CN115989415A

CN115989415A - 用于检测肺癌的方法

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Publication number: CN115989415A
Application number: CN202180052491.2A
Authority: CN
Inventors: P·帕加诺; D·格拉玛乔-莱文顿; R·里德; S·泰维莲; L·巴登; A·布朗
Original assignee: Jianfei Life Artificial Intelligence Co
Current assignee: Jianfei Life Artificial Intelligence Co
Priority date: 2020-06-30
Filing date: 2021-06-30
Publication date: 2023-04-18
Also published as: US20230266325A1; WO2022006286A1; EP4172370A1

Abstract

本公开提供一种用于在具有来自患者的血细胞的样品中确定循环肿瘤细胞(CTC)水平的方法，包括从人类受试者获得测试样品；富集循环肿瘤细胞(CTC)；用与染色体DNA的区域杂交的标记核酸探针杂交所述样品中富集的细胞；通过检测来自细胞的荧光原位杂交评估所选细胞的信号模式；基于标记核酸探针与所选细胞的杂交模式检测CTC；和当每个样品的CTC数量高于预定的临界值时，鉴定所述受试者处于肺癌发展风险下。

Description

用于检测肺癌的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2020年6月30日递交的美国临时申请第63/046,456号的优先权，其出于所有目的通过引用以其全部结合至本文中。

发明背景

计算机断层扫描为检测肺结节的标准方法，无论是偶然还是作为肺癌筛查计划的一部分。当需要活检时，进行的放射学特征和临床风险评估会指导临床医师。据估计，超过40％的可疑肺结节活检不是肺癌，并且因此没有必要。经胸活检经常导致并发症，包括感染、气胸、出血和甚至死亡。

本公开提供一种从外周血抽取中检测早期循环肿瘤细胞的4色荧光原位杂交测定。4色荧光原位杂交测定的一个非限制性实例为LungLB^TM测定。在一些方面，4色荧光原位杂交测定助于对疑似肺癌的不确定结节患者进行临床评估。在一些方面，测定基于对肺癌发病早期转移过程活跃的观察。

进行了一项同时接受LungLB^TM测定抽血与结节活检(n＝31例恶性，n＝15例良性结节)的46名受试者的盲法研究。使用接受者操作特征曲线(ROC)分析，获得灵敏度为81％和特异性为87％，曲线下面积(AUC)为0.823。还评估了恶性肿瘤预测模型中常用的临床因素并且发现无信息，表明数据反映“真实世界”的情况并且不因可得的临床因素而偏颇。

LungLB^TM测定的早期临床性能表明，其可用作不确定肺结节临床评估的辅助手段。如果在良性病变患者使用LungLB^TM，该研究中15名受试者中的有13名可能免于活检。大规模的验证和效用研究为必要的。

在用于在人类检测肺癌的方法方面，长期以来存在需求，但尚未得到满足。2018年新发肺癌病例数量估计超过230,000例，并且5年存活率从1975年的11.4％小幅增加至2013年的17.5％(Siegel RL等人,2018,CA Cancer J Clin.；68(1):7-30)。这部分地是由于缺乏早期检测，并且早期疾病一般地为无症状的。因此，大多数病例在疾病的较晚期发现，伴有可检测的转移性疾病。在较早期鉴定肺癌的能力将对肺癌患者的总体结果具有显著影响。

低剂量计算机断层扫描(LDCT)为肺癌筛查的标准，并且国家肺部筛查试验(National Lung Screening Trial)显示肺癌特异性死亡率降低20％(Aberle D.R.,AdamsA.M.等人N Engl J Med.(2011)365(5):395-409)。尽管高度灵敏，但即使结合当前的LungRADS标准，LDCT也遭受低特异性和高假阳性率(Pinsky P.F.,Gierada D.S.et al.(2015)Ann Intern Med.162(7):485-91)。据估计，通过CT扫描鉴定的不确定肺结节活检中超过40％为肺癌阴性(Lokhandwala T,Bittoni M.A.等人(2017)Clin Lung Cancer.18(1):e27-e34.doi:10.1016/j.cllc.2016.07.006.Epub 2016Jul 21)，并且据报道，近20％的活检患者经受不良事件。

使用血液进行癌症诊断为一种有前途的方法，因为可廉价地获得样本而且经常比组织活检侵入性更低。用于癌症检测的基于血液的生物标志物吸引了很多研究兴趣，尤其是其中活检具有挑战性的肺癌(Zugazagoitia,Ramos等人(2019).Ann Oncol 30(2):290-296)。全血为一种复杂混合物，其包括血浆和基于细胞的隔室，其每个含有独特的生物标志物，这些生物标志物经常为互补的(Hodara,Morrison等人(2019).JCI Insight 4(5))。血浆含有循环游离DNA(cfDNA，来自正常和肿瘤[ctDNA]组织)、含有RNA的外泌体和各种蛋白成分。细胞隔室含有正常血细胞和肿瘤来源的细胞(循环肿瘤细胞，CTC)。与传统活检相反，使用血液的主要优点之一为样本不限于单个肿瘤部位而是允许对整个肿瘤进行更完整采样。特别是，基于CTC的测定具有检测已经进入转移性级联的细胞的能力，这一过程导致>90％的癌症相关死亡率(Mehlen,Puisieux等人(2006)Nat Rev Cancer 6(6):449-58)。

肺癌早期检测的新兴技术测量循环肿瘤DNA(ctDNA)、RNA或蛋白(Seijo等人(2019)J Thorac Oncol 14(3):343-357)。然而，这些技术不可能构成准确的早期检测方法，因为它们依赖于与较晚期疾病相关的病理生理变化(即高肿瘤负荷)并且具有可能阻碍它们用于早期癌症的检测的生物和技术挑战。尽管经常与许多癌症类型的较晚期疾病相关，但直接测量循环肿瘤细胞(CTC)或许为最有前途的新兴技术，为早期肺癌检测提供一种灵敏的手段。模型系统和临床肺癌中转移性行为的非常早期出现(Pagano,Tran等人(2017)Cancer Prev Res(Phila)10(9):514-524和Tanaka,Yoneda等人(2009)Clin Cancer Res15(22):6980-6)描述肺癌与其他组织中的恶性肿瘤相比较在生物学上的根本差异，这可通过使用基于CTC的测定在早期检测环境中加以利用。诊断为肺癌且符合治愈性意图手术的患者经常复发，并且最经常地在切除后的头两年内复发(Lou,Camelia等人(2014)AnnThorac Surg95(5):1755-1761)。根据阶段，复发率在30-75％的范围内，其大多数为远处复发(Sugimura,Nichols等人(2007)Ann Thorac Surg 83(2):409-17)。这表明微转移性疾病在手术时就存在，处于癌症早期，但低于成像检测的水平。

先前的研究表明，CTC可在诊断为I期肺癌的患者(Tanaka,Yoneda等人(2009)ClinCancer Res 15(22):6980-6,Chemi F,Rothwell DG等人(2019)Nat Med.25(10):1534-1539)以及以射线照片观察到恶性肿瘤(frank malignancy)之前数年处于肺癌高风险下的慢性阻塞性肺疾病(COPD)的那些患者进行鉴定(Ilie,Hofman等人(2014)PLoS One 9(10):e111597)。从血液中回收的细胞鉴定为肿瘤细胞的手段为关键的，并且经常细胞角蛋白阳性/CD45阴性的传统定义是不够的。Katz等人描述了一种方法，其使用荧光原位杂交(FISH)对从不确定肺结节患者的外周血中富集的肿瘤细胞进行拷贝数变化检测(Katz,He等人(2010)Clin Cancer Res 16(15):3976-3987)，这是本文所述的4色荧光原位杂交LungLB^TM测定的基础。由于FISH通常为一种高度特异性测定，并且染色体不稳定性为癌症的标志，因此这种CTC鉴定方法具有超过常用的蛋白标志物(比如细胞角蛋白和CD45)的优势，这些标志物在个体和肺癌患者之间的表达不同。

本文报道使用FISH分析CTC的液体活检测定的开发及其临床性能。本研究的范围为评估偶然或通过肺癌筛查计划鉴定的可疑不确定肺结节患者内肺结节活检结果与4色荧光原位杂交LungLB^TM测定测试的一致性。

发明内容

本公开提供一种用于鉴定处于肺癌发展风险下的受试者的方法，包括：(a)从人类受试者获得测试样品；(b)进行循环肿瘤细胞(CTC)富集步骤，包括：(i)从样品中去除血浆，(ii)从样品中去除红细胞，(iii)使样品与至少一种结合细胞表面标志物的生物素化亲和剂接触，和(iv)使样品与链霉亲和素包被的磁性颗粒接触并从样品中耗尽表达细胞表面标志物的细胞；(c)用与染色体DNA的区域杂交的标记核酸探针杂交样品中富集的细胞；(d)通过检测来自细胞的荧光原位杂交评估所选细胞的信号模式；(e)基于标记核酸探针与所述所选细胞的杂交模式检测CTC；和(f)当每个样品的CTC数量高于预定的临界值时，鉴定受试者处于肺癌发展的风险下。

在一些方面，测试样品为血液。在一些方面，红细胞通过细胞裂解去除。在一些方面，细胞裂解通过氯化铵裂解缓冲液进行。

在一些方面，血浆通过离心去除。

在一些方面，细胞表面标志物选自CD66b、CD14、CD3、CD4、CD8、CD17、CD56、CD19、CD20、CD25、IgM或IgD。在一些方面，细胞表面标志物选自CD66b、CD3或CD14。在一些方面，细胞表面标志物包含CD66b和CD14。在一些方面，细胞表面标志物包含CD66b、CD14和CD3。在一些方面，细胞表面标志物包含CD66b、CD14、CD3和CD56。在一些方面，细胞表面标志物包含CD66b、CD14、CD3和CD19。在一些方面，细胞表面标志物包含CD66b、CD14、CD3、CD56和CD19。

在一些方面，至少一种生物素化亲和剂包含抗CD66b、抗CD3、抗CD56、抗CD19或抗CD14抗体。在一些方面，至少一种生物素化亲和剂包含抗CD66b抗体和抗CD14抗体。在一些方面，至少一种生物素化亲和剂包含抗CD66b抗体、抗CD14抗体和抗CD3抗体。在一些方面，至少一种生物素化亲和剂包含抗CD66b抗体、抗CD14抗体、抗CD3抗体和抗CD56抗体。在一些方面，至少一种生物素化亲和剂包含抗CD66b抗体、抗CD14抗体、抗CD3抗体和抗CD19抗体。在一些方面，至少一种生物素化亲和剂包含抗CD66b抗体、抗CD14抗体、抗CD3抗体、抗CD56抗体和抗CD19抗体。

在一些方面，耗尽细胞为中性粒细胞、单核细胞或淋巴细胞。在一些方面，耗尽细胞为中性粒细胞和单核细胞。

在一些方面，CTC富集步骤进一步包括：(i)使样品与至少一种结合细胞表面标志物的另外的生物素化亲和剂接触，和(iv)使样品与链霉亲和素包被的磁性颗粒接触并收集表达细胞表面标志物的细胞。

在一些方面，细胞表面标志物包含CD19、CD20、IgM或IgD中的至少一种。在一些方面，至少一种另外的生物素化亲和剂包含抗CD19抗体、抗CD20抗体、抗IgM抗体或抗igD抗体中的至少一种。

在一些方面，收集的细胞包含淋巴细胞。在一些方面，淋巴细胞为B细胞。

在一些方面，标记核酸探针包含3p22.1、10q22.3、10号染色体着丝粒(cep10)和3q29。

在一些方面，处于风险下的受试者具有不确定肺结节。

在一些方面，当核酸探针的杂交模式描绘细胞中两个或更多个染色体区域的增加时，鉴定CTC。

在一些方面，当核酸探针的杂交模式描绘细胞中两个或更多个染色体区域的缺失时，鉴定CTC。

在一些方面，CTC计数大于1CTC/10,000个细胞代表肺癌风险。在一些方面，CTC计数大于2CTC/10,000个细胞代表肺癌风险。在一些方面，CTC计数大于2.5CTC/10,000个细胞代表肺癌风险。在一些方面，CTC计数大于5CTC/10,000个细胞代表肺癌风险。在一些方面，CTC计数大于10CTC/10,000个细胞代表肺癌风险。在一些方面，CTC计数大于20CTC/10,000个细胞代表肺癌风险。在一些方面，CTC计数大于5CTC/10,000个细胞的受试者转诊进行结节的手术切除。

在一些方面，3p22.1的标记核酸探针为RPL14、CD39L3、PMGM或GC20探针。在一些方面，10q22.3的标记核酸探针为表面活性剂蛋白A1或表面活性剂蛋白A2探针。

本公开提供一种用于鉴定处于肺癌发展风险下的受试者的方法，包括：(a)从人类受试者获得测试样品；(b)进行循环肿瘤细胞(CTC)富集步骤，包括：(i)从样品中去除血浆，(ii)从样品中去除红细胞，(iii)使样品与至少一种结合细胞表面标志物的生物素化亲和剂接触，和(iv)使样品与链霉亲和素包被的磁性颗粒接触并从样品中收集表达细胞表面标志物的细胞；(c)用与染色体DNA的区域杂交的标记核酸探针杂交样品中富集的细胞；(d)通过检测来自细胞的荧光原位杂交评估所选细胞的信号模式；(e)基于标记核酸探针与所述所选细胞的杂交模式检测CTC；和(f)当每个样品的CTC数量高于预定的临界值时，鉴定受试者处于肺癌发展的风险下。

在一些方面，细胞表面标志物选自CD66b、CD14、CD3、CD4、CD8、CD17、CD56、CD19、CD20、CD25、IgM或IgD。

在一些方面，细胞表面标志物为B细胞特异性细胞表面标志物。在一些方面，B细胞特异性细胞表面标志物为CD19、CD20、IgM或IgD。在一些方面，至少一种生物素化亲和剂包含抗CD19抗体、抗CD20抗体、抗IgM抗体或抗IgD抗体。

本公开提供一种在受试者中评估癌症的方法，包括通过前述权利要求中任何一项的方法确定含有来自患者的血细胞的样品中循环肿瘤细胞(CTC)的水平，其中样品中较高水平的CTC，与来自非侵袭性形式癌症的CTC的对照或预定数量相比较，指示侵袭性形式的癌症和/或癌症预后不佳。

本公开提供一种在受试者中将癌症分期的方法，包括通过前述权利要求中任何一项的方法确定含有来自受试者的血细胞的样品中的循环肿瘤细胞(CTC)，其中与给定阶段的预定对照相比较样品中较高水平的CTC指示癌症的较晚期，而与给定阶段的对照相比较样品中较低水平的CTC指示癌症的较早期。

附图说明

图1为一系列流式细胞术点状图，描绘ficoll引起的红细胞和粒细胞耗尽与磁性耗尽引起的红细胞裂解。图1A描绘没有细胞富集的溶解血液并且显示高百分比的粒细胞和单核细胞以及低百分比的淋巴细胞。图1B描绘密度分离的结果，其去除了大多数粒细胞，但淋巴细胞纯度仍不足，<80％。图1C描绘使用CD66b和CD14抗体的磁性耗尽结果，并且显示适合于CTC富集的淋巴细胞的最高百分比(>90％)。

图2为描绘在4色荧光原位杂交(LungLB^TM)测定中观察到的拷贝数变化的图像。

图3为描绘显示假阴性样品中单核细胞和粒细胞较高的流式细胞术数据的图表。

图4为描述显示假阴性样品中细胞较少的总细胞计数数据的图表。

图5为描绘当CD14+CD66b用于耗尽时，与单独的CD66b相比较，平均CTC计数加倍的图表。

图6为描绘以0.5、1和3个月冷冻保存后的耗尽效率和FISH的细胞稳定性的图表。

图7为一组描绘新鲜细胞和冷冻保存3个月后的冷冻保存细胞的图像。

图8为显示健康供体血液中计数分布的散点图。虚线代表使用基于临床样本的ROC分析确定的阈值。

图9为描绘使用掺入到健康血液中的A549细胞的4色荧光原位杂交(LungLB^TM)测定的线性的图表。

图10为描绘不确定肺结节患者的四色荧光原位杂交(LungLB^TM)测定的接受者操作特征曲线的图表。

图11为一系列描绘良性活检但4色荧光原位杂交(LungLB^TM)测定测试阳性患者的实例CTC的图像。

图12A-12C为一系列描绘暴露于具有不同碳酸氢钠浓度的细胞裂解缓冲液后粒细胞尺寸变化的图表。

图13A为描绘阳性和阴性样品中使用CD66b、CD14抗体或CD66b、CD14和CD3抗体耗尽后的CTC比率/10,000个细胞的图表。

图13B为描绘2或3个抗体耗尽样品的总细胞计数及其CTC比率(CTC/10,000个细胞)及其测定后的鉴定(真阳性、真阴性、假阳性)的表格。

图14A为使用DAPI染色可视化的CTC的免疫荧光图像。将靶细胞1606装盒并在图像上鉴定。

图14B为使用CD45-FITC染色可视化的CTC的免疫荧光图像。将靶细胞1606装盒并在图像上鉴定为CD45阴性(无绿色荧光)。

图14C为靶细胞1606在LungLB测定后的图像并且描绘4R/2Gd/4Gr/2Aq的模式。R＝红色；3p22.1，Gd＝金色；10q22.3，Gr＝绿色；3q29，和Aq＝浅绿色；10号着丝粒。

图15A为一系列照片，描绘用DAPI(左图像)、CD45-FITC(居中图像)染色的靶细胞4255和LungLB测定图像(右图像)。靶细胞4255为CD45阴性并且鉴定为2R/4Gd/2Gr/4Aq。R＝红色，Gd＝金色，Gr＝绿色，和Aq＝浅绿色。

图15B为一系列照片，描绘用DAPI(左图像)、CD45-FITC(居中图像)染色的靶细胞4259和LungLB测定图像(右图像)。靶细胞4259为CD45阳性并且鉴定为3R/2Gd/3Gr/2Aq。R＝红色；3p22.1；Gd＝金色；10q22.3，Gr＝绿色；3q29，和Aq＝浅绿色；10号着丝粒。

图16为一系列照片，描绘用DAPI(图16A)、CD45-FITC(图16B)染色的靶细胞16270和LungLB测定图像(图16C)。靶细胞16270为CD45阳性并且鉴定为3R/2Gd/3Gr/2Aq。R＝红色；3p22.1，Gd＝金色；10q22.3，Gr＝绿色；3q29，和Aq＝浅绿色；10号着丝粒。

图17A为描绘使用免疫荧光抗CD19抗体鉴定CD19+或CD19-细胞的流式细胞术点状图。CD19+细胞为B细胞。

图17B为描绘使用免疫荧光抗CD56抗体鉴定CD56+或CD56-细胞的流式细胞术点状图。CD56+细胞为自然杀伤(NK)细胞。

发明内容

本公开方法

在一些方面，本公开提供用于鉴定处于癌症发展风险下的受试者的方法。在一些方面，本公开提供在受试者中检测癌症的方法。在一些方面，处于风险下的受试者具有一个或多个不确定肺结节。

在一些方面，本公开提供用于鉴定处于肺癌发展风险下的受试者的方法。在一些方面，本公开提供在受试者中检测肺癌的方法。

在一些方面，本公开提供用于鉴定处于癌症发展风险下的受试者的方法，包括：从人类受试者获得测试样品；进行循环肿瘤细胞(CTC)富集步骤，包括：从样品中去除血浆，从样品中去除红细胞，使样品与至少一种结合细胞表面标志物的亲和剂接触，和从样品中耗尽表达细胞表面标志物的细胞；用标记核酸探针杂交样品中富集的细胞；通过检测来自细胞的荧光原位杂交评估所选细胞的信号模式；基于标记核酸探针与所述所选细胞的杂交模式检测CTC；和当每个样品的CTC数量高于预定的临界值时，鉴定受试者处于肺癌发展的风险下。

在一些方面，本公开提供用于鉴定处于癌症发展风险下的受试者的方法，包括：从人类受试者获得测试样品；进行循环肿瘤细胞(CTC)富集步骤，包括：从样品中去除血浆，从样品中去除红细胞，使样品与至少一种结合细胞表面标志物的生物素化亲和剂接触，和使样品与链霉亲和素包被的磁性颗粒接触并从样品中耗尽表达细胞表面标志物的细胞；用标记核酸探针杂交样品中富集的细胞；通过检测来自细胞的荧光原位杂交评估所选细胞的信号模式；基于所有4种标记核酸探针与所述所选细胞的杂交模式检测CTC；和当每个样品的CTC数量高于预定的临界值时，鉴定受试者处于肺癌发展的风险下。

在一些方面，处于癌症发展风险下的受试者处于肺癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、胰腺癌、食道癌、所有胃肠肿瘤、泌尿生殖道肿瘤、肾癌、黑色素瘤、内分泌肿瘤、肉瘤等发展的风险下。在一些方面，受试者处于肺癌发展的风险下。

在一些方面，测试样品包含血细胞。在一些方面，测试样品包含唾液、外周血细胞、骨髓或者从血液或骨髓分离的干细胞。在一些方面，测试样品为外周血。

在一些方面，通过外周血抽取从受试者获得外周血。

循环肿瘤细胞富集

本公开提供一种从测试样品中富集和分离循环肿瘤细胞(CTC)的改进和优越方法。在一些方面，本公开提供一种进行循环肿瘤细胞(CTC)富集步骤的方法，包括：从样品中去除血浆，从样品中去除红细胞，使样品与至少一种结合细胞表面标志物的生物素化亲和剂接触，和使样品与链霉亲和素包被的磁性颗粒接触并从样品中耗尽表达细胞表面标志物的细胞。

在一些方面，从测试样品中富集CTC，其中测试样品为全血。在一些方面，样品为新鲜血液。在一些方面，样品为固定血液。在一些方面，固定血液为使用交叉连接蛋白和DNA的化学物质稳定，使得显著减缓或停止正常的凝血和降解过程的血液。

在一些方面，从样品中去除血浆。在一些方面，通过离心从样品中去除血浆。在一些方面，将样品离心至少1min、至少2min、至少3min、至少4min、至少5min、至少6min、至少7min、至少8min、至少9min、至少10min、至少11min、至少12min、至少13min、至少14min、至少15min或至少20min。在一些方面，将样品离心10min。在一些方面，样品以100xg、200xg、300xg、400xg、500xg、600xg、700xg、800xg、900xg或1000xg离心。在一些方面，样品以700xg离心。

在一些方面，离心后，将血浆从样品中取出并储存于-80℃下。

在一些方面，去除中性粒细胞、单核细胞和粒细胞降低如通过FISH分析的假阴性样品率。

在一些方面，从样品中去除红细胞。在一些方面，红细胞通过细胞裂解去除。在一些方面，样品与红细胞裂解缓冲液接触。在一些方面，红细胞裂解缓冲液为氯化铵裂解缓冲液。在一些方面，红细胞裂解缓冲液含有氯化铵。在一些方面，红细胞裂解缓冲液含有碳酸氢钠。在一些方面，红细胞裂解缓冲液含有乙二胺四乙酸(EDTA)。在一些方面，红细胞裂解缓冲液含有氯化铵(8.29克)、碳酸氢钠(0.2克)、乙二胺四乙酸(1.1克)和水(90.494毫升)。在一些方面，红细胞裂解缓冲液以0.01M-5M、0.1M-4M、0.5M-3M或1M-2M的浓度含有氯化铵。在一些方面，红细胞裂解缓冲液以1.0M、1.1M、1.2M、1.3M、1.4M、1.5M、1.55M、1.6M、1.7M、1.8M、1.9M或2M的浓度含有氯化铵。在一些方面，红细胞裂解缓冲液以1mM-200mM、5mM-150mM、15mM-100mM或20mM-40mM的浓度含有碳酸氢钠。在一些方面，红细胞裂解缓冲液以20mM、21mM、22mM、23mM、24mM、25mM、26mM、27mM、28mM、29mM或30mM的浓度含有碳酸氢钠。在一些方面，红细胞裂解缓冲液以1mM-200mM、5mM-150mM、15mM-100mM或25mM-45mM的浓度含有乙二胺四乙酸。在一些方面，红细胞裂解缓冲液以30mM、31mM、32mM、33mM、34mM、35mM、36mM、37mM、37.6mM、38mM、39mM、40mM、41mM、42mM、43mM、44mM或45mM的浓度含有乙二胺四乙酸。

在一些方面，新鲜血液和固定血液样品的碳酸氢钠浓度不同。在一些方面，不同的碳酸氢钠浓度改变尺寸和粒度发生变化的粒细胞的数量。在固定血液中，广泛使用的碳酸氢盐浓度会导致粒细胞左移(尺寸减小)。在一些方面，碳酸氢钠浓度的增加会加剧观察结果。在一些方面，较低的碳酸氢钠浓度会挽救表型(粒细胞保持正常尺寸)。

在一些方面，在红细胞去除后，使用磁性耗尽从样品中进一步去除细胞。在一些方面，样品与至少一种生物素化亲和剂接触。在一些方面，生物素化亲和剂结合细胞表面标志物。在一些方面，细胞表面标志物对细胞类型具有特异性。在一些方面，细胞类型为中性粒细胞、单核细胞、浆细胞或淋巴细胞。在一些方面，细胞类型为中性粒细胞或单核细胞。在一些方面，淋巴细胞为B细胞及其亚群、自然杀伤(NK)细胞及其亚群或T细胞及其亚群。在一些方面，B细胞为幼稚B细胞或成熟B细胞。在一些方面，T细胞为辅助性T细胞、细胞毒性T细胞或调节性T细胞。在一些方面，细胞表面标志物为CD66b、CD14、CD3、CD4、CD8、CD17、CD56、CD19、CD20、CD25、IgM或IgD。在一些方面，细胞表面标志物为CD66b或CD14。在一些方面，中性粒细胞表面标志物为CD66b。在一些方面，单核细胞表面标志物为CD14。在一些方面，CD56为自然杀伤细胞表面标志物。在一些方面，CD19、CD20、IgM和IgD为B细胞表面标志物。

在一些方面，生物素化亲和剂为抗CD66b抗体。在一些方面，生物素化亲和剂为抗CD14抗体。在一些方面，生物素化亲和剂为抗CD3抗体。在一些方面，生物素化亲和剂为抗CD4抗体。在一些方面，生物素化亲和剂为抗CD8抗体。在一些方面，生物素化亲和剂为抗CD17抗体。在一些方面，生物素化亲和剂为抗CD56抗体。在一些方面，生物素化亲和剂为抗CD19抗体。在一些方面，生物素化亲和剂为抗CD20抗体。在一些方面，生物素化亲和剂为抗CD25抗体。在一些方面，生物素化亲和剂为抗IgM抗体。在一些方面，生物素化亲和剂为抗IgD抗体。

在一些方面，使用生物素化亲和剂的组合。在一些方面，样品与至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种或至少十种生物素化亲和剂接触。在一些方面，样品与至少两种生物素化亲和剂接触。在一些方面，样品与至少三种生物素化亲和剂接触。在一些方面，样品与至少四种生物素化亲和剂接触。在一些方面，样品与至少五种生物素化亲和剂接触。在一些方面，样品与抗CD66b抗体和抗CD14抗体接触。在一些方面，样品与抗CD66b抗体、抗CD14抗体和抗CD13抗体接触。在一些方面，样品与抗CD66b抗体、抗CD14抗体、抗CD13抗体和抗CD56抗体接触。在一些方面，样品与抗CD66b抗体、抗CD14抗体、抗CD13抗体和抗CD19抗体接触。在一些方面，样品与抗CD66b抗体、抗CD14抗体、抗CD13抗体、抗CD56抗体和抗CD19抗体接触。

在一些方面，使样品与生物素化亲和剂接触后，样品与链霉亲和素包被的磁性颗粒接触。在一些方面，与链霉亲和素包被的磁性颗粒一起温育后，使样品暴露于磁体，以将表达靶向细胞表面标志物的细胞与样品磁性分离。

亲和剂

在一些方面，本公开的亲和剂为生物素化亲和剂。在一些方面，链霉亲和素包被的颗粒用于结合生物素化亲和剂并耗尽和/或收获与对特定细胞表面标志物特异性的生物素化亲和剂结合的细胞。在一些方面，本公开的亲和剂与磁性颗粒直接缀合。在一些方面，本公开的亲和剂为抗藻红蛋白(PE)微珠。在一些方面，抗PE微珠用于用PE缀合的一级抗体间接磁性标记和分离细胞。在一些方面，本公开的亲和剂为地高辛(DIG)缀合抗体，并且抗DIG磁性珠粒/颗粒用于本公开的方法。

经正向选择富集CTC

在一些方面，CTC富集步骤进一步包括：使样品与至少一种结合细胞表面标志物的另外生物素化亲和剂接触，使样品与链霉亲和素包被的磁性颗粒接触并收集表达细胞表面标志物的细胞。在一些方面，然后将收集的细胞用于本文所述的FISH测定。在一些方面，细胞表面标志物为CD66b、CD14、CD3、CD4、CD8、CD17、CD56、CD19、CD20、CD25、IgM或IgD。在一些方面，细胞表面标志物为包含CD19、CD20、IgM或IgD的B细胞特异性标志物。在一些方面，细胞表面标志物为CD66b、CD14、CD3、CD4、CD8、CD17、CD56、CD19、CD20、CD25、IgM或IgD。在一些方面，至少一种另外的生物素化亲和剂包含抗CD19抗体、抗CD20抗体、抗IgM抗体或抗IgD抗体。在一些方面，收集的细胞包含淋巴细胞。在一些方面，淋巴细胞为B细胞。

在一些方面，细胞表面标志物为B细胞特异性细胞表面标志物。在一些方面，B细胞特异性细胞表面标志物为CD19。在一些方面，至少一种生物素化亲和剂包含抗CD19抗体。

在一些方面，正向选择和负向选择方法可以结合。例如，可从样品中耗尽表达一种或多种细胞表面标志物的细胞(负向选择)，然后收集表达一种或多种另外表面标志物的细胞(正向选择)。

细胞冷冻保存和安瓿解冻

在一些方面，用多聚甲醛溶液固定包括未在CTC富集程序中使用的白细胞的血细胞，并用含有10％ FBS的PBS洗涤一次。在一些方面，将细胞重悬于含有10％ DMSO的1mL冷冻保存培养基中并在-80℃冷箱中缓慢冷冻(-1℃/min)且然后转移至液氮中。在一些方面，将冷冻细胞的等分试样在37℃水浴中解冻约2分钟，然后用含有10％FBS的10mL PBS洗涤两次以减少DMSO。

荧光原位杂交

在一些方面，本公开的方法进一步包括使CTC富集后的细胞与标记核酸探针接触，并通过荧光原位杂交检测杂交的细胞。在一些方面，核酸探针对CTC中最频繁地扩增或缺失的任何遗传标志物具有特异性。在一些方面，核酸探针为3p22.1、10q22.3、10号染色体着丝粒(cep10)、3q29或3号染色体着丝粒(cep3)特异性的。在一些方面，3p22.1的标记核酸探针为RPL14、CD39L3、PMGM或GC20探针。在一些方面，10q22.3的标记核酸探针为表面活性剂蛋白A1或表面活性剂蛋白A2探针。

在一些方面，在CTC富集后，细胞用卡诺氏固定液(甲醇和冰乙酸的3:1溶液)固定30分钟。在一些方面，细胞使用95％乙醇固定。细胞固定后，样品与蛋白酶接触。在一些方面，蛋白酶为胃蛋白酶。与蛋白酶一起温育后，样品与标记的核酸接触。

CTC鉴定

在一些方面，当核酸探针的杂交模式描绘细胞中两个或更多个染色体区域的增加时，鉴定CTC。在一些方面，当核酸探针的杂交模式描绘细胞中两个或更多个染色体区域的缺失时，鉴定CTC。

在一些方面，如果FISH杂交模式显示每种颜色的2个斑点，表明每种核酸探针有两个拷贝，则细胞分类为正常。在一些方面，缺失为属于核酸探针的一个或多个斑点的丧失，表明靶基因序列的缺失。在一些方面，增加为属于核酸探针的另外斑点的出现，表明靶基因序列的重复。在一些方面，将CTC定义为两个或更多个不同核酸探针的增加。

图像采集和分析

在一些方面，含有细胞的载玻片使用Bioview Allegro-Plus显微镜系统(BioviewUSA,Billerica,MA)成像。在一些方面，使用60x物镜(Olympus,UPlanSapo,1.35NA油浸)和使用Bioview Duet软件控制的FLIR Grasshopper 3单色相机(12位,2448x 2048像素,3.4μm像素尺寸)获取图像。在一些方面，所有细胞均用21个横切面成像，跨度为0.65μm。

在一些方面，目标通过Bioview Duet软件根据探针拷贝数变化进行分类(“正常”细胞显示每种颜色的2个斑点，“缺失”为一个或多个斑点的丧失，“单一增加”为一种颜色中的额外斑点，和“CTC”定义为两个或更多个通道中的增加)。在一些方面，持证技术人员通过Bioview Duet软件分析“CTC”类别中分箱的细胞以验证每个细胞。CTC计数通过将CTC计数除以分析的细胞总数并乘以10,000来归一化。每个受试者分析最少10,000个细胞。每个受试者的总CTC计数、总细胞计数和归一化CTC计数被发送用于揭盲。

癌症风险评估

在一些方面，CTC计数大于0.5CTC/10,000个细胞代表肺癌风险。在一些方面，CTC计数大于1CTC/10,000个细胞代表肺癌风险。在一些方面，CTC计数大于2CTC/10,000个细胞代表肺癌风险。在一些方面，CTC计数大于3CTC/10,000个细胞代表肺癌风险。在一些方面，CTC计数大于4CTC/10,000个细胞代表肺癌风险。在一些方面，CTC计数大于5CTC/10,000个细胞代表肺癌风险。在一些方面，CTC计数大于10CTC/10,000个细胞代表肺癌风险。在一些方面，CTC计数大于20CTC/10,000个细胞代表肺癌风险。

在一些方面，CTC计数大于5CTC/10,000个细胞的受试者转诊进行结节的手术切除。

本公开提供在受试者中评估癌症的方法，包括通过本公开的方法确定含有来自患者的血细胞的样品中循环肿瘤细胞(CTC)的水平，其中与来自非侵袭性形式癌症的CTC的对照或预定数量相比较，样品中较高水平的CTC指示侵袭性形式的癌症和/或癌症预后不佳。

本公开提供在受试者中将癌症分期的方法，包括通过本公开的方法确定含有来自受试者的血细胞的样品中的循环肿瘤细胞(CTC)，其中与给定阶段的预定对照相比较样品中较高水平的CTC指示癌症的较晚期，而与给定阶段的对照相比较样品中较低水平的CTC指示癌症的较早期。

癌症

本公开展望了使用测定来检测癌症并预测其与癌症疗法结合的进展。在一些情况下，当患者怀疑处于癌症风险下时，可采用预防性治疗。在其他癌症受试者中，诊断可允许早期治疗干预。在仍然其他情况下，本文所述的测定结果可提供关于重复治疗的需要的有用信息，例如，当存在转移性、复发性或残留疾病的可能性的时候。最后，本公开可证明在证实哪些疗法对特定患者提供和不提供益处方面是有用的。

此外，本申请中描述的方法能够转化成用于从任何其他类型会导致血液传播转移的癌症中分离循环肿瘤细胞的方法。这将包括肺癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、胰腺癌、食道癌、所有胃肠肿瘤、泌尿生殖道肿瘤、肾癌、黑色素瘤、内分泌肿瘤、肉瘤等。

本发明可用于肺癌的预后和诊断，其可通过多种组织学分类来定义，包括：鳞状细胞癌比如鳞状癌；小细胞癌比如燕麦细胞癌、中间型细胞癌、复合性燕麦和细胞癌；腺癌比如腺泡状腺癌、乳头状腺癌、细支气管肺泡癌和伴粘液形成的实体癌；大细胞癌比如巨细胞癌和透明细胞癌；腺鳞癌；类癌；以及支气管腺癌比如腺样囊性癌和粘液表皮样癌。用这些探针可诊断和预后其他吸烟相关癌症。头和颈部鳞状细胞癌具有与肺癌相同的风险因素，并且假设其病因学相似(Shriver,1998)。类似地，吸烟为膀胱癌、头癌、颈癌、肾癌、胰腺癌和上呼吸道癌(包括口腔癌、咽喉癌、咽癌、喉癌或食道癌)的病因。

A.肿瘤发生

本领域已对肿瘤组织中各种基因的缺失进行了深入研究。然而，仍然需要对检测癌症发展中的早期分子事件以及使患者对癌症发展易感的分子事件有意义的探针。用于癌症分期的探针也令人感兴趣。所提出的导致肿瘤发生的序列包括细胞或亚显微水平上的遗传不稳定性，如染色体的缺失或增加所证明的，由于理论上获得赋予选择性增殖优势的因素所致，导致了过度增殖状态。进一步地，在遗传水平上，细胞周期抑制因子和肿瘤抑制基因(TSG)功能的丧失，或驱动细胞增殖的致癌基因的扩增，均有牵涉。

在增生后，组织学上识别出一系列进行性程度的发育不良、原位癌和最终的肿瘤侵袭。这些组织学变化之前和并行有遗传损伤的进行性累积。在染色体水平上，遗传不稳定性表现为染色体的缺失或增加，以及染色体结构的变化，比如染色体的易位和反转，以及标记染色体的演变。另外，细胞可经受多倍体化。肿瘤细胞的单个或多个克隆可以演变，在许多情况下特征为非整倍体细胞群。这些可通过经技术比如流式细胞术或图像分析测量相对于患者正常细胞的DNA含量或倍性来定量。

B.预后因素和分期

癌症在诊断时的阶段为癌症扩散到什么程度的指示，并且可为关于患者存活的最重要预后因素之一。分期系统对每种类型的癌症具有特异性。例如，目前关于非小细胞型肺癌患者存活的最重要预后因素为诊断时的疾病阶段。例如，关于非小细胞型肺癌患者存活的最重要预后因素为诊断时的疾病阶段。相反地，小细胞癌通常呈现广泛分布扩散，因此分期系统不太适用。分期系统基于癌症的解剖程度设计，并且基于解剖学尺寸及肺和邻近结构、区域淋巴结和远处转移内的扩散现称为TNM(肿瘤、淋巴结、转移)系统。目前治愈性程序的唯一希望在于肿瘤的可手术性，只有当疾病处于低阶段且当局限于起源器官时才可切除。

C.肿瘤的分级

肺癌的组织学类型和级别确实在疾病阶段内具有一些预后影响，据报道I期腺癌的预后最好，细支气管肺泡型和乳头状亚型的5年存活率为50％和1年存活率为65％和59％(Naruke等人,1988；Travis等人,1995；Carriaga等人.,1995)。鳞状细胞癌和大细胞癌的5年存活率为约35％。小细胞癌预后最差，局部疾病患者的5年存活率仅为12％(Carcy等人,1980；Hirsh,1983；Vallmer等人,1985)。对于远处转移患者，无论组织学亚型如何，5年存活率仅为1-2％(Naruke等人,1988).除组织学亚型之外，已经表明亚型内癌的组织学分级具有预后价值，高分化肿瘤比低分化肿瘤具有更长的总存活期。高分化局部腺癌的总存活率为69％，相比较低分化腺癌患者的存活率仅为34％(Hirsh,1983)。局部鳞状癌患者的5年存活率从高分化肿瘤的37％到低分化鳞状癌的25％变化(Ihde,1991)。

用于将肺肿瘤亚型化的组织学标准如下：鳞状细胞癌由具有角蛋白形成、角蛋白珠形成和/或细胞间桥的肿瘤组成。腺癌由实体瘤中具有明确的腺体形成或粘蛋白产生的肿瘤组成。小细胞癌由以具有卵圆形或梭形核、点状染色质和模糊核的小细胞组成的肿瘤组成。大细胞未分化癌由以具有泡状核和突出核仁而没有鳞状或腺体分化证据的大细胞组成的肿瘤组成。低分化癌包括含有鳞状和腺体分化两者区域的肿瘤。

D.癌的发展

肺癌的演变最有可能代表一种区域性癌变效应，这是由于整个呼吸消化系统遭受长期致癌损害比如苯并芘、石棉沉滞症、空气污染和香烟烟雾中的化学物质等致癌物质或其他环境致癌物。这一概念首先由Slaughter等人(1953)提出。区域性效应存在的证据为多个同时或异时性第二原发性肿瘤(SPT)的常见发生，其可在整个呼吸消化道中在口咽、食道上部或者同侧或对侧肺发展。

伴随这些分子缺陷的是组织学异常上皮变化的频繁表现，包括增生、化生、发育不良和原位癌。已经在吸烟者中证实，邻近的正常支气管上皮以及肿瘤前组织学病变可含有遗传改变细胞的克隆(Wistuba等人,2000)。

Licciardello等人(1989)发现，在上和下呼吸消化道中，异时性肿瘤的发生率为10-40％和同时性SPT的发生率为9-14％，主要地在最早期原发性肿瘤患者中，SPT可能赋予比初始原发性肿瘤复发更高的风险，并且可证明是成功治疗早期原发性头、颈或肺部肿瘤后长期存活的主要威胁。因此，仔细跟踪这些患者在新恶性肿瘤的风险部位中新SPT的证据至关重要，特别是在呼吸消化系统中。

除微观水平上的染色体变化之外，多个盲支气管活检可在邻近肺癌区域的基因座显示不同程度的上皮内瘤变。其他研究人员已经表明，在大多数轻和重度吸烟者以及所有因癌症而手术切除的肺部，存在从纤毛丧失和基底细胞增生到CIS范围内的上皮变化(Auerbach等人,1961)。Voravud等人(1993)通过使用7号和17号染色体的染色体特异性探针的原位杂交(ISH)研究证实，邻近肿瘤的30-40％组织学正常上皮显示这些染色体的多体性。另外，与没有癌证据的患者的正常对照口腔上皮相比较，最接近癌的组织中多体性的频率逐渐增加。在较接近肿瘤区域基因型异常增加的发现支持区域性癌变的概念。有趣的是，如在邻近其中测量染色体的Feulgen染色切片中于正常出现的粘膜中测量到DNA含量没有增加，这或许反映了为改变DNA指数而获得的DNA不足。有趣的是，在接近癌症的发育不良区域和癌性区域两者中注意到非常相似的DNA含量增加，这表明在邻近肺癌的发育不良上皮中已经确认了复杂的克隆性核型异常。其他研究也显示，在最接近癌症区域的发育不良病变中，显示p53突变的细胞数量增加，这些病变也无一例外地发生了p53突变。最近在吸烟者的肿瘤和发育不良上皮中显示的其他染色体异常包括3p、17p、9p和5q的缺失(Feder等人,1998；Yanagisawa et al.,1996；Thiberville et al.,1995)。

E.肺癌中的染色体缺失

小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌通常在3号染色体的短臂上显示细胞遗传学上可见的缺失(Hirano等人,1994；Valdivieso等人,1994；Cheon等人41993；Pence等人,1993)。这种3p缺失在吸烟患者的肺部肿瘤组织中比非吸烟患者更频繁地发生(Rice等人,1993)。由于约85％的肺癌患者为重度吸烟者(Mrkve等人,1993)，3p可能含有与烟草致癌物暴露相关的特定DNA基因座。据报道，3p缺失发生在肺部癌变的早期，比如支气管发育不良(Pantel等人,1993)。除细胞遗传学可见缺失之外，杂合性缺失(LOH)研究已将3-21.3定义为经受单独或组合缺失的不同区域之一(Fontanini等人,1992；Liewald等人.,1992)。其他几个组在肺癌中发现了3p21.3处的大量纯合子缺失(Macchiarini等人,1992；Miyamoto等人,1991；Ichinose等人,1991；Yamaoka等人,1990)。将3-21.3-3p21.2的DNA片段转移到肺肿瘤细胞系中可抑制肿瘤发生(Sahin等人,1990；Volm等人,1989)。这些发现强烈地表明，在该特定染色体区域中存在至少一个肿瘤抑制基因，其缺失将引发肺部癌变。

肺癌的细胞遗传学观察结果已显示出染色体3p的缺失率的不寻常一致性。事实上，小细胞肺癌(SCLC)在染色体3p的某些区域内显示出100％缺失率。非小细胞肺癌(NSCLC)显示出70％缺失率(Mitsudomi等人,1996；Shiseki等人,1996)。杂合性缺失和比较基因组杂交分析显示，3p14.2和3p21.3之间的缺失为肺癌最常见的发现，并且假定是肺部肿瘤发生中最关键的变化(Wu等人,1998)。已经假设3p21.3带为肺癌肿瘤抑制基因的位置。该假设得到了3号染色体转移研究的支持，这降低了肺腺癌的致瘤性。

对非小细胞肺癌的等位基因型研究表明，27％病例的染色体10q上遗传物质缺失。对10号染色体等位基因缺失的研究表明，小细胞肺癌中LOH的发生率非常高，高达91％(Alberola等人,1995；Ayabe等人,1994)。与非转移性SCC仅在14％的病例具有可见LOH相比较，在转移性鳞状细胞癌(SCC)中，于56％的病例注意到10q上等位基因具有统计学意义的LOH(Ayabe等人,1994)。NSCLC的其他亚型未见LOH。另外，使用微卫星多态性分析，表明D10s677和D1051223之间存在高缺失发生率。该区域跨越10号染色体长臂的q21-q24带，并与一项晚期高级膀胱癌研究中缺失的区域重叠，该研究显示在10q22.3-10q23.1的2.5cM区域内高频率的等位基因缺失(Kim等人,1996)。

通过核尺寸分选和选择

在一个方面，本公开提供根据核尺寸或核/质比分离和/或分类CTC。这些方法可包括物理分选，比如通过FACS或其他细胞核分选手段，但是使用计算机驱动的尺寸分析来分析光学数据，或者通过手动探询细胞核，比如通过使用标准光学显微镜术。一般地，对细胞核染色以允许进行评估/分选，比如用DAPI(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚)。在某些实施方案中，细胞核将从细胞中获得并自行分选。可使用标准细胞裂解方案裂解细胞。

A.Bioview系统和软件

Bioview Duet^TM(Rehovot,Israel)系统使用彩色或单色CCD相机通常对细胞修复时呈现的所有有核细胞进行成像和分类。分类的细胞数量由操作员预先设置，然而通常扫描几千个细胞。有一种“研究”模式或开放的软件系统，然后对每个细胞记录：

1)基于DAPI染色的核面积(以像素为单位)，表示为任意单元，因此，如果5000，则意指细胞面积为5000像素；

2)核直径；和

3)圆度因子(CF)，通过修改延伸率(细胞高度和宽度之间的比例)计算，其中完美圆形的值为1(淋巴细胞的CF接近1，异常细胞由于其核周长不规则所致CF>>1)。

为增加CTC的产量，本发明人进行了以下测量并然后调整软件，以便提高异常细胞的产量和减少正常淋巴细胞的数量。

异常(恶性CTC)细胞的核面积为基于如基于DAPI染色(核染色)测量的核占据的像素数(如通过FISH多体性定义为>2)，并在任意单元中表示。

淋巴细胞的核面积为通过FISH为二倍体的血液中淋巴细胞占据的像素数，圆度因子接近1。测量方式为通过观察来自许多恶性样本(“内部”对照淋巴细胞)的淋巴细胞的平均核像素面积，以及记录来自已知健康且无既往恶性肿瘤或其血流中恶性细胞病史的患者的对照样本或“外部”对照淋巴细胞内淋巴细胞的平均核像素面积进行推导。类似地，记录对许多“异常”细胞(循环肿瘤细胞)的核面积的观察结果，这些细胞定义为来自已知肺癌患者的具有2个或更多个多体性(额外染色体)的细胞。本发明人表明，CTC的核面积远超过任意阈值，如下所述。

在其中CTC的绝对数量为诊断性的实施方案中，4个或更多个CTC的发现将指示患者患有癌症。本发明人注意到，一些缓解若干年的患者可显示出一些CTC(最小残留疾病；如本文定义的少于4个CTC)，这些CTC可能代表休眠CTC。据说CTC的半衰期为约4-8小时，因此有一个不断补充的来源。目前，这是一种生物学密切相关的现象，因为在若干年的明显“缓解”之后，患者可能会复发并死亡，很可能牵涉这些休眠的CTC。

B.阈值

基于患有肺癌患者血液中CF接近1的淋巴细胞的平均像素面积选择阈值为78。该阈值显著低于对异常细胞(通过FISH多体性定义为>2)注意到的平均像素。

C.分类

创建了具有排除项的重复任务，使得系统仅开始对Ficoll纯化样本内大于78的细胞进行分类。因此，排除包含淋巴细胞平均核面积的小于78的所有细胞，并仅对满足导出标准(阈值>78)的细胞进行分类且呈递给操作员进行交互评估。另外，Bioview系统创建饼形图以显示二倍体细胞、非整倍体细胞(单一增加或缺失)和异常细胞(至少如通过FISH探针、3cen、3p、3q、10cen和10q定义的2个或更多个基因的多体性)。

仪器任务设置为扫描几千个细胞，使得可从几千个图像中选择至少500个完整且非重叠的具有导出标准的(阈值>78)细胞，其呈递给操作员以进行额外信号(增加)或信号丧失(缺失)的交互评估。

当评估扫描的细胞时，操作员将首先根据饼形图检查不同类别的细胞，检查以定义为具有额外拷贝的至少2个染色体的“异常”细胞开始，然后检查单一增加和缺失类别，并且最后交互分析剩余的细胞直至500个细胞已经评分。

基因探针

本公开包括使所选细胞与标记核酸探针接触，并通过荧光原位杂交检测杂交细胞。这些探针可对CTC中最频繁扩增或缺失的任何遗传标志物具有特异性。特别是，探针可为3p22.1探针，其为与着丝粒3结合靶向RPL14、CD39L3、PMGM或GC20的核酸探针；与着丝粒10结合的10q22-23探针(包含表面活性剂蛋白A1和A2)；或PI3激酶探针。其他遗传标志物可包括但不限于着丝粒3、7、17、9p21、5p15.2、EGFR、C-myc8q22和6p22-22。对于基因探针的进一步讨论参见美国公开第2007/0218480号，其通过引用以其全部结合至本文中。

3p22.1基因探针

3p22.1探针为与着丝粒3结合靶向RPL14、CD39L3、PMGM或GC20的核酸探针。人类核糖体L14(RPL14)基因(GenBank Accession NM_003973)和基因CD39L3(GenBank AccessionAAC39884和AF039917)、PMGM(GenBank Accession P15259和J05073)和GC20(GenBankAccession NM_005875)从BAC(GenBank Accession AC104186，通过引用结合至本文中)中分离，并且位于各种肺部肿瘤缺失重叠最小区域内的3p22.1带。RPL14基因序列含有高度多态性的三核苷酸(CTG)重复序列，其编码可变长度的多聚丙氨酸束。多聚丙氨酸束在具有发育意义的结合DNA或调控转录的基因产物中发现。例如，果蝇的Engraled、Kruppel和Even-Skipped蛋白均含有作为转录抑制因子的多聚丙氨酸束。据了解，多聚丙氨酸束在无义介导的mRNA衰变途径中起关键作用，该途径清除细胞异常蛋白和转录物。RPL14的基因型分析表明，该基因座在正常群体中为68％杂合的，相比，NSCLC细胞系中为25％。源于正常支气管上皮的细胞培养物显示出65％的杂合性水平，反映了正常群体的杂合性水平。也参见RP11-391M1/AC104186。

具有调控功能的基因比如RPL14基因，以及基因CD39L3、PMGM和GC20及其类似物为用于诊断致瘤事件的良好候选物。已经假定RPL14蛋白的功能变化可经编码蛋白的三核苷酸重复序列的DNA缺失机制发生。这种缺失机制使RPL14基因成为一个有吸引力的序列，可用作肺癌风险研究的标志物(Shriver等人,1998)。另外，RPL14基因在按种族定义的群体中显示出等位基因频率分布的显著差异，使该序列成为用于研究种族调整型肺癌的有用标志物(Shriver等人,1998)。因此，该基因可用于肺癌的早期检测和化学预防研究中作为中间生物标志物。

3p21.3基因探针

结构特征

最近，人类核糖体L14(RPL14)基因(GenBank Accession NM_003973,SEQ ID NO:1)以及基因CD39L3(GenBank Accession AAC39884和AF039917；SEQ ID NO:3)、PMGM(GenBank Accession P15259和J05073；SEQ ID NO:5)和GC20(GenBank Accession NM-005875；SEQ ID NO:7)从BAC(GenBank Accession AC019204，通过引用结合至本文中)中分离，并且位于各种肺部肿瘤缺失重叠最小区域内的3p21.3带。RPL14基因序列含有高度多态性的三核苷酸(CTG)重复序列，其编码可变长度的多聚丙氨酸束。多聚丙氨酸束在具有发育意义的结合DNA或调控转录的基因产物中发现。例如，果蝇的Engraled、Kruppel和Even-Skipped蛋白均含有作为转录抑制因子的多聚丙氨酸束。RPL14的基因型分析表明，该基因座在正常群体中为68％杂合的，相比，NSCLC细胞系中为25％。源于正常支气管上皮的细胞培养物显示出65％的杂合性水平，反映了正常群体的杂合性水平。

功能方面

具有调控功能的基因比如RPL14基因(SEQ ID NO:1)，以及基因CD39L3、PMGM和GC20(SEQ ID NOS:3,5和7)及其类似物为用于诊断致瘤事件的良好候选物。已经假定RPL14蛋白(SEQ ID NO:2)的功能变化可经编码蛋白的三核苷酸重复序列的DNA缺失机制发生。这种缺失机制使RPL14基因成为一个有吸引力的序列，可用作肺癌风险研究的标志物(Shriver等人,1998)。另外，RPL14基因在按种族定义的群体中显示出等位基因频率分布的显著差异，使该序列成为用于研究种族调整型肺癌的有用标志物(Shriver等人,1998)。因此，该基因可用于肺癌的早期检测和化学预防研究中作为中间生物标志物。

10q22基因探针

结构特征

在其他实施方案中，探针可为10q22-23探针，其包含与着丝粒10结合的表面活性剂蛋白A1和A2。10q22 BAC(46b12)为200Kb，并且邻近PTEN/MMAC1且为其着丝粒(GenBankAccession AF067844)，其处于10q22-23并可通过Research Genetics(Huntsville,Ala.)购买(图3)。10q22-25的改变与多种肿瘤相关，包括肺癌、前列腺癌、肾癌、子宫内膜癌、黑色素瘤和脑膜瘤，表明该区域中可能的影响若干癌症的抑制性基因座。编码双特异性磷酸酶的PTEN/MMAC1基因位于该区域，并且已经分离为在若干类型人类肿瘤中发生改变的肿瘤抑制基因，包括脑癌、膀胱癌、乳腺癌和前列腺癌。在一些癌症细胞系、异种移植和激素难治性癌症组织样本中已经发现了PTEN/MMAC1突变。由于本发明人的10q22BAC DNA序列邻近该区域，BAC 10q22中的DNA序列可能涉及人类肺癌的发生和/或进展。也参见RP11-506M13/AC068139.6。

肺相关表面活性剂蛋白A1(SP-A)位于10q22.3。表面活性剂蛋白-A-磷脂-蛋白复合物降低肺部肺泡的表面张力，并且在肺内宿主防御中起主要作用。表面活性剂蛋白-A1也存在于肺泡2型细胞中，其认为是肺部的假定干细胞。已知2型细胞参与肺泡损伤之后的修复和再生。因此，有可能是2型细胞表达端粒酶和C-MYC，导致表面活性剂蛋白的缺失和非小细胞肺癌的发展(图4)。10q22探针可用于临床生物标志物的进一步开发，以用于肿瘤事件的早期检测，用于风险评估和监测化学预防疗法的效力。

功能方面

微细胞介导的染色体转移为10q上存在肿瘤抑制基因提供了功能证据。生成的杂合克隆显示出在裸小鼠和软琼脂糖中不能增殖的抑制的致瘤表型。对肺癌中PTEN/MMAC1基因的序列分析显示，在30例测试的肺癌中有4例的G取代为C位于外显子1编码区上游8bp处，并且这似乎为一种多态性。TPEN/MMAC1基因的体细胞突变在肺癌的原发性和转移性部位的任何肿瘤中均没有鉴定，表明PTEN/MMAC1基因的点突变可能不是肺癌主要亚群肿瘤发生和进展的重要因素。其他更重要的肿瘤抑制基因肯定位于接近PTEN/MMAC1基因，在本发明人的10q22 BAC基因座附近。因此，10q22探针可用于进一步开发临床生物标志物，以用于肿瘤事件的早期检测，用于风险评估和监测化学预防疗法在高风险从前或当前吸烟者的效力。

C.商业探针组

任何商业探针或探针组也可与本公开一起使用。例如，可使用UroVysion DNA探针组(Vysis/Abbott Molecular,Des Plaines,Ill.)，其包括针对着丝粒3、着丝粒7、着丝粒17、9p21.3的探针。已经确认UroVysion探针可检测肺癌的早期变化。在其他实施方案中，可使用LaVysion DNA探针组(Vysis/Abbott Molecular,Des Plaines,Ill.)，其包括针对7p12(表皮生长因子受体)、8q24.12-q24.13(MYC)、6p11.1-q11(染色体计数(探针CEP 6)和5p15.2(包含SEMA5A基因)的探针。已经注意到LaVysion探针组检测到更高阶段或更晚期的肺癌。此外，针对着丝粒7/7p12(表皮生长因子受体)的单一探针组还可与本公开一起使用。

用于评估基因结构的方法

根据本公开，将利用各种探针来检查来自患者样品的基因组DNA的结构。各种各样的方法可用于检测不同染色体区域结构的变化。以下为这种方法的非限制性讨论。

A.荧光原位杂交和显色原位杂交

荧光原位杂交(FISH)可用于分子研究。FISH用于使用荧光显微镜术检测已与染色体杂交的高度特异性DNA探针。DNA探针用荧光或非荧光分子标记，然后通过荧光抗体检测。探针与靶染色体上的一个或多个特定区域结合。然后将染色体使用对比色染色，并使用荧光显微镜查看细胞。

每个FISH探针均对染色体的一个区域具有特异性，并在其整个长度上用荧光分子标记。每个显微镜载玻片含有许多中期。每个中期由完整的染色体组组成，每个探针均会寻找其一小段并本身与之结合。中期染色体涂片可用于可视化特定染色体和探针结合的确切区域。第一步为使探针DNA和染色体DNA两者中的双链DNA解体(变性)，以便它们可彼此结合。这通过在高温下于甲酰胺溶液中加热DNA来进行(70-75℃)。接下来，将探针至于载玻片上并将载玻片置于37℃的温育箱中过夜，以使探针与靶染色体杂交。一夜之间，探针DNA在特定染色体上寻找其靶序列并与之结合。链然后缓慢地再退火。将载玻片在盐/洗涤剂溶液中洗涤以去除任何未与染色体结合的探针，并将不同颜色的荧光染料添加到载玻片上以使所有染色体染色，使得然后可使用荧光显微镜查看它们。可同时混合并使用以不同荧光标签标记的两种或更多种不同探针。染色体然后用第三颜色染色以形成对比。这提供具有三种或更多种颜色的中期或间期细胞，可用于同时检测不同染色体，或者在其他靶序列之一缺失且探针不能与染色体结合的情况下提供对照探针。例如，该技术允许定位基因，并且也可对遗传缺陷进行直接形态学检测。

使用FISH探针测试等位基因杂合性缺失超过微卫星不稳定性的优势在于：

(a)FISH对感兴趣的细胞容易且快速地进行并且可用于石蜡包埋或者新鲜或冷冻组织，允许使用显微解剖；

(b)可基于逐个细胞分析与着丝粒探针相关的特定基因变化，使得可评估DNA序列的真实纯合性与杂合性(PCR^TM用于微卫星不稳定性可允许扩增来自纯合子缺失区域的正常细胞污染的周围正常DNA序列，赋予感兴趣的等位基因未缺失的假阳性印象)；

(c)PCR不能鉴定基因扩增；和

(d)使用细菌人工染色体(BAC)的FISH允许容易对使用特定引物对分离的感兴趣基因的特定染色体检测和定位。

显色原位杂交(CISH)使得可使用组织学实验室中已存在的方法获得组织形态学背景下的遗传信息。CISH允许对福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织使用常规酶促反应在明视野显微镜下检测基因扩增、染色体易位和染色体数量。美国公开第2009/0137412号，通过引用结合至本文中。例如，可在具有荧光功能的自动扫描仪上进行扫描(BioviewSystem,Rehovot,Israel)。

B.模板依赖性扩增方法

可提供多种模板依赖性过程用于扩增给定模板样品中存在的标志物序列。最著名的扩增方法之一为聚合酶链式反应(称为PCR^TM)，在美国专利第4,683,195、4,683,202和4,800,159号及Innis等人,1990中有详细描述，其每一项通过引用以其全部结合至本文中。

简言之，在PCR^TM中，制备与标志物序列的相对互补链上的区域互补的两个引物序列。将过量的脱氧核苷三磷酸与DNA聚合酶例如Taq聚合酶一起添加至反应混合物中。如果样品中存在标志物序列，引物将与标志物结合并且聚合酶将通过添加核苷酸而使引物沿标志物序列延伸。通过升高和降低反应混合物的温度，延伸的引物将与标志物解离以形成反应产物，过量引物将与标志物和反应产物结合，并且重复这一过程。

可进行逆转录酶PCR^TM扩增程序以量化扩增的mRNA的量。将RNA逆转录成cDNA的方法为众所周知的，并在Sambrook等人(1989)中进行了描述。用于逆转录的备选方法利用热稳定的RNA依赖性DNA聚合酶。在1990年12月21日递交的WO 90/07641中描述了这些方法。聚合酶链式反应方法为本领域众所周知的。

另一种用于扩增的方法为在EPO第320 308中公开的连接酶链式反应(“LCR”)，通过引用以其全部结合至本文中。在LCR中，制备两个互补探针对，并且在存在靶序列的情况下，每对将与靶标的相对互补链结合，使得其邻接。在存在连接酶的情况下，两个探针对将连接形成单个单元。通过如在PCR^TM中的温度循环，结合的连接单元与靶标解离，并然后用作用于连接过量探针对的“靶序列”。美国专利第4,883,750号描述了与用于使探针对与靶序列结合的与LCR类似的方法。

PCT申请第PCT/US87/00880号中描述的Qβ复制酶也可用作本公开中的仍然另一种扩增方法。在该方法中，在存在RNA聚合酶的情况下，向样品中添加具有与靶标互补的区域的RNA复制序列。聚合酶将拷贝复制序列，其然后可被检测。

一种等温扩增方法，其中使用限制性内切核酸酶和连接酶来实现在限制性位点的一条链中含有核苷酸5’-[α-硫代]-三磷酸酯的靶分子的扩增，也可用于本公开中的核酸扩增(Walker等人,1992)。

链置换扩增(SDA)为另一种进行核酸等温扩增的方法，其包括多轮链置换和合成，即缺口移位。一种类似方法，称为修复链式反应(RCR)，包括在整个目标扩增的区域退火几个探针，然后进行修复反应，其中四个碱基中只有两个存在。另外两个碱基可作为生物素化衍生物添加加入以便于检测。在SDA中使用一种类似方法。还可使用循环探针反应(CPR)检测靶标特异性序列。在CPR中，具有非特异性DNA的3’和5’序列和特异性RNA的中间序列的探针与样品中存在的DNA杂交。杂交后，用RNase H处理反应，并且探针的产物鉴定为消化之后释放的独特产物。将初始模板退火至另一个循环探针并重复反应。

根据本公开，可使用GB申请第2 202 328号和PCT申请第PCT/US89/01025号中描述的仍然另一种扩增方法，其每一项通过引用以其全部结合至本文中。在前者应用中，“修饰的”引物用于PCR类似的、模板和酶依赖性合成。可通过用捕获部分(例如生物素)和/或检测部分(例如酶)标记来修饰引物。在后者应用中，将过量的标记探针添加至样品中。在存在靶序列的情况下，探针结合并催化切割。切割之后，使靶序列完整释放以与过量探针结合。标记探针的切割表明靶序列的存在。

其他核酸扩增程序包括基于转录的扩增系统(TAS)，包括基于核酸序列的扩增(NASBA)和3SR(Kwoh等人,1989；Gingeras等人,PCT申请WO 88/10315，通过引用以其全部结合至本文中)。在NASBA中，核酸可通过标准苯酚/氯仿提取、临床样品热变性、用裂解缓冲液和minispin柱处理以分离DNA和RNA或氯化胍提取RNA来制备用于扩增。这些扩增技术包括退火具有靶标特异性序列的引物。聚合后，DNA/RNA杂合体用RNase H消化，同时双链DNA分子再次热变性。在任一情况下，通过添加第二靶标特异性引物然后聚合，使单链DNA完全双链化。然后通过RNA聚合酶比如T7或SP6将双链DNA分子多重转录。在等温循环反应中，将RNA逆转录成单链DNA，然后转化为双链DNA，并然后用RNA聚合酶比如T7或SP6再次转录。生成的产物，无论截短的还是完整的，均指示靶标特异性序列。

Davey等人(EPO第329 822号)(通过引用以其全部结合至本文中)公开了一种核酸扩增方法，包括循环合成单链RNA(“ssRNA”)、ssDNA和双链DNA(dsDNA)，其可根据本公开使用。ssRNA为第一引物寡核苷酸的模板，其通过逆转录酶(RNA依赖性DNA聚合酶)延伸。然后通过核糖核酸酶H(RNase H，一种对具有DNA或RNA的双链体中的RNA具有特异性的RNase)的作用将RNA从生成的DNA:RNA双链体中去除。产生的ssDNA为第二引物的模板，其还包括与其模板同源的RNA聚合酶启动子(以T7 RNA聚合酶为例)5’的序列。该引物然后通过DNA聚合酶(以大肠杆菌DNA聚合酶I的大“Klenow”片段为例)延伸，产生双链DNA(“dsDNA”)分子，其序列与引物之间的初始RNA相同，并且另外在一端具有启动子序列。该启动子序列可由适当的RNA聚合酶用于制备DNA的许多RNA拷贝。然后这些拷贝可重新进入循环，导致非常迅速的扩增。通过酶的适当选择，这种扩增可等温进行而不需要在每个循环中添加酶。由于该过程的周期性，起始序列可选择为DNA或RNA的形式。

Miller等人(PCT申请WO 89/06700)(通过引用以其全部结合至本文中)公开了一种基于启动子/引物序列与靶单链DNA(“ssDNA”)杂交，然后转录该序列的许多RNA拷贝的核酸序列扩增方案。该方案不是循环的，即新模板不从产生的RNA转录物产生。其他扩增方法包括“RACE”和“单边PCR”(Frohman,1990；Ohara等人,1989；每一项通过引用以其全部结合至本文中)。

基于在存在具有生成的“双寡核苷酸”序列的核酸的情况下连接两个(或更多个)寡核苷酸从而扩增双寡核苷酸的方法也可用于本公开的扩增步骤(Wu等人,1989，通过引用以其全部结合至本文中)。

C.Southern/Northern印迹

印迹技术为本领域技术人员众所周知的。Southern印迹包括使用DNA作为靶标，而Northern印迹包括使用RNA作为靶标。每一种均提供不同类型的信息，尽管cDNA印迹在许多方面类似于印迹或RNA种类。

简言之，探针用于靶向固定于合适基质(经常为硝化纤维素的过滤器)上的DNA或RNA种类。不同种类应在空间上分开以便于分析。这经常为通过核酸种类的凝胶电泳然后“印迹”到过滤器上来完成。

随后，在促进变性和再杂交的条件下，将印记的靶标与探针(通常标记的)一起温育。由于探针设计为与靶标碱基配对，因此探针将在复性条件下结合靶序列的一部分。然后去除未结合的探针，并如上所述完成检测。

D.分离方法

出于确定是否发生了特异性扩增的目的，通常合乎期望的是在一个或另一个阶段将扩增产物与模板和过量引物分离。在一个实施方案中，使用标准方法，通过琼脂糖、琼脂糖-丙烯酰胺或聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物。参见Sambrook等人,1989。

或者，色谱技术可用于实现分离。存在许多种可在本公开中使用的色谱法：吸附、分配、离子交换和分子筛，以及使用它们的许多专门技术，包括柱色谱、纸色谱、薄层色谱和气相色谱(Freifelder,1982)。

E.检测方法

产物可以可视化以确认标志物序列的扩增。一种典型的可视化方法包括用溴化乙锭对凝胶染色，并在UV光下可视化。或者，如果扩增产物用放射或荧光标记的核苷酸整体标记，然后扩增产物可在分离后暴露于x射线胶片或在适当的刺激光谱下可视化。

在一个实施方案中，间接地实现可视化。分离扩增产物后，使标记核酸探针与扩增的标志物序列接触。探针优选地与生色团缀合，但可以放射性标记。在另一个实施方案中，探针与结合伴侣比如抗体或生物素缀合，并且结合对的另一成员携带可检测部分。

在一个实施方案中，通过标记探针进行检测。涉及的技术为本领域技术人员众所周知的，并且可在关于分子方案的许多标准书籍中找到。参见Sambrook等人(1989)。例如，生色团或放射性标记探针或引物在扩增期间或之后识别靶标。

在美国专利第5,279,721号中描述了上述的一个实例，其通过引用结合至本文中，其公开了一种用于核酸自动电泳和转移的装置和方法。该装置允许电泳和印迹而无需对凝胶进行外部操纵，并且理想地适于根据本公开进行方法。

另外，上述扩增产物可使用标准序列分析技术进行序列分析以鉴定特定种类的变化。在某些方法中，通过使用为优化测序设计的引物组的序列分析来进行基因的详尽分析(Pignon等人,1994)。本公开提供可使用任何或所有这些类型的分析的方法。

F.试剂盒组件

检测上述染色体区域变化所需的所有基本材料和试剂可一起组装于试剂盒中。这通常包括预选引物和探针。还可包括适合于扩增核酸的酶(包括各种聚合酶(RT、Taq、Sequenase^TM等))、脱氧核苷酸和缓冲液以提供扩增所需的反应混合物，以及任选地标记剂，比如用于FISH的那些。这种试剂盒通常还将以合适的方式包括用于每种单独试剂和酶以及用于每种引物或探针的不同容器。

G.芯片技术

本发明人特别考虑的是基于芯片的DNA技术，比如Hacia等人(1996)和Shoemaker等人(1996)描述的那些。这些技术包括用于快速和准确地分析大量基因的定量方法。通过用寡核苷酸标记基因或使用固定探针阵列，可采用芯片技术将靶分子分离为高密度阵列，并使用方法比如荧光、电导、质谱、放射性标记、光学扫描或电泳筛选这些分子。也参见Pease等人(1994)；Fodor等人(1991)。

生物活性DNA探针可直接或间接地固定到表面上，以确保最佳接触和最大检测。当固定到基质上时，基因探针为稳定的，并且因此可重复地使用。一般而言，杂交在固定的核酸靶标上进行，或者探针分子附着于固体表面，比如硝化纤维素、尼龙膜或玻璃上。可使用许多其他基质材料，包括增强的硝化纤维素膜、活化石英、活化玻璃、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、聚苯乙烯基质、基于聚丙烯酰胺的基质、其他聚合物比如聚(氯乙烯)，聚(甲基丙烯酸甲酯)，聚(二甲基硅氧烷)，光聚合物(含有光反应性种类，比如氮烯、碳烯和能够与靶分子形成共价连接的羰自由基(Saiki等人,1994)。

可通过多种方法实现基因探针的固定，方法包括包含可锚定部分和锚定物的固定DNA之间的非共价或共价相互作用。DNA通常通过首先硅烷化玻璃表面，然后用碳二亚胺或戊二醛活化而与玻璃结合。备选程序可使用在DNA合成期间经在分子的3’或5’端结合的氨基接头与DNA连接的试剂比如3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷(GOP)或氨基丙基三甲氧基硅烷(APTS)。基因探针可使用紫外辐射直接与膜结合。对于硝化纤维素膜，将探针斑点化到膜上。使用UV光源照射斑点并诱导交联。用于交联的备选方法包括将斑点化膜在80℃下真空烘烤两小时。

固定可由非共价涂覆含有链霉亲和素或亲和素的固相并随后固定生物素化多核苷酸组成(Holmstrom,1993)。用聚L-Lys或聚-L-Lys,Phe预涂聚苯乙烯或玻璃固相，然后使用双功能交联试剂(Running,1990；Newton,1993)共价附着氨基或巯基修饰的多核苷酸，也可用于将探针固定到表面上。

固定也可通过将短的5’-磷酸化引物直接共价附着于化学修饰的聚苯乙烯板(“Covalink”板，Nunc)Rasmussen,(1991)而进行。通过与水溶性碳二亚胺缩合引入修饰的寡核苷酸和固相表面之间的共价键。该方法促进寡核苷酸经其5’-磷酸酯的主要5’-附着。

Nikiforov等人(美国专利第5,610,287号)描述了一种在含有-OH，-C＝O或-COOH亲水基团的亲水性聚苯乙烯固体支撑体或在玻璃固体支撑体上，在存在盐或阳离子洗涤剂的情况下非共价固定核酸分子的方法。使支撑体与含有合成核酸和阳离子洗涤剂或盐的pH为约6-约8的溶液接触。含有固定核酸的支撑体可用含有非离子洗涤剂的水溶液洗涤而不去除附着的分子。

基于芯片的DNA技术有两种常见变体，涉及具有已知序列身份的DNA微阵列。对于一种变体，探针cDNA(500～5,000碱基长)使用机器人斑点化固定于固体表面比如玻璃上，并分别地或以混合物暴露于一组靶标。该方法，“传统上”称为DNA微阵列，广泛认为由Stanford大学开发。Ekins和Chu(1999)最近的一篇文章提供了一些相关细节。另一变体包括原位(芯片上)合成或通过常规合成然后芯片上固定的寡核苷酸(20～25聚体寡聚物)或肽核酸(PNA)探针阵列。将阵列暴露于标记的样品DNA，杂交，并确定互补序列的身份/丰度。这种“历史上”称为DNA芯片的方法是由Affymetrix,Inc.开发，后者以

商标销售其产品。

核酸

本发明人提供一种方法，包括使所选细胞与标记核酸探针接触以形成杂交细胞的步骤，其中标记核酸的杂交指示CTC。然而，本公开不限于使用本文公开的特定核酸区段。相反，可采用多种靶向相同区域/多态性的备选探针。

探针和引物

自然地，本公开包含与靶序列互补或基本上互补的DNA区段。“互补”的核酸序列为能够根据标准Watson-Crick互补规则进行碱基配对的那些。如本文使用的术语“互补序列”意指基本上互补的核酸序列，如可通过以上阐述的相同核苷酸比较评估的，或者如定义为能够在相对严格条件比如本文所述的那些下与靶核酸区段杂交的。这些探针可跨越数百或数千个碱基对。

或者，杂交区段可为较短的寡核苷酸。17个碱基长的序列在人类基因组中应当仅出现一次，并且因此足以指定一个独特的靶序列。尽管较短的寡聚体更易于制备并增加体内可及性，但许多其他因素也参与了确定杂交的特异性。寡核苷酸与其互补靶标的结合亲和力和序列特异性两者均随着长度的增加而增加。考虑将使用约8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、250、500、700、722、900、992、1000、1500、2000、2500、2800、3000、3500、3800、4000、5000或更多个碱基对的示例性寡核苷酸，尽管还考虑其他碱基对的寡核苷酸。如上所述，考虑编码10,000、50,000、100,000、150,000、200,000、250,000、300,000和500,000个碱基的较长多核苷酸。例如，这种寡核苷酸和多核苷酸将可见于作为探针用于FISH、Southern和Northern印迹和作为引物用于扩增反应中。

应当理解，本公开不限于本文公开的特定探针，并且特别地旨在至少包含可与所公开的序列杂交的核酸序列或这些序列的功能序列类似物。例如，部分序列可用于鉴定结构相关基因或其来源的全长基因组或cDNA克隆。本领域的技术人员熟知用于产生可用作上述探针的靶标的cDNA和基因组文库的方法(Sambrook等人,1989)。

对于其中将本公开的核酸区段掺入到载体比如质粒、粘粒或病毒中的应用，这些区段可与其他DNA序列比如启动子、多腺苷酸化信号、限制性酶位点、多克隆位点、其他编码区段等组合，使得它们的总长度可以显著变化。考虑可采用几乎任何长度的核酸片段，总长度优选地受到制备和在预期重组DNA方案中使用的容易程度的限制。

可将编码特定基因的DNA区段引入到重组宿主细胞中，并用于表达特定结构或调控蛋白。或者，通过应用基因工程技术，可采用所选基因的子部分或衍生物。可分离含有调控区(比如启动子区)的上游区域并随后用于表达所选基因。

探针的标记

在某些实施方案中，有利的是将本公开的核酸序列与适当手段(比如标记)组合用于确定杂交。本领域已知各种各样的适当指示手段，包括荧光、放射性、化学发光、电致发光、酶促标签或其他配体，比如亲和素/生物素、抗体、亲和标记等，它们能够被检测。在优选的实施方案中，可以期望采用荧光标记，比如地高辛、光谱橙、荧光素、伊红、吖啶染料、罗丹明、Alexa 350、Alexa 430、AMCA、BODIPY630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPX-TMR、BODIPZ-TRX、级联蓝、Cy2、Cy3、Cy5、6-FAM、HEX、6-JOE、俄勒冈绿488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514、太平洋蓝、REG、ROX、TAMRA、TET或德克萨斯红。

在酶标签比如脲酶碱性磷酸酶或过氧化物酶的情况下，已知可用于提供人眼或分光光度法可见的检测手段的比色指示底物，以鉴定与含有互补核酸的样品的特异性杂交。亲和标记的实例包括但不限于以下：抗体、抗体片段、受体蛋白、激素、生物素、DNP或与亲和标记结合并可用于分离扩增基因的任何多肽/蛋白分子。

指示手段可直接附着于探针，或者其可通过抗原键合附着。在优选的实施方案中，地高辛在变性之前附着于探针，和荧光团标记的抗地高辛FAB片段在杂交之后添加。

杂交条件

合适的杂交条件将为本领域技术人员众所周知的。通过增加盐浓度和降低温度可使条件变得不太苛刻。例如，在约37℃-约55℃的温度下，约0.1-0.25M NaCl可提供中等严格条件，而在约20℃-约55℃范围内的温度下，约0.15M-约0.9M盐可提供低严格条件。因此，杂交条件可易于操纵，从而通常将是一种取决于期望的结果来选择的方法。

在其他实施方案中，杂交可例如在约20℃-约37℃的温度下在50mM Tris-HCl(pH8.3)、75mM KCl、3mM MgCl₂、10mM二硫苏糖醇的条件下实现。利用的其他杂交条件可包括在约40℃-约72℃范围内的温度下约10mM Tris-HCl(pH 8.3)、50mM KCl、1.5μM MgCl₂。甲酰胺和SDS也可用于改变杂交条件。

生物标志物和其他风险因素

各种预后意义的生物标志物可与以上讨论的特定核酸探针结合使用。这些生物标志物可助于预测低期癌症的存活期以及从肿瘤前病变到侵袭性肺癌的进展。这些标志物可包括如通过Ki-67(MIB1)测量的增殖活性、如通过使用CD34的VEGF和微血管表达定量的血管生成、如通过erb B2测量的致癌基因表达以及如通过p53表达测量的肿瘤抑制基因的缺失。

多种生物标志物候选物牵涉肿瘤肺部病变的演变。已经研究的生物标志物包括一般基因组标志物(包括染色体改变)、特异性基因组标志物(比如原癌基因比如K-Ras、Erbβ1/EGFR、Cyclin D改变)；增殖标志物(比如Ki67或PCNA)、鳞状分化标志物和核类视黄醇受体(Papadimitrakopoulou等人,1996)。后者特别有趣，因为它们可由特定化学预防药物比如13-顺式-视黄酸或4HPR调节，并最终导致缺陷细胞凋亡，恢复正常分化的粘膜(Zou等人,1998)。

通过微血管计数的肿瘤血管生成

肿瘤血管生成可通过微血管密度来定量，并且为1期NSCLC的一个可行预后因素。肿瘤微血管密度似乎为1期NSCLC存活率的良好预测因子。

血管内皮生长因子(VEGF)

VEGF(3,6-8ch 4)为一种内皮细胞特异性丝裂原，是肿瘤血管生成的重要调控因子，其表达与淋巴结转移密切相关，并且为肿瘤血管生成的良好间接指标。VEGF进而通过NSCLC中的P53蛋白累积上调。

p53

p53突变在预测NSCLC患者的进展和存活中的作用存在广泛争议。尽管很少有研究表明p53的作用可以忽略不计，但关于p53作为NSCLC的预后因素之一的作用，大多数研究提供了令人信服的证据。p53在NSCLC生物学中的重要作用为腺病毒介导的晚期NSCLC患者体内p53基因转移的基础(Carcy等人,1980)。另外，p53也显示为NSCLC化疗反应的独立预测因子。在最近的一项研究(Vallmer等人,1985)中，研究了p53累积在肺癌患者和未进展为癌症的那些患者侵袭前支气管病变中的重要性。显示，肿瘤前病变中的p53累积比p53阴性病变向侵袭进展的速率更快。

c-erb-B2

与p53类似，c-erg-B2(Her2/neu)表达也证明是这些肿瘤转移倾向的良好标志物和存活指标。

Ki-67增殖标志物

除以上标志物之外，如通过Ki-67(一种在整个细胞周期表达的核抗原)的肿瘤细胞标记程度测量的肿瘤增殖指数与1期NSCLC的临床结果显著相关(Feinstein等人,1970)。肿瘤增殖指数越高无病存活标记指数就越差，在1期NSCLC中提供重要的补充性预后信息(如果不是独立的)，并且助于鉴定可能需要更积极疗法的1期NSCLC患者亚群。

已知3p21.3和10q22基因座的改变与多种癌症相关。更具体地讲，与3p21.3和10q22基因座相关的点突变、缺失、插入或调控干扰可导致癌症或促进癌症发展，导致或促进原发部位的肿瘤进展，和/或导致或促进转移。3p21.3和10q22基因座的其他现象包括血管生成和组织侵袭。因此，本发明人已经证实3p21.3和10q22处的缺失不仅可用作癌症的诊断或预后指标，而且可用于预测癌症发展、进展和疗法中的特定事件。

在这方面考虑多种不同的测定，包括但不限于荧光原位杂交(FISH)、直接DNA测序、PFGE分析、Southern或Northern印迹、单链构象分析(SSCA)、RNase保护测定、等位基因特异性寡核苷酸(ASO)、斑点印迹分析、变性梯度凝胶电泳、RFLP和PCR-SSCP。

应鉴定各种类型的缺陷。因此，“改变”应理解为包括缺失、插入、点突变和重复。点突变导致终止密码子、移码突变或氨基酸取代。体细胞突变为发生在非生殖系组织中的那些突变。生殖系组织可发生在任何组织中且可遗传。

表面活性剂蛋白A和B

存在4种主要的表面活性剂蛋白：SP-A、B、C和D。SP-A和D为亲水性的，而SP-B和C为疏水性的。这些蛋白对实验条件(温度、pH、浓度、物质比如钙等)非常敏感。此外，它们的作用往往重叠，并且因此其难以准确指出每种蛋白的具体作用。

SP-A

SP-A为第一种鉴定的表面活性剂蛋白，并且也是最丰富的(Ingenito等人,1999)。其分子量在26-38kDa变化(Pérez-Gil等人,1998)。蛋白具有六个三聚体的“花束”结构(Haagsman和Diemel,2001)，并且可根据系统中存在的其他物质以开放或封闭形式存在。钙离子产生封闭的花束形式(Palaniyar等人,1998)。

SP-A在免疫防御中起作用。它还参与表面活性物质的转运/吸附(与其他蛋白)。SP-A为产生肺部独特的脂质转运结构管状髓磷脂所需的。管状髓磷脂由衬有蛋白的方形脂质管组成(Palaniyar等人,2001)。经基因设计改造为缺乏SP-A的小鼠具有正常的肺部结构和表面活性功能，而且SP-A的有益表面活性性质可能仅在应激情况下才会明显(Korfhagen等人,1996)。

SP-B

乳头状甲状腺癌(PTC)为临床上异质性的。除与电离辐射相关以外，PTC的病因学和分子生物学知之甚少。使用基于寡核苷酸的DNA阵列研究八对匹配的正常甲状腺和PTC组织的表达模式，免疫组织化学分析在39/52个PTC中检测到SFTPB，但在滤泡性甲状腺癌和正常甲状腺组织中则没有。Huang等人(2001)。

患者访谈和其他风险因素

除如上所述分析多态性的存在或不存在之外，可以合乎期望的是评估患者的另外因素。例如，患者访谈，其中包括吸烟史(吸烟年限、包/天等)，与诊断/预后高度相关。此外，可使用痰细胞(鳞状上皮化生、发育不良等)中存在或不存在形态学变化以及遗传不稳定性评分(遗传不稳定性＝包括来自痰和/或外周血细胞或骨髓细胞或者从血液或骨髓中分离的干细胞中上皮和中性粒细胞的各种组合的异常总和)。

获得和纯化样品

根据本公开，将获得含有血细胞的生物样品。在一些实施方案中，评估样品CTC水平的实体并没有直接从患者获得样品。因此，本公开的方法包括间接或直接地从患者获得样品。为实现这些方法，医生、执业医师或其工作人员可获得生物样品进行评估。样品可由执业医师或其工作人员进行分析，或者其可发送至外部或独立实验室。执业医师可知道测试是否提供了关于CTC定量水平的信息。

在这些情况中的任何一种情况下，执业医师可了解相关信息，这些信息将允许他或她基于CTC水平确定患者是否可诊断为具有侵袭性癌症形式和/或癌症预后不佳。例如，考虑实验室进行测试以确定CTC的水平。实验室人员可向执业医师汇报所进行测试的具体结果。

一般地，使用标准技术(比如Jones(1963)中公开的，其特此通过引用结合)从取自个体的生物样品(比如血液样品或组织样品)分离样品。样品的收集可通过任何合适的方法，尽管在一些方面收集为通过针、导管、注射器、刮擦物等。

样品可以本领域技术人员已知的任何方式制备。例如，Ficoll-Hypaque梯度分离后，来自外周血的循环上皮细胞可从血沉棕黄层分离，从而允许单核细胞富集(淋巴细胞和上皮细胞)。本领域技术人员已知的其他方法也可用于制备样品。

根据标准方法，可从生物样品中含有的细胞中分离核酸(Sambrook等人,1989)。核酸可为基因组DNA或者分级的或全细胞RNA。当使用RNA时，可以期望将RNA转化为互补DNA。根据格式，直接使用扩增或在扩增后用第二已知核酸在样品中鉴定感兴趣的特定核酸。

检测后，可将给定样品中所见的结果与来自正常患者和在不同染色体基因座和对照区域具有或缺乏改变的患者的具有统计学意义的参考样品组进行比较。以这种方式，技术人员然后可将检测到的改变的数量或种类与各种临床状态和治疗选择相关联。

癌症治疗

在一些实施方案中，本公开提供用于诊断和治疗乳腺癌的组合物和方法。在一个实施方案中，本公开提供一种基于CTC水平与对照相比较是否高来确定癌症治疗的方法。治疗可为常规癌症治疗。本领域的技术人员将意识到许多可与本公开方法组合的治疗，其中一些但不是全部如下所述。

A.用于施用给患者的制剂和途径

当考虑临床应用时，有必要以适合于预期应用的形式制备药用组合物。通常，这将需要制备基本上不含热原以及其他可能对人类或动物有害的杂质的组合物。

通常期望采用适当的盐和缓冲剂以使递送载体稳定并允许由靶细胞摄取。当向患者中引入重组细胞时也会采用缓冲剂。本公开的水性组合物对细胞包含有效量的载体，其溶解或分散于药学上可接受的载体或水性介质中。这种组合物也称为接种物。短语“药学上或药理学上可接受的”是指当施用给动物或人类时不产生不利的、变应性或其他不良反应的分子实体和组合物。如本文使用的“药学上可接受的载体”包括任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。这种介质和试剂用于药用活性物质的用途为本领域众所周知的。除非任何常规介质或试剂与本公开的载体或细胞不相容，否则考虑其在治疗组合物中的使用。补充活性成分也可掺入到组合物中。

本公开的活性组合物可包括典型的药用制剂。根据本公开这些组合物的施用可经任何常见途径，只要靶组织可经该途径获得即可。这包括口服、鼻、颊、直肠、阴道或局部。或者，施用可为通过皮内、皮下、肌内、腹膜内或静脉内注射。这种组合物通常会作为药学上可接受的组合物施用。特别感兴趣的是直接瘤内施用、肿瘤灌注或者局部或区域性施用给肿瘤，例如在局部或区域性脉管系统或淋巴系统中，或者在切除的肿瘤床(例如术后导管)中。对于几乎任何肿瘤，也考虑全身递送。这证明对攻击微观或转移性癌症尤其重要。

活性化合物还可作为游离碱施用或者可在与表面活性剂比如羟丙基纤维素适当混合的水中制备的药学上可接受的盐。分散体也可在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中制备。在通常的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。

适合于注射用途的药用形式包括无菌水溶液剂或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液剂或分散体的无菌粉末。在所有情况下，该形式必须为无菌的并且必须为流体以至存在易于可注射性的程度。其必须在制造和储存条件下为稳定的，并且保护其免于微生物(比如细菌和真菌)的污染作用。载体可为含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、它们的合适混合物和植物油的溶剂或分散介质。例如通过使用包衣(比如卵磷脂)，通过在分散体的情况下保持所需的粒度以及通过使用表面活性剂，可保持适当的流动性。可通过各种抗细菌和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫汞撒等，来实现防止微生物作用。在许多情况下，优选的是包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中使用延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现。

通过将所需量的活性化合物与以上列举的各种其他成分一起掺入适当的溶剂中，根据需要然后过滤灭菌，来制备无菌可注射溶液剂。通常，通过将各种灭菌活性成分掺入到含有基本分散介质和来自以上列举的那些的所需其他成分的无菌媒介物中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液剂的无菌粉末的情况下，优选的制备方法为真空干燥和冷冻干燥技术，其从其先前无菌过滤的溶液中产生活性成分加上任何另外期望的成分的粉末。

如本文使用的“药学上可接受的载体”包括任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。这种介质和试剂用于药用活性物质的用途为本领域众所周知的。除非任何常规介质或试剂与活性成分不相容，否则考虑其在治疗组合物中的使用。补充活性成分也可掺入到组合物中。

本公开的组合物可以中性或盐形式配制。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白的游离氨基形成)，并且其用无机酸比如盐酸或磷酸或者有机酸比如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成。与游离羧基形成的盐也可衍生于无机碱(比如钠、钾、铵、钙或氢氧化铁)以及有机碱(比如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等)。

配制后，溶液剂将以与剂量制剂相容的方式和以比如治疗有效的量施用。施用给患者或受试者的本公开组合物的实际剂量可通过身体和生理因素比如体重、病症的严重程度、所治疗的疾病类型、先前或同时的治疗干预、患者的特发性疾病和基于施用途径确定。无论如何，负责施用的执业医师将确定对于个体受试者组合物中活性成分的浓度和适当剂量。

“治疗(treatment)”和“治疗(treating)”是指出于获得疾病或健康相关病症的治疗益处的目的，向受试者施用或应用治疗剂，或者对受试者实施程序或模式。

如整个本申请中使用的术语“治疗益处”或“治疗有效的”是指在该病症的医疗治疗方面促进或增强受试者的健康的任何事物。这包括但不限于减少疾病体征或症状的频率或严重程度。

“疾病”可为由任何原因造成的身体部位、器官或系统的任何病理病症，比如感染、遗传缺陷和/或环境应激。

“预防(Prevention)”和“预防(preventing)”根据其普通和平常含义用于意指“在…之前有作用”或这种行为。在特定疾病的情况下，这些术语是指出于阻断疾病或健康相关病症的发生的目的，对受试者施用或应用试剂、药物或治疗，或者对受试者实施程序或模式。

受试者可为在施用相关预防剂时已知或怀疑未患特定疾病或健康相关病症的受试者。例如，受试者可为未患已知疾病或健康相关病症的受试者(即健康受试者)。

在本公开的另外实施方案中，方法包括鉴定需要治疗的患者。例如，可基于获取患者病史或基于临床检查的发现来鉴定患者。

B.治疗

在一些实施方案中，方法进一步包括用常规癌症治疗来治疗乳腺癌患者。当前癌症研究的一个目标为发现改善化学和放射疗法的效力的方式，比如通过将传统疗法与其他抗癌治疗组合。在本公开的上下文中，考虑该治疗可为但不限于化学治疗、放射、凋亡的多肽诱导剂、新型靶向疗法(比如酪氨酸激酶抑制剂或抗VEGF抗体)或其他治疗干预。还可设想期望多于一次施用治疗。

1.化学疗法

根据本公开可使用各种各样的化学治疗剂。术语“化学疗法”是指使用药物治疗癌症。“化学治疗剂”用于意指在癌症治疗中施用的化合物或组合物。这些试剂或药物通过其在细胞内的活性模式，例如其是否影响或在什么阶段影响细胞周期进行归类。或者，可基于试剂直接交联DNA、插入到DNA中或者通过影响核酸合成来诱导染色体和有丝分裂畸变的能力来对其进行表征。大多数化学治疗剂落入以下分类：烷化剂类、抗代谢类、抗肿瘤抗生素类、有丝分裂抑制剂类和亚硝基脲类。

化学治疗剂的实例包括烷化剂类比如塞替派和环磷酰胺；烷基磺酸酯类比如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶类比如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌、米特多巴(meturedopa)和尤利多巴(uredopa)；亚乙基亚胺和甲基蜜胺类(methylamelamine)，包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺；番荔枝内酯类(acetogenins)(尤其是布拉它辛(bullatacin)和布拉它辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康)；苔藓抑素、callystatin；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；念珠藻素类(cryptophycins)(特别是念珠藻素1和念珠藻素8)；海兔毒素(dolastatin)；多卡霉素(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；软珊瑚醇(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类比如苯丁酸氮芥、萘氮芥、胆磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥(mechlorethamine)、盐酸甲氧氮芥、美法仑、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀、曲磷胺(trofosfamide)、乌拉莫司汀；亚硝基脲类比如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素比如烯二炔类抗生素(例如卡利奇霉素，尤其是卡利奇霉素γ1I和卡利奇霉素ωI1；达内霉素，包括达内霉素A；二膦酸盐类，比如氯屈膦酸盐(clodronate)；埃斯培拉霉素(esperamicin)，以及新制癌菌素(neocarzinostatin)生色团及相关的色蛋白烯二炔类抗生素生色团、阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素、authrarnycin、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素、放线菌素C、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉基-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类比如丝裂霉素C、霉酚酸、诺加霉素(nogalarnycin)、橄榄霉素、培洛霉素、potfiromycin、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢类，比如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，比如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，比如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，比如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素类，比如卡鲁睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺类比如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，比如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基酮戊酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elformithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃博霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(1entinan)；氯尼达明(lonidainine)；美登素类化合物，比如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇(mopidanmol)；尼曲吖啶(nitraerine)；喷司他丁；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK多糖复合物)；雷佐生(razoxane)；根瘤菌素；西佐喃(sizofiran)；螺旋锗；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌(triaziquone)；2,2’,2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯类(尤其是T-2毒素、疣孢菌素A(verracurin A)、杆孢菌素A和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷类，例如紫杉醇和多西他赛(doxetaxel)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；铂配位络合物，比如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱；铂剂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺消灵(novantrone)；替尼泊苷；依达曲沙(edatrexate)；柔红霉素；氨基蝶呤；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐；伊立替康(例如CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇比如视黄酸；卡培他滨；顺铂(CDDP)、卡铂、丙卡巴肼、氮芥、环磷酰胺、喜树碱(camptothecin)、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安、亚硝基脲(nitrosurea)、放线菌素D、柔红霉素、多柔比星、博来霉素、plicomycin、丝裂霉素、依托泊苷(VP16)、他莫昔芬、雷洛昔芬、雌激素受体结合剂、泰素(taxol)、紫杉醇、多西他赛、吉西他滨、诺维本(navelbine)、法尼基蛋白转移酶抑制剂、反式铂(transplatinum)、5-氟尿嘧啶、长春新碱、长春碱和甲氨蝶呤以及以上任何一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。

该定义中还包括用于调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，比如抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、keoxifene、LY117018、奥那司酮和托瑞米芬；抑制调节肾上腺中雌激素产生的酶芳香化酶的芳香化酶抑制剂，比如4(5)-咪唑类、氨鲁米特、乙酸甲地孕酮、依西美坦、formestanie、法倔唑、伏氯唑、来曲唑和阿那曲唑；以及抗雄激素，比如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制信号传导途径中牵涉异常细胞增殖的基因表达的那些，比如PKC-α、Ralf和H-Ras；核酶，比如VEGF表达抑制剂和HER2表达抑制剂；疫苗，比如基因疗法疫苗；以及以上任何一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。

2.放射疗法

放射疗法(Radiotherapy)，也称为放射疗法(radiation therapy)，是用电离辐射来治疗癌症和其他疾病。电离辐射沉积能量，其通过损害遗传物质来损伤或破坏所治疗区域中的细胞，使这些细胞不能继续生长。尽管辐射损害癌细胞和正常细胞两者，但是后者能够自身修复并适当地起作用。

根据本公开使用的放射疗法可包括但不限于使用γ射线、X射线和/或向肿瘤细胞定向递送放射性同位素。其他形式的DNA损伤因素也在考虑之中，比如微波和UV照射。最有可能的是所有这些因素均会对DNA、DNA前体、DNA的复制和修复以及染色体的组装和维持造成广泛范围的损伤。X射线的剂量范围为长时间(3-4周)50-200伦琴的每天剂量至2000-6000伦琴的单剂量。放射性同位素的剂量范围广泛变化，并且取决于同位素的半衰期、发出辐射的强度和类型以及肿瘤细胞的摄取。

放射疗法可包括使用放射性标记的抗体以直接向癌症部位递送辐射剂量(放射免疫疗法)。抗体为由机体响应于抗原(被免疫系统识别为外源的物质)的存在而产生的高度特异性蛋白。一些肿瘤细胞含有触发产生肿瘤特异性抗体的特异性抗原。大量的这些抗体可在实验室中制成并连接于放射性物质(称为放射性标记的方法)。一旦注射到体内，抗体主动地寻找癌细胞，通过辐射的细胞杀伤(细胞毒性)作用破坏癌细胞。该方法可使对健康细胞的辐射损伤风险最小化。

适形放射疗法使用作为正常放射疗法的治疗相同的放射治疗机(线性加速器)，但将金属块置于x射线束的路径中以改变其形状从而匹配癌症的形状。这确保给予肿瘤较高的辐射剂量。健康的周围细胞和附近结构接受较低剂量的辐射，因此降低副作用的可能性。已开发了一种称为多叶准直器的装置，并且可用作金属块的备选方案。多叶准直器由固定于线性加速器的多个金属片组成。可调整各层使得放射治疗束无需金属块即可成形为治疗区域。放射治疗机的精确定位对于适形放射疗法的治疗非常重要，并且可在每次治疗开始时使用专用扫描机来检查内部器官的位置。

高分辨率调强放射疗法也使用多叶准直器。在该治疗期间，在给予治疗的同时移动多叶准直器的层。该方法可能实现治疗束的甚至更精确成形，并允许放射疗法的剂量在整个治疗区域恒定。

尽管研究已经表明适形放射疗法和调强放射疗法可降低放射疗法治疗的副作用，但是如此精确地使治疗区域成形可能会停止恰好在所破坏治疗区域之外的微观癌细胞。这意味着用这些特化的放射疗法技术，将来癌症复发的风险可能会更高。

科学家们也在寻找提高放射疗法有效性的方式。正在研究两种类型的试验药物其对正经受辐射的细胞的作用。放射增敏剂使肿瘤细胞更可能被损伤，放射防护剂保护正常组织免受辐射的影响。还正在研究使用热的热疗其在使组织对辐射致敏方面的有效性。

3.免疫疗法

在癌症治疗的背景下，免疫治疗通常依赖于使用免疫效应细胞和分子来靶向和破坏癌细胞。曲妥珠单抗(Herceptin^TM)为这样一个实例。免疫效应物可为例如对肿瘤细胞表面上的一些标志物具有特异性的抗体。抗体单独可用作疗法的效应物，或者其可募集其他细胞来实际上影响细胞杀伤。抗体还可与药物或毒素(化学治疗剂、放射性核素、蓖麻毒素A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)缀合，并且仅用作靶向剂。或者，效应物可为携带直接或间接地与肿瘤细胞靶标相互作用的表面分子的淋巴细胞。各种效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。治疗模式的组合，即直接细胞毒活性及ErbB2的抑制或减少，将在治疗ErbB2过表达癌症中提供治疗益处。

还可使用另一种免疫疗法作为与上述基因沉默疗法的组合疗法的一部分。在免疫疗法的一个方面，肿瘤细胞必须携带顺从于靶向的一些标志物，即不存在于大多数其他细胞上。在本公开的上下文中，存在许多肿瘤标志物，并且任何这些均可适合于靶向。常见的肿瘤标志物包括癌胚抗原、前列腺特异性抗原、泌尿肿瘤相关抗原、胎儿抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸化路易斯抗原、MucA、MucB、PLAP、雌激素受体、层粘连蛋白受体、erb B和p155。免疫疗法的一个备选方面为将抗癌作用与免疫刺激作用组合。还存在免疫刺激分子，包括：细胞因子比如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFN、趋化因子比如MIP-1、MCP-1、IL-8和生长因子比如FLT3配体。已经表明，将免疫刺激分子作为蛋白或使用基因递送与肿瘤抑制剂组合增强抗肿瘤作用(Ju等人,2000)。此外，可使用针对任何这些化合物的抗体靶向本文讨论的抗癌剂。

目前正在研究或正在使用的免疫疗法的实例为免疫佐剂，例如牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、二硝基氯苯和芳族化合物(美国专利第5,801,005和5,739,169号；Hui和Hashimoto,1998；Christodoulides等人,1998)、细胞因子疗法，例如干扰素α、β和γ；IL-1、GM-CSF和TNF(Bukowski等人,1998；Davidson等人,1998；Hellstrand等人,1998)；基因疗法，例如TNF、IL-1、IL-2、p53(Qin等人,1998；Austin-Ward和Villaseca,1998；美国专利第5,830,880和5,846,945号)以及单克隆抗体，例如抗神经节苷脂GM2、抗HER-2、抗p185(Pietras等人,1998；Hanibuchi等人,1998；美国专利第5,824,311号)。考虑可将一种或多种抗癌疗法与本文所述的基因沉默疗法一起采用。

在主动免疫疗法中，抗原性肽、多肽或蛋白，或者自体或同种异体肿瘤细胞组合物或“疫苗”，通常与不同的细菌佐剂一起施用(Ravindranath和Morton,1991；Morton等人,1992；Mitchell等人,1990；Mitchell等人,1993)。

在过继免疫疗法中，体外分离患者的循环淋巴细胞或肿瘤浸润淋巴细胞，通过淋巴因子(比如IL-2)活化或用肿瘤坏死基因转导，并重新施用(Rosenberg等人,1988；1989)。

4.外科手术

约60％患有癌症的人将经受某种类型的外科手术，其包括预防性、诊断性或分期性、治愈性和姑息性手术。治愈性手术为可与其他疗法比如本公开的治疗、化学疗法、放射疗法、激素疗法、基因疗法、免疫疗法和/或备选疗法结合使用的癌症治疗。

治愈性手术包括其中全部或部分癌性组织被物理去除、切除和/或破坏的切除。肿瘤切除是指至少部分肿瘤的物理去除。除肿瘤切除之外，通过外科手术的治疗还包括激光手术、冷冻手术、电外科术和显微控制手术(Mohs手术)。进一步考虑，本公开可与去除浅表性癌症、前期癌或附带量的正常组织结合使用。

在切除部分或全部癌性细胞、组织或肿瘤后，可在体内形成腔。治疗可通过灌注、直接注射或用另外的抗癌疗法局部应用该部位来完成。这种治疗可以重复，例如每1、2、3、4、5、6或7天，或者每1、2、3、4和5周，或者每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。这些治疗也可具有不同剂量。

5.基因疗法

在仍然另一个实施方案中，二级治疗为基因疗法，其中在施用H2A.Z靶向剂之前、之后或同时施用治疗性多核苷酸。H2A.Z靶向剂与编码以下基因产物之一的载体结合的递送可对靶组织具有组合的抗过度增殖作用。本公开内包含多种蛋白，其中一些在以下描述。

a.细胞增殖的诱导剂

根据功能，诱导细胞增殖的蛋白进一步落入多个类别中。所有这些蛋白的共性为其调控细胞增殖的能力。例如，PDGF的一种形式sis致癌基因为分泌的生长因子。致癌基因很少由编码生长因子的基因产生，而目前，sis为唯一已知天然存在的致癌生长因子。在本公开的一个实施方案中，考虑使用针对特定细胞增殖诱导因子的反义mRNA或siRNA来防止细胞增殖诱导因子的表达。

蛋白FMS和ErbA为生长因子受体。这些受体的突变导致可调控功能的丧失。例如，影响Neu受体蛋白的跨膜结构域的点突变导致Neu致癌基因。erbA致癌基因源于甲状腺激素的胞内受体。经修饰的致癌ErbA受体认为与内源性甲状腺激素受体竞争，导致不受控制的生长。

致癌基因的最大类别包括信号转导蛋白(例如Src、Abl和Ras)。Src蛋白为胞质蛋白酪氨酸激酶，并且其在一些情况下经酪氨酸残基527处的突变导致从原癌基因转变为致癌基因。相比之下，在一个实例中，通过序列中氨基酸12处从缬氨酸到甘氨酸的突变导致GTP酶蛋白ras从原癌基因转变为致癌基因，降低了ras GTP酶活性。

Jun、Fos和Myc蛋白为作为转录因子直接发挥其对核功能的作用的蛋白。

b.细胞增殖的抑制剂

肿瘤抑制致癌基因的功能为抑制过度的细胞增殖。这些基因的失活破坏其抑制活性，导致不受调控的增殖。可采用肿瘤抑制因子p53、mda-7、FHIT、p16和C-CAM。

除p53之外，另一种细胞增殖抑制因子为p16。真核细胞周期的主要转变由细胞周期蛋白依赖性激酶或CDK触发。一种CDK细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)通过G1调控进展。该酶的活性可能是在晚期G1磷酸化Rb。CDK4的活性受活化亚基(D型细胞周期蛋白)以及抑制性亚基的控制，p16INK4已被生物化学表征为特异性地结合并抑制CDK4的蛋白，并且因此可调控Rb磷酸化(Serrano等人,1993；Serrano等人,1995)。由于p16INK4蛋白为一种CDK4抑制因子(Serrano,1993)，因此该基因的缺失可增加CDK4的活性，导致Rb蛋白的过度磷酸化。还已知p16调控CDK6的功能。

p16INK4属于一类CDK抑制蛋白，其还包括p16B、p19、p21WAF1和p27KIP1。将p16INK4基因定位于9p21，其为在许多肿瘤类型中经常缺失的染色体区域。p16INK4基因的纯合子缺失和突变在人类肿瘤细胞系中频繁。该证据表明p16INK4基因为肿瘤抑制基因。然而，该解释由于以下观察结果而已受到挑战：p16INK4基因改变的频率在原代未培养的肿瘤中比在培养的细胞系中低得多(Caldas等人,1994；Cheng等人,1994；Hussussian等人,1994；Kamb等人,1994；Kamb等人,1994；Mori等人,1994；Okamoto等人,1994；Nobori等人,1995；Orlow等人,1994；Arap等人,1995)。通过用质粒表达载体转染来恢复野生型p16^INK4功能降低一些人类癌细胞系的集落形成(Okamoto,1994；Arap,1995)。

根据本公开可采用的其他基因包括Rb、APC、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、zac1、p73、VHL、MMAC1/H2A.Z、DBCCR-1、FCC、rsk-3、p27、p27/p16融合体、p21/p27融合体、抗血栓形成基因(例如COX-1、TFPI)、PGS、Dp、E2F、ras、myc、neu、raf、erb、fms、trk、ret、gsp、hst、abl、E1A、p300、参与血管生成的基因(例如VEGF、FGF、血小板反应蛋白、BAI-1、GDAIF或其受体)和MCC。

c.程序性细胞死亡的调控因子

细胞凋亡或程序性细胞死亡为正常胚胎发育、维持成人组织内的稳态和抑制癌变的必需过程(Kerr等人,1972)。已经证实Bcl-2蛋白家族和ICE样蛋白酶两者均为其他系统中细胞凋亡的重要调控因子和效应因子。发现与滤泡性淋巴瘤相关的Bcl-2蛋白在响应于各种凋亡刺激来控制细胞凋亡和增强细胞存活中起突出作用(Bakhshi等人,1985；Cleary和Sklar,1985；Cleary等人,1986；Tsujimoto等人,1985；Tsujimoto和Croce,1986)。现在认识到演变上保守的Bcl-2蛋白为可归类为死亡激动剂或死亡拮抗剂的相关蛋白家族的成员。

继发现Bcl-2之后，表明其用于抑制由多种刺激触发的细胞死亡。此外，现在显而易见的是存在共具共同结构和序列同源性的Bcl-2细胞死亡调控蛋白家族。已经显示这些不同的家族成员具有与Bcl-2类似的功能(例如BclXL、BclW、BclS、Mcl-1、A1、Bfl-1)或者抵消Bcl-2功能并促进细胞死亡(例如Bax、Bak、Bik、Bim、Bid、Bad、Harakiri)。

d.RNA干扰(RNAi)

在某些实施方案中，H2A.Z抑制剂为针对H2A.Z的mRNA的双链RNA(dsRNA)。

RNA干扰(也称为“RNA介导的干扰”或RNAi)为一种借以可降低或消除基因表达的机制。已经观察到双链RNA(dsRNA)介导降低，这是一个多步骤过程。dsRNA活化转录后基因表达监控机制，其似乎起防御细胞免受病毒感染和转座子活性的作用(Fire等人,1998；Grishok等人,2000；Ketting等人,1999；Lin和Avery等人,1999；Montgomery等人,1998；Sharp和Zamore,2000；Tabara等人,1999)。这些机制的活化靶向成熟的dsRNA互补mRNA进行破坏。RNAi为基因功能的研究提供主要的实验优点。这些优点包括非常高的特异性、易于移动穿过细胞膜和所靶向基因的延长下调(Fire等人,1998；Grishok等人,2000；Ketting等人,1999；Lin和Avery等人,1999；Montgomery等人,1998；Sharp等人,1999；Sharp和Zamore,2000；Tabara等人,1999)。普遍认为RNAi转录后起作用，靶向RNA转录物进行降解。似乎可靶向核和胞质RNA两者(Bosher和Labouesse,2000)。

e.siRNA

siRNA的设计必须使得其在抑制感兴趣的基因表达方面具有特异性和有效性。选择靶序列(即一个或多个感兴趣的基因中存在的、siRNA将指导对其的降解机构的那些序列)的方法，涉及避免可干扰siRNA的指导功能的序列，同时包括对该一个或多个基因特异性的序列。一般地，长度为约21-23个核苷酸的siRNA靶序列为最有效的。该长度反映如上所述由加工长得多的RNA产生的消化产物的长度(Montgomery等人,1998)。siRNA为本领域众所周知的。例如，siRNA和双链RNA已描述于美国专利第6,506,559和6,573,099号中以及美国专利申请2003/0051263、2003/0055020、2004/0265839、2002/0168707、2003/0159161和2004/0064842中，其全部通过引用以其全部结合至本文中。

已提出对siRNA序列的几种进一步修改以改变其稳定性或改善其有效性。表明具有二核苷酸悬末端的合成互补21聚体RNA(即19个互补核苷酸+3’非互补二聚体)可提供最高水平的抑制。这些方案主要地使用两个(2’-脱氧)胸苷核苷酸序列作为二核苷酸悬末端。这些二核苷酸悬末端经常写为dTdT以将它们区别于掺入到RNA中的典型核苷酸。文献表明，dT悬末端的使用主要地受到需要降低化学合成RNA的成本的推动。还表明dTdT悬末端可能比UU悬末端更稳定，尽管可用数据显示，与具有UU悬末端的siRNA相比较，dTdT悬末端仅略有改善(<20％)。

f.抑制性核酸的产生

dsRNA可使用充分描述的方法来合成(Fire等人,1998)。简言之，使用T7聚合酶由DNA模板合成有义和反义RNA(MEGAscript,Ambion)。在合成完成之后，用DNaseI消化DNA模板并通过苯酚/氯仿提取和异丙醇沉淀来纯化RNA。在变性琼脂糖凝胶上测定RNA尺寸、纯度和完整性。在柠檬酸钾缓冲液中稀释有义和反义RNA并在80℃下退火3分钟以形成dsRNA。与构建DNA模板文库一样，可使用程序来助于该时间密集性程序。个体dsRNA种类的总和称为“dsRNA文库”。

siRNA的制备主要通过直接化学合成、通过经暴露于果蝇胚胎裂解物来加工较长的双链RNA或者通过源于S2细胞的体外系统。细胞裂解物或体外加工的使用可进一步包括随后从裂解物中分离短的21-23个核苷酸的siRNA等，使该过程有些麻烦和昂贵。化学合成通过制备两种单链RNA寡聚体然后使两种单链寡聚体退火成双链RNA来进行。化学合成方法多种多样。在美国专利第5,889,136、4,415,723和4,458,066号(其明确地通过引用结合至本文中)以及Wincott等人(1995)中提供了非限制性实例。

WO 99/32619和WO 01/68836提出，用于siRNA的RNA可以化学或酶促合成。这两篇文本均通过引用以其全部结合至本文中。这些参考文献中考虑的酶促合成为通过细胞RNA聚合酶或噬菌体RNA聚合酶(例如T3、T7、SP6)经使用和产生如本领域已知的表达构建体。例如，参见美国专利第5,795,715号。考虑的构建体提供产生含有与靶基因的一部分相同的核苷酸序列的RNA的模板。由这些参考文献提供的相同序列的长度为至少25个碱基，并且长度可多至400或更多个碱基。该参考文献的一个重要方面为作者考虑用在体内将长dsRNA转化为siRNA的内源性核酸酶复合物来将较长的dsRNA消化为21-25聚体的长度。他们没有描述或提供用于合成和使用体外转录的21-25聚体dsRNA的数据。化学或酶促合成的dsRNA在其用于RNA干扰中的预期特性之间没有区别。

类似地，WO 00/44914(通过引用结合至本文中)提出可酶促或通过部分/完全有机合成来产生单个RNA链。优选地，由DNA模板，优选地克隆的cDNA模板的PCR产物酶促合成单链RNA，并且RNA产物为cDNA的完整转录物，其可包含数百个核苷酸。WO 01/36646(通过引用结合至本文中)对其中合成siRNA的方式没有设置限制，只要可使用手动和/或自动程序在体外或体内合成RNA即可。该参考文献还提供了体外合成可为化学或酶促的，例如使用克隆的RNA聚合酶(例如T3、T7、SP6)来转录内源性DNA(或cDNA)模板或二者的混合物。再次地，化学或酶促合成的siRNA之间在用于RNA干扰的合乎期望的特性方面没有区别。

美国专利第5,795,715号报道了在单个反应混合物中同时转录两种互补DNA序列链，其中使两种转录物立即杂交。使用的模板优选地具有40-100个碱基对，并且其在每个末端配置有启动子序列。模板优选地连接于固体表面。在用RNA聚合酶转录之后，生成的dsRNA片段可用于检测和/或测定核酸靶序列。

几个小组已经开发了在稳定转染的哺乳动物细胞中持续地表达siRNA的表达载体(Brummelkamp等人,2002；Lee等人,2002；Paul等人,2002；Sui等人,2002；Yu等人,2002)。这些质粒中的一些设计改造为表达缺乏聚(A)尾的shRNA(Brummelkamp等人,2002；Paul等人,2002；Yu等人,2002)。shRNA的转录起始于聚合酶III(pol III)启动子处，并且认为终止于4-5个胸腺嘧啶的转录终止位点的2位。shRNA认为折叠成具有3’UU-悬末端的茎环结构。随后，加工这些shRNA的末端，将shRNA转化成～21nt的siRNA样分子(Brummelkamp等人,2002)。siRNA样分子进而可在转染的哺乳动物细胞中产生基因特异性沉默。

g.其他试剂

考虑可将其他试剂与本公开一起使用。这些另外的试剂包括免疫调节剂、影响细胞表面受体和GAP连接上调的药物、细胞抑制剂和分化剂、细胞粘附抑制剂、增加过度增殖细胞对凋亡诱导剂的敏感性的试剂、或其他生物试剂。免疫调节剂包括肿瘤坏死因子；干扰素α、β和γ；IL-2及其他细胞因子；F42K及其他细胞因子类似物；或MIP-1、MIP-1β、MCP-1、RANTES以其他趋化因子。进一步考虑细胞表面受体或其配体(比如Fas/Fas配体、DR4或DR5/TRAIL(Apo-2配体))的上调可通过建立对过度增殖细胞的自分泌或旁分泌作用来增强本公开的凋亡诱导能力。通过升高GAP连接的数量来增加细胞间信号传导可增加对邻近过度增殖细胞群的抗过度增殖作用。在其他实施方案中，可将细胞抑制剂或分化剂与本公开组合使用以改善治疗的抗过度增殖效力。考虑细胞粘附的抑制剂以改善本公开的效力。细胞粘附抑制剂的实例为粘附斑激酶(FAK)抑制剂和洛伐他汀。进一步考虑可将增加过度增殖细胞对细胞凋亡的敏感性的其他试剂(比如抗体c225)与本公开组合使用以改善治疗效力。

在引入细胞毒性化学治疗药物后，在癌症疗法中已经存在许多进展。然而，化学疗法的结果之一为发展/获得抗药表型并且发展出多重抗药性。抗药性的发展仍为治疗这种肿瘤的主要障碍，并且因此显然需要备选方法比如基因疗法。

用于与化学疗法、放射疗法或生物疗法结合使用的另一种疗法形式包括热疗，其为一种其中使患者的组织暴露于高温(高达106°F)的程序。外部或内部加热装置可参与局部、区域性或全身热疗的施加。局部热疗包括向小区域(比如肿瘤)施加热量。热量可在外部从体外装置用靶向肿瘤的高频波来产生。内部热量可涉及无菌探针，包括薄的经加热导线或用温水填充的中空管、植入的微波天线或射频电极。

加热患者的器官或肢体进行区域疗法，这使用产生高能量的装置(比如磁体)来完成。或者，可取出患者的一些血液并加热之后灌注到内部加热的区域。在其中癌症已遍及身体的情况下，还可实施全身加热。为了该目的，可使用温水毯、热蜡、感应线圈和热室。

激素疗法也可与本公开结合或与先前描述的任何其他癌症疗法组合使用。激素的使用可用于治疗某些癌症(比如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌或宫颈癌)以降低某些激素(比如睾酮或雌激素)的水平或阻断其作用。该治疗经常作为一个治疗选择或为降低转移风险而与至少一种其他癌症疗法组合使用。

5.剂量

本文阐述的组合物中包括的或方法中应用的治疗剂的量将为在药学上有效的任何量，并且将取决于多种因素，包括所选治疗剂的身份和效力。本领域的普通技术人员熟悉涉及确定特定试剂的治疗有效剂量的因素。因此，在这方面，本文阐述的组合物中治疗剂的浓度可为任何浓度。在一些特定实施方案中，药物的总浓度小于10％。在更特定的实施方案中，药物的浓度小于5％。治疗剂可应用一次或多于一次。在非限制性实例中，治疗剂应用每天一次、每天两次、每天三次、每天四次、每天六次、在清醒时每两小时、每四小时、每隔一天、每周一次等。治疗可持续任何持续时间，如本领域普通技术人员确定的。

实施例

实施例1 4色荧光原位杂交测定的开发

材料和方法

患者入组

医师、研究受试者以及实验室和统计人员对测试结果和临床信息一无所知。严格遵循盲法方案，并且测试结果没有指导或影响患者的护理。所有地点均获得机构审查委员会的批准，并获得了所有合格参与者的知情书面同意。

合格患者年龄大于18岁，计划进行经皮穿刺活检。为避免来自放射学因素的偏差，对结节特征没有限制。如果患者之前或同时诊断出任何类型的癌症，或在过去两年内诊断出肺癌，则不符合资格。

血液收集

恰好在CT导向穿刺活检程序之前收集血液。血液收集在含有血液稳定剂的真空血液收集管中(Streck,Omaha,Nebraska)，并连夜运往位于Thousand Oaks,CA的LungLifeAI’s CLIA实验室。

CTC富集

在CLIA实验室收到的样品使用两个独特标识符加入到实验室信息管理系统中。在解除制动的情况下，将血液以1000xg离心10分钟。将血浆转移至新管中并储存于-80℃下。使用基于氯化铵的红细胞裂解缓冲液去除红细胞。使用BD Accuri C6流式细胞计数器(Becton Dickenson,San Jose,CA)量化剩余的白细胞，并将5e6白细胞转移至新管中进行磁性耗尽。将细胞与靶向CD66b和CD14的生物素化抗体(BioLegend,San Diego,CA)一起温育以分别去除中性粒细胞和单核细胞。然后与顺磁性链霉亲和素包被的颗粒(BDBiosciences,San Jose,CA)一起温育并随后进行磁性分离，且将上清液转移至新管中。

细胞冷冻保存和安瓿解冻

用含有10％ FBS的PBS将在耗尽程序中未使用的白细胞洗涤一次。将细胞重悬于含有10％ DMSO的1mL冷冻保存培养基中并在-80℃的冷箱(-1℃/min)中缓慢冷冻且然后转移至液氮中。将安瓿在37℃水浴中解冻约2分钟，然后用含有10％ FBS的10mL PBS洗涤两次以减少DMSO。

荧光原位杂交

然后使用细胞离心涂片仪将来自细胞悬液的10,000-20,000个细胞转移至载玻片上。将细胞固定于卡诺氏固定液(甲醇和冰乙酸的3:1溶液)中30分钟，然后用蛋白酶处理(胃蛋白酶pH＝2,Abbot Molecular)。然后将4色FISH探针(Katz等人CancerCytopathol.2020；10.1002/cncy.22278.doi:10.1002/cncy.22278)添加到显微镜载玻片上，并使用橡胶粘合剂固定盖玻片。DNA在80℃下变性2分钟，然后在加湿室中过夜杂交18小时。然后洗涤载玻片，并用含有DAPI的封固剂施加到新的盖玻片(Vector Labs,Burlingame,CA)。

图像采集和分析

含有细胞的载玻片使用Bioview Allegro-Plus显微镜系统(Bioview USA,Billerica,MA)成像。使用60x物镜(Olympus,UPlanSapo,1.35NA油浸)和使用Bioview Duet软件控制的FLIR Grasshopper 3单色相机(12位,2448x 2048像素,3.4μm像素尺寸)获取图像。所有细胞均用21个横切面成像，跨度为0.65μm。

物体通过Bioview Duet软件根据探针拷贝数变化进行分类(“正常”细胞显示每种颜色的2个斑点，“缺失”为一个或多个斑点的丧失，“单一增加”为一种颜色中的额外斑点，和“CTC”定义为两个或更多个通道中的增加)。持证技术人员然后通过Bioview Duet软件分析“CTC”类别中分箱的细胞以及验证每个细胞。CTC计数通过将CTC计数除以分析的细胞总数并乘以10,000来归一化。每个受试者分析最少10,000个细胞。每个受试者的总CTC计数、总细胞计数和归一化CTC计数被发送用于揭盲。

统计学

使用来自病例和对照受试者(分别为恶性和良性结节)的归一化CTC计数进行接受者操作特征曲线分析。使用Mann-Whitney检验(双尾，95％置信区间)确定临床因素数据的统计学意义。

结果

CTC富集优化

Katz等人描述了一种使用基于Ficoll的密度离心富集CTC的方法，该方法主要去除红细胞和粒细胞，并将外周血单核细胞和淋巴细胞留在界面层(Katz等人,Clin CancerRes.2010；16(15):3976-3987)。尽管该方法显示出高性能(Katz等人CancerCytopathol.2020；10.1002/cncy.22278.doi:10.1002/cncy.22278)，但其为技术驱动的，并且受限于临床环境中所需的通量。免疫磁性分离为一种更简单的方法，可高度易于自动化。因此，利用红细胞裂解与CD66b靶向的粒细胞耗尽的组合来反映Ficoll介导的CTC富集。流式细胞术显示使用这两种方法等同地去除红细胞和粒细胞(图1)。CTC基于拷贝数变化进行鉴定，并定义为在两个或更多个通道中具有增加(图2)。在肺癌患者的临床样品中进行测试后，观察到比先前发表的敏感性更低。在查看富集前后的流式细胞术数据时，在假阴性样品中观察到过量的粒细胞和单核细胞(图3)，表明需要最低水平的耗尽以达到期望的足够性能水平。另外，与真阳性相比较，观察到假阴性样品中扫描的总细胞数较少，表明细胞数也助于性能(图4)。随后，将CD14和CD66b添加至耗尽混合物中以分别去除单核细胞和粒细胞。使用来自相同患者的血液，与单独使用CD66b时相比较敏感性加倍(图5)，表明CTC在该测定中优先地与淋巴细胞部分共分离。CD14/CD66b混合物用于该研究的整个其余部分。

冷冻保存对测定性能的影响

在一些方面，4色荧光原位杂交LungLB^TM测定需要500万个细胞用作测定的输入，这意味着所有血浆和剩余的血细胞仍未使用和可用。尽管存在长期储存血浆的方案并且因此许多生物样本库可用，但没有已知的生物样本库可用于访问CTC。因此，我们尝试了多种方案来冷冻保护剩余的细胞，这对于回顾性分析是极有用的。在含有10％DMSO的溶液中的悬浮液在-80℃下显示出0.5、1、3和12个月的耗尽效率和FISH稳定性(图6)。细胞的稳定性如图7所描绘，显示新鲜细胞和冷冻保存3个月后的冷冻保存细胞。

4色荧光原位杂交LungLB^TM测定的分析验证

在开始初步研究之前，对4色荧光原位杂交LungLB^TM测定的分析性能进行评估。首先，对来自20名独特健康供体的血液样品进行4色荧光原位杂交LungLB^TM测定方案并记录CTC计数(图8)。所有样品的中位CTC计数为0.945CTC/10,000个分析细胞(±0.155SEM)。为了解线性关系，将A549肺腺癌细胞以5、10和20CTC掺入到健康供体血液中以代表临床样本中所见的低、中和高腺癌范围。该测定表现出具有强的线性(R²＝0.989)并且检测限低于每10,000个分析细胞5CTC(图9)，表明该测定适用于整个临床样本谱。

临床样品盲法分析

4色荧光原位杂交LungLB^TM测定正在开发为不确定肺结节患者临床评估中的辅助手段。因此，在经皮穿刺活检的同时对从46名受试者抽取的血液样品进行评估。进行经皮穿刺活检以获取足够的组织，从而对不确定肺结节作出明确诊断。揭盲之后，对良性与恶性病变患者的恶性肿瘤预测模块中目前使用的临床特征进行比较，并且在患者年龄、吸烟史或结节尺寸方面没有发现显著差异(表1)，表明数据反映“真实世界”的情况并且没有明显的选择性偏差。

表1：研究受试者的临床特征

4色荧光原位杂交LungLB^TM测定显示，在2.17CTC/10,000个分析细胞的临界值下，接受者操作特征曲线下面积(ROC-AUC)为0.823，灵敏度为81％和特异性为87％(图10)。在该临界值下，阳性预测值计算为92.5％和阴性预测值为68.4％。

研究中值得注意的一位受试者(LB11579)为一位64岁的女性前吸烟者(每年37包(pk-yr)吸烟史)，其左肺上叶存在一个3mm的可疑结节。肺癌活检阴性；然而，4色荧光原位杂交LungLB^TM测定结果为阳性(6.87CTC/10,000)，提示恶性过程(图11)。患者转诊至胸外科医生进行楔形切除并且手术病理学显示为腺癌。

讨论

众所周知，肺癌检测越早，存活率越高。这反映在关于肺癌筛查的NLST(Aberle等人(2011)N Engl J Med 365(5):395-409)和NELSON(de Koning HJ,van der Aalst CM,deJong PA,等人Reduced Lung-Cancer Mortality with Volume CT Screening in aRandomized Trial.N Engl J Med.2020；382(6):503-513)两项试验中。然而，非恶性肺结节非常常见，并且据报道使用LDCT的错误发现率超过95％(Aberle等人(2011)N Engl JMed 365(5):395-409)。成像的次优特异性，以及肺癌筛查所需的共同决策过程中的缺陷，导致对认为处于风险下的那些的肺癌筛查领会不足(Jemel和Fedawa,JAMA Oncol.2017；3(9):1278-1281)。事实上，临床医师报告说，与肺癌筛查风险患者的对话逐年减少，部分地可能是由于缺乏有效的筛查解决方案(Huo等人Cancer Epidemiol BiomarkersPrev.2019；28(5):963-973.)。需要一种能够在不确定肺结节的情况下提供另外信息的无创工具。

用于肺癌无创早期检测的新兴技术检测血液中的分析物，技术包括CTC、循环肿瘤DNA(ctDNA)和免疫应答标志物(Seijo等人(2019)J Thorac Oncol 14(3):343-357)。在这些技术当中，CTC或许为早期肺癌的最敏感和最特异的标志物，技术限制最少。ctDNA尽管在晚期肺癌中由于坏死和凋亡性病变的普遍大量而大量存在，但在早期疾病中，当肿瘤很小并且可从治愈性手术中获得最大益处时是有限的，并且因此使用ctDNA的敏感性不足以进行临床决策(Abbosh等人(2018)Nat Rev Clin Oncol.15(9):577-586)。尽管免疫应答已经演变为检测和响应恶性肿瘤，但当前的分子和机制知识是有限的。例如，检测肿瘤新抗原的自身抗体已用于检测恶性肿瘤的存在；然而，这些测定的敏感性可能很低，因为这些新抗原不覆盖肺癌谱。另外，由于肺结节可由许多免疫反应性损伤比如真菌和病毒感染形成，因此外周免疫应答或区域效应型方法可能会受到良性病变异质性的挑战。另一方面，CTC代表一种适当的分析物，因为它们利用肺部演变保守的生物过程。肺部细胞具有高的运动倾向，这在肺部上皮损伤后体内观察到(Vaughan等人(2015)Nature 517(7536):621-625,Kathiriya等人(2020)Cell Stem Cell.26(3):346-358)，并且在恶性转变期间这种机制可能是保守的。通过使用不可擦除的DNA FISH(即DNA)定义基于拷贝数变化的CTC，可使来自细胞中转录或翻译变化的影响最小化。

使用基于CTC的液体活检，本文所述的4色荧光原位杂交LungLB^TM测定能够在处于肺癌风险下的不确定肺结节受试者区分良性与恶性过程。该测定表现出具有高灵敏度和特异性两者，因为1)其利用在肺癌发病早期发现的CTC和2)经FISH使用DNA拷贝数变化作为读数，其通常为一种高度特异性的测定。

实施例2碳酸氢钠浓度对粒细胞尺寸的影响

图12A描绘标准裂解缓冲液，其中～66％的粒细胞尺寸转变为更小。碳酸氢钠浓度增加50％导致～82％的粒细胞尺寸转变为更小)，如中图所示(图12B)。图12C描绘在碳酸氢钠浓度降低75％的裂解缓冲液中粒细胞收缩的减少。

实施例3：三抗体CTC富集方法

评估向耗尽混合物中添加一种或多种另外抗体的效果。评估含有CD66b、CD14和CD3抗体的耗尽混合物。

来自免疫FISH研究的结果确定LungLB靶细胞为CD45+/CD3-或CD45-/CD3-，表明靶细胞可为某些免疫细胞或经典上皮CTC两者。两种CTC群体均为CD3阴性，这为通过向耗尽混合物中添加生物素化CD3抗体以进一步富集LungLB样品提供机会。LungLB v2混合物包括CD66b和CD14生物素化抗体。LungLB v3包括生物素化CD66b、CD14和CD3抗体。

与LungLB v2相比较，用LungLB v3测定处理的真阳性临床样品平均产生两倍的CTC(图13A和13B)。该研究为在范围从I期到IV期的5名独特肺癌阳性患者中进行，包括腺癌、鳞状细胞癌、SCLC和神经内分泌癌。这提供了LungLB CTC为CD3阴性的高水平信心。真阳性样品表明患者患有恶性肺癌。真阴性样品表明患者患有良性肺结节。假阳性样品表明良性肺结节患者的阳性结果。假阴性样品表明其中患者患有恶性肺癌的阴性结果。

实施例4：LungLB测定和CD45免疫染色

免疫FISH已用于R&D环境中，以确定LungLB CTC上存在的表面标志物。CD45为一种区分上皮CTC与造血白细胞的常用表面标志物。尽管图14A和14B中的大多数细胞为CD45阳性，但具有4R/2Gd/4Gr/2Aq探针模式的晚期CTC为CD45阴性。

在先前的免疫FISH研究中，发现多种双缺失CTC和4X2 CTC为CD45阴性。

CD45+靶细胞通常呈现3R/2Gd/3Gr/2Aq探针模式，并在不同程度的恶性和良性患者样品两者观察到。

CD45-靶细胞通常呈现更高级的探针模式，比如5R/1Gd/5Gr/1Aq(双缺失)或2R/4Gd/2Gr/4Aq(4X2 CTC)。这些靶细胞具有与CD45+靶细胞相比显著更高的对肺癌的特异性。

实施例5：利用抗CD19和抗CD56抗体富集CTC

使用另外的生物标志物和抗体，可用于进一步富集样品并增加LungLB测定中CTC的数量。待测试的潜在另外抗体包括CD3(T细胞)、CD19(B细胞)和CD56(NK细胞)。

基于每万个总细胞的CTC既定阈值，LungLB结果鉴定为阴性或阳性。LungLB阳性结果表明样本来自恶性肺癌患者。LungLB阴性结果表明样品来自良性结节患者。

结果：

患者LB11697中白细胞亚群的起始百分比提供评估最终样品中富集效率所需的基线。表2列出患者样品的起始白细胞(WBC)组成。

表2：WBC群的起始百分比

表3描绘当使用CD66b、CD14、CD3、CD19或CD56以各种抗体混合物处理时富集的白细胞亚群百分比。除抗CD66b、抗CD14和抗CD3抗体之外使用抗CD19抗体的LungLB v4.1将B细胞的百分比降低至0.1％和将NK细胞富集至72.9％。除抗CD66b、抗CD14和抗CD3抗体之外使用抗CD56抗体的LungLB v4.2将NK细胞的百分比降低至2.2％和将B细胞富集至70.5％。除抗CD66b、抗CD14和抗CD3抗体之外使用抗CD56抗体和CD19抗体的LungLB v4.3将NK细胞的百分比降低至9.2％和将B细胞降低至0.2％。

通过用缺失抗体的免疫荧光版本染色富集的细胞群用流式细胞术处理样品。这是一种正交方法，用于在用FISH处理每张载玻片之前确认其上白细胞亚群的确切百分比(图17A和17B)。

表3：WBC群的富集百分比

添加CD19的抗体混合物(B细胞耗尽)显著减少临床样品LB11679中观察到的CTC总数(表4)。这表明B细胞占靶细胞的大部分。随着样品的进一步富集，具有所有5种抗体的LungLB v4.3混合物中高级CTC亚型(双缺失)的数量得以保持，并且甚至显著增加。B细胞在早期肺癌诊断中可为必要的。高级CTC亚型即使在所有5种耗尽抗体的情况下也继续富集，可能是真正的肿瘤细胞。CD19+B细胞的阳性选择可提供进一步的诊断优势，包括…

分析分别来自含有真CTC的剩余富集细胞的CD45+/CD19+靶B细胞提供通过从两个途径解决问题、以产生更准确的肺癌诊断的机会。

从最终富集的样品中去除B细胞仅留下剩余的真CD45-上皮CTC，LungLB v4.3高级CTC数量支持了这一点。这将显著增加测定特异性。然而，测定灵敏度可能会降低，因为这些剩余的真CD45上皮CTC难以富集，并且可能不存在于每个患者中。

在恶性和良性患者两者中，甚至在正常健康供体中，均观察到不同程度的异常B细胞。尽管异常CD45+B细胞对肺癌的特异性可能不会低于CD45-CTC，但CD45+B细胞可提高测定灵敏度并使得可早期检测。

表4：LungLB FISH结果/CTC计数

Claims

1.一种用于鉴定处于肺癌发展风险下的受试者的方法，包括：

(a)从人类受试者获得测试样品；

(b)进行循环肿瘤细胞(CTC)富集步骤，包括：

(i)从所述样品中去除血浆，

(ii)从所述样品中去除红细胞，

(iii)使所述样品与至少一种结合细胞表面标志物的生物素化亲和剂接触，和

(iv)使所述样品与链霉亲和素包被的磁性颗粒接触并从所述样品中耗尽表达所述细胞表面标志物的细胞；

(c)用与染色体DNA的区域杂交的标记核酸探针杂交所述样品中富集的细胞；

(d)通过检测来自细胞的荧光原位杂交评估所选细胞的信号模式；

(e)基于所述标记核酸探针与所述所选细胞的杂交模式检测CTC；和

(f)当每个样品的CTC数量高于预定的临界值时，鉴定所述受试者处于肺癌发展的风险下。

2.权利要求1的方法，其中所述测试样品为血液。

3.权利要求1的方法，其中所述红细胞通过细胞裂解去除。

4.权利要求3的方法，其中所述细胞裂解通过氯化铵裂解缓冲液进行。

5.权利要求1的方法，其中所述血浆通过离心去除。

6.权利要求1的方法，其中所述细胞表面标志物选自CD66b、CD14、CD3、CD4、CD8、CD17、CD56、CD19、CD20、CD25、IgM或IgD。

7.权利要求1的方法，其中所述细胞表面标志物选自CD66b、CD3或CD14。

8.权利要求1的方法，其中所述细胞表面标志物包含CD66b和CD14。

9.权利要求1的方法，其中所述细胞表面标志物包含CD66b、CD14和CD3。

10.权利要求1的方法，其中所述细胞表面标志物包含CD66b、CD14、CD3和CD56。

11.权利要求1的方法，其中所述细胞表面标志物包含CD66b、CD14、CD3和CD19。

12.权利要求1的方法，其中所述细胞表面标志物包含CD66b、CD14、CD3、CD56和CD19。

13.权利要求1的方法，其中所述至少一种生物素化亲和剂包含抗CD66b、抗CD3、抗CD56、抗CD19或抗CD14抗体。

14.权利要求13的方法，其中所述至少一种生物素化亲和剂包含抗CD66b抗体和抗CD14抗体。

15.权利要求13的方法，其中所述至少一种生物素化亲和剂包含抗CD66b抗体、抗CD14抗体和抗CD3抗体。

16.权利要求13的方法，其中所述至少一种生物素化亲和剂包含抗CD66b抗体、抗CD14抗体、抗CD3抗体和抗CD56抗体。

17.权利要求13的方法，其中所述至少一种生物素化亲和剂包含抗CD66b抗体、抗CD14抗体、抗CD3抗体和抗CD19抗体。

18.权利要求13的方法，其中所述至少一种生物素化亲和剂包含抗CD66b抗体、抗CD14抗体、抗CD3抗体、抗CD56抗体和抗CD19抗体。

19.权利要求1的方法，其中所述耗尽细胞为中性粒细胞、单核细胞或淋巴细胞。

20.权利要求1的方法，其中所述耗尽细胞为中性粒细胞和单核细胞。

21.权利要求1的方法，其中所述CTC富集步骤进一步包括：

(i)使所述样品与至少一种结合细胞表面标志物的另外的生物素化亲和剂接触，和

(iv)使所述样品与链霉亲和素包被的磁性颗粒接触并收集表达所述细胞表面标志物的细胞。

22.权利要求21的方法，其中所述细胞表面标志物包含CD19、CD20、IgM或IgD中的至少一种。

23.权利要求21的方法，其中所述至少一种另外的生物素化亲和剂包含抗CD19抗体、抗CD20抗体、抗IgM抗体或抗igD抗体中的至少一种。

24.权利要求21的方法，其中所述收集的细胞包含淋巴细胞。

25.权利要求24的方法，其中所述淋巴细胞为B细胞。

26.权利要求1的方法，其中所述标记核酸探针包含3p22.1、10q22.3、10号染色体着丝粒(cep10)和3q29。

27.权利要求1的方法，其中所述处于风险下的受试者具有不确定肺结节。

28.权利要求1的方法，其中当所述核酸探针的杂交模式描绘细胞中两个或更多个染色体区域的增加时，鉴定CTC。

29.权利要求1的方法，其中当所述核酸探针的杂交模式描绘细胞中两个或更多个染色体区域的缺失时，鉴定CTC。

30.权利要求1的方法，其中CTC计数大于1CTC/10,000个细胞代表肺癌风险。

31.权利要求1的方法，其中CTC计数大于2CTC/10,000个细胞代表肺癌风险。

32.权利要求1的方法，其中CTC计数大于2.5CTC/10,000个细胞代表肺癌风险。

33.权利要求1的方法，其中CTC计数大于5CTC/10,000个细胞代表肺癌风险。

34.权利要求1的方法，其中CTC计数大于10CTC/10,000个细胞代表肺癌风险。

35.权利要求1的方法，其中CTC计数大于20CTC/10,000个细胞代表肺癌风险。

36.权利要求1的方法，其中所述CTC计数大于5CTC/10,000个细胞的受试者转诊进行结节的手术切除。

37.权利要求1的方法，其中所述3p22.1的标记核酸探针为RPL14、CD39L3、PMGM或GC20探针。

38.权利要求1的方法，其中所述10q22.3的标记核酸探针为表面活性剂蛋白A1或表面活性剂蛋白A2探针。

39.一种用于鉴定处于肺癌发展风险下的受试者的方法，包括：

(a)从人类受试者获得测试样品；

(b)进行循环肿瘤细胞(CTC)富集步骤，包括：

(i)从所述样品中去除血浆，

(ii)从所述样品中去除红细胞，

(iv)使所述样品与链霉亲和素包被的磁性颗粒接触并从所述样品中收集表达所述细胞表面标志物的细胞；

40.权利要求39的方法，其中所述细胞表面标志物选自CD66b、CD14、CD3、CD4、CD8、CD17、CD56、CD19、CD20、CD25、IgM或IgD。

41.权利要求39的方法，其中所述细胞表面标志物为B细胞特异性细胞表面标志物。

42.权利要求41的方法，其中所述B细胞特异性细胞表面标志物为CD19、CD20、IgM或IgD。

43.权利要求42的方法，其中所述至少一种生物素化亲和剂包含抗CD19抗体、抗CD20抗体、抗IgM抗体或抗IgD抗体。

44.一种在受试者中评估癌症的方法，包括通过前述权利要求中任何一项的方法确定含有来自患者的血细胞的样品中循环肿瘤细胞(CTC)的水平，其中所述样品中较高水平的CTC，与来自非侵袭性形式癌症的CTC的对照或预定数量相比较，指示侵袭性形式的癌症和/或癌症预后不佳。

45.一种在受试者中将癌症分期的方法，包括通过前述权利要求中任何一项的方法确定含有来自所述受试者的血细胞的样品中的循环肿瘤细胞(CTC)，其中与给定阶段的预定对照相比较所述样品中较高水平的CTC指示癌症的较晚期，而与给定阶段的对照相比较所述样品中较低水平的CTC指示癌症的较早期。