよう選択されているものを得、
（２）プロモーター−プライマー伸長産物が合成される
ハイブリダイゼーション条件下でプロモーター−プライ
マーに被検試料を接触させ、さらに（３）第２プライマ
ーの伸長産物が合成されるハイブリダイゼーション条件
下で被検試料を接触させることからなる方法で得ること
からなる方法によっても、本発明の目的は達成される。
【００１０】本発明は被検試料中の特定の核酸配列の存
在を測定する方法の改良法および本発明の実施に必要な
試薬を含有するキットを提供するものである。総括する
と、本発明方法は、検出すべき核酸配列とプロモーター
とを含有する２本鎖核酸の合成、そのプロモーターのコ
ントロール下での複数個の様々なＲＮＡ転写物の合成、
および産生された特定のＲＮＡ転写物の検出を含む。Ｄ
ＮＡプライマー伸長産物の形でなくＲＮＡ転写物の形で
増幅させることの利点は、ポリメライゼーションのため
の酵素とリボヌクレオシド三りん酸の存在下においてＲ
ＮＡ転写物の合成は連続的に起こるので、極めて、また
本質的に誤りを生じやすいプライマーハイブリダイゼー
ション反応を何度も繰り返さずに、検出すべき核酸配列
を任意の所望のレベルにまで増幅させることができると
いう点にある。
在を測定する方法の改良法および本発明の実施に必要な
試薬を含有するキットを提供するものである。総括する
と、本発明方法は、検出すべき核酸配列とプロモーター
とを含有する２本鎖核酸の合成、そのプロモーターのコ
ントロール下での複数個の様々なＲＮＡ転写物の合成、
および産生された特定のＲＮＡ転写物の検出を含む。Ｄ
ＮＡプライマー伸長産物の形でなくＲＮＡ転写物の形で
増幅させることの利点は、ポリメライゼーションのため
の酵素とリボヌクレオシド三りん酸の存在下においてＲ
ＮＡ転写物の合成は連続的に起こるので、極めて、また
本質的に誤りを生じやすいプライマーハイブリダイゼー
ション反応を何度も繰り返さずに、検出すべき核酸配列
を任意の所望のレベルにまで増幅させることができると
いう点にある。
【００１１】本明細書中、“プロモーター"という語句
はそれにＲＮＡポリメラーゼ酵素が結合し、ＲＮＡ転写
物の合成を開始する核酸配列を意味する。プロモーター
は専用の(dedicated)プロモーターであり、ＲＮＡポリ
メラーゼは専用のＲＮＡポリメラーゼであることが好ま
しい。“専用の"という語句はそのプロモーターが、実
質上、分析すべき被検試料中に通常存在しているポリメ
ラーゼ以外の、１つのＲＮＡポリメラーゼによってのみ
認識されるものであることを意味する。同様に、“専用
のＲＮＡポリメラーゼ"は被検試料中に存在する他のプ
ロモーターと比較したとき、専ら、あるいは優先的に専
用のプロモーターと結合し、プロモーターの下流に位置
する核酸のＲＮＡ転写物を合成する。専用のプロモータ
ーと専用のＲＮＡポリメラーゼとの組み合わせにより、
通常でない、特異的なプロモーター−ＲＮＡポリメラー
ゼ相互反応が起きる。
はそれにＲＮＡポリメラーゼ酵素が結合し、ＲＮＡ転写
物の合成を開始する核酸配列を意味する。プロモーター
は専用の(dedicated)プロモーターであり、ＲＮＡポリ
メラーゼは専用のＲＮＡポリメラーゼであることが好ま
しい。“専用の"という語句はそのプロモーターが、実
質上、分析すべき被検試料中に通常存在しているポリメ
ラーゼ以外の、１つのＲＮＡポリメラーゼによってのみ
認識されるものであることを意味する。同様に、“専用
のＲＮＡポリメラーゼ"は被検試料中に存在する他のプ
ロモーターと比較したとき、専ら、あるいは優先的に専
用のプロモーターと結合し、プロモーターの下流に位置
する核酸のＲＮＡ転写物を合成する。専用のプロモータ
ーと専用のＲＮＡポリメラーゼとの組み合わせにより、
通常でない、特異的なプロモーター−ＲＮＡポリメラー
ゼ相互反応が起きる。
【００１２】一般に、専用のプロモーターと専用のＲＮ
Ａポリメラーゼとは、例えばバクテリオファージＴ７ま
たはバクテリオファージＳＰ６等、同じ供給源から得ら
れる。Ｔ７およびＳＰ６の両者の場合、ファージがコー
ドしているＤＮＡポリメラーゼは同族起源のファージプ
ロモーターからのＲＮＡ転写物の合成を有効に開始す
る。他の原核性または真核性プロモーターからＲＮＡ転
写が開始されることは殆ど認められない。しかも、単塩
バッファー、２本鎖核酸鋳型、リボヌクレオシド三りん
酸およびファージＲＮＡポリメラーゼからなる転写反応
によって大量のＲＮＡが迅速に合成される。被検試料Ｄ
ＮＡに含まれる既知の任意の配列との偶発的なハイブリ
ダイゼーションを最小限に止めるよう、プロモーター
を、固有の配列から選択するか、そのヌクレオチド配列
を修飾することが好ましい。
Ａポリメラーゼとは、例えばバクテリオファージＴ７ま
たはバクテリオファージＳＰ６等、同じ供給源から得ら
れる。Ｔ７およびＳＰ６の両者の場合、ファージがコー
ドしているＤＮＡポリメラーゼは同族起源のファージプ
ロモーターからのＲＮＡ転写物の合成を有効に開始す
る。他の原核性または真核性プロモーターからＲＮＡ転
写が開始されることは殆ど認められない。しかも、単塩
バッファー、２本鎖核酸鋳型、リボヌクレオシド三りん
酸およびファージＲＮＡポリメラーゼからなる転写反応
によって大量のＲＮＡが迅速に合成される。被検試料Ｄ
ＮＡに含まれる既知の任意の配列との偶発的なハイブリ
ダイゼーションを最小限に止めるよう、プロモーター
を、固有の配列から選択するか、そのヌクレオチド配列
を修飾することが好ましい。
【００１３】本明細書中“プライマー"という語句は、
天然に存在するか、合成されたオリゴヌクレオチド配列
であって、検出すべき核酸配列の全体または一部と実質
上、ホモローガスであるか、または相補的な配列を指
す。プライマーは検出すべき配列またはその相補配列を
含有する鋳型核酸とハイブリダイズし、ポリメライゼー
ション用試薬の存在下で伸長産物の合成を開始(プライ
ム)するのに充分な長さでなければならない。プライマ
ーの正確な長さはハイブリダイゼーションおよびプライ
マー伸長合成反応の条件、並びに検出すべき特定の核酸
配列の組成などの様々な因子に左右される。通常、プラ
イマーは１０−２５またはそれ以上のヌクレオチドを含
有するが、それより少ないこともある。しかしながら、
プライマーは、検出すべき核酸配列またはその相補体の
配列を正確に反映したものである必要はない。例えば、
選択された条件下でプライマーが検出すべき核酸配列ま
たはその相補配列と特異的にハイブリダイズする限り、
プライマー内に非相補的な塩基が分散されていたり、プ
ライマーから相補的な塩基が欠失されていてもよい。
天然に存在するか、合成されたオリゴヌクレオチド配列
であって、検出すべき核酸配列の全体または一部と実質
上、ホモローガスであるか、または相補的な配列を指
す。プライマーは検出すべき配列またはその相補配列を
含有する鋳型核酸とハイブリダイズし、ポリメライゼー
ション用試薬の存在下で伸長産物の合成を開始(プライ
ム)するのに充分な長さでなければならない。プライマ
ーの正確な長さはハイブリダイゼーションおよびプライ
マー伸長合成反応の条件、並びに検出すべき特定の核酸
配列の組成などの様々な因子に左右される。通常、プラ
イマーは１０−２５またはそれ以上のヌクレオチドを含
有するが、それより少ないこともある。しかしながら、
プライマーは、検出すべき核酸配列またはその相補体の
配列を正確に反映したものである必要はない。例えば、
選択された条件下でプライマーが検出すべき核酸配列ま
たはその相補配列と特異的にハイブリダイズする限り、
プライマー内に非相補的な塩基が分散されていたり、プ
ライマーから相補的な塩基が欠失されていてもよい。
【００１４】本明細書中、“プロモーター−プライマ
ー"という語句はプライマーの５'末端にプロモーターが
結合してなる、天然に存在するまたは合成されたオリゴ
ヌクレオチドを指す。適当な条件下、ポリメライゼーシ
ョンのための試薬の存在下でプロモーター−プライマー
は、検出すべき核酸配列またはその相補配列と、プロモ
ーター−プライマーのプロモーターとを包含するプロモ
ーター−プライマー伸長物産生の開始点として作用する
ことができる。ハイブリダイゼーション効果を最大にす
るためには、プロモーター−プライマーは１本鎖である
ことが好ましいが、２本鎖であってもよい。２本鎖の場
合には、伸長産物の製造に用いる前に、まずプロモータ
ー−プライマーを処理してそのストランドを解く。
ー"という語句はプライマーの５'末端にプロモーターが
結合してなる、天然に存在するまたは合成されたオリゴ
ヌクレオチドを指す。適当な条件下、ポリメライゼーシ
ョンのための試薬の存在下でプロモーター−プライマー
は、検出すべき核酸配列またはその相補配列と、プロモ
ーター−プライマーのプロモーターとを包含するプロモ
ーター−プライマー伸長物産生の開始点として作用する
ことができる。ハイブリダイゼーション効果を最大にす
るためには、プロモーター−プライマーは１本鎖である
ことが好ましいが、２本鎖であってもよい。２本鎖の場
合には、伸長産物の製造に用いる前に、まずプロモータ
ー−プライマーを処理してそのストランドを解く。
【００１５】“第２プライマー"という語句は、天然に
存在するか、または合成されたオリゴヌクレオチドであ
って、適当な条件下、ポリメライゼーションのための試
薬の存在下で検出すべき核酸配列またはその相補配列を
含む第２プライマー伸長生産の開始点として作用するこ
とができるものを指す。ハイブリダイゼーション効果を
最大にするためには、第２プライマーは１本鎖であるこ
とが好ましいが、２本鎖であってもよい。２本鎖の場合
には、伸長産物の製造に用いる前に、まずプロモーター
−プライマーを処理してそのストランドを解く。第２プ
ライマーは、検出すべき核酸配列の全部または一部と実
質上、相補的であれば、いかなるヌクレオチド配列を含
有していてもよいが、プロモーター−プライマーの相補
配列でないように選択することが好ましい。
存在するか、または合成されたオリゴヌクレオチドであ
って、適当な条件下、ポリメライゼーションのための試
薬の存在下で検出すべき核酸配列またはその相補配列を
含む第２プライマー伸長生産の開始点として作用するこ
とができるものを指す。ハイブリダイゼーション効果を
最大にするためには、第２プライマーは１本鎖であるこ
とが好ましいが、２本鎖であってもよい。２本鎖の場合
には、伸長産物の製造に用いる前に、まずプロモーター
−プライマーを処理してそのストランドを解く。第２プ
ライマーは、検出すべき核酸配列の全部または一部と実
質上、相補的であれば、いかなるヌクレオチド配列を含
有していてもよいが、プロモーター−プライマーの相補
配列でないように選択することが好ましい。
【００１６】“プローブ"という語句は、検出すべき核
酸配列の全部または一部とホモローガスまたは相補的
な、天然に存在する、または合成されたオリゴヌクレオ
チドを指す。プローブは、適当な条件下、検出すべき核
酸配列のＲＮＡ転写物と特異的にハイブリダイズするこ
とができる。本明細書中、プライマーおよびプローブに
関して“オリゴヌクレオチド"という語句は２またはそ
れ以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオ
チドからなる分子を意味する。所望のオリゴヌクレオチ
ドは、例えば、天然に存在する核酸から精製する、ある
いは新たに合成する等、適当な方法で調製される。様々
な有機化学の技術を用い、ヌクレオシド誘導体からオリ
ゴヌクレオチドを合成することに関する幾つかの方法が
文献に記載されている。有機合成の１つの型はホスホト
リエステル法であり、この方法では、ヌクレオシド三り
ん酸エステルが結合して所望の配列を有するオリゴヌク
レオチドを形成する[ナラングら(Ｎarang)、Ｍeth.Ｅnz
ymol.、６８：９０(１９７９)]。ヌクレオシド二りん酸
[ブラウン(Ｂrown)、Ｍeth.Ｅnzymol.、６８：１０９
(１９７９)]、またはヌクレオシド・ホスホラミデート
[カルーサー(Ｃaruthers)、Ｍeth.Ｅnzymol.、１５４：
２８７(１９８５)]の使用を含む他の有機合成法が報告
されている。次いで、これらの方法のいずれかで合成さ
れたオリゴヌクレオチドを一緒にして、必要な長さおよ
び配列を有する任意の１本鎖オリゴヌクレオチドを形成
することができる。別法として、インビトロでの転写性
増幅、宿主細胞へのクローニング、あるいは適当な制限
酵素を使用して天然の供給源から回収することによりオ
リゴヌクレオチドを生産する。
酸配列の全部または一部とホモローガスまたは相補的
な、天然に存在する、または合成されたオリゴヌクレオ
チドを指す。プローブは、適当な条件下、検出すべき核
酸配列のＲＮＡ転写物と特異的にハイブリダイズするこ
とができる。本明細書中、プライマーおよびプローブに
関して“オリゴヌクレオチド"という語句は２またはそ
れ以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオ
チドからなる分子を意味する。所望のオリゴヌクレオチ
ドは、例えば、天然に存在する核酸から精製する、ある
いは新たに合成する等、適当な方法で調製される。様々
な有機化学の技術を用い、ヌクレオシド誘導体からオリ
ゴヌクレオチドを合成することに関する幾つかの方法が
文献に記載されている。有機合成の１つの型はホスホト
リエステル法であり、この方法では、ヌクレオシド三り
ん酸エステルが結合して所望の配列を有するオリゴヌク
レオチドを形成する[ナラングら(Ｎarang)、Ｍeth.Ｅnz
ymol.、６８：９０(１９７９)]。ヌクレオシド二りん酸
[ブラウン(Ｂrown)、Ｍeth.Ｅnzymol.、６８：１０９
(１９７９)]、またはヌクレオシド・ホスホラミデート
[カルーサー(Ｃaruthers)、Ｍeth.Ｅnzymol.、１５４：
２８７(１９８５)]の使用を含む他の有機合成法が報告
されている。次いで、これらの方法のいずれかで合成さ
れたオリゴヌクレオチドを一緒にして、必要な長さおよ
び配列を有する任意の１本鎖オリゴヌクレオチドを形成
することができる。別法として、インビトロでの転写性
増幅、宿主細胞へのクローニング、あるいは適当な制限
酵素を使用して天然の供給源から回収することによりオ
リゴヌクレオチドを生産する。
【００１７】本明細書中、“ＲＮＡ転写物"という語句
はプロモーター−プライマーのプロモーターのコントロ
ール下でＲＮＡポリメラーゼ酵素によって合成されたリ
ボ核酸分子を指す。検出すべき特定の核酸配列のＲＮＡ
転写物は、プロモーター−プライマーの性質により該配
列とホモローガスであるか相補的である。本明細書中、
“伸長産物"という語句は、プライマーがハイブリダイ
ズしている核酸分子を合成の鋳型として用い、プライマ
ーの３'ＯＨ末端から合成が開始される核酸分子を指
す。“ポリメライゼーション用試薬"という語句は、一
般に、既存の核酸を鋳型としてデオキシリボヌクレオチ
ドまたはリボヌクレオチドからの核酸の合成を触媒する
酵素を意味する。
はプロモーター−プライマーのプロモーターのコントロ
ール下でＲＮＡポリメラーゼ酵素によって合成されたリ
ボ核酸分子を指す。検出すべき特定の核酸配列のＲＮＡ
転写物は、プロモーター−プライマーの性質により該配
列とホモローガスであるか相補的である。本明細書中、
“伸長産物"という語句は、プライマーがハイブリダイ
ズしている核酸分子を合成の鋳型として用い、プライマ
ーの３'ＯＨ末端から合成が開始される核酸分子を指
す。“ポリメライゼーション用試薬"という語句は、一
般に、既存の核酸を鋳型としてデオキシリボヌクレオチ
ドまたはリボヌクレオチドからの核酸の合成を触媒する
酵素を意味する。
【００１８】被検試料としては、精製形または非精製形
の任意の起源の核酸を鋳型として用い得る。例えば、被
検試料は食物、農産物、あるいはヒトまたは動物の臨床
標本であってよい。通常、標本試料は、尿、血液、血
漿、血清、および啖などの生物学的な液体である。被検
試料中の検出すべき核酸は細菌、酵母、ウイルス、およ
び植物または動物などのより高等な生物に由来する細胞
または組織など、任意の源からのＤＮＡまたはメッセン
ジャーＲＮＡをも含むＲＮＡである。そのような核酸の
抽出および精製法は、例えば、マニアティス(Ｍaniati
s)[モレキュラー・クローニング(Ｍolecular Ｃlonin
g)：実験手引書(Ａ Ｌaboratory Ｍanual)、ニューヨー
ク、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
(１９８２)]によって報告された。
の任意の起源の核酸を鋳型として用い得る。例えば、被
検試料は食物、農産物、あるいはヒトまたは動物の臨床
標本であってよい。通常、標本試料は、尿、血液、血
漿、血清、および啖などの生物学的な液体である。被検
試料中の検出すべき核酸は細菌、酵母、ウイルス、およ
び植物または動物などのより高等な生物に由来する細胞
または組織など、任意の源からのＤＮＡまたはメッセン
ジャーＲＮＡをも含むＲＮＡである。そのような核酸の
抽出および精製法は、例えば、マニアティス(Ｍaniati
s)[モレキュラー・クローニング(Ｍolecular Ｃlonin
g)：実験手引書(Ａ Ｌaboratory Ｍanual)、ニューヨー
ク、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
(１９８２)]によって報告された。
【００１９】被検試料中の検出すべき核酸配列は最初か
ら分離した分子として存在し、検出すべき配列が全核酸
を構成していてもよく、あるいは大きい分子の単なる一
部分であってもよい。検出すべき核酸配列が最初から、
精製された形である必要はない。被検試料は検出すべき
核酸配列が少数部分である核酸複合体(コンプレックス)
混合物を含有するものであってもよい。例えば、検出す
べき核酸配列は全ヒトゲノムＤＮＡに含有された腫瘍遺
伝子、または臨床標本の少数部分である微生物、病原体
の核酸配列の一部に該当するものであってもよい。本発
明方法によれば、いかなる核酸配列をも検出することが
できる。配列の内、検出すべき核酸配列またはその相補
体とハイブリダイズし得る最小限１個、または好ましく
は２個のプライマーを調製するのに充分な数の配列中の
ヌクレオチドが分かっているだけで十分である。検出す
べき核酸配列は、例えば、任意の既知の核酸配列決定法
によって確かめるか、決定されたタンパク質配列に基づ
いて推測することができる。検出すべき核酸配列につい
ての知識が多いほど、選択されるプライマーの特異性が
より大きくなり、本発明方法の精度が一層高くなる。例
えば、選択された条件下、被検試料中の検出すべき核酸
配列またはその相補的配列とは特異的にハイブリダイズ
するが他の配列とはハイブリダイズしないプロモーター
−プライマーを選択し得るよう、充分な配列情報を入手
することが好ましい。プロモーター−プライマーと第２
プライマーの両方を用いるときは、検出すべき核酸配列
について、相互に相補的でないプライマーを選択し得る
だけの知識を得ることが望ましい。
ら分離した分子として存在し、検出すべき配列が全核酸
を構成していてもよく、あるいは大きい分子の単なる一
部分であってもよい。検出すべき核酸配列が最初から、
精製された形である必要はない。被検試料は検出すべき
核酸配列が少数部分である核酸複合体(コンプレックス)
混合物を含有するものであってもよい。例えば、検出す
べき核酸配列は全ヒトゲノムＤＮＡに含有された腫瘍遺
伝子、または臨床標本の少数部分である微生物、病原体
の核酸配列の一部に該当するものであってもよい。本発
明方法によれば、いかなる核酸配列をも検出することが
できる。配列の内、検出すべき核酸配列またはその相補
体とハイブリダイズし得る最小限１個、または好ましく
は２個のプライマーを調製するのに充分な数の配列中の
ヌクレオチドが分かっているだけで十分である。検出す
べき核酸配列は、例えば、任意の既知の核酸配列決定法
によって確かめるか、決定されたタンパク質配列に基づ
いて推測することができる。検出すべき核酸配列につい
ての知識が多いほど、選択されるプライマーの特異性が
より大きくなり、本発明方法の精度が一層高くなる。例
えば、選択された条件下、被検試料中の検出すべき核酸
配列またはその相補的配列とは特異的にハイブリダイズ
するが他の配列とはハイブリダイズしないプロモーター
−プライマーを選択し得るよう、充分な配列情報を入手
することが好ましい。プロモーター−プライマーと第２
プライマーの両方を用いるときは、検出すべき核酸配列
について、相互に相補的でないプライマーを選択し得る
だけの知識を得ることが望ましい。
【００２０】
【発明の実施の形態】第１図は１本鎖核酸中の検出すべ
特定の配列へのオリゴヌクレオチド、プロモーター−プ
ライマーのハイブリダイゼーション、検出すべき配列と
プロモーター−プライマーのプロモーターを含有する２
本鎖核酸の合成、およびプロモーターの制御下における
２本鎖核酸からの複数個のＲＮＡ転写物の合成を示す模
式図である。第２図は、本発明の１実施態様であって、
オリゴヌクレオチド、プロモーター−プライマーとオリ
ゴヌクレオチド、第２プライマーとを一緒に用い、検出
すべき核酸配列とプロモーター−プライマーのプロモー
ターとを含有する２本鎖核酸を製造することを含む実施
態様の模式図である。プロモーター−プライマーと、１
本鎖核酸中の検出すべき配列とがハイブリダイズし、プ
ロモーター−プライマー伸長産物の中の検出すべき配列
と相補的な配列に第２プライマーがハイブリダイズす
る。得られた生産物は２本鎖核酸であり、１本の鎖はオ
リゴヌクレオチド、プロモーター−プライマー伸長産物
を、もう１本の鎖はオリゴヌクレオチド、第２プライマ
ー伸長産物を含有しており、それから、プロモーターの
コントロール下でＲＮＡ転写物が産生される。第３図は
本発明の他の実施態様であって、オリゴヌクレオチド、
プロモーター−プライマーと、オリゴヌクレオチド、第
２プライマーとを一緒に用いることからなる実施態様の
模式図である。オリゴヌクレオチド、第２プライマーと
１本鎖核酸内の検出すべき配列とがハイブリダイズし、
オリゴヌクレオチド、プロモーター−プライマーと第２
プライマー伸長産物内の検出すべき配列に相補的な配列
とがハイブリダイズする。の構築の模式図である。第１
−３図記載の方法はいずれも、中核となる第１段階とし
て、検出すべき配列とプロモーターとを含有する２本鎖
核酸の製造工程を含む。一般に、この２本鎖核酸の調製
にはプライマーがハイブリダイズした１本鎖核酸を鋳型
として用いるプロモーター−プライマー伸長産物の合
成、および、場合によっては、第２プライマー伸長産物
の合成が含まれる。プロモーター−プライマーを単独で
用いるか、第２プライマーと併用するかによって、鋳型
は検出すべき配列を含有する被検試料核酸か、または先
に合成された検出すべき核酸配列の相補配列を含有する
プライマー伸長産物のいずれかで構成される。
特定の配列へのオリゴヌクレオチド、プロモーター−プ
ライマーのハイブリダイゼーション、検出すべき配列と
プロモーター−プライマーのプロモーターを含有する２
本鎖核酸の合成、およびプロモーターの制御下における
２本鎖核酸からの複数個のＲＮＡ転写物の合成を示す模
式図である。第２図は、本発明の１実施態様であって、
オリゴヌクレオチド、プロモーター−プライマーとオリ
ゴヌクレオチド、第２プライマーとを一緒に用い、検出
すべき核酸配列とプロモーター−プライマーのプロモー
ターとを含有する２本鎖核酸を製造することを含む実施
態様の模式図である。プロモーター−プライマーと、１
本鎖核酸中の検出すべき配列とがハイブリダイズし、プ
ロモーター−プライマー伸長産物の中の検出すべき配列
と相補的な配列に第２プライマーがハイブリダイズす
る。得られた生産物は２本鎖核酸であり、１本の鎖はオ
リゴヌクレオチド、プロモーター−プライマー伸長産物
を、もう１本の鎖はオリゴヌクレオチド、第２プライマ
ー伸長産物を含有しており、それから、プロモーターの
コントロール下でＲＮＡ転写物が産生される。第３図は
本発明の他の実施態様であって、オリゴヌクレオチド、
プロモーター−プライマーと、オリゴヌクレオチド、第
２プライマーとを一緒に用いることからなる実施態様の
模式図である。オリゴヌクレオチド、第２プライマーと
１本鎖核酸内の検出すべき配列とがハイブリダイズし、
オリゴヌクレオチド、プロモーター−プライマーと第２
プライマー伸長産物内の検出すべき配列に相補的な配列
とがハイブリダイズする。の構築の模式図である。第１
−３図記載の方法はいずれも、中核となる第１段階とし
て、検出すべき配列とプロモーターとを含有する２本鎖
核酸の製造工程を含む。一般に、この２本鎖核酸の調製
にはプライマーがハイブリダイズした１本鎖核酸を鋳型
として用いるプロモーター−プライマー伸長産物の合
成、および、場合によっては、第２プライマー伸長産物
の合成が含まれる。プロモーター−プライマーを単独で
用いるか、第２プライマーと併用するかによって、鋳型
は検出すべき配列を含有する被検試料核酸か、または先
に合成された検出すべき核酸配列の相補配列を含有する
プライマー伸長産物のいずれかで構成される。
【００２１】もしも鋳型が元々２本鎖核酸に含有されて
いたものであればプライマー伸長産物の合成の前、また
は同時に核酸ストランドを分離しなければならない。ス
トランドの分離は、被検試料を９０〜１００℃で約１〜
１０分間加熱して熱変成する方法によることが好ましい
が、他の物理的、化学的または酵素的な方法を使用する
こともできる。プライマーハイブリダイゼーションは、
通常、プライマーが、検出すべき核酸配列またはその相
補配列と特異的にハイブリダイズするが、他のいかなる
配列ともハイブリダイズしない、十分なストリンジェン
シーとなるよう、温度、塩濃度およびpＨに関する条件
を選択した緩衝化水溶液中で行う。一般に、プライマー
と鋳型とのハイブリダイゼーション効果は、加えられた
プライマーが鋳型に対して過剰モル、好ましくは１００
０〜１０6モル濃度過剰に存在するような条件下で促進
される。しかしながら、被検試料中の鋳型の量が不明の
場合には鋳型に対するプライマーの相対量も確実に決定
されないということは理解されるであろう。
いたものであればプライマー伸長産物の合成の前、また
は同時に核酸ストランドを分離しなければならない。ス
トランドの分離は、被検試料を９０〜１００℃で約１〜
１０分間加熱して熱変成する方法によることが好ましい
が、他の物理的、化学的または酵素的な方法を使用する
こともできる。プライマーハイブリダイゼーションは、
通常、プライマーが、検出すべき核酸配列またはその相
補配列と特異的にハイブリダイズするが、他のいかなる
配列ともハイブリダイズしない、十分なストリンジェン
シーとなるよう、温度、塩濃度およびpＨに関する条件
を選択した緩衝化水溶液中で行う。一般に、プライマー
と鋳型とのハイブリダイゼーション効果は、加えられた
プライマーが鋳型に対して過剰モル、好ましくは１００
０〜１０6モル濃度過剰に存在するような条件下で促進
される。しかしながら、被検試料中の鋳型の量が不明の
場合には鋳型に対するプライマーの相対量も確実に決定
されないということは理解されるであろう。
【００２２】第１Ａ−Ｇ図は、本発明の実施態様を示し
ており、プロモーター−プライマーを用いた、検出すべ
き配列とプロモーターとを含有する２本鎖核酸の調製を
示す図である。第１Ａ図では、プロモーター−プライマ
ーｃ、ｄのプライマーｃは、相補的なヌクレオチド配列
の非共有結合的な塩基対形成ｅを介して核酸ａの一部で
ある検出すべき核酸配列ｂとハイブリダイズしている。
プロモーター−プライマーのプロモーターｄは被検試料
中の既知の核酸配列のどれとも非相補的であるよう、好
適に選択されているのでハイブリダイズしないままであ
る。次いで、ヌクレオシド三りん酸の存在下、ポリヌク
レオチドポリメラーゼｆを加えると、最初にプライマー
がハイブリダイズした配列ｂの５'側に境界を接してい
る被検試料核酸配列ａを含有する１本鎖鋳型に沿って、
プライマーの３'末端から始まり、５'側に向けてプロモ
ーター−プライマー伸長産物が合成される(第１図１Ｂ
−Ｃ)。このようにプライマー伸長産物は、検出すべき
核酸配列およびもしあるならば、５'側に隣接する被検
試料核酸配列と相補的な２本鎖分子を形成する。
ており、プロモーター−プライマーを用いた、検出すべ
き配列とプロモーターとを含有する２本鎖核酸の調製を
示す図である。第１Ａ図では、プロモーター−プライマ
ーｃ、ｄのプライマーｃは、相補的なヌクレオチド配列
の非共有結合的な塩基対形成ｅを介して核酸ａの一部で
ある検出すべき核酸配列ｂとハイブリダイズしている。
プロモーター−プライマーのプロモーターｄは被検試料
中の既知の核酸配列のどれとも非相補的であるよう、好
適に選択されているのでハイブリダイズしないままであ
る。次いで、ヌクレオシド三りん酸の存在下、ポリヌク
レオチドポリメラーゼｆを加えると、最初にプライマー
がハイブリダイズした配列ｂの５'側に境界を接してい
る被検試料核酸配列ａを含有する１本鎖鋳型に沿って、
プライマーの３'末端から始まり、５'側に向けてプロモ
ーター−プライマー伸長産物が合成される(第１図１Ｂ
−Ｃ)。このようにプライマー伸長産物は、検出すべき
核酸配列およびもしあるならば、５'側に隣接する被検
試料核酸配列と相補的な２本鎖分子を形成する。
【００２３】３'−５'エキソヌクレアーゼ活性を有する
物質ｈの存在下、もしあるならば被検試料核酸の３'末
端側１本鎖配列を第１Ｄ図のように切断し、ポリヌクレ
オチドポリメラーゼｆにより、被検試料核酸配列の３'
末端でプロモーター−プライマーのプロモーターを鋳型
として開始され、合成された新しい核酸で置換する(第
１図Ｅ−Ｇ)。検出すべき配列とプロモーターを含有す
る２本鎖分子を生成する第１Ａ−Ｇ図の方法はプロモー
ター−プライマーと検出すべき核酸配列とのハイブリダ
イゼーション、およびその後の、プロモーター−プライ
マー伸長合成、核酸の切除、および置換合成からなる工
程によるものである。切除反応には、プロモーター−プ
ライマー伸長合成および置換合成に用いた試薬ｆと異な
る試薬ｈが使用されるが、２本鎖産物の合成が、プロモ
ーター−プライマーハイブリダイゼーションに続いて行
われるよう、単一の試薬を使用することが望ましい。従
って、ポリヌクレオチドポリメラーゼは、大腸菌のＤＮ
ＡポリメラーゼＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレ
ノウ断片、およびＴ４ＤＮＡポリメラーゼ等の５'−３'
ポリメラーゼ活性と３'−５'エキソヌクレアーゼ活性の
両者を有するものであることが好ましい。これらの酵素
はいずれもプライマー伸長合成に鋳型を必要とするの
で、それらを第１Ｂおよび第１Ｆ図記載の方法で使用す
るのに適切な場合は、検出すべき配列がＤＮＡである場
合である事が分かる。
物質ｈの存在下、もしあるならば被検試料核酸の３'末
端側１本鎖配列を第１Ｄ図のように切断し、ポリヌクレ
オチドポリメラーゼｆにより、被検試料核酸配列の３'
末端でプロモーター−プライマーのプロモーターを鋳型
として開始され、合成された新しい核酸で置換する(第
１図Ｅ−Ｇ)。検出すべき配列とプロモーターを含有す
る２本鎖分子を生成する第１Ａ−Ｇ図の方法はプロモー
ター−プライマーと検出すべき核酸配列とのハイブリダ
イゼーション、およびその後の、プロモーター−プライ
マー伸長合成、核酸の切除、および置換合成からなる工
程によるものである。切除反応には、プロモーター−プ
ライマー伸長合成および置換合成に用いた試薬ｆと異な
る試薬ｈが使用されるが、２本鎖産物の合成が、プロモ
ーター−プライマーハイブリダイゼーションに続いて行
われるよう、単一の試薬を使用することが望ましい。従
って、ポリヌクレオチドポリメラーゼは、大腸菌のＤＮ
ＡポリメラーゼＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレ
ノウ断片、およびＴ４ＤＮＡポリメラーゼ等の５'−３'
ポリメラーゼ活性と３'−５'エキソヌクレアーゼ活性の
両者を有するものであることが好ましい。これらの酵素
はいずれもプライマー伸長合成に鋳型を必要とするの
で、それらを第１Ｂおよび第１Ｆ図記載の方法で使用す
るのに適切な場合は、検出すべき配列がＤＮＡである場
合である事が分かる。
【００２４】検出すべき配列とプロモーターとを含有す
る２本鎖核酸は、検出すべき配列の複数個のＲＮＡ転写
物の供給源として作用する。第１Ｈ−Ｉ図に示すよう
に、被検試料に適当なＲＮＡポリメラーゼaaを加えると
２本鎖産物のプロモーターにＲＮＡポリメラーゼが結合
し、次いで、リボヌクレオシドトリホスファターゼの存
在下、検出すべき核酸配列をも含む、核酸配列のＲＮＡ
転写物がプロモーターの下流に位置して合成される。必
要な試薬の存在を含む、適当な条件下、ＲＮＡ転写物の
合成は連続的に、しかも元々被検試料中に存在していた
検出すべき核酸配列の量に比例して起こる。所望の量の
ＲＮＡ転写物を調製するために必要ならば試薬を追加し
てもよい。ＲＮＡ転写物の合成は、本質的でないリボヌ
クレアーゼ不純物(混在物)によって有り得る偶発的な転
写物の分解を避けるために、バナジル−リボヌクレオシ
ド複合体またはヒト胎盤リボヌクレアーゼ・インヒビタ
ーなどのリボヌクレアーゼ・インヒビターの存在下で行
うことが好ましい[バーガーら(Ｂerger)、Ｍeth.Ｅnzym
ol.、１５２：２２７(１９８７)；ド・マルチノフら(de
Ｍartynoff)、バイオケミカル・アンド・バイオフィジ
カル・リサーチ・コミュニケーションズ(Ｂiochem.Ｂio
phys.Ｒes.Ｃommun.)、９３：６４５(１９８０)；およ
びシールら(Ｓheel)、プロシーディングズ・オブ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンシィーズ(Ｐroc.
Ｎatl.Ａcad.Ｓci.)、７６：４８９８(１９７９)]。
る２本鎖核酸は、検出すべき配列の複数個のＲＮＡ転写
物の供給源として作用する。第１Ｈ−Ｉ図に示すよう
に、被検試料に適当なＲＮＡポリメラーゼaaを加えると
２本鎖産物のプロモーターにＲＮＡポリメラーゼが結合
し、次いで、リボヌクレオシドトリホスファターゼの存
在下、検出すべき核酸配列をも含む、核酸配列のＲＮＡ
転写物がプロモーターの下流に位置して合成される。必
要な試薬の存在を含む、適当な条件下、ＲＮＡ転写物の
合成は連続的に、しかも元々被検試料中に存在していた
検出すべき核酸配列の量に比例して起こる。所望の量の
ＲＮＡ転写物を調製するために必要ならば試薬を追加し
てもよい。ＲＮＡ転写物の合成は、本質的でないリボヌ
クレアーゼ不純物(混在物)によって有り得る偶発的な転
写物の分解を避けるために、バナジル−リボヌクレオシ
ド複合体またはヒト胎盤リボヌクレアーゼ・インヒビタ
ーなどのリボヌクレアーゼ・インヒビターの存在下で行
うことが好ましい[バーガーら(Ｂerger)、Ｍeth.Ｅnzym
ol.、１５２：２２７(１９８７)；ド・マルチノフら(de
Ｍartynoff)、バイオケミカル・アンド・バイオフィジ
カル・リサーチ・コミュニケーションズ(Ｂiochem.Ｂio
phys.Ｒes.Ｃommun.)、９３：６４５(１９８０)；およ
びシールら(Ｓheel)、プロシーディングズ・オブ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンシィーズ(Ｐroc.
Ｎatl.Ａcad.Ｓci.)、７６：４８９８(１９７９)]。
【００２５】産生された特異的なＲＮＡ転写物の測定
は、ＲＮＡ転写物をその合成の間、または合成後に検出
可能な部分で標識するか、検出すべき核酸配列のＲＮＡ
転写物と特異的にハイブリダイズすることができる標識
したプローブを用いて標識することにより行われる。Ｒ
ＮＡ転写物は、例えば、それ自身、検出可能な部分で標
識されており、ＲＮＡポリメラーゼの基質として利用さ
れ、そのことによりＲＮＡ転写物に組み込まれるリボヌ
クレオシド三りん酸を供給することによって標識され
る。検出可能な部分は直接または間接的に検出可能なシ
グナルを産生し得るものであればよい。例えば、１つの
態様として、検出可能な部分は32Ｐ、3Ｈ、14Ｃ、125Ｉ
および35Ｓ等の放射性同位元素であってよい。また別の
態様として、検出可能な部分は１またはそれ以上の適当
な試薬と相互反応したときに検出可能なシグナルを産生
する非放射能性の化学修飾である。即ち、例えば、検出
可能な部分はビオチンであってよく、ビオチン部分と、
アビジン、ストレプトアビジン、または抗ビオチン抗体
などビオチンと特異的に結合し得るタンパク質との複合
体の形成によって検出可能なシグナルが生成されるもの
であり、ここに、結合したタンパク質はフルオレスセイ
ン、または適当な基質と反応して蛍光、ルミネセンス、
または着色生成物を形成する酵素と抱合体を形成する
(コンジュゲートする)ものである[ランガーら(Ｌange
r)、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンシィーズ(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓc
i.)、７８：６６３３(１９８１)；ベイヤー(Ｂayer)お
よびウィルチェック(Ｗilchek)、Ｍeth.Ｂiochem.Ａna
l,、２６：１(１９８０)]。
は、ＲＮＡ転写物をその合成の間、または合成後に検出
可能な部分で標識するか、検出すべき核酸配列のＲＮＡ
転写物と特異的にハイブリダイズすることができる標識
したプローブを用いて標識することにより行われる。Ｒ
ＮＡ転写物は、例えば、それ自身、検出可能な部分で標
識されており、ＲＮＡポリメラーゼの基質として利用さ
れ、そのことによりＲＮＡ転写物に組み込まれるリボヌ
クレオシド三りん酸を供給することによって標識され
る。検出可能な部分は直接または間接的に検出可能なシ
グナルを産生し得るものであればよい。例えば、１つの
態様として、検出可能な部分は32Ｐ、3Ｈ、14Ｃ、125Ｉ
および35Ｓ等の放射性同位元素であってよい。また別の
態様として、検出可能な部分は１またはそれ以上の適当
な試薬と相互反応したときに検出可能なシグナルを産生
する非放射能性の化学修飾である。即ち、例えば、検出
可能な部分はビオチンであってよく、ビオチン部分と、
アビジン、ストレプトアビジン、または抗ビオチン抗体
などビオチンと特異的に結合し得るタンパク質との複合
体の形成によって検出可能なシグナルが生成されるもの
であり、ここに、結合したタンパク質はフルオレスセイ
ン、または適当な基質と反応して蛍光、ルミネセンス、
または着色生成物を形成する酵素と抱合体を形成する
(コンジュゲートする)ものである[ランガーら(Ｌange
r)、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンシィーズ(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓc
i.)、７８：６６３３(１９８１)；ベイヤー(Ｂayer)お
よびウィルチェック(Ｗilchek)、Ｍeth.Ｂiochem.Ａna
l,、２６：１(１９８０)]。
【００２６】他の実施態様においては、生産された特異
的なＲＮＡ転写物を核酸ハイブリダイゼーションプロー
ブを用いて測定する[ファルコウら(Ｆalkow)、米国特許
出願Ｎo.４,３５８,５３５、グッドソンら(Ｇodson)、
欧州特許出願Ｎo.０２３８３３２]。検出すべき核酸配
列と相補的またはホモローガスなＲＮＡ転写物の配列と
ハイブリダイズするように選択することが好ましい。ハ
イブリダイゼーション法は欧州特許公開Ｎo.７０,６８
５および７０,６８７記載の液相ハイブリダイゼーショ
ン法、および米国特許出願Ｎo.４,３５８,５３５(ファ
ルコウ)および４,６４７,５２９(ロドランド(Ｒodlan
d))、欧州特許出願Ｎo.０,２３８,３３２(グッドソ
ン)、およびランキら(Ｒanki)、Ｇene２１:７７(１９８
３)に記載の液−固相ハイブリダイゼーションなど、任
意の適当な方法で行うことができる。液−固ハイブリダ
イゼーションの場合には、プローブ分子またはＲＮＡ転
写物のいずれかを固体支持体に固定化すればよい。
的なＲＮＡ転写物を核酸ハイブリダイゼーションプロー
ブを用いて測定する[ファルコウら(Ｆalkow)、米国特許
出願Ｎo.４,３５８,５３５、グッドソンら(Ｇodson)、
欧州特許出願Ｎo.０２３８３３２]。検出すべき核酸配
列と相補的またはホモローガスなＲＮＡ転写物の配列と
ハイブリダイズするように選択することが好ましい。ハ
イブリダイゼーション法は欧州特許公開Ｎo.７０,６８
５および７０,６８７記載の液相ハイブリダイゼーショ
ン法、および米国特許出願Ｎo.４,３５８,５３５(ファ
ルコウ)および４,６４７,５２９(ロドランド(Ｒodlan
d))、欧州特許出願Ｎo.０,２３８,３３２(グッドソ
ン)、およびランキら(Ｒanki)、Ｇene２１:７７(１９８
３)に記載の液−固相ハイブリダイゼーションなど、任
意の適当な方法で行うことができる。液−固ハイブリダ
イゼーションの場合には、プローブ分子またはＲＮＡ転
写物のいずれかを固体支持体に固定化すればよい。
【００２７】例えば、定められた量の検出すべき配列ま
たは他の既知配列を含有する核酸標準と、被検試料中の
検出すべき配列の量を同時に測定する方法など、任意の
適当な方法を用いてＲＮＡ転写物の量と被検試料中の検
出すべき核酸配列の量とを関係づけることができる(ラ
ンキら、英国特許出願２１８７２８３Ａ)。また、本発
明の別の実施態様では、検出すべき配列とプロモーター
とを含有する２本鎖核酸の合成を、プロモーター−プラ
イマーと第２プライマーとを一緒に用いて互いにハイブ
リダイズし得る２個の異なるプライマー伸長産物の合成
を開始することにより行う。
たは他の既知配列を含有する核酸標準と、被検試料中の
検出すべき配列の量を同時に測定する方法など、任意の
適当な方法を用いてＲＮＡ転写物の量と被検試料中の検
出すべき核酸配列の量とを関係づけることができる(ラ
ンキら、英国特許出願２１８７２８３Ａ)。また、本発
明の別の実施態様では、検出すべき配列とプロモーター
とを含有する２本鎖核酸の合成を、プロモーター−プラ
イマーと第２プライマーとを一緒に用いて互いにハイブ
リダイズし得る２個の異なるプライマー伸長産物の合成
を開始することにより行う。
【００２８】第２Ａ−Ｆ図は、まずプロモーター−プラ
イマー伸長産物を合成し、次いで、第２プライマー伸長
産物を合成することからなる方法を示す図である。第２
Ａ図は、プロモーター−プライマーcdにおけるプライマ
ーｃが検出すべき核酸配列ｂの３'末端に結合し、相補
的なヌクレオチド配列の非共有結合的な塩基対形成ｅを
介してハイブリダイズしていることを示す図である。ヌ
クレオシド三りん酸の存在下、ポリメライゼーション用
の試薬ｆを加えると、１本鎖鋳型に沿って、プロモータ
ー−プライマーの３'末端から５'方向に伸長産物ｇの合
成が開始される。このようにして得られる生成物は１本
の鎖が被検試料核酸であり、他の鎖がプロモーター−プ
ライマー伸長産物ｇである２本鎖核酸である。
イマー伸長産物を合成し、次いで、第２プライマー伸長
産物を合成することからなる方法を示す図である。第２
Ａ図は、プロモーター−プライマーcdにおけるプライマ
ーｃが検出すべき核酸配列ｂの３'末端に結合し、相補
的なヌクレオチド配列の非共有結合的な塩基対形成ｅを
介してハイブリダイズしていることを示す図である。ヌ
クレオシド三りん酸の存在下、ポリメライゼーション用
の試薬ｆを加えると、１本鎖鋳型に沿って、プロモータ
ー−プライマーの３'末端から５'方向に伸長産物ｇの合
成が開始される。このようにして得られる生成物は１本
の鎖が被検試料核酸であり、他の鎖がプロモーター−プ
ライマー伸長産物ｇである２本鎖核酸である。
【００２９】次の工程(第２Ｄ図)では上記の方法の内、
任意の方法で２本鎖を分離して１本鎖分子を得る。この
鎖分離工程の後、第２プライマーとプロモーター−プラ
イマー伸長産物中の検出すべき配列と相補的な配列との
ハイブリダイゼーションに適した条件下、被検試料と第
２プライマーｈとを接触させる。しかしながら、分析の
正確さを増すためには第２プライマーとプロモーター−
プライマーとは相補的でないことが望ましいので、相補
配列の３'末端とハイブリダイズするように第２プライ
マーを選択することが好ましい(第２Ｅ図)。 プロモーター−プライマー伸長合成に用いたポリメライ
ゼーション用試薬ｆの継続的な存在下、またはポリメラ
イゼーション用試薬ｉの添加により、第２プライマーの
３'末端から、プロモーター−プライマー伸長産物鋳型
に沿って５'側に向かう第２プライマーの伸長産物の合
成が開始される(第２Ｆ図)。このように、第２プライマ
ー伸長産物はプロモーター−プライマー伸長産物と相補
的であり、それとハイブリダイズして検出すべき配列と
プロモーター−プライマーのプロモーターとを含有する
２本鎖核酸を形成する。
任意の方法で２本鎖を分離して１本鎖分子を得る。この
鎖分離工程の後、第２プライマーとプロモーター−プラ
イマー伸長産物中の検出すべき配列と相補的な配列との
ハイブリダイゼーションに適した条件下、被検試料と第
２プライマーｈとを接触させる。しかしながら、分析の
正確さを増すためには第２プライマーとプロモーター−
プライマーとは相補的でないことが望ましいので、相補
配列の３'末端とハイブリダイズするように第２プライ
マーを選択することが好ましい(第２Ｅ図)。 プロモーター−プライマー伸長合成に用いたポリメライ
ゼーション用試薬ｆの継続的な存在下、またはポリメラ
イゼーション用試薬ｉの添加により、第２プライマーの
３'末端から、プロモーター−プライマー伸長産物鋳型
に沿って５'側に向かう第２プライマーの伸長産物の合
成が開始される(第２Ｆ図)。このように、第２プライマ
ー伸長産物はプロモーター−プライマー伸長産物と相補
的であり、それとハイブリダイズして検出すべき配列と
プロモーター−プライマーのプロモーターとを含有する
２本鎖核酸を形成する。
【００３０】プロモーター−プライマー伸長産物の合成
に用いられるポリメライゼーション用試薬はエキソヌク
レアーゼ欠損Ｔ７ＤＮＡ[ターバー(Ｔabor)およびリチ
ャードソン(Ｒichardson)、プロシーディングズ・オブ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシィーズ
(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.)、８４：４７６７(１９８
７)]であることが好ましいが逆転写酵素やその他の３'
−５'エキソヌクレアーゼ活性を欠損したポリヌクレオ
チド・ポリメラーゼ等の他の試薬を用いることもでき
る。市販の３'−５'エキソヌクレアーゼ活性を欠損した
ポリメラーゼ[シークエナーゼTM(ＳequenaseTM)、ユナ
イテッド・ステイツ・バイオケミカル・コーポレイテッ
ド(Ｕnited Ｓtates Ｂiochemical Ｃorp.)、クリーブ
ランド(Ｃleveland)、オハイオ(Ｏhio)]は残存量の３'
−５'エキソヌクレアーゼ活性を有しており、例えば、
プロモーター−プライマーが結合している、被検試料デ
オキシリボ核酸のハイブリダイズされていない３'末端
は第２Ｄ図記載の鎖分離工程にかける前に切除されるよ
うな場合には望ましくない。このような現象は、被検試
料の核酸が機械的に剪断される場合や制限酵素消化によ
ってプロモーター−プライマーが結合する配列の３'側
に位置する被検試料の核酸配列の長さが短縮されるよう
な場合に起こり得ると予測される。
に用いられるポリメライゼーション用試薬はエキソヌク
レアーゼ欠損Ｔ７ＤＮＡ[ターバー(Ｔabor)およびリチ
ャードソン(Ｒichardson)、プロシーディングズ・オブ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシィーズ
(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.)、８４：４７６７(１９８
７)]であることが好ましいが逆転写酵素やその他の３'
−５'エキソヌクレアーゼ活性を欠損したポリヌクレオ
チド・ポリメラーゼ等の他の試薬を用いることもでき
る。市販の３'−５'エキソヌクレアーゼ活性を欠損した
ポリメラーゼ[シークエナーゼTM(ＳequenaseTM)、ユナ
イテッド・ステイツ・バイオケミカル・コーポレイテッ
ド(Ｕnited Ｓtates Ｂiochemical Ｃorp.)、クリーブ
ランド(Ｃleveland)、オハイオ(Ｏhio)]は残存量の３'
−５'エキソヌクレアーゼ活性を有しており、例えば、
プロモーター−プライマーが結合している、被検試料デ
オキシリボ核酸のハイブリダイズされていない３'末端
は第２Ｄ図記載の鎖分離工程にかける前に切除されるよ
うな場合には望ましくない。このような現象は、被検試
料の核酸が機械的に剪断される場合や制限酵素消化によ
ってプロモーター−プライマーが結合する配列の３'側
に位置する被検試料の核酸配列の長さが短縮されるよう
な場合に起こり得ると予測される。
【００３１】第２プライマー伸長産物の合成は第２プラ
イマーの３'末端から合成を開始し、プロモーター-プラ
イマー伸長産物鋳型に沿って５'方向に進行し得る任意
のポリメライゼーション用試薬を用いて行うことができ
る。この目的に適した酵素には、例えば、大腸菌ＤＮＡ
ポリメラーゼＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノ
ウ断片、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ
欠損Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、および逆転写酵素が含ま
れる。第３Ａ−Ｉ図は、まず第２プライマー伸長産物を
合成し、次いで、プロモーター−プライマー伸長産物を
合成することからなる方法を図示したものである。第３
Ａ図は、第２プライマーｃが、相補的なヌクレオチド配
列の非共有結合的塩基対ｄを介して検出すべき核酸配列
ｂの３'末端にハイブリダイズしている様子を示す図で
ある。ヌクレオシド三りん酸の存在下、ポリメライゼー
ション用の試薬ｅを加えると、１本鎖鋳型に沿って、第
２プライマーの３'末端から開始され５'方向に向けて伸
長産物ｆが合成される。このようにして得られる生成物
は１本の鎖が被検試料の核酸であり、他の鎖が第２プラ
イマー伸長産物である２本鎖核酸である(第３Ｃ図)。
イマーの３'末端から合成を開始し、プロモーター-プラ
イマー伸長産物鋳型に沿って５'方向に進行し得る任意
のポリメライゼーション用試薬を用いて行うことができ
る。この目的に適した酵素には、例えば、大腸菌ＤＮＡ
ポリメラーゼＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノ
ウ断片、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ
欠損Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、および逆転写酵素が含ま
れる。第３Ａ−Ｉ図は、まず第２プライマー伸長産物を
合成し、次いで、プロモーター−プライマー伸長産物を
合成することからなる方法を図示したものである。第３
Ａ図は、第２プライマーｃが、相補的なヌクレオチド配
列の非共有結合的塩基対ｄを介して検出すべき核酸配列
ｂの３'末端にハイブリダイズしている様子を示す図で
ある。ヌクレオシド三りん酸の存在下、ポリメライゼー
ション用の試薬ｅを加えると、１本鎖鋳型に沿って、第
２プライマーの３'末端から開始され５'方向に向けて伸
長産物ｆが合成される。このようにして得られる生成物
は１本の鎖が被検試料の核酸であり、他の鎖が第２プラ
イマー伸長産物である２本鎖核酸である(第３Ｃ図)。
【００３２】次の工程(第３Ｄ図)では上記の方法の内、
任意の方法で２本鎖を分離して１本鎖分子を得る。この
鎖分離工程の後、プロモーター−プライマーと第２プラ
イマー伸長産物の中の検出すべき配列と相補的な配列と
のハイブリダイゼーションに適した条件下、被検試料と
プロモーター−プライマーghとを接触させる。しかしな
がら、発明の精度の向上のためにはプロモーター−プラ
イマーと第２プライマーとが相補的でないことが望まし
いので、相補配列の３'末端とハイブリダイズするよう
にプロモーター−プライマーのプライマーを選択するこ
とが好ましい。第２プライマー伸長産物ｅの合成に用い
たポリメライゼーション用試薬ｆの継続的な存在下、ま
たはポリメライゼーション用試薬ｉの添加により、プロ
モーター−プライマーの３'末端から開始され、第２プ
ライマー伸長産物鋳型に沿って５'側に向かい、プロモ
ーター−プライマーの伸長産物ｊが合成される。プロモ
ーター−プライマー伸長産物は検出すべき核酸配列であ
って、第２プライマー伸長産物中の該配列に相補的な配
列とハイブリダイズする配列およびプロモーターを含有
している。このように、得られた生産物は検出すべき核
酸配列とプロモーター−プライマーのプロモーターとを
含有する２本鎖核酸である。
任意の方法で２本鎖を分離して１本鎖分子を得る。この
鎖分離工程の後、プロモーター−プライマーと第２プラ
イマー伸長産物の中の検出すべき配列と相補的な配列と
のハイブリダイゼーションに適した条件下、被検試料と
プロモーター−プライマーghとを接触させる。しかしな
がら、発明の精度の向上のためにはプロモーター−プラ
イマーと第２プライマーとが相補的でないことが望まし
いので、相補配列の３'末端とハイブリダイズするよう
にプロモーター−プライマーのプライマーを選択するこ
とが好ましい。第２プライマー伸長産物ｅの合成に用い
たポリメライゼーション用試薬ｆの継続的な存在下、ま
たはポリメライゼーション用試薬ｉの添加により、プロ
モーター−プライマーの３'末端から開始され、第２プ
ライマー伸長産物鋳型に沿って５'側に向かい、プロモ
ーター−プライマーの伸長産物ｊが合成される。プロモ
ーター−プライマー伸長産物は検出すべき核酸配列であ
って、第２プライマー伸長産物中の該配列に相補的な配
列とハイブリダイズする配列およびプロモーターを含有
している。このように、得られた生産物は検出すべき核
酸配列とプロモーター−プライマーのプロモーターとを
含有する２本鎖核酸である。
【００３３】３,−５,エキソヌクレアーゼ活性を有する
試薬ｋの存在下、もしあれば、プロモーター−プライマ
ー伸長産物の３'末端の１本鎖配列を切除し、プロモー
ター−プライマーのプロモーターを鋳型としてプロモー
ター−プライマー伸長産物の３'末端からポリメライゼ
ーション試薬ｉにより合成が開始されるプロモーター相
補配列によって置換する(第３Ｇ−Ｉ図)。第２プライマ
ー伸長産物の合成は第２プライマーの３'末端から合成
を開始し、被検試料の核酸配列の鋳型に沿って５'方向
に進行する任意のポリメライゼーション用試薬を用いて
行うことができる。この目的に適した酵素には、例え
ば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌ＤＮＡポリメ
ラーゼＩのクレノウ断片、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、エ
キソヌクレアーゼ欠損Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、および
逆転写酵素が含まれる。プロモーター−プライマー伸長
産物の合成およびプロモーター相補配列の合成は第２プ
ライマー伸長産物の合成に用いたポリメライゼーション
用試薬をも含めて、同一の試薬または異なる試薬を用い
て行うことができる。しかしながら、第３図記載の工程
を効率的に行うためには、プロモーター−プライマー伸
長産物の合成に使用する試薬が第３Ｇ図記載の切除反応
をも行って第２プライマー伸長産物のハイブリダイズし
ていない３'末端側の配列を除去し得るものであること
が好ましい。合成と切除反応の両方を行うのに適した酵
素には大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌ＤＮＡポリ
メラーゼＩのクレノウ断片およびＴ４ＤＮＡポリメラー
ゼなどの３'−５'エキソヌクレアーゼ活性を有するポリ
ヌクレオチド・ポリメラーゼが含まれる。
試薬ｋの存在下、もしあれば、プロモーター−プライマ
ー伸長産物の３'末端の１本鎖配列を切除し、プロモー
ター−プライマーのプロモーターを鋳型としてプロモー
ター−プライマー伸長産物の３'末端からポリメライゼ
ーション試薬ｉにより合成が開始されるプロモーター相
補配列によって置換する(第３Ｇ−Ｉ図)。第２プライマ
ー伸長産物の合成は第２プライマーの３'末端から合成
を開始し、被検試料の核酸配列の鋳型に沿って５'方向
に進行する任意のポリメライゼーション用試薬を用いて
行うことができる。この目的に適した酵素には、例え
ば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌ＤＮＡポリメ
ラーゼＩのクレノウ断片、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、エ
キソヌクレアーゼ欠損Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、および
逆転写酵素が含まれる。プロモーター−プライマー伸長
産物の合成およびプロモーター相補配列の合成は第２プ
ライマー伸長産物の合成に用いたポリメライゼーション
用試薬をも含めて、同一の試薬または異なる試薬を用い
て行うことができる。しかしながら、第３図記載の工程
を効率的に行うためには、プロモーター−プライマー伸
長産物の合成に使用する試薬が第３Ｇ図記載の切除反応
をも行って第２プライマー伸長産物のハイブリダイズし
ていない３'末端側の配列を除去し得るものであること
が好ましい。合成と切除反応の両方を行うのに適した酵
素には大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌ＤＮＡポリ
メラーゼＩのクレノウ断片およびＴ４ＤＮＡポリメラー
ゼなどの３'−５'エキソヌクレアーゼ活性を有するポリ
ヌクレオチド・ポリメラーゼが含まれる。
【００３４】この、または前記の方法により２本鎖核酸
生成物が形成されると、それは検出すべき配列の複数個
のＲＮＡ転写物の源として作用し、その合成および測定
は上記方法のいずれかを用いて行うことができる。検出
すべき配列とプロモーターを含有する２本鎖核酸の生産
にプロモーター−プライマーと第２プライマーとを一緒
に用いることの利点は、分析の精度がより大きいという
点にある。プロモーター−プライマーまたは第２プライ
マーが、検出すべき配列またはその相補配列以外の配列
と間違ってハイブリダイズした場合、得られたプライマ
ー伸長副産物は被検試料核酸または他のプライマー伸長
産物とハイブリダイズして、ＲＮＡ転写物が合成される
ような２本鎖生成物を与えるとは考えられない。
生成物が形成されると、それは検出すべき配列の複数個
のＲＮＡ転写物の源として作用し、その合成および測定
は上記方法のいずれかを用いて行うことができる。検出
すべき配列とプロモーターを含有する２本鎖核酸の生産
にプロモーター−プライマーと第２プライマーとを一緒
に用いることの利点は、分析の精度がより大きいという
点にある。プロモーター−プライマーまたは第２プライ
マーが、検出すべき配列またはその相補配列以外の配列
と間違ってハイブリダイズした場合、得られたプライマ
ー伸長副産物は被検試料核酸または他のプライマー伸長
産物とハイブリダイズして、ＲＮＡ転写物が合成される
ような２本鎖生成物を与えるとは考えられない。
【００３５】また、２個のプライマーを一緒に用いるこ
との他の利点は、検出すべき配列のＲＮＡ転写物が様々
な大きさで得られることである。第２図および第３図に
記載のごとく、プロモーター−プライマーと第２プライ
マーとを、１本のプライマーが検出すべき配列の３'末
端にハイブリダイズし、他のプライマーが相補配列の
３'末端にハイブリダイズするようにプロモーター−プ
ライマーと第２プライマーとを選択することにより、Ｒ
ＮＡ転写物が合成される核酸生成物の２本鎖領域は、検
出すべき配列とプロモーター−プライマーのプロモータ
ーのみに限定される。得られたＲＮＡ転写物が様々なサ
イズであるということは、ゲルろ過クロマトグラフィー
等によって被検試料から所望のＲＮＡ転写物を分離する
など、以後の転写物の検出または単離に好都合である。
さらに、生成された転写物が第１図記載の方法で生成さ
れたものよりも短いと、その合成はより迅速に進み、か
つ必要な試薬の量も少い。以下の実施例は単なる例示で
あって、いかなる意味においても本発明を限定するもの
ではない。本明細書で引用した文献は、すべて明確に記
載されている。
との他の利点は、検出すべき配列のＲＮＡ転写物が様々
な大きさで得られることである。第２図および第３図に
記載のごとく、プロモーター−プライマーと第２プライ
マーとを、１本のプライマーが検出すべき配列の３'末
端にハイブリダイズし、他のプライマーが相補配列の
３'末端にハイブリダイズするようにプロモーター−プ
ライマーと第２プライマーとを選択することにより、Ｒ
ＮＡ転写物が合成される核酸生成物の２本鎖領域は、検
出すべき配列とプロモーター−プライマーのプロモータ
ーのみに限定される。得られたＲＮＡ転写物が様々なサ
イズであるということは、ゲルろ過クロマトグラフィー
等によって被検試料から所望のＲＮＡ転写物を分離する
など、以後の転写物の検出または単離に好都合である。
さらに、生成された転写物が第１図記載の方法で生成さ
れたものよりも短いと、その合成はより迅速に進み、か
つ必要な試薬の量も少い。以下の実施例は単なる例示で
あって、いかなる意味においても本発明を限定するもの
ではない。本明細書で引用した文献は、すべて明確に記
載されている。
【００３６】
【実施例】実施例１ 本実施例では式： 5' AAATTAATACGACTCACTATAGGGAGATGTACCTCTGTATCATATGC 3' で示される配列を有するデオキシリボヌクレオチドプロ
モーター−プライマーを用いたＨＩＶ(ヒト免疫不全症
ウイルス、以前はＨＴＬＶ−III／ＬＡＶと呼称されて
いた)のenv遺伝子の検出に関して示す。このプロモータ
ー−プライマーの配列は、プロモーター−プライマーの
５'末端側がバクテリオファージＴ７クラスIIIプロモー
ター[ダン(Ｄunn)およびスタディア(Ｓtudier)、ジャー
ナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ.Ｍol.Ｂ
iol.)、１６６：４７７（１９８３)]の機能的な領域の
配列に対応し、３'末端側はＨＩＶのenv遺伝子の暗号配
列、ＨＩＶゲノム配列のヌクレオチド５９８１−６００
０の間の配列[ミュシングら(Ｍuesing)、ネイチャー(Ｎ
ature)、３１３：４５０(１９８５)]と相補的であるよ
うに選択されている。分析用の核酸はクエン酸処理した
ヒト血液またはウイルス感染Ｈ９細胞[ポポビックら(Ｐ
opovic)、サイエンス(Ｓcience)、２２４：４９７(１９
８４)]から、[ハーマン(Ｈermann)およびフィシャウフ
(Ｆischauf)、Ｍeth.Ｅnzymol.、１５２:１８０(１９８
７)]の方法に従って抽出された。４０mＭ Ｔris−ＨＣ
ｌ(pＨ８.０)、２０mＭ ＭgＣｌ2、１mＭジチオスレイ
トール、５ｍg／ｍｌゼラチン、１０mＭバナジル−リボ
ヌクレオシド複合体、および各１０mＭの４種のデオキ
シリボヌクレオシド三りん酸(dＡＴＰ、dＴＴＰ、dＧＴ
ＰおよびdＣＴＰ)および４種のリボヌクレオシド三りん
酸(ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰおよびＣＴＰ)を含有する反
応バッファー１００μｌ中のプロモーター−プライマー
１００pmolに被検試料核酸合計１０μgを加える。混合
物を１００℃で１分間加熱し、３７℃まで放冷する。次
いで、この混合物に大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレ
ノウ断片５単位とＴ７ＲＮＡポリメラーゼ５単位とを加
え、３７℃で１時間反応を続ける。生成したＲＮＡ転写
物を、式： 5' TTGATGATCTGTAGTGCTAC 3' で示される配列を有する32Ｐ末端標識デオキシオリゴヌ
クレオチドをハイブリダイゼーションのプローブとして
用いるドット−ブロットハイブリッド形成法によって検
出する。上記プローブの配列はＨＩＶゲノム配列のヌク
レオチド５８７５から５８９５の間に位置するＨＩＶen
v遺伝子の暗号配列部分とホモローガスなように選択さ
れている。ＲＮＡ合成反応の一部をとり１５×ＳＳＣバ
ッファー(１×ＳＳＣ＝０.１５Ｍ塩化ナトリウム、０.
０１５Ｍクエン酸ナトリウム、pＨ７.０)１００μｌに
加え、６×ＳＳＣ中で予め湿らせておいたニトロセルロ
ースフィルターによってろ過する。次いで、フィルター
を８０℃で１時間、真空オーブン中で乾燥する。乾燥
後、各フィルターを５×ＳＳＣ、５０mＭりん酸ナトリ
ウム（pＨ６.５)、５×デンハート溶液(１×＝０.０２
％ポリビニルピロリドン、０.０２％フィコール、０.０
２％ウシ血清アルブミン、０.２mＭ Ｔris−ＨＣｌ、
０.２mＭ ＥＤＴＡ、pＨ８.０)、０.１％ドデシル硫酸
ナトリウム、および０.２％変性サケ精子ＤＮＡからな
るハイブリダイゼーション溶液と４２℃で１時間接触さ
せる。次いで、標識したプローブを終濃度１０7cpm／ｍ
ｌとなるようにハイブリダイゼーション溶液に加え、４
２℃で２時間、フィルターのインキュベーションを続け
る。最後に、フィルターを６×ＳＳＣ中、バッファーを
２回交換して３７℃で１時間洗浄する。乾燥後、フィル
ターをオートラジオグラフィーにかけるかチェレンコフ
の放射能測定に付す。
モーター−プライマーを用いたＨＩＶ(ヒト免疫不全症
ウイルス、以前はＨＴＬＶ−III／ＬＡＶと呼称されて
いた)のenv遺伝子の検出に関して示す。このプロモータ
ー−プライマーの配列は、プロモーター−プライマーの
５'末端側がバクテリオファージＴ７クラスIIIプロモー
ター[ダン(Ｄunn)およびスタディア(Ｓtudier)、ジャー
ナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ.Ｍol.Ｂ
iol.)、１６６：４７７（１９８３)]の機能的な領域の
配列に対応し、３'末端側はＨＩＶのenv遺伝子の暗号配
列、ＨＩＶゲノム配列のヌクレオチド５９８１−６００
０の間の配列[ミュシングら(Ｍuesing)、ネイチャー(Ｎ
ature)、３１３：４５０(１９８５)]と相補的であるよ
うに選択されている。分析用の核酸はクエン酸処理した
ヒト血液またはウイルス感染Ｈ９細胞[ポポビックら(Ｐ
opovic)、サイエンス(Ｓcience)、２２４：４９７(１９
８４)]から、[ハーマン(Ｈermann)およびフィシャウフ
(Ｆischauf)、Ｍeth.Ｅnzymol.、１５２:１８０(１９８
７)]の方法に従って抽出された。４０mＭ Ｔris−ＨＣ
ｌ(pＨ８.０)、２０mＭ ＭgＣｌ2、１mＭジチオスレイ
トール、５ｍg／ｍｌゼラチン、１０mＭバナジル−リボ
ヌクレオシド複合体、および各１０mＭの４種のデオキ
シリボヌクレオシド三りん酸(dＡＴＰ、dＴＴＰ、dＧＴ
ＰおよびdＣＴＰ)および４種のリボヌクレオシド三りん
酸(ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰおよびＣＴＰ)を含有する反
応バッファー１００μｌ中のプロモーター−プライマー
１００pmolに被検試料核酸合計１０μgを加える。混合
物を１００℃で１分間加熱し、３７℃まで放冷する。次
いで、この混合物に大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレ
ノウ断片５単位とＴ７ＲＮＡポリメラーゼ５単位とを加
え、３７℃で１時間反応を続ける。生成したＲＮＡ転写
物を、式： 5' TTGATGATCTGTAGTGCTAC 3' で示される配列を有する32Ｐ末端標識デオキシオリゴヌ
クレオチドをハイブリダイゼーションのプローブとして
用いるドット−ブロットハイブリッド形成法によって検
出する。上記プローブの配列はＨＩＶゲノム配列のヌク
レオチド５８７５から５８９５の間に位置するＨＩＶen
v遺伝子の暗号配列部分とホモローガスなように選択さ
れている。ＲＮＡ合成反応の一部をとり１５×ＳＳＣバ
ッファー(１×ＳＳＣ＝０.１５Ｍ塩化ナトリウム、０.
０１５Ｍクエン酸ナトリウム、pＨ７.０)１００μｌに
加え、６×ＳＳＣ中で予め湿らせておいたニトロセルロ
ースフィルターによってろ過する。次いで、フィルター
を８０℃で１時間、真空オーブン中で乾燥する。乾燥
後、各フィルターを５×ＳＳＣ、５０mＭりん酸ナトリ
ウム（pＨ６.５)、５×デンハート溶液(１×＝０.０２
％ポリビニルピロリドン、０.０２％フィコール、０.０
２％ウシ血清アルブミン、０.２mＭ Ｔris−ＨＣｌ、
０.２mＭ ＥＤＴＡ、pＨ８.０)、０.１％ドデシル硫酸
ナトリウム、および０.２％変性サケ精子ＤＮＡからな
るハイブリダイゼーション溶液と４２℃で１時間接触さ
せる。次いで、標識したプローブを終濃度１０7cpm／ｍ
ｌとなるようにハイブリダイゼーション溶液に加え、４
２℃で２時間、フィルターのインキュベーションを続け
る。最後に、フィルターを６×ＳＳＣ中、バッファーを
２回交換して３７℃で１時間洗浄する。乾燥後、フィル
ターをオートラジオグラフィーにかけるかチェレンコフ
の放射能測定に付す。
【００３７】実施例２ 本実施例または以後の実施例はプロモーター−プライマ
ーと第２プライマーとを一緒に用いてＨＩＶenv遺伝子
を検出する方法に関するものである。実施例１と同様に
してヒト血液またはウイルス感染Ｈ９細胞から調製した
被検試料１０μgを反応バッファー１００μｌ中でプロ
モーター−プライマー１００pmolおよび第２プライマー
(5' ATGAGAGTGAAGGAGAAATA 3')１００pmolと混合する。
この第２プライマーはＨＩＶのenv遺伝子のアミノ末端
暗号配列(ヌクレオチド５８０３−５８２２)とホモロー
ガスである。このプロモーター−プライマーと第２プラ
イマーとの特殊な組み合わせは、隣接するＴ７プロモー
ターの調節(コントロール)下に、それから２０６ヌクレ
オチドのＲＮＡ転写物が合成される、ＨＩＶのenv遺伝
子配列中の１９８塩基対を含有する２２５塩基対の２本
鎖核酸が生産されるよう、選択されている。２個のプラ
イマーと被検試料核酸を含有する混合物を１００℃で１
分間加熱した後、１００℃で１分間加熱し、３７℃まで
放冷する。この時点でエキソヌクレアーゼ不含Ｔ７ＤＮ
Ａポリメラーゼ[シークエナーゼTM（ＳequenaseTM)、ユ
ナイテッド・ステイツ・バイオケミカル・コーポレイテ
ッド(Ｕnited Ｓtates Ｂiochemical Ｃorp.)]５単位を
加える。３７℃で５分間インキュベートした後、再度、
反応混合物を１００℃で１分間加熱し、次いで、３７℃
で３０分間〜１時間反応を続ける。最後に、反応混合物
を１００℃で５分間加熱し、４２℃まで冷却する。生成
したＲＮＡ転写物を第２プライマーと発生期のＲＮＡ転
写物とのハイブリダイゼーションによって特異的に開始
される逆転写によって測定する。被検試料反応混合物に
逆転写酵素５単位と一緒に、終濃度１μＭとなるように
α−32Ｐ−dＴＴＰ(比活性約３０００Ｃi／mmol)を加え
た後、反応混合物を４２℃で１５分間インキュベートす
る。32Ｐ標識逆転写産物を、反応混合物中の全酸不溶性
放射能を測定することにより、定量する。反応混合物の
１部をポリスチレンチューブに入れた１０％トリクロロ
酢酸(ＴＣＡ)５００μｌに加え、氷上で１０分間インキ
ュベートする。次いで、各チューブの内容物をワットマ
ンのグラスファイバーフィルターを用いて吸引ろ過し氷
冷ＴＣＡでフィルターを洗浄する。乾燥後、フィルター
のチェレンコフの放射能を計数する。
ーと第２プライマーとを一緒に用いてＨＩＶenv遺伝子
を検出する方法に関するものである。実施例１と同様に
してヒト血液またはウイルス感染Ｈ９細胞から調製した
被検試料１０μgを反応バッファー１００μｌ中でプロ
モーター−プライマー１００pmolおよび第２プライマー
(5' ATGAGAGTGAAGGAGAAATA 3')１００pmolと混合する。
この第２プライマーはＨＩＶのenv遺伝子のアミノ末端
暗号配列(ヌクレオチド５８０３−５８２２)とホモロー
ガスである。このプロモーター−プライマーと第２プラ
イマーとの特殊な組み合わせは、隣接するＴ７プロモー
ターの調節(コントロール)下に、それから２０６ヌクレ
オチドのＲＮＡ転写物が合成される、ＨＩＶのenv遺伝
子配列中の１９８塩基対を含有する２２５塩基対の２本
鎖核酸が生産されるよう、選択されている。２個のプラ
イマーと被検試料核酸を含有する混合物を１００℃で１
分間加熱した後、１００℃で１分間加熱し、３７℃まで
放冷する。この時点でエキソヌクレアーゼ不含Ｔ７ＤＮ
Ａポリメラーゼ[シークエナーゼTM（ＳequenaseTM)、ユ
ナイテッド・ステイツ・バイオケミカル・コーポレイテ
ッド(Ｕnited Ｓtates Ｂiochemical Ｃorp.)]５単位を
加える。３７℃で５分間インキュベートした後、再度、
反応混合物を１００℃で１分間加熱し、次いで、３７℃
で３０分間〜１時間反応を続ける。最後に、反応混合物
を１００℃で５分間加熱し、４２℃まで冷却する。生成
したＲＮＡ転写物を第２プライマーと発生期のＲＮＡ転
写物とのハイブリダイゼーションによって特異的に開始
される逆転写によって測定する。被検試料反応混合物に
逆転写酵素５単位と一緒に、終濃度１μＭとなるように
α−32Ｐ−dＴＴＰ(比活性約３０００Ｃi／mmol)を加え
た後、反応混合物を４２℃で１５分間インキュベートす
る。32Ｐ標識逆転写産物を、反応混合物中の全酸不溶性
放射能を測定することにより、定量する。反応混合物の
１部をポリスチレンチューブに入れた１０％トリクロロ
酢酸(ＴＣＡ)５００μｌに加え、氷上で１０分間インキ
ュベートする。次いで、各チューブの内容物をワットマ
ンのグラスファイバーフィルターを用いて吸引ろ過し氷
冷ＴＣＡでフィルターを洗浄する。乾燥後、フィルター
のチェレンコフの放射能を計数する。
【００３８】実施例３ ヒト血液またはウイルス感染Ｈ９細胞から単離した核酸
を音波処理して剪断し、平均の長さが５００ヌクレオチ
ドの断片を調製する。次いで、剪断した被検試料核酸１
０μgを４０mＭ Ｔris−ＨＣｌ(pＨ８.０)、２０mＭ Ｍ
gＣｌ2、１mＭジチオスレイトール、５ｍg／ｍｌゼラチ
ン、１０mＭバナジル−リボヌクレオシド複合体、およ
び各１０mＭの４種のデオキシリボヌクレオシド三りん
酸(dＡＴＰ、dＴＴＰ、dＧＴＰおよびdＣＴＰ)および５
００μＭ ＡＴＰ、５００μＭ ＵＴＰ、５００μＭ Ｇ
ＴＰおよび５００μＭ ＣＴＰ、および１μＭ α−32Ｐ
−ＵＴＰ(比活性約３０００Ｃi／mmol)を含有する反応
バッファー１００μｌ中でプロモーター−プライマー１
００pmolおよび第２プライマー１００pmolと混合する。
混合物を１００℃で１分間加熱し、２８℃まで放冷した
時点で、逆転写酵素５単位を加える。２８℃で１５分間
インキュベートした後、反応混合物を１００℃で１分間
再度加熱し、２８℃まで放冷する。逆転写酵素５単位お
よびＴ７ＤＮＡポリメラーゼ５単位を加え、２８℃で１
時間反応を進行させる。32Ｐ標識逆転写産物を、上記の
ごとく、反応混合物中の全酸不溶性放射能を測定するこ
とにより、定量する。２０６ヌクレオチドの標識ＲＮＡ
転写物も、ＲＮＡ合成反応物の一部を種々の量の放射性
標識ＲＮＡ標準と一緒に尿素−ポリアクリルアミドゲル
のオートラジオグラフィーにかけて測定することができ
る。次いで、現像したオートラジオグラムをデンシトメ
ーター(濃度計)にかけて解析することによりenv遺伝子
配列の２０６ヌクレオチド転写物を定量する。
を音波処理して剪断し、平均の長さが５００ヌクレオチ
ドの断片を調製する。次いで、剪断した被検試料核酸１
０μgを４０mＭ Ｔris−ＨＣｌ(pＨ８.０)、２０mＭ Ｍ
gＣｌ2、１mＭジチオスレイトール、５ｍg／ｍｌゼラチ
ン、１０mＭバナジル−リボヌクレオシド複合体、およ
び各１０mＭの４種のデオキシリボヌクレオシド三りん
酸(dＡＴＰ、dＴＴＰ、dＧＴＰおよびdＣＴＰ)および５
００μＭ ＡＴＰ、５００μＭ ＵＴＰ、５００μＭ Ｇ
ＴＰおよび５００μＭ ＣＴＰ、および１μＭ α−32Ｐ
−ＵＴＰ(比活性約３０００Ｃi／mmol)を含有する反応
バッファー１００μｌ中でプロモーター−プライマー１
００pmolおよび第２プライマー１００pmolと混合する。
混合物を１００℃で１分間加熱し、２８℃まで放冷した
時点で、逆転写酵素５単位を加える。２８℃で１５分間
インキュベートした後、反応混合物を１００℃で１分間
再度加熱し、２８℃まで放冷する。逆転写酵素５単位お
よびＴ７ＤＮＡポリメラーゼ５単位を加え、２８℃で１
時間反応を進行させる。32Ｐ標識逆転写産物を、上記の
ごとく、反応混合物中の全酸不溶性放射能を測定するこ
とにより、定量する。２０６ヌクレオチドの標識ＲＮＡ
転写物も、ＲＮＡ合成反応物の一部を種々の量の放射性
標識ＲＮＡ標準と一緒に尿素−ポリアクリルアミドゲル
のオートラジオグラフィーにかけて測定することができ
る。次いで、現像したオートラジオグラムをデンシトメ
ーター(濃度計)にかけて解析することによりenv遺伝子
配列の２０６ヌクレオチド転写物を定量する。
【００３９】
配列番号：１ 配列の長さ：４７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AAATTAATAC GACTCACTAT AGGGAGATGT ACCTCTGTAT CATATGC 47
【００４０】配列番号：２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TTGATGATCT GTAGTGCTAC 20
【００４１】配列番号：３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ATGAGAGTGA AGGAGAAATA 20
【図１】 １本鎖核酸中の検出すべ特定の配列へのオリ
ゴヌクレオチド、プロモーター−プライマーのハイブリ
ダイゼーション、検出すべき配列とプロモーター−プラ
イマーのプロモーターを含有する２本鎖核酸の合成、お
よびプロモーターの制御下における２本鎖核酸からの複
数個のＲＮＡ転写物の合成を示す模式図である。
ゴヌクレオチド、プロモーター−プライマーのハイブリ
ダイゼーション、検出すべき配列とプロモーター−プラ
イマーのプロモーターを含有する２本鎖核酸の合成、お
よびプロモーターの制御下における２本鎖核酸からの複
数個のＲＮＡ転写物の合成を示す模式図である。
【図２】 本発明の１実施態様であって、オリゴヌクレ
オチド、プロモーター−プライマーとオリゴヌクレオチ
ド、第２プライマーとを一緒に用い、検出すべき核酸配
列とプロモーター−プライマーのプロモーターとを含有
する２本鎖核酸を製造することを含む実施態様の模式図
である。
オチド、プロモーター−プライマーとオリゴヌクレオチ
ド、第２プライマーとを一緒に用い、検出すべき核酸配
列とプロモーター−プライマーのプロモーターとを含有
する２本鎖核酸を製造することを含む実施態様の模式図
である。
【図３】 本発明の他の実施態様であって、オリゴヌク
レオチド、プロモーター−プライマーと、オリゴヌクレ
オチド、第２プライマーとを一緒に用いることからなる
実施態様の模式図である。
レオチド、プロモーター−プライマーと、オリゴヌクレ
オチド、第２プライマーとを一緒に用いることからなる
実施態様の模式図である。
Claims (12)
- 【請求項１】 検出すべき配列に操作可能に結合したプ
ロモーターを含む２本鎖核酸の製造方法であって、 （a）オリゴヌクレオチドプロモーター−プライマーを
得； （b）プロモーター−プライマーと検出すべき核酸配列
とがハイブリダイズする条件下で、該プロモーター−プ
ライマーと該検出すべき配列を含有する核酸とを接触さ
せ、 （c）プロモーター−プライマーの３’末端から、検出
すべき核酸配列に相補的な伸長産物を製造させ； （d）工程(c)の産物を３'−５'エキソヌクレアーゼ活性
を有する物質と接触させ； （e)プロモーター−プライマーのプロモーターと相補的
な伸長産物を、検出すべき配列の３’末端から合成する
ことからなる方法。 - 【請求項２】 工程（ａ）のプロモーター−プライマー
が用いられる唯一のプライマーである請求項１記載の方
法。 - 【請求項３】 検出すべき配列を含有する核酸が工程
（ｂ）の前、または間に制限酵素で消化される請求項１
または２記載の方法。 - 【請求項４】 工程（ｃ）および（ｅ）の伸長産物の合
成が、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、お
よびＴ４ＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択される
酵素を用いて行われるものである請求項１または２記載
の方法。 - 【請求項５】 工程（ｄ）の物質が、大腸菌ＤＮＡポリ
メラーゼＩのクレノウ断片、およびＴ４ＤＮＡポリメラ
ーゼからなる群から選択される酵素である請求項１また
は２記載の方法。 - 【請求項６】 工程（ｃ）および（ｅ）の伸長産物の合
成が、工程（ｄ）で用いる物質と同じ物質を用いて行わ
れる請求項１または２記載の方法。 - 【請求項７】 工程（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）が同じ
反応容器中で同時に行われる請求項１または２記載の方
法。 - 【請求項８】 核酸を含有する被検試料中の特定の核酸
配列を検出するために有用な方法であって、請求項１ま
たは２記載の方法に従って製造した２本鎖核酸から複数
のＲＮＡ転写物を合成し（ここに各ＲＮＡ転写物は検出
すべき特定の核酸配列に対応するＲＮＡ配列を含有す
る)、該ＲＮＡ配列の存在を決定することを含む方法。 - 【請求項９】 複数のＲＮＡ転写物がＴ７ＲＮＡポリメ
ラーゼを用いて合成されるものである請求項８記載の方
法。 - 【請求項１０】 複数個のＲＮＡ転写物がＳＰ６ＲＮＡ
ポリメラーゼを用いて合成されるものである請求項８記
載の方法。 - 【請求項１１】 該ＲＮＡ配列の存在を、ＲＮＡ転写物
を、該ＲＮＡ転写物中の予め決定しておいた配列とハイ
ブリダイズするよう選択されたオリゴヌクレオチドプロ
ーブとハイブリダイズし得る条件下で接触させることに
より、決定する請求項８〜１０のいずれかに記載の方
法。 - 【請求項１２】 ＲＮＡ転写物が固体支持体に固定化さ
れている請求項８記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US14646288A | 1988-01-21 | 1988-01-21 | |
| US146462 | 1988-01-21 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1502250A Division JP2846018B2 (ja) | 1988-01-21 | 1989-01-12 | 核酸配列の増幅および検出 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1189600A true JPH1189600A (ja) | 1999-04-06 |
| JP3514630B2 JP3514630B2 (ja) | 2004-03-31 |
Family
ID=22517472
Family Applications (3)
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