CN116814796B - 一种宫颈病变标志物及其在诊断和预后评价的应用 - Google Patents
一种宫颈病变标志物及其在诊断和预后评价的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116814796B CN116814796B CN202311001410.3A CN202311001410A CN116814796B CN 116814796 B CN116814796 B CN 116814796B CN 202311001410 A CN202311001410 A CN 202311001410A CN 116814796 B CN116814796 B CN 116814796B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pir
- cervical
- primer
- seq
- diagnosis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 230000003902 lesion Effects 0.000 title claims abstract description 61
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 title abstract description 16
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 title abstract description 14
- 239000003550 marker Substances 0.000 title abstract description 10
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 41
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims description 41
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 21
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 8
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 claims description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 7
- 238000007850 in situ PCR Methods 0.000 claims description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 8
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 abstract description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 50
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 26
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 15
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 14
- 206010008263 Cervical dysplasia Diseases 0.000 description 14
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 14
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 14
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 14
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 14
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 12
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 12
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 description 11
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 210000003756 cervix mucus Anatomy 0.000 description 7
- 229960005156 digoxin Drugs 0.000 description 7
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 7
- LTMHDMANZUZIPE-AMTYYWEZSA-N Digoxin Natural products O([C@H]1[C@H](C)O[C@H](O[C@@H]2C[C@@H]3[C@@](C)([C@@H]4[C@H]([C@]5(O)[C@](C)([C@H](O)C4)[C@H](C4=CC(=O)OC4)CC5)CC3)CC2)C[C@@H]1O)[C@H]1O[C@H](C)[C@@H](O[C@H]2O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](O)C2)[C@@H](O)C1 LTMHDMANZUZIPE-AMTYYWEZSA-N 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 208000019065 cervical carcinoma Diseases 0.000 description 6
- LTMHDMANZUZIPE-PUGKRICDSA-N digoxin Chemical compound C1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](C)O[C@@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](O[C@@H]3C[C@@H]4[C@]([C@@H]5[C@H]([C@]6(CC[C@@H]([C@@]6(C)[C@H](O)C5)C=5COC(=O)C=5)O)CC4)(C)CC3)C[C@@H]2O)C)C[C@@H]1O LTMHDMANZUZIPE-PUGKRICDSA-N 0.000 description 6
- LTMHDMANZUZIPE-UHFFFAOYSA-N digoxine Natural products C1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(C)OC(OC2C(OC(OC3CC4C(C5C(C6(CCC(C6(C)C(O)C5)C=5COC(=O)C=5)O)CC4)(C)CC3)CC2O)C)CC1O LTMHDMANZUZIPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 5
- 108091007412 Piwi-interacting RNA Proteins 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 5
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 5
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 4
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 4
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 4
- 238000012167 Small RNA sequencing Methods 0.000 description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 3
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960002143 fluorescein Drugs 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 101100408379 Drosophila melanogaster piwi gene Proteins 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 2
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 208000007951 cervical intraepithelial neoplasia Diseases 0.000 description 2
- 238000007621 cluster analysis Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000020082 intraepithelial neoplasia Diseases 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- RZXMPPFPUUCRFN-UHFFFAOYSA-N p-toluidine Chemical compound CC1=CC=C(N)C=C1 RZXMPPFPUUCRFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 238000010827 pathological analysis Methods 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 2
- 102000019679 piRNA binding proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091016318 piRNA binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-L 4-nitrophenyl phosphate(2-) Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C(OP([O-])([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N Disodium Chemical compound [Na][Na] QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 240000008168 Ficus benjamina Species 0.000 description 1
- 241001272567 Hominoidea Species 0.000 description 1
- 238000012179 MicroRNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 1
- AFBPFSWMIHJQDM-UHFFFAOYSA-N N-methyl-N-phenylamine Natural products CNC1=CC=CC=C1 AFBPFSWMIHJQDM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 238000001190 Q-PCR Methods 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108010087230 Sincalide Proteins 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000001680 brushing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000009702 cancer cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 239000007894 caplet Substances 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000010609 cell counting kit-8 assay Methods 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000012568 clinical material Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000012296 in situ hybridization assay Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000006996 mental state Effects 0.000 description 1
- GVYLCNUFSHDAAW-UHFFFAOYSA-N mirex Chemical compound ClC12C(Cl)(Cl)C3(Cl)C4(Cl)C1(Cl)C1(Cl)C2(Cl)C3(Cl)C4(Cl)C1(Cl)Cl GVYLCNUFSHDAAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 238000001921 nucleic acid quantification Methods 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 101150056385 piwil2 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 230000007859 posttranscriptional regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 229950003937 tolonium Drugs 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/118—Prognosis of disease development
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
本发明公开了一种宫颈病变标志物及其在诊断和预后评价的应用，该标志物为piR‑020365，其在宫颈病变组织样本中表达。本发明还公开了piR‑020365在制备宫颈病变诊断、疗效预测或预后评估试剂盒中的应用，用于宫颈病变诊断、疗效预测或预后评估的试剂盒及piR‑020365的检测方法。通过检测本发明中的piR‑020365在宫颈病变组织样本是否表达，能够准确诊断早期的宫颈病变、疗效预测及预后评价，从而为宫颈病变的早诊早治提供坚实的技术基础。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种宫颈病变标志物及其在诊断和预后评价的应用。
背景技术
高危型人乳头瘤病毒(high-risk human papillomavirus，HR-HPV)持续感染，导致宫颈病变发生，经过5-10年的癌前病变阶段，最终进展为宫颈癌。由于病因明确和较长的癌前病变阶段，因此宫颈病变的早诊早治意义重大。目前，宫颈癌的临床筛查主要采用薄层液基细胞学(Thinprep Cytologic Test，TCT)和HPV核酸检测，然而TCT为形态学观察，易受临床取材和阅片医师水平、精神状态等因素影响，检测灵敏度低，从而容易造成漏诊，延误病情；HPV核酸检测灵敏度高，但是很多女性HPV是一过性感染，一段时间后机体可以清除病毒，HPV阳性并不意味着宫颈病变发生，如此一方面造成临床过度诊疗，导致不必要的宫颈手术损伤，另一方面也造成医疗资源的浪费。
piRNA是一类新的小分子非编码RNA，长度约为23-31nt，通过基因表达的转录后调控，在胚胎及配子发育、肿瘤发生过程中发挥重要作用。piRNA通过3’端特征序列与Piwi蛋白的PAZ区域结合，然后通过碱基配对结合目标mRNA，引导具有核酸内切酶活性的Piwi亚基剪切目标mRNA，从而沉默靶基因表达。
发明内容
为了解决上述的技术问题，快速、简便地对宫颈病变进行诊断、疗效预测或预后评估，发明人通过临床不同病变程度的宫颈组织测序分析，获得差异基因，然后在宫颈癌细胞株中过表达及沉默验证，最终获得与宫颈病变发生密切相关的特异分子piR-020365。
一方面，本发明提供piR-020365在制备宫颈病变诊断、疗效预测或预后评估试剂盒中的应用，所述piR-020365在宫颈病变患者生物样本中表达。
优选地，所述表达相对于正常人的生物样本，piR-020365在正常人的生物样本中不表达。
优选地，采用荧光定量PCR、原位杂交法或者PCR-ELISA方法检测所述piR-020365的表达。
优选地，所述的生物样本包括宫颈脱落细胞、宫颈组织、阴道分泌物、血液或尿液。
优选地，所述的生物样本为宫颈脱落细胞、宫颈组织、阴道分泌物、血液或尿液中的至少一种，进一步优选为宫颈脱落细胞。
优选地，所述试剂盒中包含piR-020365检测试剂。
优选地，所述piR-020365的检测试剂包括宫颈病变生物样本中piR-020365的逆转录试剂和荧光定量PCR试剂、原位杂交试剂或PCR-ELISA试剂中的至少一种。
优选地，所述试剂盒中包含piR-020365标准品。进一步优选采用荧光定量PCR或者PCR-ELISA方法检测所述piRNA-020365时，所述试剂盒包含piR-020365标准品。
第二方面，本发明提供一种用于宫颈病变诊断、疗效预测或预后评估的试剂盒。
优选地，所述试剂盒包括检测piR-020365的试剂。
优选地，所述piR-020365在宫颈病变患者生物样本中表达。
优选地，所述表达相对于正常人的生物样本，piR-020365在正常人的生物样本中不表达。
优选地，所述的生物样本包括宫颈脱落细胞、宫颈组织、阴道分泌物、血液、尿液。
优选地，所述的生物样本为宫颈脱落细胞、宫颈组织、阴道分泌物、血液或尿液中的至少一种，进一步优选为宫颈脱落细胞。
优选地，所述试剂还包括检测所述宫颈病变生物样本中piR-020365的逆转录试剂和荧光定量PCR试剂、原位杂交试剂、PCR-ELISA试剂中的至少一种。
优选地，所述逆转录的试剂包括piR-020365反转录引物、dNTP、RNA酶抑制剂、逆转录酶、内参参照物U6反转录引物等。
优选地，所述piR-020365反转录引物如下：
5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCAGAGTAC-3’(SEQ ID NO：1)
所述内部参照物U6的反转录引物如下：
5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAAAAATATG-3’(SEQ ID NO：2)。
优选地，所述荧光定量PCR试剂包括扩增piR-020365基因的特异引物、DNA聚合酶、缓冲液、阳性对照、阴性对照。
优选地，所述扩增piR-020365基因的特异引物序列包括上游引物：5’-GCCGAGGGCCGTGATCGTATAGTGGTTAGT-3’(SEQ ID NO：3)或5’-TCGGCAGGGGCCGTGATCGTATAGTGGTTAGT-3’(SEQ ID NO：4)；下游引物：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGC-3’(SEQ ID NO：5)。
进一步优选地，所述阳性对照为piR-020365反转录cDNA链，所述阴性对照为随机寡核苷酸片段。
优选地，内部参照物U6的上游引物为5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’(SEQ ID NO：6)，内部参照物U6下游引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’(SEQ ID NO：7)。
进一步优选地，piR-020365特异上游引物和特异下游引物均可以采用选自生物素、地高辛或荧光素中的任意一种进行标记，所述piR-020365特异上游引物和特异下游引物标记物不同。
优选地，所述原位杂交试剂包括：与piR-020365序列碱基互补的核酸探针，组织消化酶、杂交缓冲液、显色液及封片剂。其中，核酸探针采用荧光标记、地高辛或酶标记。
优选地，所述核酸探针序列如下：
5’-GCCGAGGGCCGTGATCGTATAGTGGTTAGT-3’(SEQ ID NO：3)或5’-TCGGCAGGGGCCGTGATCGTATAGTGGTTAGT-3’(SEQ ID NO：4)。
优选地，所述酶标记包括酶标记地高辛抗体和酶标记亲和素分子，其中的酶可以是辣根过氧化物酶(HRP)，对应的底物是H2O2，显色剂是TMB；也可以是碱性磷酸酶(AKP)，对应的显色底物是对硝基苯磷酸二钠(PNPP)，或对甲苯氨蓝/氯化硝基四氮唑蓝(BCIP/NBT)。
优选地，所述PCR-ELISA试剂包括带标记的piR-020365特异上游引物、带标记的piR-020365特异下游引物、捕获抗体包被的酶标反应板、酶标记检测抗体或亲和素分子、显色系统、终止液。
优选地，所述piR-020365特异上游引物序列如下：
5’-GCCGAGGGCCGTGATCGTATAGTGGTTAGT-3’(SEQ ID NO：3)。
所述piR-020365特异下游引物序列如下：
5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGC-3’(SEQ ID NO：5)。
优选地，piR-020365特异上游引物和特异下游引物均可以采用选自生物素、地高辛或荧光素中的任意一种进行标记，所述piR-020365特异上游引物和特异下游引物的标记物不同。
第三方面，本发明提供一种用于宫颈病变诊断、疗效预测或预后评估的标志物，所述标志物为piR-020365，所述piR-020365在宫颈病变患者生物样本中表达。
优选地，所述表达相对于正常人的生物样本，piR-020365在正常人的生物样本中不表达。
优选地，所述的生物样本包括宫颈脱落细胞、宫颈组织、阴道分泌物、血液、尿液。
优选地，所述的生物样本为宫颈脱落细胞、宫颈组织、阴道分泌物、血液或尿液中的至少一种，进一步优选为宫颈脱落细胞。
第四方面，本发明提供一种piR-020365的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
收集宫颈病变患者生物样本，提取生物样本的RNA；
采用逆转录获取piR-020365的cDNA；
采用荧光定量PCR检测piR-020365的表达量。
优选地，所述的宫颈病变患者生物样本包括宫颈脱落细胞、宫颈组织、阴道分泌物、血液、尿液，进一步优选为宫颈脱落细胞。
优选地，所述逆转录的试剂包括piR-020365反转录引物、dNTP、人体样品的RNA、RNA酶抑制剂、逆转录酶、内部参照物U6反转录引物等。
优选地，所述piR-020365反转录引物如下：
5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCAGAGTAC-3’(SEQ ID NO：1)。
内部参照物U6的反转录引物序列为：
5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAAAAATATG-3’(SEQ ID NO：2)。
优选地，所述荧光定量PCR试剂包括扩增piR-020365基因的特异引物、DNA聚合酶、缓冲液、阳性对照、阴性对照。
优选地，所述扩增piR-020365基因的特异引物序列包括上游引物：5’-GCCGAGGGCCGTGATCGTATAGTGGTTAGT-3’(SEQ ID NO：3)或5’-TCGGCAGGGGCCGTGATCGTATAGTGGTTAGT-3’(SEQ ID NO：4)；下游引物：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGC-3’(SEQ ID NO：5)。
进一步优选地，所述阳性对照为piR-020365反转录cDNA链，所述阴性对照为随机寡核苷酸片段。
进一步优选地，piR-020365特异上游引物和特异下游引物均可以采用选自生物素、地高辛或荧光素中的任意一种进行标记，所述piR-020365特异上游引物和特异下游引物标记物不同。
优选地，内部参照物U6的上游引物为5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’(SEQ ID NO：6)，内部参照物U6下游引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’(SEQ ID NO：7)。
优选地，所述piR-020365的表达可以是相对表达量，也可以是采用piR-020365标准品测定的绝对表达量。
本发明的有益效果：
通过检测本发明中的piR-020365在宫颈病变患者生物样本中的表达量，能够准确诊断早期的宫颈病变、疗效预测及预后评价，从而为宫颈病变的早诊早治提供坚实的技术基础。
附图说明
图1为宫颈癌SiHa细胞过表达和沉默piRNA结合蛋白后微小RNA测序分析结果；
图2为基因操作后宫颈癌细胞微小RNA测序结果分析差异基因；
图3为piR-020365抑制剂对宫颈癌细胞增殖的影响；
图4为荧光定量PCR检测piR-020365在宫颈病变组织中的表达量；
图5为piR-020365在测试集35例宫颈病变组织中的诊断价值；
图6为piR-020365在验证集71例宫颈病变组织中的诊断效能。
图7为原位杂交法检测piR-020365在宫颈病变组织的表达结果；
图8为PCR-ELISA检测piR-020365在宫颈病变组织的表达结果。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件。如无特殊说明，均为常规方法。除非另行定义，文中所用的专业与科学用语与本领域技术人员熟悉的意义相同。
发明人在长期研究宫颈病变的基础上，采用高通量基因测序技术快速、全面分析与宫颈病变相关基因的表达变化。然后通过生物信息学手段聚类分析、构建调控网络、预测靶基因。进一步采用基因工程技术，对特定基因进行过表达或沉默，精准分析基因的功能及其表达调控通路，寻找到与宫颈病变发生、进展密切相关的关键分子。发明人最终获得了与宫颈病变发生密切相关的特异分子piR-020365。
实施例1小RNA测序
1.1piRNA通过与Piwil2(Piwi蛋白家族一员)蛋白结合发挥作用，构建过表达和沉默Piwil2表达的慢病毒载体，分别转染宫颈癌SiHa细胞，建立Piwil2过表达细胞SiHa-Piwil2、Piwil2沉默细胞SiHa-shPiwil2，以及空载体转染的对照细胞SiHa-Lenti。
1.2获取细胞总RNA。收集对数生长期的SiHa-Piwil2、SiHa-shPiwil2和SiHa-Lenti细胞，数量大于1×106个细胞，采用酚-氯仿方法提取总RNA 5μg以上。Nanodrop检测RNA样品浓度及纯度(OD260/280值在1.8～2.2之间)，琼脂糖凝胶电泳及Agilent2100Bioanalyzer检测RNA样品完整性。
1.3在RNA3’-和5’-两端分别连上adapter，利用随机引物反转录合成cDNA第一链，PCR扩增、富集文库，并引入测序接头序列。采用Agilent 2100Bioanalyzer进行文库质检，文库大小分布在18-40bp之间。
1.4文库采用Illumina平台进行测序。
1.5miRNA种类鉴定：测序数据进入miRBase20.0比对，获得已知miRNA种类；采用miREvo和mirdeep2软件深度分析，获得新的miRNA种类。
1.6miRNA表达差异分析：miRNA表达量采用TPM(transcripts per million)表示，标化公式：Normalized expression＝mapped readcount/Total reads×1000000；DESeq Rpackage(1.8.3)分析组间表达差异，Benjamini&Hochberg方法进行P值校正，校正后P＜0.05有统计学意义。结果见图1(其中，图1A为SiHa-Piwil2、SiHa-shPiwil2和SiHa-Lenti细胞差异表达的小RNA聚类分析热图，图1B为SiHa细胞过表达Piwil2后，不同类别piRNA表达差异，图1C为SiHa细胞沉默Piwil2后，不同类别piRNA表达差异)和图2。
由图1A可以看出，在宫颈癌SiHa细胞中，过表达或沉默与piRNA结合的Piwil2基因表达，引起宫颈癌SiHa细胞中小RNA种类及表达量的变化。
由图1B可以看出，在宫颈癌SiHa细胞中过表达piRNA结合蛋白Piwil2，采用小RNA测序获得的测序片段(reads)，与亲本细胞SiHa比较多个小RNA簇存在数量差异。
由图1C可以看出，在宫颈癌SiHa细胞中沉默piRNA结合蛋白Piwil2表达，采用小RNA测序获得的测序片段(reads)，与亲本细胞SiHa比较仅小RNA簇2(cluster 2)测序片段数量存在差异。
由图2可以看出，小RNA测序获得的测序片段经过数据库比对，获得差异表达基因制作火山图，有统计学意义的上调基因只有piR-020365。说明过表达Piwil2的SiHa细胞与亲本细胞比较piR-020365显著上调。
实施例2细胞增殖实验
1.1收集对数生长期的宫颈癌SiHa细胞和HeLa细胞，1000个细胞/孔接种96孔板；
1.212h后，吸去培养基，加入100μL新鲜无血清培养基；实验组再加入1ipofectamine 3000包裹的piR-020365抑制剂10ng，对照组仅加入等量的1ipofectamine3000，作用8h后吸去培养孔内液体，换成新鲜完全培养基100μL，继续培养；
1.3分别在换液后24h、48h、72h、96h加入10μL增强型CCK-8溶液，37℃培养箱继续孵育2h；
1.4孵育结束，取出培养板，分光光度计测定450nm吸光度值，结果见图3。
由图3可以看出，对于宫颈癌SiHa细胞和HeLa细胞，piR-020365抑制剂均能有效阻断piR-020365的表达，进而显著抑制宫颈癌细胞的增殖。说明在宫颈癌细胞中，piR-020365的表达促进肿瘤细胞增殖，可以采用piR-020365作为标志物指示宫颈癌细胞的病变。
实施例3荧光定量PCR检测宫颈脱落细胞中piR-020365
1.1样本收集
经过患者知情同意及医院伦理委员会批准，收集医院宫颈疾病门诊就诊患者的宫颈脱落细胞。利用宫颈采样刷刷取宫颈脱落细胞，一份放入常规固定液中，用于TCT及HPV检测，另外一份放入PBS缓冲液中，离心获得脱落细胞，转入2mL EP内加入Trizol1mL，用于提取RNA。待TCT和HPV结果出来，并经后续阴道镜下宫颈活检，送病理诊断证实分别为正常、低度宫颈上皮内瘤变(LSIL)、高度宫颈上皮内瘤变(HSIL)和宫颈癌，每组各选择10例患者，提取样本的RNA用于检测。
1.2样本RNA提取
1.2.1从-80℃冰箱取出已经加入1mL Trizol的宫颈脱落细胞样本，复融后加入200μL氯仿，盖紧盖子，用力手动颠倒混匀。
1.2.2EP管放入高速低温离心机，4℃条件下12000rpm离心20min。
1.2.3离心结束，小心吸取EP管上层水相到新的1.5mL EP管中，加入500μL异丙醇，轻微颠倒混匀，室温静置10min。
1.2.4EP管放入高速低温离心机，4℃条件下12000rpm离心20min。
1.2.5吸去上清，向EP管内加入1mL 75％乙醇，4℃条件下7500rpm离心5min，洗涤RNA沉淀。
1.2.6吸去上清，EP管放入37℃烤箱，使RNA沉淀干燥备用。
1.3反转录
1.3.1RNA沉淀加入20μL无核酶ddH2O水溶解，核酸定量后，取5μg RNA作为模板。
1.3.2反转录体系及操作：
按照以下成分配制反转录体系：
piR-020365反转录引物 50pmol
10mM dNTPMixture 1μL
RNA模板 5μg
加入无核酶ddH2O水至反转录体系体积为10μL。
piR-020365反转录引物序列如下：
5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCAGAGTAC-3’(SEQ ID NO：1)。
将上述反应体系在PCR仪中65℃加热5min，取出冰上急冷。
按照以下成分配制反转录反应体系：
将反转录反应体系轻轻混匀，然后再PCR仪上30℃加热10min、42℃加热30min、70℃加热15min，反转录反应结束后放入-20℃冰箱，备用。
1.3.3取合成的piR-020365标准品，无核酶ddH2O水梯度稀释后，重复1.3.1和1.3.2的操作。
1.3.4以U6反转录引物进行的反转录反应，采用50pmolU6反转录引物代替piR-020365反转录引物，实验操作同上面1.3.1和1.3.2的操作。
U6反转录引物如下：
5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAAAAATATG-3’(SEQ ID NO：2)
1.4荧光定量PCR检测piR-020365
1.4.1采用SYBR Green I染料法进行荧光定量PCR检测piR-020365；
1.4.2扩增体系及扩增条件如下：
piR-02036上游引物如下：
5’-GCCGAGGGCCGTGATCGTATAGTGGTTAGT-3’(SEQ ID NO：3)或5’-TCGGCAGGGGCCGTGATCGTATAGTGGTTAGT-3’(SEQ ID NO：4)。
piR-020365下游引物如下：
5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGC-3’(SEQ ID NO：5)。
将上述扩增体系放置于PCR仪上，95℃2min后，95℃30sec、60℃45sec、40个循环，读取CT值。
1.4.3分别取阳性对照和阴性对照，重复1.4.2操作，进行SYBR Green I染料法荧光定量PCR检测piR-020365；其中阳性对照可见扩增曲线，阴性对照无扩增。
1.4.4把上、下游引物换成U6的引物，按照上面的扩增体系及扩增条件检测内参U6的CT值。
U6上游引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’(SEQ ID NO：6)。
U6下游引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’(SEQ ID NO：7)
1.4.5根据正常、LSIL、HSIL和宫颈癌样本piR-020365和U6的CT值，计算各组样本piR-020365的相对表达量，结果见图4。
由图4可以看出，piR-020365在正常宫颈组织和LSIL表达的差异没有统计学意义。piR-020365在HSIL和宫颈癌组织中的表达量显著增加，与正常宫颈组织样本比较差异有统计学意义，且宫颈癌组织中的表达量显著高于HSIL组织。说明piR-020365对宫颈病变具有很好的诊断效能，能够作为宫颈病变的诊断、疗效预测和预后评估的标志物。
实施例4piR-020365用于宫颈病变诊断效能测试
1.1采用小RNA测序筛选出来的piR-020365作为宫颈病变诊断的候选分子，实时荧光定量PCR明确piR-020365在正常宫颈组织、低级别上皮内瘤变(LSIL)、高级别上皮内瘤变(HSIL)和宫颈鳞癌(SCC)组织中的差异表达。
1.2收集35例宫颈组织作为训练集(正常宫颈组织13例，LISL 9例，HSIL 7例，SCC6例)，实时荧光定量PCR检测piR-020365表达水平，以病理特征作为宫颈病变诊断的金标准，建立piR-020365表达水平与宫颈病变程度的相关性，采用受试者工作曲线(ROC)分析piR-020365表达水平对宫颈病变的诊断价值，结果见图5；
1.3收集71例宫颈组织作为验证集(正常宫颈组织23例，LISL 16例，HSIL 13例，SCC 19例)，实时荧光定量PCR检测piR-020365表达水平，以病理诊断作为金标准，验证piR-020365表达水平对宫颈病变的诊断作用，绘制ROC曲线评价其临床诊断效能，结果见图6。
由图5和图6可以看出，正常宫颈组织和LSIL之间的piR-020365表达量差异不显著，正常宫颈组织不表达piR-020365，宫颈病变发生后开始表达piR-020365，并且piR-020365表达水平与病变程度呈正相关。说明piR-020365对宫颈病变具有很好的诊断效能，能够作为宫颈病变的诊断、疗效预测和预后评估的标志物。
实施例5原位杂交法检测宫颈病变组织中的piR-020365
1.1收集活检的宫颈病变组织，4％多聚甲醛固定、脱水、包埋、制备6-8μm切片，多聚赖氨酸或APES预处理的载玻片捞片。
1.2石蜡切片经常规脱蜡至水，3％H2O2处理20min灭活内源性酶。
1.33％柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶37℃消化30min，暴露核酸片段；加入含有1/1000DEPC的1％多聚甲醛/0.1M PBS(pH7.2-7.6)，室温条下后固定10min。
1.4切片放入湿盒内，每张切片加20μL预杂交液，38-42℃作用2-4h后，弃去多余液体，不洗。
1.5杂交
1.5.1每张切片加入piR-020365反转录反应体系20μL，包括引物1μL、10mM dNTPmixture 1μL、200U逆转录酶，piR-020365反转录引物序列如下：
5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCAGAGTAC-3’(SEQ ID NO：1)。
1.5.2切片在湿盒内42-50℃作用1h，弃去液体，不洗；
1.5.3加入地高辛标记的piR-020365上游引物作为杂交探针，序列如下：
5’-GCCGAGGGCCGTGATCGTATAGTGGTTAGT-3’(SEQ ID NO：3)或5’-TCGGCAGGGGCCGTGATCGTATAGTGGTTAGT-3’(SEQ ID NO：4)。
1.5.4每张切片滴加20μL杂交液(探针浓度0.5ng/μL)，盖上原位杂交专用盖玻片，42℃杂交过夜。
1.5.5常规脱蜡至水的切片，分别滴加商品化的阳性对照探针和阴性对照探针，盖上原位杂交专用盖玻片，42℃杂交过夜，作为阳性对照和阴性对照。
1.6揭掉盖玻片，37℃预热的2×SSC洗涤5min×2次、0.5×SSC洗涤15min×1次、0.2×SSC洗涤15min×1次。
1.7滴加5％BSA，37℃封闭30min，甩去多余液体，不洗。
1.8滴加HRP标记抗地高辛抗体，37℃1h，原位杂交用PBS洗5min×4次；
1.9DAB显色、苏木素复染后，流水冲洗。
1.10酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。
实验结果见图7。
由图7可以看出：阳性细胞内出现棕黄色颗粒。正常子宫颈上皮为阴性，在宫颈病变组织上皮层可见阳性信号，信号强度与病变程度呈正相关。说明piR-020365能够作为宫颈病变的诊断、疗效预测和预后评估的标志物。
实施例6PCR-ELISA法检测宫颈病变组织中的piR-020365
1.1收集宫颈病变组织，酚-氯仿法提取总RNA；
1.2取5μg总RNA进行反转录，获得第一链cDNA；
1.2.1piR-020365反转录引物序列如下：
5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCAGAGTAC-3’(SEQ ID NO：1)。
1.2.2反转录体系及操作：
piR-020365反转录引物 50pmol
10mM dNTP Mixture 1μL
RNA模板 5μg
加入无核酶ddH2O水至10μL，PCR仪中65℃加热5min，取出冰上急冷；
加入无核酶ddH2O水至20μL，轻轻混匀；PCR仪上30℃加热10min、42℃加热30min、70℃加热15min，反转录反应结束后放入-20℃冰箱，备用；
1.2.3以U6反转录引物进行的反转录反应，采用50pmolU6反转录引物代替piR-020365反转录引物，实验操作与上面1)和2)的操作。
U6反转录引物：
5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAAAAATATG-3’(SEQ ID NO：2)。
1.3PCR扩增
1.3.1引物序列：
piR-020365上游引物：5’-GCCGAGGGCCGTGATCGTATAGTGGTTAGT-3’(SEQ ID NO：3)。
piR-020365下游引物：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGC-3’(SEQ ID NO：5)。
U6上游引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’(SEQ ID NO：6)。
U6下游引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’(SEQ ID NO：7)。
1.3.2上、下游引物3’端或5’端标记FITC或生物素，上、下游引物的标记物需不一样；
1.3.3扩增体系
95℃2min后，95℃30sec、55℃30sec、72℃45sec、34个循环。
1.4以合成并经Q-PCR鉴定的piR-020365序列作为阳性对照，去离子水作为阴性对照，与实验样品同时进行反转录、PCR扩增。
1.5碳酸盐包被液配制1μg/mL链霉亲和素，包被96孔板，37℃恒温培养箱内过夜；
1.61×PBS洗涤3次，加入50倍稀释后PCR产物100μL，37℃孵育2h；
1.71×PBS洗涤3次，加入HRP标记抗FITC抗体，37℃孵育1h；
1.81×PBS洗涤3次，加入TMB溶液显色30min，加入2mol/LH2SO4终止显色；
1.9酶标仪上读取450nm的吸光度值。
1.10对实验样品(T)、阳性对照(P)、阴性对照(B)的数据采用以下标准进行判定：
POD450/BOD450＞2.0，表示本次测试质控符合要求，测试结果可以接受；
TOD450/BOD450＞2.0，表示测试结果为阳性；
TOD450/BOD450≤2.0，表示测试结果为阴性；
具体测试结果见图8。
由图8可以看出，阳性对照与阴性对照450nm的吸光度比值大于2，说明方法学质控正常，测试结果可以接受。实验样品OD450/阴性对照OD450＞2，测试结果判定为阳性。说明piR-020365能够作为宫颈病变的诊断、疗效预测和预后评估的标志物。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
Claims (2)
1.扩增piR-020365的引物在制备宫颈病变诊断试剂盒中的应用，其特征在于：所述引物包括：SEQ ID NO:1所示的piR-020365反转录引物，SEQ ID NO:3或者SEQ ID NO:4所示的piR-02036上游引物，SEQ ID NO:5所示的piR-020365下游引物；
相对于正常人的宫颈脱落细胞或宫颈组织，所述引物扩增的piR-020365片段在宫颈病变患者宫颈脱落细胞或宫颈组织中表达。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：采用荧光定量PCR、原位杂交法或者PCR-ELISA方法检测所述piR-020365片段的表达。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311001410.3A CN116814796B (zh) | 2023-08-09 | 2023-08-09 | 一种宫颈病变标志物及其在诊断和预后评价的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311001410.3A CN116814796B (zh) | 2023-08-09 | 2023-08-09 | 一种宫颈病变标志物及其在诊断和预后评价的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116814796A CN116814796A (zh) | 2023-09-29 |
| CN116814796B true CN116814796B (zh) | 2024-03-01 |
Family
ID=88118654
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311001410.3A Active CN116814796B (zh) | 2023-08-09 | 2023-08-09 | 一种宫颈病变标志物及其在诊断和预后评价的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116814796B (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008048570A2 (en) * | 2006-10-16 | 2008-04-24 | The Ohio State University Research Foundation | Piwil2-related biomarkers and cell lines useful therewith |
| CN109628580A (zh) * | 2019-01-15 | 2019-04-16 | 冯子辉 | 一种用于宫颈病变预警的指标及其诊断试剂盒 |
| KR20230046404A (ko) * | 2021-09-30 | 2023-04-06 | 아주대학교산학협력단 | 자궁경부암 진단용 혈장 엑소좀 RNAs 마커 조성물 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017147594A1 (en) * | 2016-02-26 | 2017-08-31 | Yale University | COMPOSITIONS AND METHODS OF USING piRNAS IN CANCER DIAGNOSTICS AND THERAPEUTICS |
-
2023
- 2023-08-09 CN CN202311001410.3A patent/CN116814796B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008048570A2 (en) * | 2006-10-16 | 2008-04-24 | The Ohio State University Research Foundation | Piwil2-related biomarkers and cell lines useful therewith |
| CN109628580A (zh) * | 2019-01-15 | 2019-04-16 | 冯子辉 | 一种用于宫颈病变预警的指标及其诊断试剂盒 |
| KR20230046404A (ko) * | 2021-09-30 | 2023-04-06 | 아주대학교산학협력단 | 자궁경부암 진단용 혈장 엑소좀 RNAs 마커 조성물 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| A serum piRNA signature as promising non-invasive diagnostic and prognostic biomarkers for colorectal cancer;Ailin Qu等;Cancer Management and Research;第11卷;第3703–3720页 * |
| piRNA‑14633 promotes cervical cancer cell malignancy in a METTL14‑dependent m6A RNA methylation manner;Qi Xie等;Journal of Translational Medicine;第20卷;文献号51 * |
| Piwil2 is reactivated by HPV oncoproteins and initiates cell reprogramming via epigenetic regulation during cervical cancer tumorigenesis;Dingqing Feng等;Oncotarget;第7卷(第40期);第64575-64588 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116814796A (zh) | 2023-09-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP2809801B1 (en) | Non-invasive cancer diagnosis | |
| WO2011122857A9 (ko) | 유방암 예후 예측을 위한 조성물 및 이를 포함하는 키트 | |
| WO2016033287A1 (en) | Methods for collecting cervical-vaginal fluids and isolating exosome and microvesicles for molecular analysis | |
| CN105779618A (zh) | 一种舌鳞癌的新诊治靶标基因及其应用 | |
| CN111154879A (zh) | 用于膀胱癌诊断或复发监控的生物标志物及试剂盒 | |
| CN116814796B (zh) | 一种宫颈病变标志物及其在诊断和预后评价的应用 | |
| CN108165631B (zh) | 一种骨肉瘤的生物标志物syt12及其应用 | |
| CN111979315A (zh) | 环状tp63作为肺鳞癌诊断或治疗靶点的应用 | |
| CN108624690A (zh) | 一种左右半结肠腺癌早期筛查检测试剂盒及检测方法 | |
| CN109266750B (zh) | 用于鼻咽癌诊断的生物标志物以及应用 | |
| CN109266751B (zh) | 用于鼻咽癌诊断的生物标志物组合以及应用 | |
| JP2010502179A (ja) | 予後診断方法 | |
| CN106399485A (zh) | 一种在舌鳞癌癌旁组织中高表达的基因及其应用 | |
| CN107893119B (zh) | Zcchc12在骨肉瘤中的应用 | |
| CN111635939A (zh) | 一种检测rbp1基因或蛋白的产品及应用 | |
| CN110951873A (zh) | 一种骨肉瘤标志物及其应用、试剂盒 | |
| CN113373229B (zh) | 胃癌相关生物标志物及其应用 | |
| CN108676892B (zh) | 结直肠癌诊断标志物mettl11a及其应用 | |
| CN113604568B (zh) | Hpv16整合靶点联合铁死亡调控基因在制备宫颈癌早期治疗试剂盒中的应用 | |
| CN111057790B (zh) | miRNA在制备用于检测KSHV潜伏感染的试剂盒中的用途 | |
| CN108893537B (zh) | C7orf70及其应用 | |
| CN110592218B (zh) | 一种诊治乳腺癌的生物标志物 | |
| CN110684847B (zh) | 一种与乳腺癌发生发展相关的生物标志物的用途 | |
| CN107475419A (zh) | Kndc1基因及其表达产物在卵巢癌检测中的应用 | |
| CN105803067B (zh) | miR-1304在转移性肺鳞癌诊治中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |