KR20230046404A - 자궁경부암 진단용 혈장 엑소좀 RNAs 마커 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 자궁경부암 진단용 혈장 엑소좀 RNAs 마커 조성물에 관한 것으로서, 본 발명자들은 자궁경부암의 조기진행과 전이를 예측하기 위한 엑소좀 miRNA를 선별하기 위해 방사선 조사에 따른 miRNA의 변화량과 mRNA의 변화량의 연관성을 분석하여 생물학 데이터베이스로부터 2차적 검증을 수행하였는데, 본 발명에서는 일차적으로 자궁경부암 환자들과 건강한 대조군 상이의 DEG 분석을 수행한 후 선별된 non-coding small RNA의 방사선에 따른 변화와 높은 연관성을 보이는 mRNA들의 갯수 또는 선별된 mRNA의 변화와 높은 연관성을 보이는 non-coding small RNA들의 갯수를 비교하고 그들의 생물학적 기능을 분석하여 이차적으로 검증하는 방법을 통해 자궁경부암의 진단 도구로서의 혈장 엑소좀 RNA들을 선별하였다. 이에, 본 발명에서 선별된 혈장 엑소좀 RNA들은 향후 유용한 자궁경부암 진단 바이오마커로 활용될 가능성이 매우 높다.
Description
본 발명은 자궁경부암 진단용 혈장 엑소좀 RNAs 마커 조성물에 관한 것이다.
2017년도를 기준으로 한국에서 자궁경부암의 100,000명당 연령 표준화 발생율(age standardized incidence rate per 100,000; ASR)는 8.7로 1999년도의 18.6과 비교했을 때 많은 향상을 보였다. 이는 검진과 인간 유두종 바이러스(human papillary virus; HPV) 백신을 중심으로 한 의료 시스템의 발전과 연관될 것으로 생각된다. 하지만, 전반적인 자궁경부암의 ASR의 향상과 달리 25-29세의 ASR은 2000년의 3.6에서 2011년의 6.5로 점차 증가하는 추세이다. 이러한 중장년층의 발생율(incidence) 감소와 젊은 층에서의 증가는 선진국으로 가면서 발생함을 전 세계적 통계에서도 확인할 수 있었다. 이러한 변화는 젊은 여성들의 적극적인 검진 참여로 인해 조기에 자궁경부암이 진단되었다는 긍정적인 부분과 식생활과 성문화의 변화로 인해 암의 발생이 더 이른 시기에 나타났다는 부정적인 부분을 모두 암시하고 있다. 현재 한국에서는 30세 이상의 여성에게 2년 마다 자궁경부 세포검사를 시행하고 있다. 하지만, 여성들에게 산부인과 스크리닝 검사인 pap smear test는 두려움 및 수치심의 대상일 뿐만 아니라 그 민감도는 50%로 무척 낮다. HPV test의 높은 민감도를 통해 이를 극복할 수 있지만, 비점액성 선암(non-mucinous adenocarcinoma)의 경우는 HPV와 관련이 없는 경우가 대부분이므로 조기진단에 어려움이 많다. 이에 더해 산부인과 전문의에 의한 시술 여부 검진 환경 등에 따라 검진의 민감도를 더욱 낮추는 상황이 발생할 수 있음을 우리는 경험을 통해 잘 알고 있다. 따라서 간단히 혈액이나 체액을 통해 자궁경부암 여부를 확인할 수 있는 방법이 있다면 현재의 상황에서 큰 도움이 될 것이다.
엑소좀은 지질 이중 층 및 매우 다양한 생물 활성 분자, 예컨대 핵산, 지질 및 단백질을 포함하는, 엔도좀 기원의 30 내지 100 nm 세포 외 소포로 상피 세포, 면역 세포 및 종양 세포를 포함한 모든 세포 유형에서 방출된다. 그들은 세포 간 정보교환을 위한 방법으로 면역반응 및 항상성 유지에 중요할 뿐 아니라 그 간의 연구들을 통해 암과 관련된 엑소좀들은 신생 혈관 생성을 유도하고, 세포 외 매트릭스를 리모델링하며, 면역 세포의 기능을 손상시킴으로써 종양촉진에 중요한 역할을 하는 것으로 생각되고 있다. 특히 엑소좀에 포함된 비코딩(non-coding)/코딩(coding) RNA들과 암과의 연관성에 대한 연구들은 계속 증가하고 있다. 자궁경부암과 엑소좀 miRNA, 췌장암과 엑소좀 전령 RNA(messenger RNA; mRNA)/소핵소체(small nucleolar RNA; snoRNA), 전립샘암과 엑소좀 mRNA의 연관성 등을 예로 들 수 있다. 이들 연구들은 암세포의 실험실적인 연구들과 구축된 암환자들과 대조군 사이의 차등 발현 유전자(differentially expressed gene; DEG) 분석을 통해 스크리닝을 시도해 왔다.
본 발명의 목적은 RGS18, SNORA12 및 SNORD97로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상의 RNA를 유효성분으로 포함하는 자궁경부암 진단용 바이오마커 조성물을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 RGS18, SNORA12 및 SNORD97로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상의 RNA의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 자궁경부암 진단용 조성물 및 이를 포함하는 자궁경부암 진단용 키트를 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 RGS18, SNORA12 및 SNORD97로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상의 RNA의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는 자궁경부암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 RGS18, SNORA12 및 SNORD97로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상의 RNA를 유효성분으로 포함하는 자궁경부암 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 RGS18, SNORA12 및 SNORD97로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상의 RNA의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 자궁경부암 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 자궁경부암 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) 환자에서 분리된 시료로부터 RGS18, SNORA12 및 SNORD97로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상의 RNA의 발현수준을 측정하는 단계; 및 (2) 상기 측정된 RNA의 발현수준을 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하는 자궁경부암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명은 자궁경부암 진단용 혈장 엑소좀 RNAs 마커 조성물에 관한 것으로서, 본 발명자들은 자궁경부암의 조기진행과 전이를 예측하기 위한 엑소좀 miRNA를 선별하기 위해 방사선 조사에 따른 miRNA의 변화량과 mRNA의 변화량의 연관성을 분석하여 생물학 데이터베이스로부터 2차적 검증을 수행하였는데, 본 발명에서는 일차적으로 자궁경부암 환자들과 건강한 대조군 상이의 DEG 분석을 수행한 후 선별된 non-coding small RNA의 방사선에 따른 변화와 높은 연관성을 보이는 mRNA들의 갯수 또는 선별된 mRNA의 변화와 높은 연관성을 보이는 non-coding small RNA들의 갯수를 비교하고 그들의 생물학적 기능을 분석하여 이차적으로 검증하는 방법을 통해 자궁경부암의 진단 도구로서의 혈장 엑소좀 RNA들을 선별하였다. 이에, 본 발명에서 선별된 혈장 엑소좀 RNA들은 향후 유용한 자궁경부암 진단 바이오마커로 활용될 가능성이 매우 높다.
도 1은 대조군과 비교군 사이의 혈장 엑소좀 mRNA의 DEG들을 volcano plot을 이용하여 나타낸 것이다.
도 2는 67개의 mRNA들에 대한 비교군과 대조군의 heatmap을 표시한 것으로 건강한 사람과 자궁경부암 환자군 상의 전반적인 발현량 차이를 나타낸다.
도 3은 67개의 mRNA들의 발현량을 이용한 MDS와 k-means clustering을 이용하여 두 그룹으로 나누었을 때 각 그룹간의 대조군과 암환자간의 비율을 나타낸다.
도 4 내지 도 6은 30명의 자궁경부암 환자들에서 67개의 mRNA들의 방사선 조사 후 변화량 (log 2 fold change)과 유의하게 연관된 lncRNA, miRNA, 또는 piRNA들의 갯수를 나타낸다.
도 7은 67개의 mRNA들과 선별된 5개의 mRNA들과 연관된 lncRNA, miRNA, 또는 piRNA들을 조합하여 igraph 패키지의 prim 알고리즘을 이용한 edge가 0.9 이상의 연관성을 가지는 네크워크 생성 결과를 나타낸다.
도 8은 mRNA, snoRNA와 같은 방법으로 DEG 분석 후 방사선 치료에 따른 lncRNA의 변화에 따라 변화하는 mRNA들의 갯수를 분석하여 선별한 4개의 lncRNA들을 중심으로한 edge가 0.9 이상의 연관성을 가지는 lncRNA-mRNA 네크워크를 나타낸다.
도 9는 도 7의 네트워크상에 포함된 RNA들이 반영하는 생물학적인 IPA를 통해 선별한 것으로 -log10 P value 가 가장 큰 항목 10개를 선별한 결과를 나타낸다.
도 10은 선별된 5종의 mRNA들의 조직학적 특성과(위) 병기에(아래) 따른 log2 RPKM+1 값을 보여주는 boxplot들이다
도 11은 대조군과 비교군 사이의 혈장 엑소좀 snoRNA의 DEG들을 volcano plot을 이용하여 나타낸 것이다.
도 12는 18개의 snoRNA들에 대한 비교군과 대조군의 heatmap을 표시한 것으로 건강한 사람과 자궁경부암 환자군 상의 전반적인 발현량 차이를 나타낸다.
도 13은 18개의 snoRNA들의 발현량으로 MDS와 k-means clustering을 수행하여 두 그룹으로 나누었을 때 각 그룹간의 대조군과 암환자간의 비율을 나타낸다.
도 14는 30명의 자궁경부암 환자들에서 선별된 snoRNA 들의 방사선 조사 후 변화량 (log 2 fold change)과 유의하게 연관된 mRNA들의 갯수를 나타낸다.
도 15는 URS0000822206 및 URS000067E6DC와 R > 0.9의 연관성을 보이는 mRNA들과 11 종의 snoRNA들로 구성된 edge가 0.9 이상의 네크워크 생성 결과를 나타낸다.
도 16은 도 15의 두 네트워크상에 포함된 RNA들이 반영하는 생물학적인 IPA를 통해 선별한 것으로, -log10 P value 가 가장 큰 항목 10개를 각각 선별한 결과를 나타낸다.
도 17은 snoRNA 에서 발현량의 차이를 보이는 환자들 사이의 ALC2 값에 대한 density plot과 snoRNA URS000002084A (log2 RPM+1)가 증가할수록 ALC2가 감소함을 보여주는 결과이다.
도 18은 9종의 snoRNA중 그림 12상 정상군과 암의 차등발현과 연관된 4종의 조직학적 특성과(위) 병기에(아래) 따른 log2 RPM+1 값을 보여주는 boxplot들이다.
도 19는 mRNA 및 snoRNA와 같은 과정을 거쳐 선별된 hsa-miR-142-3p와 앞서 선별된 mRNA(5), 및 snoRNA(9)로 heatmap를 수행한 결과를 나타낸다.
도 20은 도 19의 RNA들을 이용하여 MDS와 k-means clustering을 시행한 결과를 나타낸다.
도 21은 도 7 및 도 8에서 lncRNA와의 연관성을 고려하여 RGS18를 선별하였으며, 도 14에서 보여주는 발현량과 림프구와의 연관성을 고려하여 5종의 snoRNA 중 URS000002084A를 선별하였으며, 두 가지의 RNA를 선별 후 도 18의 4종의 snoRNA 중 RGS18 및 URS000002084A와 통합하였을 때 정상군과 암환자군을 가장 잘 구분한 snoRNA URS00003B57B1를 선별한 결과를 나타낸다.
도 22는 30명의 암환자 중 30명을 예측하여 100%의 민감도를, 12명의 정상군 중 11명을 예측하여 91.7%의 특이도를 나타내는 결과를 나타낸다.
도 2는 67개의 mRNA들에 대한 비교군과 대조군의 heatmap을 표시한 것으로 건강한 사람과 자궁경부암 환자군 상의 전반적인 발현량 차이를 나타낸다.
도 3은 67개의 mRNA들의 발현량을 이용한 MDS와 k-means clustering을 이용하여 두 그룹으로 나누었을 때 각 그룹간의 대조군과 암환자간의 비율을 나타낸다.
도 4 내지 도 6은 30명의 자궁경부암 환자들에서 67개의 mRNA들의 방사선 조사 후 변화량 (log 2 fold change)과 유의하게 연관된 lncRNA, miRNA, 또는 piRNA들의 갯수를 나타낸다.
도 7은 67개의 mRNA들과 선별된 5개의 mRNA들과 연관된 lncRNA, miRNA, 또는 piRNA들을 조합하여 igraph 패키지의 prim 알고리즘을 이용한 edge가 0.9 이상의 연관성을 가지는 네크워크 생성 결과를 나타낸다.
도 8은 mRNA, snoRNA와 같은 방법으로 DEG 분석 후 방사선 치료에 따른 lncRNA의 변화에 따라 변화하는 mRNA들의 갯수를 분석하여 선별한 4개의 lncRNA들을 중심으로한 edge가 0.9 이상의 연관성을 가지는 lncRNA-mRNA 네크워크를 나타낸다.
도 9는 도 7의 네트워크상에 포함된 RNA들이 반영하는 생물학적인 IPA를 통해 선별한 것으로 -log10 P value 가 가장 큰 항목 10개를 선별한 결과를 나타낸다.
도 10은 선별된 5종의 mRNA들의 조직학적 특성과(위) 병기에(아래) 따른 log2 RPKM+1 값을 보여주는 boxplot들이다
도 11은 대조군과 비교군 사이의 혈장 엑소좀 snoRNA의 DEG들을 volcano plot을 이용하여 나타낸 것이다.
도 12는 18개의 snoRNA들에 대한 비교군과 대조군의 heatmap을 표시한 것으로 건강한 사람과 자궁경부암 환자군 상의 전반적인 발현량 차이를 나타낸다.
도 13은 18개의 snoRNA들의 발현량으로 MDS와 k-means clustering을 수행하여 두 그룹으로 나누었을 때 각 그룹간의 대조군과 암환자간의 비율을 나타낸다.
도 14는 30명의 자궁경부암 환자들에서 선별된 snoRNA 들의 방사선 조사 후 변화량 (log 2 fold change)과 유의하게 연관된 mRNA들의 갯수를 나타낸다.
도 15는 URS0000822206 및 URS000067E6DC와 R > 0.9의 연관성을 보이는 mRNA들과 11 종의 snoRNA들로 구성된 edge가 0.9 이상의 네크워크 생성 결과를 나타낸다.
도 16은 도 15의 두 네트워크상에 포함된 RNA들이 반영하는 생물학적인 IPA를 통해 선별한 것으로, -log10 P value 가 가장 큰 항목 10개를 각각 선별한 결과를 나타낸다.
도 17은 snoRNA 에서 발현량의 차이를 보이는 환자들 사이의 ALC2 값에 대한 density plot과 snoRNA URS000002084A (log2 RPM+1)가 증가할수록 ALC2가 감소함을 보여주는 결과이다.
도 18은 9종의 snoRNA중 그림 12상 정상군과 암의 차등발현과 연관된 4종의 조직학적 특성과(위) 병기에(아래) 따른 log2 RPM+1 값을 보여주는 boxplot들이다.
도 19는 mRNA 및 snoRNA와 같은 과정을 거쳐 선별된 hsa-miR-142-3p와 앞서 선별된 mRNA(5), 및 snoRNA(9)로 heatmap를 수행한 결과를 나타낸다.
도 20은 도 19의 RNA들을 이용하여 MDS와 k-means clustering을 시행한 결과를 나타낸다.
도 21은 도 7 및 도 8에서 lncRNA와의 연관성을 고려하여 RGS18를 선별하였으며, 도 14에서 보여주는 발현량과 림프구와의 연관성을 고려하여 5종의 snoRNA 중 URS000002084A를 선별하였으며, 두 가지의 RNA를 선별 후 도 18의 4종의 snoRNA 중 RGS18 및 URS000002084A와 통합하였을 때 정상군과 암환자군을 가장 잘 구분한 snoRNA URS00003B57B1를 선별한 결과를 나타낸다.
도 22는 30명의 암환자 중 30명을 예측하여 100%의 민감도를, 12명의 정상군 중 11명을 예측하여 91.7%의 특이도를 나타내는 결과를 나타낸다.
본 발명은 RGS18, SNORA12 및 SNORD97로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상의 RNA를 유효성분으로 포함하는 자궁경부암 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 바이오마커 조성물은 Hsa-miR-142-3p, CXCL5, KIF2A, ARL6IP5, DAPP1, SNORD17, SCARNA12, SNORA6, SCARNA1, SNORD62A 및 SNORD38A로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상의 RNA를 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 RNA는 혈장 엑소좀 유래일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 "RGS18"은 regulator of G protein signaling 18로서, Gene ID 64407, NCBI accession no. NM_130782 또는 XM_011509891 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 "SNORA12"는 RNA central accession no. URS000002084A 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 "SNORD97"은 RNA central accession no. URS00003B57B1 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 "Hsa-miR-142-3p"는 Gene ID 406934 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 "CXCL5"는 C-X-C motif chemokine ligand 5로서, Gene ID 6374, NCBI accession no. NM_002994 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 "KIF2A"는 kinesin family member 2A로서, Gene ID 3796, NCBI accession no. NM_001098511, NM_001243952, NM_001243953, NM_004520 또는 XR_001742064 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 "ARL6IP5"는 ADP ribosylation factor like GTPase 6 interacting protein 5로서, Gene ID 10550, NCBI accession no. NM_006407 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 "DAPP1"는 dual adaptor of phosphotyrosine and 3-phosphoinositides 1로서, Gene ID 27071, NCBI accession no. NM_001306151, NM_014395, XM_011531840, XM_011531842, XM_011531843, XM_017008023, XM_017008024 또는 XR_001741200 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 "SNORD17"는 RNA central accession no. URS00006BA413 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 "SCARNA12"는 RNA central accession no. URS000014FF3E 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 "SNORA6"는 RNA central accession no. URS0000714944 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 "SCARNA1"는 RNA central accession no. URS000021BC29 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 "SNORD62A"는 RNA central accession no. URS00004D7B5D 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 "SNORD38A"는 RNA central accession no. URS00003640C3 또는 URS000067EB9D 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한, 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링하는 것)를 포함한다.
또한, 본 발명은 RGS18, SNORA12 및 SNORD97로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상의 RNA의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 자궁경부암 진단용 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 조성물은 Hsa-miR-142-3p, CXCL5, KIF2A, ARL6IP5, DAPP1, SNORD17, SCARNA12, SNORA6, SCARNA1, SNORD62A 및 SNORD38A로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상의 RNA의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는 상기 RNA의 발현수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 RNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 RNA는 혈장 엑소좀 유래일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 자궁경부암 진단용 키트를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로서 작용하는 짧은 핵산 서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머라제 또는 역전사효소) 및 상이한 4 가지의 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "프로브"는 mRNA외 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무, 발현양을 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중쇄DNA(double strand DNA)프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술 분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다.
또한, 본 발명은 (1) 환자에서 분리된 시료로부터 RGS18, SNORA12 및 SNORD97로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상의 RNA의 발현수준을 측정하는 단계; 및 (2) 상기 측정된 RNA의 발현수준을 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하는 자궁경부암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 방법은 Hsa-miR-142-3p, CXCL5, KIF2A, ARL6IP5, DAPP1, SNORD17, SCARNA12, SNORA6, SCARNA1, SNORD62A 및 SNORD38A로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상의 RNA의 발현수준을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상세하게는, 상기 RNA의 발현수준을 측정하는 방법은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR (Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅 (Northern blotting), DNA 칩, 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent asay), 방사선면역분석(Radioimmunoassay; RIA), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케이트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법 (Complement Fixation Assay), FACS 또는 단백질 칩을 이용할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 "환자에서 분리된 시료"란 환자의 자궁경부암 진단용 바이오마커인 RNA의 발현 수준에 있어서 대조군과 차이가 나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액, 또는 뇨와 같은 시료를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서, 바람직하게는 상기 시료는 혈액일 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 시료는 혈액 유래 혈장 엑소좀일 수 있다.
이하에서는, 본 발명을 한정하지 않는 실시예에 따라 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 따라서, 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.
<실험예>
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 정상군
12 명의 건강한 여성 지원자들의 혈장 자원 2-3mL를 분양받았다.
2. 자궁경부암 환자군
자궁경부암 병기 IB-IVB로 진단 후 아주대병원에서 항암방사선 치료를 시행한 환자들 30명으로부터 방사선 치료 전과 방사선 치료 시작 2주 후의 혈액 샘플을 5-10 mL 기증받아 사용하였다.
| 정상군 | 자궁경부암 환자군 | ||
| 인원 (명) | 12명 | 30명 | |
| 항암방사선 치료 전 | 항암방사선 치료 시작 2주 | ||
| 분류 | 대조군 | 비교군 | |
| 대조군 | 비교군 | ||
| 분석 | Group DEG | ||
| pairwise DEG를 이용한 개개인의 모든 RNA의 log2FC 계산 | |||
3. 정상군 12명으로부터 12 샘플, 환자 30명으로부터 60 샘플의 혈장 엑소좀 RNA Sequencing을 시행하였으며 시행 항목은 다음과 같다.
| Plasma exosome | Non-coding RNA | Coding RNA |
| Small (<=200nt) | Micro RNA (miRNA), piwi-interacting RNA (piRNA), small nucleolar RNA (snoRNA), small nucleolar RNA (snRNA), transfer RNA (tRNA), Y RNA (yRNA) | |
| Long (>200nt) | Long non coding RNA (lncRNA) | Messenger RNA (mRNA) |
혈장 엑소좀 RNA의 종류별로 자궁경부암을 진단하기 위한 바이오마커를 선별하기 위해 다음과 같은 분석을 시행하였다.
(1) 차등 발현 유전자(Differentially expressed gene; DEG) 분석을 edgeR로 수행하고 volcano plot으로 표현하였다. RNA read count가 0인 샘플이 12개를 넘는 RNA는 제외한 후 TMM 정규화(normalization)를 시행하였다. lncRNA와 mRNA의 경우는 filterByExp 함수로 필터링(filtering)을 추가 하였다.
(1.1) 정상군 (12명) vs. 자궁경부암 (30명), p < 0.05 & |log2FC|>2 인 RNA를 선별하였다.
(1.2) 정상군 (12명) vs. 비-선암 (24명), p < 0.05 & |log2FC|>1.5로 선별하고(A) 정상군 (12명) vs. 선암 (6명), p<0.05 & |log2FC|>1.5로 선별 후 (B), |log2FC(A)+logFC(B)| >4 인 RNA를 선별하였다.
(1.3) (1.1)과 (1.2)에 공통으로 포함된 RNA를 선별하였다.
(2) 선별된 RNA들의 TMM 정규화된 log2 CPM 값을 이용하여 multidimensional scaling (MDS)를 수행하고 k-means clustering으로 2그룹으로 분리하여 그림으로 표현한 후, 각 그룹별로 정상군과 암의 비율을 %로 표현하였다.
(3) 선별된 RNA들의 TMM 정규화된 log2 CPM 값을 이용하여 정상인과 자궁경부암 환자들의 Heatmap을 표현하였다.
(4) 30명의 자궁경부암 환자들의 항암방사선 치료 전 대비 치료 후 2주의 모든 종류의 혈장 엑소좀 RNA들의 변화량을 각 개인별로 DEG를 수행하여 log2 FC로 구하였다. 그룹간 DEG 과정을 통해 선별된 mRNA를 제외한 non-coding RNA (ncRNA)들의 log2FC 값의 변화에 따라 유의하게 변화하는 mRNA 값들의 갯수를 |Pearson's correlation (R)| 0.6 0.7, 0.8, 0.9를 기준으로 구한 후 |R| >0.7 또는 |R| >0.6의 연관성을 가지는 mRNA들의 갯수에 따라 bar plot으로 표현하였다.
(5) 종류별로 선별된 ncRNA들의 R>0.7 또는 R>0.6의 연관성을 보이는 mRNA의 갯수에 따른 cut-off에 의한 두 그룹 사이에 정상군과 암환자군의 DEG에서 계산된 P 값들의 (-log10(DEG Pvalue)) 차이의 유의성을 -log10(Pvalue)로 표현하였고, -log10(Pvalue)의 Peak 값을 optimal cut off로 설정하고 이에 따른 두 그룹의 -log10(DEG Pvalue) 값들의 차이를 boxplot으로 제시하였다. (Wilcoxon rank sum test)
(6) Boxplot 중 더 높은 -log10(DEG Pvalue)에 속한 ncRNA들을 1차 선별하고 더 밀접한 연관성이 있는 mRNA들을 (|R|>0.7, |R|>0.8 또는 |R|>0.9) 포함하는 ncRNA들을 최종 선별하였다. 이들 mRNA들과 1차 선별된 ncRNA들을 이용하여 network를 구성하였다. Prim's algorithm of minimum spanning tree in igraph package 을 사용하였으며 |R|>0.7, |R|>0.8 또는 |R|>0.9 로 구성되는 edge의 붉은색과 푸르색은 각 각 음과 양의 방향을 의미한다.
mRNA의 경우는 선별된 mRNA의 log2FC와 연관된 miRNA, piRNA, lncRNA의 갯수를 사용하여 상기의 과정을 (5, 6) 수행하였으며, miRNA와 snoRNA의 경우는 연관된 mRNA들의 갯수가 선별된 small ncRNA들 사이에 현저히 차이 나기 때문에, 연관된 mRNA가 많은 그룹과 적은 그룹으로 나누어 network를 구성하였다.
(7) Ingenuity pathway analysis (IPA) software를 이용하여 (QIAGEN, https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis) Network를 구성하는 RNA들의 질병과 생물학적 기능을 탐색하였다. 연관된 질병 및 생물학적 기능에 관한 RNA들이 Network를 구성하는 RNA들에 얼마나 포함되어 있는 지를 %로 나타내고 P 값을 표시하여 barplot을 나타내었다.
(8) 이를 바탕으로 Cancer과 연관성이 높은 RNA들을 종류별로 선별하였으며, 이들의 병기 및 조직학적 소견에 따른 log2(RPM or RPKM +1) 값을 boxplot으로 표시하고 통계적 유의성을 확인하였다 (Kruskal-Wallis test)
(9) 선별된 miRNA, mRNA, snoRNA를 이용하여 heatmap을 표시하였고 MDS 분석을 수행하였다. 다른 종의 선별된 RNA들 상의 비교로 TMM 정규화하지 않은 log2 CPM 값을 이용하였다.
(10) 모든 통계적 분석 및 그래프는 R version 4.1을 이용하여 수행되었다.
<
실시예
>
도 1은 대조군과 비교군 사이의 혈장 엑소좀 mRNA의 DEG들을 volcano plot을 이용하여 표현하고 (A: 대조군 12명 vs. 자궁경부암 30명, B:대조군12명 vs. 비선암 24명, C: 대조군12명 vs. 선암 6명), |log2FC (A)} > 2 면서 |log2FC (B) + log2FC (C)| >4 인 67개의 mRNA들을 선별하였다.
도 2는 67개의 mRNA들에 대한 비교군과 대조군의 heatmap을 표시한 것으로 건강한 사람과 자궁경부암 환자군 상의 전반적인 발현량 차이를 보여준다.
도 3은 67개의 mRNA들의 발현량을 이용한 MDS와 k-means clustering을 이용하여 두 그룹으로 나누었을 때 각 그룹간의 대조군과 암환자간의 비율을 표시하였다. 이 분류에 따르면 30명의 암환자 중 27명을 예측하여 민감도 90%, 12명의 건강인 중 10명을 예측하여 특이도 83.3%이다.
도 4는 30명의 자궁경부암 환자들에서 67개의 mRNA들의 방사선 조사 후 변화량 (log 2 fold change)과 유의하게 연관된 lncRNA, miRNA, 또는 piRNA들의 갯수를 보여준다. 상관계수 0.7을 기준으로 한 mRNA와 연관된 lncRNA, miRNA, 또는 piRNA들의 갯수가 클 수록 대조군과 비교군 사이의 그룹 간의 -log10(DEG P value)의 차이가 커지는 경향을 보임을 알 수 있다(도 5). 이는 mRNA와 연관된 lncRNA, miRNA, 또는 piRNA들의 갯수가 10에 이를 때 까지 꾸준히 증가한다. 이에 따라 mRNA들을 나누어 두 그룹 간의 -log10(DEG P value) 값을 비교했을 때 방사선에 따라 많은 엑소좀 lncRNA, miRNA, 또는 piRNA들과 연관되는 mRNA들의 -log10(DEG P value)가 유의하게 높음을 알 수 있다(도 6). 따라서 상관계수 0.9를 초과하는 lncRNA, miRNA, 또는 piRNA들을 보유한 5종의 mRNA들을 선별하였다.
-log10(DEG P value)는 도 1에서 대조군 12명과 자궁경부암 30명을 비교하는 DEG 분석에서 얻어진 값을 의미한다.
도 7은 67개의 mRNA들과 선별된 5개의 mRNA들과 연관된 lncRNA, miRNA, 또는 piRNA들을 조합하여 igraph 패키지의 prim 알고리즘을 이용한 edge가 0.9 이상의 연관성을 가지는 네크워크를 생성하였다. 네모 박스의 lncRNA들은 자궁경부암과 연관된 엑소좀 lncRNA들 이다(도 8).
도 8은 mRNA, snoRNA와 같은 방법으로 DEG 분석 후 방사선 치료에 따른 lncRNA의 변화에 따라 변화하는 mRNA들의 갯수를 분석하여 선별한 4개의 lncRNA들을 중심으로한 edge가 0.9 이상의 연관성을 가지는 lncRNA-mRNA 네크워크를 보여준다(상기 실험예 부분 참조). 동그리미의 mRNA들은 도 4에서 선별된 mRNA들 이다.
도 7 및 도 8을 살펴보았을 때, 선별된 mRNA와 lncRNA는 상호 간에 연관되며 특히 RGS18는 lncRNA와 가까이 위치하며 LOC105374768 및 LINC0089와 상호연관을 보인다.
도 9는 도 7의 네트워크상에 포함된 RNA들이 반영하는 생물학적인 IPA를 통해 선별한 것으로 -log10 P value 가 가장 큰 항목 10개를 선별하였다. 이후 네트워크 상의 RNA들 가운데 카테고리에 포함된 RNA들의 비율 순으로 정리하여 네트워크 상에 RNA들의 기능이 어떤 카테고리를 주로 반영하고 있는지를 평가하였다. 이를 통해 선별된 5가지의 mRNA들은 암과 유의하게 연관됨을 알 수 있다.
도 10은 선별된 5 종의 mRNA들의 조직학적 특성과(위) 병기에(아래) 따른 log2 RPKM+1 값을 보여주는 boxplot들이다. 유의하게 정상군과의 차이를 보이고 있음을 알 수 있다. 특히 RGS18과 CXCL5는 병기에 따른 유의미한 차이를 보여준다.
도 11은 대조군과 비교군 사이의 혈장 엑소좀 snoRNA의 DEG들을 volcano plot을 이용하여 표현하고 (A: 대조군 12명 vs. 자궁경부암 30명, B:대조군12명 vs. 비선암 24명, C: 대조군12명 vs. 선암 6명), |log2FC (A)} > 2 면서 |log2FC (B) + log2FC (C)| >4 인 18개의 snoRNA들을 선별하였다.
도 12는 18개의 snoRNA들에 대한 비교군과 대조군의 heatmap을 표시한 것으로 건강한 사람과 자궁경부암 환자군 상의 전반적인 발현량 차이를 보여준다. 붉은색 (점선) 박스 구간은 암 환자중 12명에서 명확한 차등발현을 보였으며 붉은색 (실선) 박스 구간은 전반적으로 정상군과 차등 발현되는 양상이다.
도 13은 18개의 snoRNA들의 발현량으로 MDS와 k-means clustering을 수행하여 두 그룹으로 나누었을 때 각 그룹간의 대조군과 암환자간의 비율을 표시하였다. 이 분류에 따르면 30명의 암환자 중 12명을 예측하여 민감도 40%, 12명의 건강인 중 12명을 예측하여 특이도 100% 이다.
도 14는 30명의 자궁경부암 환자들에서 선별된 snoRNA 들의 방사선 조사 후 변화량 (log 2 fold change)과 유의하게 연관된 mRNA들의 갯수를 각각 보여준다. 11종의 snoRNA에서 상관계수 0.7 이상의 mRNA들을 가졌는데 월등히 많이 연관 mRNA들을 가지는 2종 (URS0000822206, URS000067E6DC)과 그렇지 않은 9종으로 나누었다. 붉은색 (점선)은 암환자중 12명에서 차등발현을 보이는 snoRNA 5종이고, 붉은색 (실선)은 정상군과 암환자간의 차등발현을 보이는 snoRNA 4종이다.
도 15는 URS0000822206 및 URS000067E6DC와 R > 0.9의 연관성을 보이는 mRNA들과 11 종의 snoRNA들로 구성된 edge가 0.9 이상의 네크워크를 생성하였다(위). 연관 mRNA들의 갯수가 적은 9종의 snoRNA들과 R >0.7 의 연관성을 보이는 mRNA들과 11종의 snoRNA들로 구성된 edge가 0.7이상의 네크워트를 생성하였다(아래).
도 16은 도 15의 두 네트워크상에 포함된 RNA들이 반영하는 생물학적인 IPA를 통해 선별한 것으로 -log10 P value 가 가장 큰 항목 10개를 각각 선별하였다. 이 후 네트워크 상의 RNA들 가운데 카테고리에 포함된 RNA들의 비율 순으로 정리하여 네트워크 상에 RNA들의 기능이 어떤 카테고리를 주로 반영하고 있는지를 각각 평가하였다. 이를 통해 9종의 snoRNA들이 암과 연관 있음을 알 수 있다.
도 12의 암환자 12명에게서 차등발현 된 5종 snoRNA들의 임상적 연관성을 살펴보았다.
표 3은 snoRNA의 발현 차이에 따른 임상적인 요소들의 차이를 보여주는데 방사선 치료 시작 2주 후의 림프구의 값과 (ALC2), 치료 전의 종양표지자에서 통계적으로 유의한 차이를 보여 준다.
| Patients' clinical characteristics | |||||
| Healthy | Cancer | DEG (snoRNA) | P | ||
| (N=12) | (N=30) | No (N=18) | Yes (N=12) | ||
| Age (years) | 49.2 ± 11.6 | 49.9 ± 10.1 | 47.9 ± 11.4 | 52.8 ± 7.1 | 0.199 |
| FIGO stage 2018 | 0.627 | ||||
| - IB | 5 (16.7%) | 4 (22.2%) | 1 (8.3%) | ||
| - IIB-IIIC1 | 15 (50.0%) | 9 (50.0%) | 6 (50.0%) | ||
| - IIIC2-IVA | 7 (23.3%) | 4 (22.2%) | 3 (25.0%) | ||
| - IVB | 3 (10.0%) | 1 (5.6%) | 2 (16.7%) | ||
| Pathology | 0.374 | ||||
| - Adenocarcinoma | 5 (16.7%) | 4 (22.2%) | 1 (8.3%) | ||
| - Adenosquamous cell carcinoma | 1 (3.3%) | 0 (0.0%) | 1 (8.3%) | ||
| - Unclassified carcinoma | 1 (3.3%) | 1 (5.6%) | 0 (0.0%) | ||
| - Squamous cell carcinoma | 23 (76.7%) | 13 (72.2%) | 10 (83.3%) | ||
| Radiotherapy field | 0.464 | ||||
| Pelvis | 21 (70.0%) | 14 (77.8%) | 7 (58.3%) | ||
| Pelvis with paraaortic region | 9 (30.0%) | 4 (22.2%) | 5 (41.7%) | ||
| Hemoglobin (g/dl) | |||||
| Pretreatment | 12.1 ± 1.5 | 12.0 ± 1.5 | 12.2 ± 1.6 | 0.78 | |
| Second week during CCRT | 11.1 ± 1.4 | 11.3 ± 1.2 | 10.8 ± 1.7 | 0.336 | |
| Abolute lymphocyte count (cells/μl) | |||||
| Pretreatment | 1754 ± 470 | 1758 ± 451 | 1747 ± 518 | 0.95 | |
| Second week during CCRT | 931 ± 393 | 929 ± 281 | 936 ± 546 | 0.966 | |
| Second week during CCRT (ALC2) | 511 [ 371;632 ] | 575 [ 505;661 ] | 384 [ 323;466 ] | 0.008 | |
| Pretreatment tumor marker (ng/ml) | |||||
| Squamous cell carcinoma antigen | 3.7 [ 0.9;16 .6] | 2.2 [0.8; 4.8] | 13.1 [ 4.0;60 .6] | 0.016 | |
| Cytokeratin fragment 21-1 | 2.5 [ 1.8;10 .2] | 2.2 [1.2; 2.8] | 8.4 [ 2.5;16 .6] | 0.031 | |
| Pretretmnet tumor volume (cm3) | 50.5 [18.1;94.1] | 40.6 [15.2;94.1] | 61.0 [30.9;103.3] | 0.346 | |
| Continuous variables are described usin median [interquartile range] or mean ± standard deviation, FIGO; International Federation of Gynecology and Obstetrics, CCRT; concurrent chemoradiotherapy | |||||
도 17은 snoRNA 에서 발현량의 차이를 보이는 환자들 사이의 ALC2 값에 대한 density plot과 snoRNA URS000002084A (log2 RPM+1) 가 증가할 수 록 ALC2가 감소함을 보여준다. ALC2: 항암방사선 치료 시작 2주 후의 림프구 (cells/μl).
따라서 표 3, 도 17을 고려했을 때 상기 발현량의 차이를 보이는 snoRNA 들은 암의 활동으로 인한 림프구의 감소와 연관된다. 림프구의 감소와 자궁경부암 진행의 연관성을 고려했을 때, 상기 snoRNA들은 암과 연관된 면역력의 저하와 관련됨을 추론할 수 있다.
도 18은 9종의 snoRNA 중 도 12 상에 정상군과 암의 차등발현과 연관된 4종의 조직학적 특성과(위) 병기에(아래) 따른 log2 RPM+1 값을 보여주는 boxplot들이다. 유의하게 정상군과의 차이를 보이고 있음을 알 수 있다.
도 19는 mRNA 및 snoRNA와 같은 과정을 거쳐 선별된 hsa-miR-142-3p (실험예 참조)와 앞서 선별된 mRNA(5), 및 snoRNA(9)로 heatmap를 수행하였고, 열의 계층적 군집화를 보았을 때 정상군과 암환자군을 분리함을 알 수 있다. 푸른색은 miRNA/mRNA로 구분되는 영역, 보라색은 miRNA/mRNA/snoRNA로 구분되는 영역, 붉은색 (점선)은 snoRNA 5종으로 구분되는 영역, 붉은색 (실선)은 snoRNA 4종으로 구분되는 영역이다.
도 20은 도 19의 RNA들을 이용하여 MDS와 k-means clustering을 시행하였을 때 3그룹으로 나눌 수 있었으며, 이는 민감도 특이도 모두 100%로 비교군과 대조군을 구분한다.
도 21은 도 7 및 도 8에서 lncRNA와의 연관성을 고려하여 RGS18을 선별하였으며, 도 14에서 보여주는 발현량과 림프구와의 연관성을 고려하여 5종의 snoRNA중 URS000002084A를 선별하였으며, 두 가지의 RNA를 선별 후 도 18의 4종의 snoRNA 중 RGS18 및 URS000002084A와 통합하였을 때 정상군과 암환자군을 가장 잘 구분한 snoRNA URS00003B57B1를 선별하였다. 상기 선별되 3가지 RNA로 heatmap를 보여주고 있다. 푸른색은 RGS18로 구분되는 영역, 보라색은 선별된 3가지 RNA 모두로 구분되는 영역, 붉은색(점선)은 URS000002084A로 구분되는 영역, 붉은색 (실선)은 URS00003B57B1으로 구분되는 영역이다.
도 22는 암환자군에 한 명의 정상군 대상자가 들어간 것 외에는 적절히 암환자 군을 나누고 있다. 30명의 암환자 중 30명을 예측하여 100%의 민감도를, 12명의 정상군 중 11명을 예측하여 91.7%의 특이도를 보인다.
Claims (12)
- RGS18, SNORA12 및 SNORD97로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상의 RNA를 유효성분으로 포함하는 자궁경부암 진단용 바이오마커 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 바이오마커 조성물은 Hsa-miR-142-3p, CXCL5, KIF2A, ARL6IP5, DAPP1, SNORD17, SCARNA12, SNORA6, SCARNA1, SNORD62A 및 SNORD38A로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상의 RNA를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 자궁경부암 진단용 바이오마커 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 RNA는 혈장 엑소좀 유래인 것을 특징으로 하는 자궁경부암 진단용 바이오마커 조성물.
- RGS18, SNORA12 및 SNORD97로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상의 RNA의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 자궁경부암 진단용 조성물.
- 제4항에 있어서, 상기 조성물은 Hsa-miR-142-3p, CXCL5, KIF2A, ARL6IP5, DAPP1, SNORD17, SCARNA12, SNORA6, SCARNA1, SNORD62A 및 SNORD38A로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상의 RNA의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 자궁경부암 진단용 조성물.
- 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 RNA의 발현수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 RNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는 자궁경부암 진단용 조성물.
- 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 RNA는 혈장 엑소좀 유래인 것을 특징으로 하는 자궁경부암 진단용 조성물.
- 제4항 또는 제5항의 조성물을 포함하는 자궁경부암 진단용 키트.
- (1) 환자에서 분리된 시료로부터 RGS18, SNORA12 및 SNORD97로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상의 RNA의 발현수준을 측정하는 단계; 및
(2) 상기 측정된 RNA의 발현수준을 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하는 자궁경부암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법. - 제9항에 있어서, 상기 방법은 Hsa-miR-142-3p, CXCL5, KIF2A, ARL6IP5, DAPP1, SNORD17, SCARNA12, SNORA6, SCARNA1, SNORD62A 및 SNORD38A로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상의 RNA의 발현수준을 측정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 자궁경부암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
- 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 시료는 혈액인 것을 특징으로 하는 자궁경부암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 시료는 혈액 유래 혈장 엑소좀인 것을 특징으로 하는 자궁경부암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
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| US20170067123A1 (en) | 2008-07-21 | 2017-03-09 | Neodiagnostix | Method for the Cytological Analysis of Cervical Cells |
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| CN116814796B (zh) * | 2023-08-09 | 2024-03-01 | 中日友好医院(中日友好临床医学研究所) | 一种宫颈病变标志物及其在诊断和预后评价的应用 |
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