CN114438213A - 一种检测胆囊癌和胆管癌的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一组染色体不稳定区域在制备胆囊癌和/或胆管癌的检测、筛查、诊断、预后评估或病情监测的药物或试剂盒中的应用,所述的染色体区域包括以下17个:1p、1q、2q、3q、6p、7p、8p、8q、9p、12p、14q、17p、18p、18q、20p、20q、21q。本发明17个常见染色体不稳定区域在胆囊癌和胆管癌患者中总的携带率高达90.2%,这对临床胆囊癌和胆管癌的检测、筛查、诊断、预后评估或病情监测具有很大的意义。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种检测胆囊癌和胆管癌的试剂盒。
背景技术
胆囊癌指发生于胆囊(包括胆囊底部、体部、颈部及胆囊管)的恶性肿瘤。我国胆囊癌的发病率占同期胆道疾病的0.4%-3.8%,居消化道肿瘤第六位,胆囊癌患者5年总体生存率仅为5%。目前对于胆囊癌的发病机制尚未完全了解,多为环境、遗传因素相关。胆囊癌的发生的危险因素包括:胆囊结石、胆囊息肉样病变、胆囊慢性炎症和“保胆取石”术后胆囊,其中约85%的胆囊癌患者合并胆囊结石。胆囊结石患者胆囊癌的风险是无胆囊结石人群的13.7倍。
胆囊癌无特异性临床症状,常被胆囊炎、胆囊结石及其并发症所掩盖,如腹部不适、食欲下降或体重减轻。一旦出现明显临床症状,多属中晚期,可表现为黄疸、发热及腹痛等。目前血清CA19-9和(或)癌胚抗原升高是最常用的诊断胆囊癌的肿瘤标志物,其他还有CA125、CA724、CA153等。合并梗阻性黄疸时,CA19-9的诊断特异性低。常见的影像学检查包括超声、内镜超声、多层螺旋CT、MRI和PET-CT,临床上需要与黄色肉芽性肝胆炎、肝癌侵犯胆囊、肝门胆管癌与萎缩性胆囊炎等疾病相鉴别。
胆管癌主要指肝外胆管细胞癌(extrahepatic cholangiocarcinoma,ECC)是一类起源于胆管粘膜上皮细胞、以胆管细胞分化为特征的相对罕见的高致死性恶性肿瘤,约占胆系恶性肿瘤的75%。ECC主要的特点是恶性程度高、确诊时间晚、化学治疗效果差、耐多药、预后差,极易侵犯周围肝实质。原发性恶性肝胆系统肿瘤中,ECC的发病率仅次于胆囊癌,位居第二。ECC的发病率显著高于肝内胆管细胞癌,而在ECC中发病率最高的是肝门部胆管癌,约占ECC总数的60-70%,占所有胆管癌的40-60%,又被称为高位胆管癌、近端胆管癌。ECC多见于50-70岁之间的中老年人,男女发病比例约为2-2.6:1。
染色体不稳定通常与肿瘤相关,具体包括整个染色体或者染色体片段拷贝的缺失或扩增。含有与肿瘤发生相关的染色体或者染色体片段的扩增和缺失经常是肿瘤发生所特有的,检测肿瘤染色体不稳定区域对于研究肿瘤发生和开发肿瘤诊断技术都至关重要。当前临床上有使用原位荧光杂交的方法对染色体上部分区域的不稳定性进行检测,但缺少对患者整个基因组层面染色体不稳定性的分布特征。
发明内容
为了解决上述问题,本发明使用二代测序技术,通过分析胆囊癌和胆管癌染色体不稳定信息,筛选出适宜表征胆囊癌和胆管癌的17个区域,通过该方法可以对胆囊癌和胆管癌的临床早期诊断和制定个体化治疗方案提供科学依据。
本发明中,染色体不稳定是指正在进行的染色体改变,它涉及染色体拷贝数(numerical)或结构(structure)的扩增或缺失,所述的染色体不稳定包括整个染色体或者染色体片段拷贝的缺失或扩增。
涉及的染色体不稳定的编号依据本领域惯用编号规则进行限定,例如不稳定区1q在本领域惯用规则中指第1号染色体的长臂,不稳定区域6p指6号染色体短臂。
一方面,本发明提供了一组染色体不稳定区域在制备胆囊癌和/或胆管癌的检测、筛查、诊断、预后评估或病情监测的药物或试剂盒中的应用。
所述的染色体区域包括以下17个:1p、1q、2q、3q、6p、7p、8p、8q、9p、12p、14q、17p、18p、18q、20p、20q、21q。
所述的应用基于二代测序技术。
具体地,所述的7p区域的扩增可导致表皮生长因子EGFR(原癌基因)高表达;所述的9p区域16位点抑癌基因的缺失,导致细胞周期调控的异常;所述的17p缺失导致抑癌基因TP53不能表达,促进肿瘤进展。
具体地,所述的17个不稳定区域在胆囊癌和胆管癌患者中总的携带率高达90.2%。
所述的在药物中的应用包括但不限于药效的检测。
另一方面,本发明提供了一种基于二代测序技术的胆囊癌和/或胆管癌相关试剂盒。
所述的试剂盒可用于胆囊癌和/或胆管癌的检测、筛查、诊断、预后评估或病情监测。
具体地,所述的试剂或试剂盒包括但不限于:诊断胆囊癌和胆管癌的试剂或试剂盒、胆囊癌和胆管癌的早期筛查的试剂或试剂盒、胆囊癌和胆管癌的病情监测的试剂或试剂盒。
所述的试剂盒种包括用于二代测序中检测染色体不稳定区域的试剂。
所述的染色体不稳定包括:1p、1q、2q、3q、6p、7p、8p、8q、9p、12p、14q、17p、18p、18q、20p、20q、21q。
具体地,所述的试剂盒还包含:阳性参考品、阴性参考品、缓冲液、酶、文库接头、可检测标签、核酸提取试剂、核酸纯化试剂中的一种或多种。
进一步具体地,所述的酶包含打断酶、DNA聚合酶、DNA连接酶中的一种或多种。
进一步具体地,所述的阳性参考品为混合有前述的17个区域变异的细胞系。
可选择地,所述的试剂盒可通过以下方法进行结果检测:数字PCR、原位荧光杂交、核酸探针杂交法等。
可选择地,所述试剂盒还包含临床上用于肺癌的检测、筛查、诊断、预后评估或病情监测和肺部感染的检测、诊断的其它试剂,以辅助或验证通过检测上述17个染色体区域所得到的结果。
优选地,所述的试剂或试剂盒可检测的临床样品包括但不限于:胆汁、活检组织等。
优选地,所述的试剂盒中包括SEQ ID NO.1-8所示的P7端标签引物中的一种或多种。
优选地,所述的试剂盒中包括SEQ ID NO.9-16所示的P5端标签引物中的一种或多种。
所述的阳性参考品为混合有前述17个染色体不稳定区域变异的细胞系;所述的阴性参考品为无染色体变异的细胞系。
再一方面,本发明提供了前述胆囊癌和胆管癌的试剂盒的操作方法。
具体地,所述的操作方法包括以下步骤:
(1)从检测对象获得待测样品;
(2)待测样品与利用本发明的检测试剂接触;
(3)检测待测样本上述17个染色体区域;
(4)根据检测结果进行胆囊癌和胆管癌的检测、筛查、诊断、预后评估。
本发明的有益效果:
本发明17个常见染色体不稳定区域在胆囊癌和胆管癌患者中总的携带率高达90.2%,这对临床胆囊癌和胆管癌的检测、筛查、诊断、预后评估或病情监测具有很大的意义,为下一步进行早期诊断和制定个体化治疗方案提供科学依据。另外,收集了患者的肿瘤标记物CA199临床检测结果,以临床病理结果为标准,与本发明检测结果进行比较,本发明临床诊断结果显著优于两个临床常用肿瘤标志物,显示了优异的临床诊断能力。
附图说明
图1为3q+、7p+、8q+染色体不稳定分析结果图;其中A为3q+,B为7p+,C为8q+。
图2为9p-、17p-染色体不稳定分析结果图;其中A为9p-,B为17p-。
图3为本发明17个染色体区域和肿瘤标志物CA199的ROC曲线图,其中AUC为ROC曲线下面积。
需要特别说明的是,图1-2为分析软件直出,当前图片足以支持判断实验结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例,对本发明作进一步详细的阐述,下述实施例不用于限制本发明,仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,下述实施例中所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1胆汁脱落细胞基因组DNA提取
本实施例选用的试剂盒购自QIAGEN公司(货号:80204)。
a.将胆汁转移至10mL离心管中,进行1600g离心10min,小心倒去上清液,再用移液枪小心吸弃剩余的上清液。
b.加入350μL 1×Buffer RL/DTT至新的1.5mL离心管中,用一次性20号针头的注射器小心抽打裂解液至少5次打散细胞。
c.把DNA纯化柱装在2mL收集管中。把细胞裂解液转移至gDNA过滤柱中。14000g离心2min。
d.取DNA纯化柱装在2mL收集管中。加入500μL Buffer DW1至柱子中,静置2min。10000g离心30-60s。
e.倒弃流出液,把柱子装回收集管中。加入500μL Buffer RW2至柱子中。10000g离心30-60s。
f.倒弃流出液,把柱子装回收集管中。加入500μL Buffer RW2至柱子中。10000g离心30-60s。
g.倒弃流出液,把柱子套回空的收集管。13000g离心2min。
h.将DNA柱子装在1.5mL离心管中。加入30-50μL预热至65℃无核酸酶水至柱子膜中央。室温静置3min。13000g离心1min。
i.弃去DNA柱,把DNA保存于2-8℃或-20℃。
实施例2基因组文库构建
本实施例中相关建库试剂盒购自NEB公司,货号:E7645S;磁珠购自Beckman公司,货号:A63882。
1、基因组片段化:取20ng基因组DNA,配制如表1所示的酶切反应体系,振荡混匀、离心(避免气泡)后按照表2程序进行反应。本实施例中人基因组DNA的浓度为2ng/μL,反应体系中需加入10μL。
如果人基因组DNA为无细胞的游离DNA,如血液中的cfDNA,则不需要经过基因组片段化,直接进入下步操作。
表1
DNA打断反应 | 体系 |
基因组DNA | 10μL |
打断酶 | 3μL |
缓冲Buffer | 7μL |
无核酸水 | 补至35μL |
表2
2、接头连接反应:将接头连接预混液(15μL/样本)、接头连接增强剂(0.5μL/样本,外购NEB公司)按照所检测的样本数目吸取适当的体积进行混合后,吸取15.5μL混合液加入到上一步的末端处理反应混合液中,振荡混匀、离心后再吸取1.5μL实施例1中制备的混合接头加入到上述反应液中,振荡混匀、离心。最终形成下表3中的反应体系。
表3
接头连接反应 | 体系 |
末端修复反应混合液(上一步) | 35μL |
接头连接预混液 | 15μL |
接头连接增强剂 | 0.5μL |
混合接头 | 1.5μL |
总体系 | 52μL |
将上述体系置于PCR仪中,运行程序:20℃,30min,热盖关闭。
3、连接反应后纯化步骤:
a、提前从磁珠试剂盒中取出文库纯化磁珠,室温静置至少30min,使用前需混匀。
b、将上述步骤中的接头连接反应液转移到相应编号的1.5mL离心管,加入46μL重悬的文库纯化磁珠,使用适当量程的移液器匀速吸打20次,室温孵育5min。
c、将离心管置于磁力架上,待溶液澄清后,弃上层清液。
d、向其中加入新鲜配置的200μL 80%的乙醇,静置30s后,弃上层清液。
e、重复步骤d一次。
f、磁力架上取下离心管,瞬时离心3sec,离心管放回磁力架上,吸弃掉残留的80%乙醇,注意不要吸到磁珠。打开管盖,室温晾干2-10min。
g、待磁珠成亚光色,离心管中加入16μL Low TE缓冲液(或者无核酸酶水),轻微震荡使磁珠重悬,室温孵育5min。
h、将离心管置于磁力架上,静置2min。待溶液澄清后,取15μL上清留待下一步扩增反应。
4、PCR扩增:依下表4,加入相应试剂至PCR管中:
表4
其中,P7端标签引物和P5端标签引物经由生工生物(上海)公司合成。具体序列如下:
表5
编号 | 标签引物序列5’-3’ |
P7-01 | SEQ ID NO.1 |
P7-02 | SEQ ID NO.2 |
P7-03 | SEQ ID NO.3 |
P7-04 | SEQ ID NO.4 |
P7-05 | SEQ ID NO.5 |
P7-06 | SEQ ID NO.6 |
P7-07 | SEQ ID NO.7 |
P7-08 | SEQ ID NO.8 |
P5-01 | SEQ ID NO.9 |
P5-02 | SEQ ID NO.10 |
P5-03 | SEQ ID NO.11 |
P5-04 | SEQ ID NO.12 |
P5-05 | SEQ ID NO.13 |
P5-06 | SEQ ID NO.14 |
P5-07 | SEQ ID NO.15 |
P5-08 | SEQ ID NO.16 |
将混合好的PCR管放入至PCR仪中,运行以下程序:
表6
5、PCR产物纯化参考步骤3纯化步骤,其中:
步骤b中重悬的文库纯化磁珠的用量为22.5μL;
步骤g中Low TE缓冲液(或者无核酸酶水)加入量为31μL;
步骤h中取30μL上清留待下一步操作。
6、文库定量上机
上述纯化文库使用Agilent BioAnalyzer生物芯片分析系统对片段大小进行分析,使用dsDNA HS Assay Kit对文库质量浓度进行测量,通过质量浓度和片段大小计算文库摩尔浓度,根据上测序仪说明书使用Illumina Hiseq X-ten进行测序。
结果分析讨论:
上机测序数据经过本发明所述数据分析方法后,得到染色体测序深度分布图,如图1-3所示。
分析结果由两部分组成:
一部分为染色体变异情况,结果包括染色体编号,染色体分区以及染色体测序深度分布。染色体测序深度分布区域中圆点为染色体小区域拷贝数分布情况,当其在纵轴scores值在-3到3之间时判定无不稳定发生,当其scores值大于3时判定为扩增,当其scores值小于-3时判定为缺失,对于发生扩增或缺失的区域使用灰色背景与正常区域进行区分。通过分析结果查看是否有上述染色体不稳定发生,若发生判定为肿瘤,若未发生判定为非肿瘤。
实施例3检测样本验证
选取临床样本123例肿瘤患者和非肿瘤患者样本75例,参考实施例1和实施例2进行检测,结果如下:肿瘤患者检出染色体拷贝数变异者111例,健康人检出染色体异常3例。结果表明:本试剂盒对于胆管和胆囊癌的灵敏度90.2%,特异性96.0%。
另外,同时收集了肿瘤患者123例和非肿瘤患者75例的肿瘤标记物CA199临床检测结果,结果显示123例肿瘤患者中有71例CA199超过正常值,灵敏度为57.7%;75例非肿瘤患者中有12例CA199超过正常值,特异性为84.0%。综上,本试剂盒可以很好的用于胆囊癌和胆管癌的检测,并且显著优于临床常用肿瘤标志物CA199,显示了优异的临床诊断能力,为临床诊断提供支持。
对比例
参照实施例1和实施例2设置以下对比例,对实施例3中的检测样本进行检测:
通过对比例发现,当检测不稳定区域减少(对比例1和2)时,相对本发明检测特异性变化不明显,但灵敏度有显著性下降,临床使用意义显著降低;当检测不稳定区域增加(对比例3)时,灵敏度和特异性变化都不明显,相对本发明并没有显著变化,但检测费用需要增加。因此,本发明染色体异常组合既能保证临床检测性能,同时又不显著增加检测费用,是当前最优的检测组合。
序列表
<110> 苏州宏元生物科技有限公司
<120> 一种检测胆囊癌和胆管癌的试剂盒
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<400> 16
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Claims (10)
1.一组染色体不稳定区域在制备胆囊癌和/或胆管癌的检测、筛查、诊断、预后评估或病情监测的药物或试剂盒中的应用,其特征在于,所述的染色体区域包括以下17个:1p、1q、2q、3q、6p、7p、8p、8q、9p、12p、14q、17p、18p、18q、20p、20q、21q。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的试剂盒为二代测序试剂盒。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的应用为药物药效检测。
4.一种用于胆囊癌和/或胆管癌的检测、筛查、诊断、预后评估或病情监测的试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒包含用于检测以下17个染色体不稳定区域的试剂:1p、1q、2q、3q、6p、7p、8p、8q、9p、12p、14q、17p、18p、18q、20p、20q、21q。
5.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒为二代测序试剂盒。
6.根据权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒还包含:阳性参考品、阴性参考品、缓冲液、酶、文库接头、可检测标签、核酸提取试剂、核酸纯化试剂中的一种或多种。
7.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,所述的酶包含打断酶、DNA聚合酶、DNA连接酶中的一种或多种。
8.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,所述的阳性参考品为混合有权利要求1中所述的17个染色体不稳定区域变异的细胞系。
9.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,包括SEQ ID NO.1-8所示的P7端标签引物中的一种或多种。
10.根据权利要求9所述的试剂盒,其特征在于,包括SEQ ID NO.9-16所示的P5端标签引物中的一种或多种。
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