CN117844932B - 人类3号和10号染色体异常细胞检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及体外诊断技术领域，特别涉及人类3号和10号染色体异常细胞检测试剂盒及其制备方法。该试剂盒含有的探针组以特定的染色体位点或着丝粒为靶点，或者以多个特定的染色体位点或着丝粒的组合为靶点，能够快速、有效地检出包括肺癌乳腺癌、肠癌、食管癌、膀胱癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、宫颈癌或前列腺癌在内的多种癌症样本，适用于癌症诊断和预后产品的开发、推广。
Description
技术领域
本公开涉及体外诊断技术领域，特别涉及人类3号和10号染色体异常细胞检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
荧光原位杂交技术（FISH）是目前临床病理诊断中一种重要的辅助技术，主要用于基因的扩增、易位和融合，在癌症诊断中应该较为广泛，例如在癌症靶向相关基因检测、早期诊断、良性和恶性胸水鉴别以及预后等方面的应用。
原位杂交（in situ hybridization, ISH）是指将特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程。荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization, FISH）是以应该标记取代同位素标记而形成的一种原位杂交方法。目前该方法已广泛应用于临床病理工作中，发挥着有助于正确诊断疾病、指导临床靶向治疗以及评估患者预后的作用。
细菌人工染色体文库（BAC Library），是一种常用的基因组文库（Genomiclibrary），用BAC载体构建的含有某种生物体部分或者全部基因随机片段的重组DNA克隆群体，是一个贮存有基因组全部序列的信息库。
BAC载体通常以大肠杆菌作为宿主，稳定性高，没有基因缺失、交换和嵌合现象，构建的基因组文库是进行基因组研究的一项重要基础性工作，特别是对大基因组及超大基因组生物来说更是如此，在物理作图、基因图位克隆、比较基因组学分析、转基因研究、基因结构和调控、随机探针制备等研究中发挥了重要作用。
应用BAC文库制备用于癌症检测的原位杂交探针是目前快速获得癌症诊断产品的重要途径之一，但是，对于同一染色体靶点（例如同一亚带），使用含有不同靶点片段区域的BAC制备得到的随机探针组用于癌症诊断的荧光原位杂交检测得到的信号强度以及荧光背景结果具有明显差异，因此，需要对BAC文库含有的靶点片段区域进行优化，进而得到能够有效检测癌症的荧光原位杂交探针组。
发明内容
本公开的目的在于，提供一种人染色体异常检测试剂盒及其制备方法，该试剂盒含有的探针组以特定的染色体位点或着丝粒为靶点，或者以多个特定的染色体位点或着丝粒的组合为靶点，能够快速、有效地检出包括肺癌、乳腺癌、肠癌、食管癌、膀胱癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、宫颈癌和前列腺癌等在内的多种癌症样本，适用于癌症诊断和预后产品的开发、推广。
为了解决上述技术问题，实现上述目的，本公开提供以下技术方案：
本公开第一方面提供了人染色体异常检测试剂盒，其中，检测的染色体位点包括3p、3q、10cen（10p11.1）或10q中的至少一个位点，所述检测试剂盒含有扩增所述染色体位点的荧光原位杂交探针组。
在可选的实施方式中，所述探针组靶向的位点包括Chr3:40.2~41.2Mb、Chr3:195.6~197.3Mb、Chr10:37.7~39.5Mb或Chr10:78.9~79.7Mb中的至少一个位点。
在可选的实施方式中，所述染色体位点包括3p22.1、3q29、10cen（10p11.1）或10q22.3中的至少一个位点。
在可选的实施方式中，检测染色体位点3p22.1探针组的靶点片段包括Chr3:40,281,947~Chr3:41,223,565，检测染色体位点3q29探针组的靶点片段包括Chr3:195,692,486~ 197,328,281，检测染色体位点10cen（10p11.1）探针组的靶点片段包括Chr10:37,709,476~39,201,629，检测染色体位点10q22.3探针组的靶点片段包括Chr10:78,908,277~Chr10:79,990,274。
进一步地，所述检测染色体位点3p22.1探针组的靶点片段选自Chr3:40,281,947~40,476,764、Chr3:40,335,808~40,532,606、Chr3:40,331,951~40,518,255或Chr3:40,382,551~40,613,653中的至少一项；所述检测染色体位点3q29探针组的靶点片段为Chr3:195,692,486~195,894,522；所述检测染色体位点10cen（10p11.1）探针组的靶点片段为Chr10:37,709,476~38,214,862，优选为Chr10:37,709,476~37,861,144、Chr10:37,861,252~38,004,303或Chr10:38,007,581~38,214,862中的至少一项；所述检测染色体位点10q22.3探针组的靶点片段选自Chr10:79,491,820~79,670,444或Chr10:79,499,153~79,703,867中的至少一项。
在可选的实施方式中，所述检测试剂盒中仅含有以下（a）~（d）中任一项荧光原位杂交探针组：（a）所述荧光原位杂交探针组用于扩增Chr3:40,335,808~40,532,606、Chr3:40,331,951~40,518,255或Chr3:40,382,551~40,613,653中的至少一项；（b）所述荧光原位杂交探针组用于扩增Chr3:195,692,486~195,894,522；（c）所述荧光原位杂交探针组用于扩增Chr10:37,709,476~37,861,144、Chr10:37,861,252~38,004,303和Chr10:38,007,581~38,214,862的组合；（d）所述荧光原位杂交探针组用于扩增Chr10:79,491,820~79,670,444或Chr10:79,499,153~79,703,867中的至少一项。
在另一可选的实施方式中，所述检测试剂盒的荧光原位杂交探针组由以下（a）~（d）所示的荧光原位杂交探针组组成：（a）所述荧光原位杂交探针组用于扩增Chr3:40,335,808~40,532,606、Chr3:40,331,951~40,518,255或Chr3:40,382,551~40,613,653中的至少一项；（b）所述荧光原位杂交探针组用于扩增Chr3:195,692,486~195,894,522；（c）所述荧光原位杂交探针组用于扩增Chr10:37,709,476~37,861,144、Chr10:37,861,252~38,004,303和Chr10:38,007,581~38,214,862的组合；（d）所述荧光原位杂交探针组用于扩增Chr10:79,491,820~79,670,444或Chr10:79,499,153~79,703,867中的至少一项。
在可选的实施方式中，所述检测试剂盒还包括样品采集装置及耗材；所述样品采集装置采集的样本来自血液、唾液、尿液、胸腔积液或腹腔积液。
进一步地，所述来自血液的样本为外周血单个核细胞的梯度分离样品。
在可选的实施方式中，所述检测试剂盒还包括辅助检测试剂；
所述辅助检测试剂包括消化液、清洗液、血液样本保存液、Ficoll分裂液或FISH杂交用的有机试剂中的至少一种。
本公开第二方面提供了第一方面所述检测试剂盒的制备方法，所述制备方法包括，制备含有人染色体3p、3q、10cen（10p11.1）或10q中的至少一个位点靶序列的一株或多株BAC菌株，提取BAC菌株DNA，使用转座酶对提取得到的DNA随机片段化，同时在得到的随机片段两端添加转座酶识别序列，而后以随机片段为扩增模板，以靶向转座酶识别序列的序列为扩增引物，在dUTP与dTTP+dUTP数量比为50%~100%的扩增体系中进行扩增，得到靶向靶标序列的随机探针组合物；所述转座酶识别序列包括转座酶的ME序列和连于转座酶的ME序列5’端的接头序列；所述接头序列中碱基A的数量为4~20，在接头序列中，通过调整碱基A的含量来调整扩增步骤中插入dUTP碱基的数量，且不影响转座酶的效率及扩增效率；所述随机探针组合物中的dUTP还带有标记，标记方法包括：将dUTP标记后再加入扩增体系中，随扩增反应进行实现对随机探针组合物中dUTP的标记；或者，扩增反应过程中或扩增完成后，对得到的随机探针组合物中的dUTP进行标记；所述标记为荧光基团标记；所述荧光基团选自荧光素类染料、罗丹明类染料或菁染料。
本公开第三方面提供了前述实施方式所述检测试剂盒在制备癌症诊断和/或预后产品中的用途。其中，所述癌症优选为肺癌、乳腺癌、肠癌、食管癌、膀胱癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、宫颈癌或前列腺癌。其中，所述诊断和/或预后的方法包括，从待诊断样本和/或预后样本中分离获得细胞样本，使用前述实施方式中任一项所述检测试剂盒或者采用前述实施方式所述制备方法制备得到的试剂盒中的探针组与获得的细胞样本杂交，检测杂交信号并输出细胞样本的染色体异常结果。
本公开针对人染色体3p、3q、10cen（10p11.1）或10q中的至少一个位点，构建BAC文库，并以构建的BAC文库为原材料制备随机探针组，能够避免染色体定位错误，非特异性位点检出，背景噪音高，以及特异性信号强度弱等缺陷，快速、准确地检出包括肺癌、乳腺癌、肠癌、食管癌、膀胱癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、宫颈癌或前列腺癌等在内的多种癌症样本，适用于癌症诊断和预后产品的开发、推广。
附图说明
图1为实施例1中靶向3p22.1的BAC的Sp6测序比对结果；
图2为实施例1中靶向3p22.1的BAC的T7测序比对结果；
图3为实施例3中3p BAC单个靶点杂交结果；
图4为实施例3中4个3p BAC靶点特异性验证结果；
图5为实施例4中3q BAC单个靶点杂交结果；
图6为实施例4中3q BAC不同靶点杂交特异性验证结果；
图7为实施例5中10cen（10p11.1） 单/组合靶点的杂交结果；
图8为实施例5中10cen（10p11.1） 3个BAC叠加后的特异性验证结果；
图9为实施例5中3个BAC叠加后的信号强度对比和覆盖区域对比结果；
图10为实施例6中10q22.3-1和10q22.3-6的杂交结果；
图11为实施例6中10q22.3-1和10q22.3-6的特异性验证结果；
图12为实施例9中不同细胞数下得到的AUC值；
图13为实施例9中不同界值取值条件下的约登指数曲线；
图14为实施例9中界值取值为大于0.000183时的ROC曲线。
具体实施方式
为了更清楚地说明本公开实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本公开的一种实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的实施方式。
在本公开中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本公开，下面提供相关术语的定义和解释。
还应理解，在本文所述的包括多于一个步骤或行动的某些方法中，除非上下文另外指示，否则所述方法的步骤或行动的顺序未必限于所述方法的步骤或行动被列举的顺序。
定义
如本文所用，术语“一个”和“一种”以及“所述”和类似的指代物指示单数和复数，除非本文另外指明或上下文明显矛盾。
如本文所用，术语“约”、“基本上”和“类似于”是指在本领域普通技术人员所确定的特定值的可接受误差范围内，所述误差范围可部分取决于该值的测量或确定方式，或取决于测量系统的局限性。如本文使用本文提及“约”某个值或参数包括（和描述）针对值或参数本身的实施方式。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。
如本文所使用，术语“疾病和/或病症”是指所述受试者的一种身体状态，该身体状态与本发明所述疾病和/或病症有关。如本文所使用，术语“受试者”可以指患者或者其它接受本发明药物组合物以治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的动物，特别是哺乳动物，例如人、狗、猴、牛、马等。
如本文所使用，术语“癌症”指由致癌性转化的细胞增殖所导致的疾病或失调症。“癌症”应包含任意一种或多种大范围的良性或恶性肿瘤，包含那些能够例如经由淋巴系统和/或血流侵袭生长且穿过人体或动物体或其部分转移的那些肿瘤。尽管本发明的目的尤其在于恶性肿瘤和实体癌症的诊断或检测，但如在本文中所使用的，术语“肿瘤”包含良性和恶性肿瘤或实体肿块。癌症进一步包含（但并不限于）癌、淋巴瘤或肉瘤，例如卵巢癌、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌、尿道癌、子宫癌、急性淋巴细胞性白血病、霍奇金氏病（Hodgkin's disease）、小细胞肺癌、黑色素瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤（如成胶质细胞瘤），和软组织肉瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、肉瘤和腺癌等。
如本文所使用，术语“探针”指的是可与靶序列结合并用于检测与其互补的核酸序列的单链DNA或RNA片段。在一些实施方式中，探针为FISH探针。如本发明中所使用的，术语“荧光原位杂交技术，FISH(Fluorescence In Situ Hybridization)”是一种可以用来鉴定和分析准确位点上特定基因情况的技术。FISH检测根据核酸碱基互补配对原则，当待检测的DNA分子与所用核酸探针同源互补时，二者经过变性-退火-复性即可形成靶DNA 与核酸探针的杂交体。通常在核酸探针上标记报告分子，如生物素、地高辛等，利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，通过荧光显微镜镜检，对待测DNA 进行定性、定量或相对定位分析。FISH 技术可用来检测基因扩增、缺失及重排，如用于已知基因或序列的染色体定位、未克隆基因或遗传标记及染色体畸变的研究。“FISH探针”指的是荧光原位杂交技术所用的与待测DNA分子同源互补的核酸探针。
具体技术方案
在一个方面，本公开提供了人染色体异常检测试剂盒，其中，检测的染色体位点包括3p、3q、10cen（10p11.1）或10q中的至少一个位点，所述检测试剂盒含有扩增所述染色体位点的荧光原位杂交探针组。
在可选的实施方式中，所述探针组靶向的位点包括Chr3:40.2~41.2Mb、Chr3:195.6~197.3Mb、Chr10:37.7~39.5Mb或Chr10:78.9~79.7Mb中的至少一个位点。
在可选的实施方式中，所述染色体位点包括3p22.1、3q29、10cen（10p11.1）或10q22.3中的至少一个位点。
在可选的实施方式中，所述探针组靶向的位点包括染色体位点3p22.1的40.2~41.2Mb、染色体位点3q29的195.6~197.3Mb、染色体位点10cen（10p11.1）的37.7~39.5Mb或染色体位点10q22.3的78.9~79.7Mb中的至少一个位点。
在可选的实施方式中，检测染色体位点3p22.1探针组的靶点片段包括Chr3:40,281,947~Chr3:41,223,565，检测染色体位点3q29探针组的靶点片段包括Chr3:195,692,486~ 197,328,281，检测染色体位点10cen（10p11.1）探针组的靶点片段包括Chr10:37,709,476~39,201,629，检测染色体10q22.3探针组的靶点片段包括Chr10:78,908,277~Chr10:79,990,274。
进一步地，所述检测染色体位点3p22.1探针组的靶点片段选自Chr3:40,281,947~40,476,764、Chr3:40,335,808~40,532,606、Chr3:40,331,951~40,518,255或Chr3:40,382,551~40,613,653中的至少一项；所述检测染色体位点3q29探针组的靶点片段为Chr3:195,692,486~195,894,522；所述检测染色体位点10cen（10p11.1）探针组的靶点片段为Chr10:37,709,476~38,214,862，优选为Chr10:37,709,476~37,861,144、Chr10:37,861,252~38,004,303或Chr10:38,007,581~38,214,862中的至少一项；所述检测染色体位点10q22.3探针组的靶点片段选自Chr10:79,491,820~79,670,444或Chr10:79,499,153~79,703,867中的至少一项。
在可选的实施方式中，所述检测试剂盒中仅含有以下（a）~（d）中任一项荧光原位杂交探针组：（a）所述荧光原位杂交探针组用于扩增Chr3:40,335,808~40,532,606、Chr3:40,331,951~40,518,255或Chr3:40,382,551~40,613,653中的至少一项；（b）所述荧光原位杂交探针组用于扩增Chr3:195,692,486~195,894,522；（c）所述荧光原位杂交探针组用于扩增Chr10:37,709,476~37,861,144、Chr10:37,861,252~38,004,303和Chr10:38,007,581~38,214,862的组合；（d）所述荧光原位杂交探针组用于扩增Chr10:79,491,820~79,670,444或Chr10:79,499,153~79,703,867中的至少一项。
在另一可选的实施方式中，所述检测试剂盒的荧光原位杂交探针组由以下（a）~（d）所示的荧光原位杂交探针组组成：（a）所述荧光原位杂交探针组用于扩增Chr3:40,335,808~40,532,606、Chr3:40,331,951~40,518,255或Chr3:40,382,551~40,613,653中的至少一项；（b）所述荧光原位杂交探针组用于扩增Chr3:195,692,486~195,894,522；（c）所述荧光原位杂交探针组用于扩增Chr10:37,709,476~37,861,144、Chr10:37,861,252~38,004,303和Chr10:38,007,581~38,214,862的组合；（d）所述荧光原位杂交探针组用于扩增Chr10:79,491,820~79,670,444或Chr10:79,499,153~79,703,867中的至少一项。
在可选的实施方式中，所述检测试剂盒还包括样品采集装置及耗材；所述样品采集装置采集的样本来自血液、唾液、尿液、胸腔积液或腹腔积液。
进一步地，所述来自血液的样本为外周血单个核细胞的梯度分离样品。
在可选的实施方式中，所述检测试剂盒还包括辅助检测试剂；
所述辅助检测试剂包括消化液、清洗液、血液样本保存液、Ficoll分裂液或FISH杂交用的有机试剂中的至少一种。
其中，所述消化液包括消化酶，例如K蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等。所述染色液包括核酸复染液，例如DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）。所述洗脱液可以选用SSC洗脱剂溶液或其他常规洗脱液。
本公开第二方面提供了第一方面所述检测试剂盒的制备方法，所述制备方法包括，制备含有人染色体3p、3q、10cen（10p11.1）或10q中的至少一个位点靶序列的一株或多株BAC菌株，提取BAC菌株DNA，使用转座酶对提取得到的DNA随机片段化，同时在得到的随机片段两端添加转座酶识别序列，而后以随机片段为扩增模板，以靶向转座酶识别序列的序列为扩增引物，在dUTP与dTTP+dUTP数量比为50%~100%的扩增体系中进行扩增，得到靶向靶标序列的随机探针组合物；所述转座酶识别序列包括转座酶的ME序列和连于转座酶的ME序列5’端的接头序列；所述接头序列中碱基A的数量为4~20，在接头序列中，通过调整碱基A的含量来调整扩增步骤中插入dUTP碱基的数量，且不影响转座酶的效率及扩增效率；所述随机探针组合物中的dUTP还带有标记，标记方法包括：将dUTP标记后再加入扩增体系中，随扩增反应进行实现对随机探针组合物中dUTP的标记；或者，扩增反应过程中或扩增完成后，对得到的随机探针组合物中的dUTP进行标记；所述标记为荧光基团标记；所述荧光基团选自荧光素类染料、罗丹明类染料或菁染料。
本公开第三方面提供了前述实施方式所述检测试剂盒在制备癌症诊断和/或预后产品中的用途。其中，所述癌症优选为肺癌、乳腺癌、肠癌、食管癌、膀胱癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、宫颈癌或前列腺癌。其中，所述诊断和/或预后的方法包括，从待诊断样本和/或预后样本中分离获得细胞样本，使用前述实施方式中任一项所述检测试剂盒或者采用前述实施方式所述制备方法制备得到的试剂盒中的探针组与获得的细胞样本杂交，检测杂交信号并输出细胞样本的染色体异常结果。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件（例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社）或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：BAC文库构建
以染色体位点3p22.1为例，以染色体位点3p22.1的40.2~41.2Mb范围作为探针组的靶标，构建对应BAC，具体步骤如下：
以从单倍体细胞系(CHM1htert)/健康人白细胞中分离出的DNA为原料，用EcoRI限制性内切酶和EcoRI甲基化酶对嵌入的DNA进行酶切，并通过脉冲场电泳进行大小分离。将适当大小的DNA片段克隆到两个EcoRI位点之间的pBACGK1载体中，将连接产物转到DH10B(T1抗性)电转入大肠杆菌感受态细胞中。使用含抗生素的培养基筛选转染成功的克隆，单克隆培养后提取BAC DNA，并通过Sp6和T7双端测序鉴定、筛选插入的序列在染色体位点3p22.1的40.2~41.2Mb范围内的BAC（命名为3p22.1-8），筛选到的克隆测序结果如下：
Sp6测序结果为：
NNNNNNNNNNNCNNNNNNNNNNNNAGTTGTGCACAGCTTCTCACCCCCTGCATCGTTACATAAGAGCAGCCTTGGGCCTGGAACATTTTCTTGCACAGAGATAAAGAGTCATCATAGCCTGTGCTAGGCACATCTCTGCTTTGTAATAACTTTCCCCGTTCCGGGTTTCACGTGTACTTCTTTGTTCTTAAGCGCATGGGTCAATGGCCATCAAGTGCACCTCCAGCTTTCTATAGTTCTGGCCCCAGGGGGATGGGTTGAGGATCTTCACCTGCAGCAACAGAGCAGTGTATGCATTCCATCTCCCTGCATCAGCTAGAGGTCAAGACCCACTGCCATGGGGGCACACAGTCATCACTGAAGCTAATCCTGTTCCATCTCTTCTCTATATGAGTAAAGTGTTTTCCATCCAGTGCCTGTGTGAATCATCTTTCTTGGTGACATGGACATCTCCAAACCATACAGTAAGTTAACATCCTGGGACTGCTGCTTTGGTGATAAGCAACAGGGGTCATTTGCTCAACAACGACTGTAATGAAACTCTAGCTGAAAGAAAGGAATGCCTGCTTTAAAAGCACATAATTTAGGGACTTGACCCAGTTTGGATGTATGATCCAGATTAGGGGATGCCGGGGAAGTATCAGTGAAATGACTGAAGTGAGAAAAAAAGTATAAACAAGTGCTAATTAGTAAAATAATGTACAAAGGTCCTATGGCAGGAGTAAACATGATATATTTGAAAAACTGAAAGAAGGCTGGTTTGTCTTCAGAGCATGAAGTAAGAAGTAGTATGGGTTAATAGAGACTGGAAAGAGAGATAGAGAATATACCTTGCAGGGCCTTCCAGGTCACATTGAGAATCTGATTGTGAATCCACTAAGAAATGGACAGCATAAAAANAANNNTTTTNNNAAAANNNTTTTNNNNNNAAAAANANATNNNNNNNTTTTNNAAAAAAANNNGGCNNNNNTNNNNTNGGGAAAANNNNNNNNAANNGAAN（SEQ ID NO:1）。
T7测序结果为：
NNNNNNNNNNNNNNNANCAGAGCCATTCCTCCTTGGAGATAAGGCCTTCTAGACTCTGCTTTCTCTTCCAGGAGAGTATCTGGAAGGCCTGCGGTCCCTGTGGTCACTCCAAACCACCACCTCCAGCTCTGCCTTTCCAGTGCCCTCCTTCCACAAGAAAAGAAAGAAATGCTCCCCTTTACATGTGTAGGGATGGGAGGTTCTGGGCCAAGAGTCTTCTCCAAAGCTTTTCTCATTTATAAGGGGCACTACTAAACTCGTTGCCTGTGAGCACAGAGCTTTCCTATCTACTTCTCTACTTCCACTCCAAGCATTCCACTCGATCCTCCCTATCAGTCCATTTTGCAGATGGAGGCGCAGAACTGCAGATCTAGAGGAGACTGTAGAGATTGCCTTTGTGGGGGACAGAGTGGGCGTGAAGGTGATATTTATAGATACCTATTTTGTGCCCACACTGTACAGGACATTTTGTGAACAGGACTTCTGCCCAGTTCCACCTCATCACTTTCCTGATAGGGAAACTCTTTGCTTGCAGAAACGCTCTCTTGAGGGACTGCAGGGAAATGACTCTCTACCCCCGTCAATATGGTTACACATCCACATCTGCGTTCCATCTCCATGGCTGCCTTGCCTAGCACAGGGTCCAGAACAGAACCAGAGGTTGTATTATTGTGTTGGTTATATGTTTTCCCCTGGGACAAACAAAACAAAGCAGATGGTTTGTGCTGTGGTTCCTTTGAACCAGAAATTACAATCTTTGCTTCAAGACACAAGAGGATTATGAAGCCTTTTAAATGTCCTCCCTTTCTCGTTTTACTGCGAAGCTTCAGTGAACTCCAAACCCAGGGGTATTCATCGTAGCACAACAGATTAACCANNAGGACTGGGAAGTCATTTGAGATCTTNCNTNCCTTACTAAGCCNNNNNNAGATGNNANGNNNGGGCCTTANGGGAAANCNNCAGGGNANGGGNCTGCNTNNCGGAGGCNNNNNNAGCTTNN（SEQ ID NO:2）。
使用UCSC BLAT工具对测序结果进行序列比对，比对结果分别与chr3:40382456~40383326（如图1所示），chr3:40612865~40613750完全匹配（如图2所示），说明BAC插入的序列范围在chr3:40382456~40613750之间。
同理可以类似地获取其他靶标的BAC文库。
实施例2：随机探针组制备
本实施例以多种不同的BAC文库为原料制备靶向不同BAC的随机探针，具体包括以下步骤：
(1)序列获取
使用含氯霉素的LB培养基培养BAC菌株，按照BAC DNA纯化试剂盒或质粒纯化试剂盒(NucleoBond Xtra BAC，厂家：MACHEREY-NAGEL)提取BAC DNA。
(2)转座体(TTE Mix)制备
根据转座酶Tn5设计19bps的ME互补序列，序列如下：
ME-A：5’-AGATGTGTATAAGAGACAG-3’(SEQ ID No.3)
ME-B：5’-phos-CTGTCTCTTATACACATCT-NH2-3’(SEQ ID No.4)
将ME-A和ME-B等摩尔浓度混合并复性成双链，按转座酶(1Prep TagmentEnzyme，诺维赞)使用说明制备转座体。
(3)DNA片段化及接头添加
将BAC DNA稀释至50ng/μL，根据反应管数按下表配制反应体系，55℃反应10分钟：
反应结束后使用磁珠或柱纯化片段化产物。
(4)PCR扩增
以片段化的DNA为模板，能与ME序列互补结合的序列作为通用引物(所述通用引物可以与ME序列全序列对应互补，也可以与其部分互补)，进行PCR扩增，扩增反应中将部分或全部的dTTP替换为带修饰的dUTP进行多组实验，扩增时将dUTP随机插入到核酸序列中，所述dUTP与dTTP+dUTP数量比为50％、67％、75％、80％和100％。
根据反应管数按下表配制反应体系：
运行以下程序：
纯化PCR产物，使用超微量分光光度计测核酸浓度。取10ng产物作为模板进行下一轮扩增及修饰，反应体系如下：
运行以下程序：
纯化PCR产物，得到随机探针。
具体的BAC菌株靶点区域以及荧光标记颜色如下表所示：
实施例3：3p BAC筛选
使用建库法对3p BAC进行扩增，用Alexa Fluor 594染料（红色）进行标记，标记后的探针使用阴性参考盘玻片（健康人白细胞）进行杂交测试标记效果。用Alexa Fluor 488染料（绿色）进行标记，标记后的探针使用中期相玻片（健康人白细胞经秋水仙素）进行特异性验证。
BAC标记杂交结果显示，3p22.1-3杂交单个细胞信号点数量＞2个（图3所示），提示存在特异性问题，排除该BAC；三个BAC混合(3p22.1-1、3p22.1-2和3p22.1-3)的杂交结果显示单个细胞信号点数量＞4个，说明3个BAC定位不一致；后对除3p22.1-3的BAC进行中期相染色体特异性验证（与OGT探针进行共杂交，若信号点重叠，说明定位与OGT探针一致）。
特异性结果（图4所示）显示，3p22.1-1定位不在3号染色体上（与OGT探针定位不在同一染色体上）。3p22.1-2，3p22.1-11，3p22.1-8与OGT探针的定位一致，该4个BAC的特异性（图4所示）和杂交信号均可满足要求，3p22.1-8杂交信号最强，如下表所示：
实施例4：3q BAC筛选
使用建库法对3q BAC进行扩增，用Alexa Fluor 488染料（绿色）进行标记，标记后的探针使用阴性参考盘玻片进行杂交测试标记效果。用Alexa Fluor 594染料（红色）进行标记，标记后的探针使用中期相玻片进行特异性验证。
BAC标记效果显示3q29-6和3q29-1杂交信号均较强，特异性结果显示（图6所示）3q29-1和3q29-6与OGT-3q探针定位一致，但3q29-1有弱的非特异性信号点（图6所示），提示序列可能与其他染色体区域有非特异性结合，3q29-6与OGT-3q探针定位一致，因此选择3q29-6作为3q29的BAC效果更佳。3q BAC标记探针及OGT-3q探针杂交FISH扫描信号参数如下：
实施例5：10cen（10p11.1） BAC 探针组筛选
可行性研究阶段对10cen（10p11.1） BAC(10p11.1-6)的标记效果进行了验证，信号弱无法满足判读要求。因此选用5个连续的BAC（10p11.1-1~10p11.1-5）进行BAC叠加探针标记测试，通过BAC叠加来增加探针覆盖的区域，以期提高信号强度。
使用建库法对10cen（10p11.1）BAC进行扩增，用iFluor 440染料（蓝色）进行标记，标记后的探针使用阴性参考盘玻片进行杂交测试标记效果。用Atto 532染料（金色）进行标记，标记后的探针使用中期相玻片进行特异性验证。
BAC标记效果（图7所示）显示10p11.1-4和10p11.1-5标记探针有较多非特异性信号点，因此仅对10p11.1-1，10p11.1-2，10p11.1-3进行叠加测试。单个BAC和叠加后的BAC均为2个信号点，说明3个BAC在染色体上的定位一致，特异性验证结果表明叠加的探针与OGT-10cen（10p11.1）探针定位一致（图8所示），且3个BAC叠加的探针信号强度优于单个BAC的探针（图9所示）。
实施例6：10q BAC 筛选
使用建库法对10q BAC进行扩增，用Atto 532染料（金色）进行标记，标记后的探针使用阴性参考盘玻片进行杂交测试标记效果。用Alexa Fluor 594染料（红色）进行标记，标记后的探针使用中期相玻片进行特异性验证。
10q22.3-1和10q22.3-6标记的探针杂交信号均可满足判读要求（图10所示），且10q22.3-6与OGT-10q探针在同一样本上定位一致（图11所示），杂交FISH扫描信号参数如下：
实施例7
根据实施例3-6中的扫描结果，设置四色探针组合的临床性能，四色探针分别是3p22.1-8标记的3p 探针、3q29-6标记的3q探针、10p11.1-1，10p11.1-2，10p11.1-3叠加标记的10cen（10p11.1）探针和10q22.3-6标记的10q探针。
本实施例基于血液样本的杂交-上机检测流程，为提高杂交的成像效果，本实施例对FISH探针杂交流程中进行了优化。优化实验使用的检测样本为阴性参考盘玻片，阴性参考盘破片是通过分离的健康人白细胞中得到的单个核细胞制备得到。各个细胞的荧光信号强度及背景强度通过病理切片扫描仪（Duet System，BioView）成像分析的读取数据获取。
血液样本的杂交-上机的一般杂交流程如下：
（1）使用Ficoll分裂液分离待测样本得到单个核细胞混悬液；
（2）取细胞悬液，滴至载玻片上制备得到载有单个核细胞的载玻片；
（3）将载玻片浸没于消化液消化后，使用1×PBS洗涤，后依次浸没于1％甲醛固定液，以及70％、85％、100％梯度乙醇中室温脱水，静置待其完全干燥备用；
（4）吸取探针混合液，缓慢加到载玻片目的区域，立即将盖玻片覆盖至载玻片目的区域，用封片胶沿盖玻片边缘封片；
（5）将步骤（4）中的载玻片至于杂交仪中，启动杂交程序，杂交程序包括变性和杂交；
（6）将杂交后的载玻片依次浸入到洗脱剂-溶液1内高温洗脱（洗脱1），再侵入室温洗脱剂-溶液内洗脱（洗脱2），后取出载玻片避光干燥备用；
（7）向步骤（6）得到的载玻片目的区域中间加入核酸复染液，盖上盖玻片后直接用于病理切片扫描仪（Duet System，BioView）成像分析。
7.1 消化液合适工作浓度及时间的探究
使用胃蛋白酶作为消化液，胃蛋白酶是一种蛋白水解酶，其最适pH值为2.0，在此环境下，可消化包围核酸的蛋白质，以增加探针与核酸结合的机会，提高杂交效率。对反应体系中的酶消化条件进行检测，根据其荧光原位杂交信号质量筛选出最适的酶消化条件。
（1）消化液制备
参考原位杂交用蛋白酶说明书（粤珠械备20190035号，珠海圣美生物诊断技术有限公司）进行消化液的配制。配制时，先将消化缓冲液预热至37±1℃，再使用适当量程的移液器将1mL预热的消化缓冲液加至消化剂中；盖上消化剂盖子颠倒混匀充分溶解后，将瓶中溶液转移至消化缓冲液中；重复该步骤，直至所有的消化剂全部溶解及转移至消化缓冲液中，配制成0.25mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL三种浓度的消化液，将配制好的不同浓度消化工作液放置37±1℃活化15分钟备用。
（2）实验设置
将制备得到3个不同浓度的消化液在3个不同的酶消化时间进行正交实验，实验分组见表下表：
每个条件使用3张阴性参考盘玻片进行荧光原位杂交测试，然后在病理切片扫描仪进行扫描。扫描完成后对各个条件下的样本荧光信号强度及背景强度进行分析。选择最优的作为消化液工作条件。
（3）评价标准：
合格：要求4种荧光信号强度达到2级及以上，且高背景细胞比例小于10%。
优：要求4种荧光信号强度均达到3级且高背景细胞比例小于10%。
所述信号强度等级包括，1级：信号弱；2级：明亮；3级：很强。
实验结果如下表所示，可见消化条件为胃蛋白酶1mg/mL-10min时，其实验结果均为优，重复性及稳定性好。
7.2 变性条件
细胞核中的DNA经变性，随后与荧光探针杂交结合，形成“染色体-特定序列探针”复合物。在合适的变性温度及变性时间下，探针与核酸结合的紧密，可发出明亮的荧光信号。对反应体系中的变性条件进行研究，确认最优的变性条件。
（1）实验设置：
条件初筛： 设置3个不同的变性温度（70、75、80℃）、3个不同的变性时间（1、5、10min）进行正交实验，实验分组见下表：
每个条件使用3张阴性参考品进行荧光原位杂交测试，然后在病理切片扫描仪进行扫描。扫描完成后对各个条件下的样本荧光信号强度及背景强度进行分析。选择最优的作为初筛条件。
（2）条件复筛：在初筛最优的变性温度增加及降低3℃（±3℃），变性时间增加及降低2分钟（±2min）；每个条件使用3张阴性参考品进行荧光原位杂交测试，然后在病理切片扫描仪进行扫描。扫描完成后对各个条件下的样本荧光信号强度及背景强度进行分析。选择最优的作为复筛条件。
（3）条件确认：根据复筛最适的变性条件，使用3张阴性参考品进行荧光原位杂交测试，然后在病理切片扫描仪进行扫描。扫描完成后对样本荧光信号强度及背景强度进行分析。确定最终的变性条件。
（4）评判标准：
合格：要求4种荧光信号强度达到2级及以上，且高背景细胞比例小于10%。
优：要求4种荧光信号强度均达到3级且高背景细胞比例小于10%。
所述信号强度等级包括，1级：信号弱；2级：明亮；3级：很强。
检测结果如下，可见，在75℃-5min及75℃-10min条件下，均有合格和优的评价，此两种条件下无差别。结合常见的FISH方法以及时间的考量，选择75℃-5min进行下一步的条件确认。
复筛实验结果如下表所示，可见，在78℃-5min条件下实验结果为最优，选择该条件作为后续的确认条件。
变性实验结果如下表所示，可见，变性条件78℃-5min进行3次重复确认后，其实验结果均为优，重复性及稳定性较好。
综上，变性条件选择78℃-5min。
7.3 杂交温度和时间探究
杂交温度是杂交能否成功的一个关键因素。合适的温度下探针与核酸序列结合得更为紧密，温度过高或者过低，则会影响探针和目标DNA的杂交效率。杂交时间对结果的影响也较大。杂交时间过短会造成杂交不完全，过长则会增加非特异性杂交。大部分的DNA探针杂交时间定为16~20小时。
本实施例对反应体系中的杂交条件进行检测，根据其荧光原位杂交信号质量筛选出最优的杂交条件。
（1）实验设置
条件初筛：设置3个不同的杂交温度、3个不同的杂交时间进行正交实验，如下表所示：
每个条件使用3张阴性参考品进行荧光原位杂交测试，然后在病理切片扫描仪进行扫描。扫描完成后对各个条件下的样本荧光信号强度及背景强度进行分析。选择最优的作为初筛条件。
（2）条件复筛：复筛条件为最优的杂交温度±2℃，在最优的杂交时间范围内增加1个中间节点，每个条件使用3张阴性参考品进行荧光原位杂交测试，然后在病理切片扫描仪进行扫描。扫描完成后对各个条件下的样本荧光信号强度及背景强度进行分析。选择最优的作为复筛条件。
（3）条件确认：根据复筛最适的杂交条件，使用3张阴性参考品进行荧光原位杂交测试，然后在病理切片扫描仪进行扫描。扫描完成后对样本荧光信号强度及背景强度进行分析。确定最终的杂交条件。
（4）评价方法
合格：要求4种荧光信号强度达到2级及以上，且高背景细胞比例小于10%。
优：要求4种荧光信号强度均达到3级且高背景细胞比例小于10%。
所述信号强度等级包括，1级：信号弱；2级：明亮；3级：很强。
（5）实验结果及分析
初筛实验结果如下表所示，可见34℃-24h、39℃-16h、39℃-24h、44℃-16h检测结果均在合格以上，而39℃下16~24h整体更稳定，因此优先选择39℃作为最适的杂交温度，16~24h为杂交时间进行下一步复筛。
复筛实验结果如下表所示，可见，9个实验分组中每份样本4色荧光信号强度均符合2级及以上的标准，且高背景比例小于10%，符合预期标准。根据预期标准优先选择等级更高的条件作为最适条件，从上述3个杂交温度的实验分组中筛选出4色荧光信号强度等级更高更稳定的39℃/16~24h作为最适的杂交条件进行重复确认。
确认实验结果如下表所示，可见，3次确认的结果均符合预期标准，且可稳定重复，因此最适的杂交条件为39℃/16h~24h。
综上，杂交条件选择39℃、16h~24h。
7.4 高温洗脱1条件研究
洗脱1主要成分为0.4×SSC/0.3%洗脱剂（NP-40），在高温低盐的洗脱条件下，能够增加核酸链的严紧性，使RNA/DNA之间的排斥力增加，达到降低非特异性杂交信号的目的。对反应体系中的洗脱1条件进行研究，根据其荧光原位杂交信号质量筛选出最适的洗脱1条件。
（1）实验设置
条件初筛：设置3个不同的洗脱温度、3个不同的洗脱时间进行正交实验，实验分组如下表所示，每个条件使用3张阴性参考品进行荧光原位杂交测试，然后在病理切片扫描仪进行扫描。扫描完成后对各个条件下的样本荧光信号强度及背景强度进行分析。选择最优的作为初筛条件。
（2）复筛条件：在初筛最优的洗脱温度（±2℃），由于洗脱时间较短复筛仍对初筛的3个洗脱1时间（1min、2min、3min）进行重复测试；每个条件使用3张阴性参考品进行荧光原位杂交测试，然后在病理切片扫描仪进行扫描。扫描完成后对各个条件下的样本荧光信号强度及背景强度进行分析。选择最优的作为复筛条件。
（3）确认条件：根据复筛最适的洗脱条件，使用3张阴性参考品进行荧光原位杂交测试，然后在病理切片扫描仪进行扫描。扫描完成后对样本荧光信号强度及背景强度进行分析。确定最终的洗脱条件。
（4）可接受标准
合格：要求4种荧光信号强度达到2级及以上，且高背景细胞比例小于10%。
优：要求4种荧光信号强度均达到3级且高背景细胞比例小于10%。
所述信号强度等级包括，1级：信号弱；2级：明亮；3级：很强。
（5）实验结果及分析
初筛实验结果如下表所示，可见，78℃-3min的蓝色信号强度为1级不合格，其余8组实验均满足要求，按照选择条件最优更稳定的要求作为筛选标准，从上述8组实验中排除78℃及73℃，优先选择68℃作为最适的洗脱1温度进行下一步复筛。
复筛实验结果如下表所示，可见，66℃条件下各个时间的样本玻片信号出现不合格的情况。由于洗脱温度及洗脱时间在一定范围内均可满足信号强度高、背景低的要求，因此在确认条件的范围内选择70℃洗脱2分钟（蓝色信号很稳定呈现最优）进行实验稳定性确认的研究。
确认实验结果如下表所示，可见，洗脱1条件70℃-2min进行3次重复确认后，其实验结果均为合格或优，重复性及稳定性较好。
综上，高温洗脱1的条件为70℃洗脱2分钟。
7.5 室温洗脱2条件研究
洗脱2主要成分为2×SSC/0.1%洗脱剂（NP-40），在低温高盐的洗脱条件下，能够洗去大部分非特异性结合的探针。对反应体系中的洗脱2条件进行检测，根据其荧光原位杂交信号质量筛选出最适的洗脱2条件。
（1）实验设置
条件初筛：设置3个不同的洗脱时间，实验设置见下表，由于洗脱2温度为室温，无明确值，因此测试中沿用室温1个条件作为研究进行正交实验，每个条件使用3张阴性参考品进行荧光原位杂交测试，然后在病理切片扫描仪进行扫描。扫描完成后对各个条件下的样本荧光信号强度及背景强度进行分析。选择最优的作为初筛条件。
（2）条件确认：根据初筛最适的洗脱条件，使用3张阴性参考品进行荧光原位杂交测试，然后在病理切片扫描仪进行扫描。扫描完成后对样本荧光信号强度及背景强度进行分析。确定最终的洗脱2条件。
（3）可接受标准
合格：要求4种荧光信号强度达到2级及以上，且高背景细胞比例小于10%。
优：要求4种荧光信号强度均达到3级且高背景细胞比例小于10%。
所述信号强度等级包括，1级：信号弱；2级：明亮；3级：很强。
（4）实验结果及分析
初筛实验结果如下表所示，可以得知，室温洗脱3分钟的效果最优，因此优先选择室温-3min进行重复确认。
条件确认实验结果如下表所示，可以看出，洗脱条件室温-3min进行3次重复确认后，其实验结果均为合格或优，重复性及稳定性较好。
综上，洗脱条件选择室温洗脱3分钟。
实施例8 临床样本实验
8.1 样本信息
本实施例对130例申请人自存样本进行了研究，均有明确的诊断结果；包括非手术活检、手术活检或查体指症判断其良性。其中样本的人口学资料见下表：
按照国际抗癌联盟和美国癌症联合会TNM分期第8版，对130例样本的病例进行分类，分类结果见下表，原发肿瘤最大径小于等于30mm时为IA期。
8.2 实验流程
分别对以上样本按照如下所示的检测流程：
（1）收集受试者血样于细胞保存液中保存；
（2）使用Ficoll法分离血液样本得到单个核细胞混悬液；
（3）取20μL的细胞悬液，滴至载玻片上，得到载有单个核细胞的载玻片；
（4）将载玻片浸没于1mg/mL胃蛋白酶消化液10分钟后，使用1×PBS洗涤，后浸没于1％甲醛固定液5分钟后洗涤，后依次浸没在70％、85％、100％梯度乙醇中，室温脱水各1 分钟，静置待其完全干燥备用；
（5）吸取6 μL探针混合液，缓慢加到载玻片目的区域，立即将盖玻片覆盖至载玻片目的区域，用封片胶沿盖玻片边缘封片；
（6）将步骤5中的载玻片至于杂交仪中，启动杂交程序，杂交程序：78±1℃变性5分钟，39±1℃杂交16~24小时；
（7）将载玻片浸入到预热至70±1℃的0.4×SSC /0.3%洗脱剂-溶液内洗脱2分钟，取出载玻片，使用无尘纸吸干载玻片底部过量的液体，再浸入室温的2×SSC/0.1%洗脱剂-溶液内洗脱3分钟，后取出载玻片避光干燥备用；
（8）向步骤（7）得到的载玻片目的区域中间加入6μL核酸复染液，盖上盖玻片后直接用于病理切片扫描仪（Duet System，BioView）成像分析；
（9）识别成像结果中前500、5000、10000、30000和50000（含大于50000）的细胞，同时将扫描的细胞信号进行归类，并记录不同样本的细胞扫描数，异常细胞数量。
（10）识别判断标准：
①染色体异常的细胞的信号分布表现为染色体位点的增加或者缺失。
②测定检测到多染色体增加（即3号染色体的两种探针有3个或以上信号或10号染色体的两种探针有3个或以上信号）的细胞为循环异常细胞（Circulating Abnormal Cell，CAC）
③若有一个或多个CAC，则该样本判为异常样本。
选取前500、5000、10000、30000和50000的总扫描细胞数，分别检测不同细胞数下的循环异常细胞（CAC）数量，并比对其组织病例切片FISH数据，计算其AUC值，如图12所示，其中A~E分别代表扫描500、5000、10000、30000和50000个细胞。可见，扫描500、5000、10000、30000和50000个细胞均有不错的检测性能，其中50000个或以上的细胞下检测探针的检测性能最优，具有最优的AUC性能。
8.3 最佳阳性判断值的计算
确定50000或以上的细胞扫描数，统计130例申请人自存样本的阳性细胞比例，结合其组织病例切片FISH数据，计算不同阳性细胞比例界值下的约登指数。具体结果如图13所示，探究了界值为0.00038051~0.000995096下的约登指数，其中，界值为0.000053632~0.000311579的区间下，约登指数大于0.1，在界值为0.000177854~0.000274977区间下的约登指数均大于0.5，说明本方案可有效区分阴性和阳性患者。当界值取值为大于0.000183时（示例性的，当细胞扫描数为50000时，阳性细胞个数大于9个），约登指数最高，达到0.6282，此界值下本方案的灵敏度为84.69%，特异性为78.12%，ROC曲线如图14所示，AUC值高达0.866，说明界值取值为大于0.000183时，区分阴阳性患者的效果最佳。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.人染色体异常检测试剂盒，其中，检测的染色体位点包括3p22.1、3q29、10cen和10q22.3，所述检测试剂盒含有检测所述染色体位点的荧光原位杂交探针组；
其中，检测3p22.1的荧光原位杂交探针组的靶点片段为Chr3:40,382,551~40,613,653；
检测3q29的荧光原位杂交探针组的靶点片段为Chr3:195,692,486~195,894,522；
检测10cen的荧光原位杂交探针组的靶点片段为Chr10:37,709,476~37,861,144、Chr10:37,861,252~38,004,303和Chr10:38,007,581~38,214,862；
检测10q22.3的荧光原位杂交探针组的靶点片段为Chr10:79,499,153~79,703,867。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其中，所述检测试剂盒还包括样品采集装置及耗材；所述样品采集装置采集的样本来自血液、唾液、尿液、胸腔积液或腹腔积液。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其中，所述来自血液的样本为外周血单个核细胞的梯度分离样品。
4.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其中，所述检测试剂盒还包括消化液、清洗液、血液样本保存液、Ficoll分裂液或FISH杂交用的有机试剂中的至少一种。
5.权利要求1~4任一项所述检测试剂盒的制备方法，其中，所述制备方法包括，制备含有人染色体3p22.1、3q29、10cen和10q22.3靶序列的多株BAC菌株，提取BAC菌株DNA，使用转座酶对提取得到的DNA随机片段化，同时在得到的随机片段两端添加转座酶识别序列，而后以随机片段为扩增模板，以靶向转座酶识别序列的序列为扩增引物，在dUTP与dTTP+dUTP数量比为50%~100%的扩增体系中进行扩增，得到靶向靶标序列的随机探针组合物；所述转座酶识别序列包括转座酶的ME序列和连于转座酶的ME序列5’端的接头序列；所述接头序列中碱基A的数量为4~20，在接头序列中，通过调整碱基A的含量来调整扩增步骤中插入dUTP碱基的数量，且不影响转座酶的效率及扩增效率；所述随机探针组合物中的dUTP还带有标记，标记方法包括：将dUTP标记后再加入扩增体系中，随扩增反应进行实现对随机探针组合物中dUTP的标记；或者，扩增反应过程中或扩增完成后，对得到的随机探针组合物中的dUTP进行标记；所述标记为荧光基团标记；所述荧光基团选自荧光素类染料、罗丹明类染料或菁染料；
所述3p22.1的靶序列为Chr3:40,382,551~40,613,653；
所述3q29的靶序列为Chr3:195,692,486~195,894,522；
所述10cen的靶序列为Chr10:37,709,476~37,861,144、Chr10:37,861,252~38,004,303和Chr10:38,007,581~38,214,862；
所述10q22.3的靶序列为Chr10:79,499,153~79,703,867。
6.权利要求1~4任一项所述检测试剂盒在制备肺癌诊断产品中的用途；
所述诊断的方法包括，从待诊断样本中分离获得细胞样本，使用权利要求1~4任一项所述检测试剂盒中的探针组与获得的细胞样本杂交，检测杂交信号并输出细胞样本的染色体异常结果。
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