CN113621705A - 一种女性生殖系统肿瘤筛查、诊断和预后评估试剂盒 - Google Patents
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Abstract
一种女性生殖系统肿瘤筛查、诊断和预后评估试剂盒。本发明提供了一组染色体不稳定区域和基因变异的组合,所述的染色体不稳定区域和基因变异包括:1q、2p、2q、3p、3q、4p、6q、7q、8q、9q、10q、12p、14q、16q、17p、18q、19q、20q、PIK3CA。本发明的19个染色体不稳定区域和基因变异在女性生殖系统肿瘤患者中平均发生率高达90.8%,其中宫颈癌中发生率为96.2%,子宫内膜癌中发生率为90.8%,卵巢癌中发生率为85.7%,应用于筛查和/或诊断和/或预后评估女性生殖系统肿瘤的试剂或试剂盒中时,具有很高的灵敏度和特异性,具有很好的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种女性生殖系统肿瘤的筛查、诊断和预后评估的试剂盒。
背景技术
女性生殖系统肿瘤又称妇科肿瘤,临床上有良性及恶性之分。恶性妇科肿瘤中宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌是临床上最常见的恶性肿瘤。
宫颈癌患病的高峰年龄为40-60岁,近年来大量研究表明,宫颈癌的发病年龄呈年轻化趋势。宫颈癌的发生可通过对癌前病变的检查和处理得以有效控制。宫颈/阴道细胞学涂片检查及HPV检测是现阶段发现早期宫颈癌及癌前病变如宫颈上皮内瘤变(CIN)的初筛手段,特别是对临床体征不明显的早期病变的诊断。取材应在宫颈上皮的移行带处,即新旧鳞-柱上皮交界间的区域。细胞学涂片检查目前主要采用宫颈液基细胞学检查法(TCT),HPV检测可以作为TCT的有效补充,二者联合有利于提高筛查效率。宫颈/阴道细胞学及HPV检查有两点不足,首先取样需要专业的人员,占用大量工作人员;其次,对于宫颈管和宫颈内口无法采集到细胞,容易漏掉宫颈内部的肿瘤。
子宫内膜癌是发生于子宫内膜的上皮性恶性肿瘤,又称子宫体癌。目前为止,尚没有推荐的可以对子宫内膜癌进行常规筛查的手段。超声是可选择的检查方法。主要筛查方式为经阴道或经腹超声,监测子宫内膜厚度及异常情况。血液学方面没有特异性血清标志物,因此无常规监测筛查指标。Ⅰ期卵巢癌患者5年生存率可超过90%。但是卵巢深处盆腔,当卵巢病变处于早期时常无特异临床症状,当因出现症状而就诊时,70%的患者已处于晚期。因此卵巢癌的早期诊断具有重大意义。可是现有基于普通人群的资料,无论是CA125、经阴道超声单独筛查还是二者联合,均不能达到满意的筛查效果。对于普通人群的筛查方法,还需要进一步的探索。
卵巢癌死亡率位于女性生殖道恶性肿瘤之首,是严重威胁女性健康的恶性肿瘤。卵巢恶性肿瘤包括多种病理类型,其中最常见的是上皮性癌,约占卵巢恶性肿瘤的70%,其次是恶性生殖细胞肿瘤和性索间质肿瘤,各约占20%和5%。
染色体不稳定通常与肿瘤相关,染色体不稳定包括整个染色体或者染色体片段拷贝的缺失或扩增。含有与肿瘤发生相关的染色体或者染色体片段的扩增和缺失经常是肿瘤发生所特有的,检测肿瘤染色体不稳定区域对于研究肿瘤发生和开发肿瘤诊断技术都至关重要。
女性生殖系统分泌物可以获得卵巢、输卵管、子宫和宫颈的脱落细胞,通过二代测序检测阴道分泌物的脱落细胞的染色体异常和基因变异,可以很好的应用于女性整个生殖系统肿瘤的筛查、诊断和预后评估。
发明内容
本发明提供了一种女性生殖系统肿瘤筛查、诊断和预后评估试剂盒。本发明在研究女性生殖系统肿瘤所特有的染色体不稳定性和相关分子标志物的的基础上,公开了优化的全基因组二代测序方法的具体过程和染色体不稳定区域和基因变异,发现了19个与女性生殖系统肿瘤发生常见的染色体不稳定区域和基因变异,为应用二代测序技术对女性生殖系统肿瘤的临床筛查、早期诊断、制定个体化治疗方案及评估预后提供科学依据。
本发明中涉及的染色体不稳定区域和基因变异的编号依据本领域惯用编号规则进行限定,例如不稳定区2q在本领域惯用规则中指第2号染色体的长臂,不稳定区域7p指7号染色体短臂。
一方面,本发明提供了一组染色体不稳定区域和基因变异的组合。
所述的染色体不稳定区域和基因变异包括:1q、2p、2q、3p、3q、4p、6q、7q、8q、9q、10q、12p、14q、16q、17p、18q、19q、20q、PIK3CA。
所述的染色体不稳定包括整个染色体或者染色体片段拷贝的缺失或扩增。
所述的基因变异包括PIK3CA点突变。
所述的PIK3CA热点突变信息如下:
突变名称 | 氨基酸变化 | 碱基变化 | Cosmic ID |
H1047R | 组氨酸到精氨酸 | C<u>A</u>T>C<u>G</u>T | 775 |
H1047L | 组氨酸到亮氨酸 | C<u>A</u>T>C<u>T</u>T | 776 |
E542K | 谷氨酸到赖氨酸 | <u>G</u>AA><u>A</u>AA | 760 |
E545K | 谷氨酸到赖氨酸 | <u>G</u>AG><u>A</u>AG | 763 |
E545D | 谷氨酸到天冬氨酸 | GA<u>G</u>>GA<u>T</u> | 765 |
所述的7p扩增导致表皮生长因子EGFR(原癌基因)高表达,促进肿瘤进展。
所述的8q扩增导致原癌基因MYC高表达,促进肿瘤进展。
所述的16q区域或丢失或扩增丢失也导致相关抑癌基因低表达,促进肿瘤进展。
所述的PIK3CA基因时逆转录病毒v-p3k癌基因在细胞内的同系物,PIK3CA基因是由Volinia在1994年利用原位杂交技术检测到的,其定位于3q26.3,包含20个外显子,编码1068个氨基酸。PIK3CA基因突变导致PI3K/Akt信号通路持续性活化,PIK3CA作为EGFR下游信号分子被激活,导致肿瘤的发生。
所述的19个染色体不稳定区域和基因变异在女性生殖系统肿瘤中总的携带率为90.8%。
另一方面,本发明提供了一种文库接头。
所述的文库接头的序列选自SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2。
所述的文库接头用于检测前述的染色体不稳定区域和基因变异的组合。
所述的文库接头可用于基因文库的构建。
再一方面,本发明提供了一种基因文库的构建方法。
所述的构建方法中包括使用前述的文库接头进行构建。
又一方面,本发明提供了前述的染色体不稳定区域和基因变异的组合和/或文库接头和/或基因文库的构建方法在制备用于筛查和/或诊断和/或预后评估女性生殖系统肿瘤的试剂或试剂盒中的应用。
又一方面,本发明提供了一种用于筛查和/或诊断和/或预后评估女性生殖系统肿瘤的试剂或试剂盒。
所述的试剂或试剂盒包括但不限于:女性生殖系统肿瘤筛查的试剂或试剂盒、女性生殖系统肿瘤早期诊断的试剂或试剂盒、女性生殖系统肿瘤病情监测的试剂或试剂盒。
所述的试剂用于检测前述的染色体不稳定区域和基因变异的组合。
所述的试剂用于二代测序中检测前述的染色体不稳定区域和基因变异的组合。
所述的试剂盒中包括用于二代测序中检测前述的染色体不稳定区域和基因变异的组合的试剂。
所述的试剂盒中还包括权利要求前述的文库接头。
所述的试剂盒中还包括阳性参考品、阴性参考品、缓冲液、酶、可检测标签、核酸提取试剂、核酸纯化试剂中的一种或多种。
进一步地,所述的酶包括打断酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、RNA消化酶、DNA消化酶及逆转录酶中的一种或多种。
进一步地,所述的阳性参考品为混合有前述的19个区域变异的细胞系;所述的阴性参考品为无染色体变异的细胞系。
可选择地,所述试剂盒还包含临床上用于女性生殖系统肿瘤的筛查、诊断、治疗方案选择、监测和预后评估的其它试剂,以辅助或验证通过检测上述19个染色体不稳定区域和基因变异所得到的结果。
又一方面,本发明提供了前述试剂或试剂盒的使用方法。
所述的使用方法包括但不限于数字PCR、原位荧光杂交、核酸探针杂交法等。
所述的试剂或试剂盒可检测的临床样品包括但不限于:阴道分泌液、组织、脱落细胞等。
所述试剂盒的操作方法包括以下步骤:
(1)从检测对象获得待测样品;
(2)待测样品与利用本发明的检测试剂接触;
(3)检测待测样本上述19个染色体不稳定区域和基因变异;
(4)根据检测结果进行女性生殖系统肿瘤的筛查、诊断、治疗方案选择、监测和预后评估。
本发明的有益之处:
1、19个染色体不稳定区域和基因变异在女性生殖系统肿瘤患者中高达90.8%;其中宫颈癌中发生率为96.2%,子宫内膜癌中发生率为90.8%,卵巢癌中发生率为85.7%。
2、使用本专利19个染色体不稳定区域和基因变异作为分析标识,通过二代测序诊断女性生殖系统肿瘤具有很高的灵敏度和特异性。
附图说明
图1为19个染色体不稳定区域和基因变异在2号染色体和3号染色体上的分布图。此图为分析软件直出图,如果对阴影部分进行人为修改不利于结果判读,因此保留了灰度图片。
图2为19个染色体不稳定区域和基因变异在7号染色体上的分布图。此图为分析软件直出图,如果对阴影部分进行人为修改不利于结果判读,因此保留了灰度图片。
图3为19个染色体不稳定区域和基因变异在8号染色体和9号染色体上的分布图。此图为分析软件直出图,如果对阴影部分进行人为修改不利于结果判读,因此保留了灰度图片。
图4为19染色体不稳定区域和基因变异在12号染色体、14号染色体和18号染色体上的分布图。此图为分析软件直出图,如果对阴影部分进行人为修改不利于结果判读,因此保留了灰度图片。
图5为计算本分析方法的灵敏度和特异性得到的ROC曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例,对本发明作进一步详细的阐述,下述实施例不用于限制本发明,仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,下述实施例中所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1染色体不稳定区域和基因变异的筛选
对临床病理确诊的53例宫颈癌患者、65例子宫内膜癌患者、56例卵巢癌患者和78例女性生殖系统良性疾病的核酸进行建库,上机进行全基因组和转录组高通量测序或者目标区域靶向捕获测序,对染色体拷贝数和基因变异进行分析,识别发生染色体不稳定区域和基因变异。分析统计肿瘤患者和对照组在染色体不稳定和基因变异方面的差别。
经过上述操作,发现了与女性生殖系统肿瘤相关性很高的19个常见染色体不稳定区域和基因变异,包含1q、2p、2q、3p、3q、4p、6q、7q、8q、9q、10q、12p、14q、16q、17p、18q、19q、20q、PIK3CA。
从携带频率来看,19个染色体不稳定区域和基因变异在女性生殖系统肿瘤中高达90.8%,共计158例患者携带上述染色体不稳定区域和基因变异。基因变异PIK3CA基因点突变在子宫内膜癌中发生频率36.9%。染色体不稳定以1q最为常见,发生频率44.9%;其次是8q、7q、17p,其发生频率分别是39.9%、32.3%和31.0%。
实施例2阴道分泌物脱落细胞基因组DNA提取
本实施例选用的试剂盒购自QIAGEN公司(货号:80204)。
a.使用卫生棉球放置患者阴道中6-8h,取出卫生棉球至50mL离心管中,加入1×PBS缓冲液,并淹没卫生棉球,轻微震荡后,去除卫生棉球并挤压出液体,剩余液体进行1600g离心10min,小心倒去上清液,再用移液枪小心吸弃剩余的上清液。
b.加入350μL 1×Buffer RL/DTT至新的1.5mL离心管中,用一次性20号针头的注射器小心抽打裂解液至少5次打散细胞。
c.把DNA纯化柱装在2mL收集管中。把细胞裂解液转移至gDNA过滤柱中。14000g离心2min。
d.取DNA纯化柱装在2mL收集管中。加入500μL Buffer DW1至柱子中,静置2min。10000g离心30-60s。
e.倒弃流出液,把柱子装回收集管中。加入500μL Buffer RW2至柱子中。10000g离心30-60s。
f.倒弃流出液,把柱子装回收集管中。加入500μL Buffer RW2至柱子中。10000g离心30-60s。
g.倒弃流出液,把柱子套回空的收集管。13000g离心2min。
h.将DNA柱子装在1.5mL离心管中。加入30-50μL预热至65℃无核酸酶水至柱子膜中央。室温静置3min。13000g离心1min。
i.弃去DNA柱,把DNA保存于2-8℃或-20℃。
实施例3文库接头的制备
本实施例接头序列经由生工生物(上海)公司进行合成。
接头-1序列为SEQ ID NO.1,接头-2序列为SEQ ID NO.2。
接头-1的5’端进行磷酸化修饰,接头-2的3’端G和T之间进行硫代磷酸修饰。
使用退火缓冲液(Annealing buffer)将接头-1和接头-2的干粉分别稀释成10μM,将两者稀释液等比例混合,得到的混合液置于PCR仪中,运行程序如表1:
表1
实施例4 19个染色体不稳定区域和基因变异作为分析标识筛查、诊断女性生殖系统肿瘤-基因组DNA文库构建
本实施例中相关试剂盒购自Roche公司,货号:KK8601;NEB公司,货号:E7645S。
1、基因组片段化:取20ng人基因组DNA(来源为临床确诊样本),配制如表2所示的酶切反应体系,按照表3程序进行反应。本实施例中人基因组DNA的浓度为2ng/μL,反应体系中需加入10μL。
表2
组分 | 体系/μL |
基因组DNA | 10 |
片段化混合酶 | 10 |
片段化缓冲液 | 5 |
无核酸水 | 补至50 |
总体系 | 50 |
振荡混匀、离心(避免气泡)后在PCR仪上运行以下程序:
表3
2、末端加A反应
如果人基因组DNA为无细胞的游离DNA,如血液中的cfDNA,则不需要经过基因组片段化,直接进行末修加A,取20ng cfDNA,配制如表4所示的酶切反应体系,按照表5程序进行反应。上一步反应产物按照表5进行配置。
表4
gDNA末修加A反应 | 体系/μL |
上一步反应产物 | 50 |
末修加A酶 | 3 |
末修加A缓冲液 | 7 |
总体系 | 60 |
振荡混匀、离心(避免气泡)后在PCR仪上运行以下程序:
表5
3、接头连接反应:将接头连接酶(5μL/样本)、接头连接增强剂(30μL/样本)按照所检测的样本数目吸取适当的体积进行混合后,吸取35μL混合液加入到上一步的反应产物中,再吸取5μL实施例3中制备的混合接头加入到上述反应液中,振荡混匀、离心。最终形成下表6中的反应体系。
表6
组分 | 体系/μL |
上一步反应产物 | 60 |
接头连接预混液 | 30 |
接头连接增强剂 | 1 |
混合接头 | 2.5 |
总体系 | 93.5 |
将上述体系置于PCR仪中,运行程序:20℃,30min,热盖关闭。
4、连接反应后纯化步骤:
a.提前取出文库纯化磁珠,室温静置至少30min,使用前需混匀。
b.将上述步骤中的接头连接反应液转移到相应编号的1.5mL离心管,加入84μL重悬的文库纯化磁珠,使用适当量程的移液器匀速吸打20次,室温孵育5min。
c.将离心管置于磁力架上,待溶液澄清后,弃上层清液。
d.向其中加入新鲜配置的200μL 80%的乙醇,静置30s后,弃上层清液。
e.重复步骤d一次。
f.磁力架上取下离心管,瞬时离心3s,离心管放回磁力架上,吸弃掉残留的80%乙醇,注意不要吸到磁珠。打开管盖,室温晾干2-10min。
g.待磁珠成亚光色,离心管中加入17μL无核酸酶水,轻微震荡使磁珠重悬,室温孵育5min。
h.将离心管置于磁力架上,静置2min。待溶液澄清后,取15μL上清留待下一步扩增反应。
5、PCR扩增:依下表7,加入相应试剂至PCR管中:
表7
组分 | 体系/μL |
上一步纯化连接产物 | 15 |
PCR扩增预混液 | 25 |
P7端标签引物 | 5 |
P5端标签引物 | 5 |
总体系 | 50 |
其中,P7端标签引物和P5端标签引物经由生工生物(上海)公司合成。具体序列如下:
表8
将混合好的PCR管放入至PCR仪中,运行以下程序:
表9
6、PCR产物纯化参考步骤3纯化步骤,其中:
步骤b中重悬的文库纯化磁珠的用量为45μL;
步骤g中Low TE缓冲液(或者无核酸酶水)加入量为31μL;
步骤h中取30μL上清留待下一步操作。
7、文库定量上机
上述纯化文库使用Qseq生物片段分析系统对片段大小进行分析,使用dsDNA HS Assay Kit(购自赛默飞世尔科技公司)对文库质量浓度进行测量,通过质量浓度和片段大小计算文库摩尔浓度,根据上测序仪说明书使用Illumina Hiseq X-ten进行测序。
结果分析讨论:
上机测序数据经过本发明所述数据分析方法后,得到染色体不稳定区域和基因变异分布图,如图1-4所示。
染色体不稳定分析结果由三部分组成:染色体编号,染色体分区以及染色体测序深度分布。染色体测序深度分布区域中圆点为染色体小区域拷贝数分布情况,当其在纵轴scores值在-3到3之间时判定无不稳定发生,当其scores值大于3时判定为扩增,当其scores值小于-3时判定为缺失,对于发生扩增或缺失的区域使用灰色背景与正常区域进行区分。通过分析结果查看是否有上述染色体不稳定发生,若发生判定为阳性,若未发生判定为阴性。
基因变异分析:PIK3CA热点突变,首先计算热点的测序深度要求大于300×,在此基础上若支持突变类型的测序reads数≥3条,且突变频率≥1%,则判定为突变阳性,否则判定为阴性。
将二代分析结果与病理结果进行比较,计算本分析方法的灵敏度和特异性,得到ROC曲线,如图5所示。本方法ROC曲线的AUC面积达到0.923,说明使用本专利19个染色体不稳定区域和基因变异作为分析标识,通过二代测序诊断女性生殖系统肿瘤具有很高的灵敏度和特异性。
序列表
<110> 苏州宏元生物科技有限公司
<120> 一种女性生殖系统肿瘤筛查、诊断和预后评估试剂盒
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aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca agcggaaaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 15
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc ggaacaaaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
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aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg gtaagctaca ctctttccct acacgacgct 60
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aatgatacgg cgaccaccga gatctacact gtggcataca ctctttccct acacgacgct 60
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<212> DNA
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aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca ctacggaaca ctctttccct acacgacgct 60
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Claims (7)
1.一组染色体不稳定区域和基因变异的组合,其特征在于,所述的染色体不稳定区域和基因变异包括:1q、2p、2q、3p、3q、4p、6q、7q、8q、9q、10q、12p、14q、16q、17p、18q、19q、20q、PIK3CA。
2.根据权利要求1所述的染色体不稳定区域和基因变异的组合,其特征在于,所述的染色体不稳定包括整个染色体或者染色体片段拷贝的缺失或扩增,所述的基因变异包括PIK3CA的点突变。
3.权利要求1-2任一项所述的染色体不稳定区域和基因变异的组合在制备用于筛查和/或诊断和/或预后评估女性生殖系统肿瘤的试剂和/或试剂盒中的应用。
4.一种用于筛查和/或诊断和/或预后评估女性生殖系统肿瘤的试剂或试剂盒,其特征在于,所述的试剂用于检测权利要求1-2任一项所述的染色体不稳定区域和基因变异的组合;所述的试剂盒包括用于检测权利要求1-2任一项所述的染色体不稳定区域和基因变异的组合的试剂。
5.根据权利要求4所述的试剂或试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒中包括阳性参考品、阴性参考品、缓冲液、酶、可检测标签、核酸提取试剂、核酸纯化试剂中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的试剂或试剂盒,其特征在于,所述的酶包括打断酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、RNA消化酶、DNA消化酶及逆转录酶中的一种或多种。
7.根据权利要求6所述的试剂或试剂盒,其特征在于,所述的阳性参考品为混合有权利要求1所述的19个区域变异的细胞系;所述的阴性参考品为无染色体变异的细胞系。
Priority Applications (1)
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-
2021
- 2021-07-28 CN CN202110859600.3A patent/CN113621705A/zh active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Title |
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