KR20230010426A - 혈액 종양 질환 특이적 마커 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 혈액 종양 질환 특이적인 사이토카인 유전자 및 NGAL 유전자 발현 수준의 마커로서의 용도에 관한 것으로, NGAL 유전자 발현과 다른 사이토카인(Cytokine) 유전자 발현의 관련성을 확인하였으며, 특히 발현에 영향을 미치는 사이토카인들의 발현 수준이 독립 변수로 들어간 NGAL 유전자 발현 수준을 나타내는 다중 회귀식을 유도하였고, NGAL 유전자 발현 수준과 특정 사이토카인 유전자들의 발현 수준이 각 혈액 종양 질환에 특이적인지 확인하였으므로, 이들을 혈액 종양 질환의 분류, 진단 또는 예후 판단 용도로 유용하게 활용할 수 있다.

Description

혈액 종양 질환 특이적 마커 및 이의 용도{HEMATOLOGIC MALIGNANCY SPECIFIC MARKERS AND USE THEREOF}
본 발명은 혈액 종양 질환 특이적인 사이토카인 유전자 및 NGAL 유전자 발현 수준의 마커로서의 용도에 관한 것이다.
사망 질환의 원인으로 혈액암의 발생빈도는 점차 증가하고 있는 추세이며, 이의 원인으로는 환자의 유전적 요인뿐 아니라 유해한 환경 노출, 바이러스 감염 등 다양한 요인들이 관여하고 있다. 이 중 감염과 이에 동반되는 염증이 암 발생의 위험 인자 중의 하나로 인식되고 있다. 이 중, 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia, AML)은 골수에 축적되어 정상 혈구의 생산을 방해하는 비정상 백혈구의 급격한 성장을 특징으로 하는, 혈구의 골수계 암이다. 골수 신생물 및 급성 백혈병의 WHO 분류가 AML의 분류를 위한 현재의 기준이며 유전적 이상도 진단 알고리즘에 편입된다. 이러한 분류는 임의의 내재하는 염색체 이상 또는 유전적 변화를 확인하기 위해 광학 현미경하에 악성 세포의 출연을 검사하고 세포유전학 및 분자유전학을 사용함으로써 수행된다. 아형(sybtype)은 예후, 요법에 대한 반응 및 치료 결정에 영향을 준다. 또한, 다른 혈액암 중 하나인 골수이형성 증후군(myelodysplastic syndromes, MDS)은 비효율적인 조혈, 말초-혈액 혈구감소, 및 급성 골수성 백혈병(AML)으로의 진행 증가 경향을 특징으로 하는 클론 조혈간세포 장애로, 혈액 및 골수암을 포함하는 일련의 증상이다. MDS에는 CML(chronic myeloid leukemia), PV(polycythemia vera), ET(essential thrombocythemia), PMF(primary myelofibrosis) 및 MPN-U(MPN-unclassifiable)이 포함된다. 또한, 다른 혈액암 중 하나인 골수증식성 종양(myeloproliferative neoplasm, MPN)은 적혈구, 혈소판 및 과립구의 전구체와 같은 골수내 신생물성 조혈 골수 전구체 세포로 부터 발생하는 혈액 종양이다. 종양 선조 세포의 증식은 질환에 따라 백혈구, 적혈구 및/또는 혈소판의 임의의 조합의 과잉 생산을 유발시킨다. 이러한 과잉생산된 세포는 또한 비정상적일 수 있어, 추가의 임상 합병증을 유발할 수 있다.
암과 같은 상태 및 질환들에 대한 생물학적 지표들은 생물학적 분자들 가령, 단백질들, 펩티드들, 지질들, RNAs, DNA 그리고 이의 변이 및 수정과 같은 것을 포함한다. 특이적 생물학적 지표들, 가령 DNA, RNA 및 단백질들의 확인은 이상 또는 질환들의 진단, 예후, 또는 치료진단(theranosis)에 이용되는 생체특징(biosignatures)을 제공할 수 있다.
한편, 호중구 젤라티나제 결합 리포칼린(Neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL)은 인간 호중구(neutrophil)의 과립으로부터 분리되어 그 특성이 분석된 당단백질로, 미생물, 특히 호중구의 탈과립 및 과립 단백질의 엑소사이토시스의 원인이 되는 화농성 박테리아에 침입할 때, 혈액으로부터 방출되는 호중구 활성화 표지로서 공개되었었다. 그 때문에 인간의 혈장 또는 혈청 시료에서 NGAL의 상승한 수치의 측정은 개체가 염증, 특히 박테리아 감염에 의한 염증을 앓고 있다는 것을 나타내는 것으로 믿어졌다 (Venge, 2000; 미국 특허 제6,136,526호; PCT 출원 제WO95/29404호). NGAL은 호중구 리포칼린 (NL; 인간 호중구 리포칼린의 경우에는 HNL), 리포칼린 2 (LCN2), 25 kDa 알파 2-마이크로글로불린 관련 단백질 (래트에서) 또는 24P3 (마우스에서)으로도 알려져 있으며, 래트에서 NGAL의 유전자가 neu (HER2/c-erbB-2) 발암 유전자 (Stoesz와 Gould, 1995)에 의해 개시된 유방암에서 과잉 발현되기 때문에, neu 관련 리포칼린 (NRL)으로도 지칭되어 왔다. NGAL은 다형핵 백혈구 과립으로부터 첫 번째 분리된 25 kDa 당단백질로 (Triebel 등, 1992; Kjeldsen 등, 1993), 이황가교를 함유하고 이량체 부분과 더 작은 삼량체 부분을 형성한다. NGAL은 또한 기질 금속 단백질 분해효소 9 (MMP-9, matrix metalloproteinase 9) 또는 젤라티나제 B로도 불리는 92 kDa 인간 호중구 타입 Ⅳ 콜라게나제와 결합하여, 단량체로서 식별가능한 115 kDa의 복합체를 형성하거나 (Monier 등, 2000; Yan 등, 2001) 이량체로서 식별가능한 125kDa의 복합체를 형성한다 (Yan 등, 2001). 이들 복합체는 전립선암, 방광암, 신장암 및 유방암을 포함하는 각종 암 환자의 소변에서 확인되었다. NGAL은 신장 손상의 바이오마커로서 역할을 하는 것으로 알려져 있으나, 최근 들어 세포 증식을 위한 철(iron)-반응성 유전자의 조절에 관여하고 허혈이나 조직손상과 같은 여러 병리적 상태에 반응하여 다른 조직에서도 발현되는 것으로 밝혀지고 있다.
본 발명의 목적은 혈액 종양 질환 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 혈액 종양 질환 진단용 키트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 혈액 종양 질환의 분류, 진단 또는 예후 판단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
아울러, 본 발명의 목적은 NGAL 유전자 발현 수준을 예측하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적의 달성을 위해, 본 발명은 혈액 종양 질환 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 혈액 종양 질환 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 혈액 종양 질환의 분류, 진단 또는 예후 판단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 NGAL 유전자 발현 수준을 예측하는 방법을 제공한다.
본 발명에서는 NGAL 유전자 발현과 다른 사이토카인(Cytokine) 유전자 발현의 관련성을 확인하였으며, 특히 발현에 영향을 미치는 사이토카인들의 발현 수준이 독립 변수로 들어간 NGAL 유전자 발현 수준을 나타내는 다중 회귀식을 유도하였고, NGAL 유전자 발현 수준과 특정 사이토카인 유전자들의 발현 수준이 각 혈액 종양 질환에 특이적인지 확인하였으므로, 이들을 혈액 종양 질환의 분류, 진단 또는 예후 판단 용도로 유용하게 활용할 수 있다.
도 1은 골수에서 TLR4의 유전자 발현 수준 및 STAT3의 유전자 발현 수준 사이의 산포도를 나타낸 도이다.
도 2는 골수성 혈액암 군들 및 대조군의 BM 단핵구(MNCs)에서 NGAL (A), STAT3 (B), IL5 (C) 및 TLR4 (D) 유전자의 발현 수준을 비교한 도이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명에서 용어, "대상체" 또는 "환자"는 인간, 유인원, 원숭이, 소, 개, 기니아 피그, 토끼, 닭, 곤충 등을 포함하여 치료가 요구되는 임의의 단일 개체를 의미한다. 또한, 임의의 질병 임상 소견을 보이지 않는 임상 연구 시험에 참여한 임의의 대상 또는 역학 연구에 참여한 대상 또는 대조군으로 사용된 대상이 대상에 포함된다.
본 발명에서 용어, "시료(샘플)"는 대상으로부터 얻은 생물학적 시료를 의미한다. 생물학적 시료의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성분; 대상의 세포일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
일 측면에서, 본 발명은 BCL2L1, CRP, CXCL2, Caspase-1, IL10, IL11, IL2, IL28A/B, IL29, IL3, IL5, IL6, IL7, INFB, IRAK4, IRF7, NF-kB, RAGE, STAT3, STAT4, TLR1, TLR2, TLR4 및 TLR5으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 mRNA 또는 단백질 수준에서 측정하는 제제를 포함하는, 혈액 종양 질환 진단용 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 혈액 종양 질환은 골수증식성 종양(myeloproliferative neoplasm, MPN), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia, AML) 또는 골수 이형성 증후군(myelodysplastic syndromes, MDS)일 수 있으며, 골수증식성 종양은 만성골수성백혈병(chronic myeloid leukemia, CML), 적혈구증가증(polycythemia vera, PV), 본태성혈소판증가증(essential thrombocythemia, ET), 원발골수섬유증(primary myelofibrosis, PMF) 또는 분류불능 골수 증식 종양(MPN-unclassifiable, MPN-U)일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 STAT3, IL5, TLR1, TLR2 및 IRAK4 유전자의 발현 수준을 mRNA 또는 단백질 수준에서 측정하는 제제를 포함할 수 있으며, TLR4, STAT3, IL5, TLR1, TLR2 및 IRAK4 유전자의 발현 수준을 mRNA 또는 단백질 수준에서 측정하는 제제를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, STAT3, IL5, TLR1, TLR2 및 IRAK4 유전자의 발현 수준을 하기 수학식 2에 대입하여 NGAL(neutrophil gelatinase-associated lipocalin) 유전자의 발현 수준을 예측할 수 있다:
[수학식 2]
NGAL 유전자 발현 수준=4316.825 + 9.056 × STAT3 유전자 발현 수준 + 844.226 × IL5 유전자 발현 수준 + 17.540 × TLR1 유전자 발현 수준 - 28.206 × TLR2 유전자 발현 수준 - 42.524 × IRAK4 유전자 발현 수준.
일 구현예에서, STAT3, IL5, TLR1, TLR2 및 IRAK4 유전자의 발현 수준을 하기 수학식 1에 대입하여 NGAL 유전자의 발현 수준을 예측할 수 있다:
[수학식 1]
NGAL 유전자 발현 수준=4165.283 + 7.676 × TLR4 유전자 발현 수준 + 882.859 × IL5 유전자 발현 수준 + 6.792 × STAT3 유전자 발현 수준 - 27.477 × TLR2 유전자 발현 수준 + 16.348 × TLR1 유전자 발현 수준 - 35.902 × IRAK4 유전자 발현 수준.
일 구현예에서, 유전자 발현 수준은 골수(bone marrow, BM)에서의 유전자 발현 수준일 수 있으며, 골수 흡인액(BM aspirates) 내의 단핵구(mononuclear cell, MNCs)에서의 유전자 발현 수준일 수 있다.
일 구현예에서, 유전자 발현 수준을 mRNA 수준에서 측정하는 제제는, 상기 마커의 핵산서열, 상기 핵산서열에 상보적인 핵산서열, 상기 핵산서열 및 상보적인 서열의 단편을 특이적으로 인식하는 프라미어 쌍, 프로브, 또는 프라이머 쌍 및 프로브일 수 있으며, 측정은 중합효소연쇄반응, 실시간 RT-PCR (Real-time RT-PCR), 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소연쇄반응(Competitive RT-PCR), Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, 핵산 마이크로어레이, 노던블랏 또는 DNA 칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법으로 수행될 수 있다.
일 구현예에서, 유전자 발현 수준을 단백질 수준에서 측정하는 제제는 상기 단백질 전장 또는 그 단편을 특이적으로 인식하는 항체, 항체단편, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 또는 펩티도모방체(peptidomimetics)일 수 있으며, 측정은 웨스턴블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 면역 전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 질량분석 또는 단백질 마이크로어레이로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법으로 수행될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "검출" 또는 "측정"은 검출 또는 측정된 대상의 농도를 정량하는 것을 의미한다.
본 발명에서 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기 (free 3 hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍 (base pair)를 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응 (즉, DNA 폴리머레이트 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다.
본 발명에서 용어, "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 상기 유전자와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 상기 유전자 발현 정도를 진단할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 통상의 기술분야에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있으므로 본 발명에서는 이에 대해 특별히 한정하지 않는다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포스소트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
본 발명에서, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시키는 적합한 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, NucleicAcidHybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHPO4, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate),1mM EDTA에서 65℃ 조건으로 혼성화하고, 0.1 x SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 또는, 고 엄격조건은 6 x SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 저 엄격조건은 예를 들어, 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다.
본 발명에서 용어, "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 유전자에서 발현되는 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 상기 항체의 제조방법은 널리 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함된다. 본발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 조성물을 포함하는 혈액 종양 질환 진단용 키트에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 키트는 대상체 또는 환자로부터 생체 시료를 수집하기 위한 도구 및/또는 시약 뿐 아니라 그 시료로부터 게놈 DNA, cDNA, RNA 또는 단백질을 준비하기 위한 도구 및/또는 시약을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 게놈 DNA의 관련 영역을 증폭하기 위한 PCR 프라이머를 포함할 수 있다. 상기 키트는 약리게놈학적 프로파일링에 유용한 유전 인자의 프로브를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 키트의 사용에 있어서, 표지화된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 분석 중 용이하게 동정할 수 있다.
본 발명에서, 사용된 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 키트는 DNA 중합효소 및 dNTP(dGTP, dCTP, dATP 및 dTTP), 형광물질 등의 표지 물질을 추가로 더 함유할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 (a) 검사 대상체로부터 분리한 골수 흡인액에서 단핵구를 분리하는 단계; (b) 단핵구에서 mRNA를 추출하는 단계; 및 (c) BCL2L1, CRP, CXCL2, Caspase-1, IL10, IL11, IL2, IL28A/B, IL29, IL3, IL5, IL6, IL7, INFB, IRAK4, IRF7, NF-kB, RAGE, STAT3, STAT4, TLR1, TLR2, TLR4 및 TLR5으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준(normalized count)을 측정하는 단계를 포함하는, 혈액 종양 질환의 분류, 진단 또는 예후 판단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 검사 대상체에서 TLR4 유전자의 발현 수준이 대조군에 비해 높은 경우 골수증식성 종양(myeloproliferative neoplasm, MPN)인 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 검사 대상체에서 TLR4 유전자의 발현 수준이 대조군에 비해 낮은 경우 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia, AML) 또는 골수 이형성 증후군(myelodysplastic syndromes, MDS)인 것으로 판단할 수 있다.
일 구현예에서, 검사 대상체에서 STAT3 유전자의 발현 수준이 대조군에 비해 높은 경우 골수증식성 종양(myeloproliferative neoplasm, MPN)인 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 검사 대상체에서 STAT3 유전자의 발현 수준이 대조군에 비해 낮은 경우 골수 이형성 증후군(myelodysplastic syndromes, MDS)인 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 검사 대상체에서 IL5 유전자의 발현 수준이 대조군에 비해 높은 경우 골수증식성 종양(myeloproliferative neoplasm, MPN)인 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 검사 대상체에서 IL5 유전자의 발현 수준이 대조군에 비해 낮은 경우 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia, AML) 또는 골수 이형성 증후군(myelodysplastic syndromes, MDS)인 것으로 판단할 수 있다.
일 구현예에서, (d) STAT3, IL5, TLR1, TLR2 및 IRAK4 유전자의 발현 수준을 하기 수학식 2에 대입하여 NGAL 유전자의 발현 수준을 예측하는 단계; 및 (e) NGAL 발현 수준이 대조군에 비해 높은 경우 골수증식성 종양(myeloproliferative neoplasm, MPN)인 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다:
[수학식 2]
NGAL 유전자 발현 수준=4316.825 + 9.056 × STAT3 유전자 발현 수준 + 844.226 × IL5 유전자 발현 수준 + 17.540 × TLR1 유전자 발현 수준 - 28.206 × TLR2 유전자 발현 수준 - 42.524 × IRAK4 유전자 발현 수준.
일 구현예에서, (d) TLR4, STAT3, IL5, TLR1, TLR2 및 IRAK4 유전자의 발현 수준을 하기 수학식 1에 대입하여 NGAL 유전자의 발현 수준을 예측하는 단계; 및 (e) NGAL 유전자 발현 수준이 대조군에 비해 높은 경우 골수증식성 종양(myeloproliferative neoplasm, MPN)인 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다:
[수학식 1]
NGAL 유전자 발현 수준=4165.283 + 7.676 × TLR4 유전자 발현 수준 + 882.859 × IL5 유전자 발현 수준 + 6.792 × STAT3 유전자 발현 수준 - 27.477 × TLR2 유전자 발현 수준 + 16.348 × TLR1 유전자 발현 수준 - 35.902 × IRAK4 유전자 발현 수준.
일 구현예에서, 상기에서 예측한 NGAL 유전자의 발현 수준이 대조군에 비해 낮은 경우 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia, AML) 또는 골수 이형성 증후군(myelodysplastic syndromes, MDS)인 것으로 판단할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 생물학적 시료에서 측정한 STAT3, IL5, TLR1, TLR2 및 IRAK4 유전자의 발현 수준을 하기 수학식 2에 대입하여 NGAL 유전자 발현 수준을 예측하는 방법에 관한 것이다:
[수학식 2]
NGAL 유전자 발현 수준=4316.825 + 9.056 × STAT3 유전자 발현 수준 + 844.226 × IL5 유전자 발현 수준 + 17.540 × TLR1 유전자 발현 수준 - 28.206 × TLR2 유전자 발현 수준 - 42.524 × IRAK4 유전자 발현 수준.
일 구현예에서, 상기 생물학적 시료는 골수일 수 있으며, 골수의 단핵구인 것이 더욱 바람직하다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 검체 수집 및 단핵구 분리
BM(bone marrow) 도말 검사 및 병리학적 검토 후 WHO 진단 기준에 따라 골수증식성 종양(myeloproliferative neoplasm, MPN) 질환군 n=20 (CML(chronic myeloid leukemia) n=8, PV(polycythemia vera) n=4, ET(essential thrombocythemia) n=4, PMF(primary myelofibrosis) n=3 및 MPN-U(MPN-unclassifiable) n=1), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia, AML) 질환군 n=12, 골수 이형성 증후군(myelodysplastic syndromes, MDS) 질환군 n=7 및 대조군 n=9으로 초기 진단된 평균 연령 62세 (22 내지 89세의 범위)인 48명의 환자로부터 골수 흡인액(BM aspirates)을 채취하여 EDTA를 포함하는 BD Vacutainer 튜브 (Becton Dickinson, Franklin, NJ, USA)에 넣고 2399 × g로 10분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후, SepMate 튜브 (STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada)에서 Lymphoprep를 이용하여, BM 조혈모 세포(hematopoietic cells)를 포함하는 BM 하청액(infranatant)에서 단핵구(mononuclear cell, MNCs)를 분리하였다. 구체적으로, Lymphoprep (밀도 구배 매질; 밀도: 1.077 g/mL; STEMCELL Technologies) 4.5 mL을 15 mL SepMate 튜브에 넣고 피펫팅한 뒤, 상기 BM 하청액을 동일 부피의 PBS와 혼합하여 수직으로 고정된 튜브의 측면 아래로 피펫팅하였다. 그 후 튜브를 1200 × g로 10분 동안 원심분리하고 MNCs를 포함하는 상청액을 새로운 튜브 (15-mL 코니칼 튜브; Becton Dickinson)로 옮겨 PBS를 추가해 최종 부피가 14.5 mL가 되도록 하였다. 300 × g로 8분 동안 원심분리하고 상청액을 조심스럽게 제거한 뒤, BM MNCs을 포함하는 하청액에 2 mL의 PBS를 첨가하였다. 용액을 잘 섞은 뒤, 1.5-mL 에펜도르프 튜브에 옮겨 400 × g로 5분 동안 원심분리하여 상청액을 제거하여 BM MNCs를 얻었다. 참고로, 상기 환자들의 기준 인구 통계학적 데이터 및 헤모글로빈 수준, 백혈구(white blood cell, WBC) 수, 호중구(neutrophil) 및 혈소판(platelet) 수를 포함하는 혈액학적 매개변수, 및 CRP(C-reactive protein) 수준에 대한 데이터는 의료 기록에서 수집하였으며, eGFR(estimated glomerular filtration rate)는 Chronic Kidney Disease Epidemiology Collaboration 방정식를 사용하여 계산하였다.
실시예 2. NGAL 및 48개 사이토카인 유전자의 발현 수준(normalized count) 확인
2-1. 단핵구에서 RNA 추출
상기 실시예 1에서 BM에서 분리한 단핵구에서 mRNA를 추출하고, Nanostring 기술을 이용하여 NGAL(neutrophil gelatinase-associated lipocalin) 및 48개 사이토카인 유전자의 발현 수준(normalized count)를 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 1에서 BM에서 분리한 단핵구 세포 펠릿에 Trizol (#79306-200mL; Qiagen, Valencia, CA, USA) 1 mL를 첨가하고, 볼텍싱한 뒤 20-24 ℃에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 그 뒤, 클로로포름 (#34854-1L; Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) 200 μL를 첨가하여 15초 동안 혼합하고 20-24 ℃에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 13,000 × g로 4 ℃에서 15분 동안 원심분리하고, 수상을 새로운 1.5-mL 튜브에 옮기고 동일한 부피의 아이소프로판올을 첨가하였다. 튜브를 4회 뒤집고, 20-24 ℃에서 10분 동안 인큐베이션한 뒤, 13,000 × g로 4 ℃에서 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 펠릿을 70% 에탄올 1 mL로 2회 세척하고 7,500 × g로 4 ℃에서 5분 동안 원심분리하여 RNA 펠릿을 얻었다. RNA 펠릿을 기건한 뒤 10-20 μL의 RNase-프리 증류수에 재현탁하여 새 1.5-mL 튜브로 옮기고 RNA의 품질을 2100 Bioanalyzer capillary electrophoresis system (Agilent Technologies, Santa Clara, CA)를 이용하여 측정하였다.
2-2. mRNA 발현 분석
추출한 RNA에서 mRNA의 발현을 nCounter Analysis System (NanoString Technologies Inc., Seattle, WA, USA)을 이용하여 분석하였으며, 유전자 BAX(bcl-2-associated X protein), BCL2L1(bcl-2-like 1), CASP8, CRP, CXCL1, CXCL10, CXCL2, CASPASE-1, ELK1(ETS like transcription factor-1), FOS, IL10, IL11, IL18, IL1A, IL1B, IL1R1, IL1R2, IL2, IL28A/B, IL29, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, INFB, IRAK1, IRAK2, IRAK4, IRF7(interferon regulatory factor 7), MyD88, NF-κB, NFKB1A, NGAL, NLRP3, RAGE, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TNF, TRAF3 및 TRAF6를 포함하는 사이토카인 패널을 사용하였다. 구체적으로, RNA (5 μL; 100-300 ng), Master Mix (8 μL; 리포터(reporter) CodeSet 및 혼성화 버퍼) 및 capture probeSet (2 μL)를 포함하는 반응 혼합물을 준비하고, 이 용액을 혼합한 뒤 스핀다운하여 65 ℃의 thermocycler (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA)에서 16시간 (최대 혼성화, 48 h) 동안 인큐베이션하였다. 그 후 시료를 준비된 nCounter Master Kit 및 카트리지와 함께 준비 스테이션(prep station) (NanoString Technologies, Inc.)으로 옮기고, 시료를 카트리지에 결합시킨 뒤, 12 레인/run의 nCounter 준비 스테이션을 약 2.53 h 동안 실행하였다. 카트리지를 Digital Analyzer (NanoString Technologies Inc.)로 옮기고 555 관측 시야(fields of view)에서 스캔하였다. 데이터의 품질을 (i) 이미징 QC: 관측 시야75%; (ii) 결합 밀도(Binding Density) QC: 0.1<결합 밀도<2.25; (iii) 양성 대조군 선형성(Positive Control Linearity) QC: R2>0.95; (iv) 검출한계(Limit of Detection) QC: 0.5 fM 양성 대조군 프로브>2 음성 대조군의 표준편차로 체크하였다. 데이터는 Codeset의 대조군 프로브를 이용하여 정규화되었고, 정규화된 NGAL 및 48개의 사이토카인 유전자의 발현 수준을 통계 분석에 사용하였다. 정량적 데이터는 중앙값으로 표시하였으며, 데이터가 정규 분포를 따르는지 확인하기 위해, Shapiro-Wilk 검정을 사용하였다. 또한, 환자 인구 통계학적 특징 및 실험실 매개변수의 통계 분석을 위해, 모수적(parametric) 또는 비-모수적 검정을 수행하여 신뢰할 수 있는 통계적 결과를 얻었으며, 정규성(normality)이 유효하지 않은(untenable) 시료 데이터에 대해서는 Kruskal-Wallis H 검정이 수행되었다. 즉, 연령(Age) 및 Hb(hemoglobin) 변수에 대해, one-way ANOVA 검증을 수행하였으며, WBC 수, 호중구 수, 혈소판 치, CRP, eGFR 및 NGAL 유전자 발현 수준(normalized count) 변수에 대해서는 Kruskal-Wallis H-검정이 수행되었다. 분석 결과, 환자의 인구 통계학적 특징 및 실험실 매개 변수에서 6개의 변수가 MPN 군, AML 군, MDS 군 및 대조군의 4개의 군 사이에서 유의한 차이를 나타냈으며 (표 1의 볼드체), 상기 4개의 군에서 6개의 수치 변수를 쌍대비교(pairwise comparisons)하기 위해, Scheffe's post-hoc 검정 또는 Dunn's 쌍대 검정을 적용하였다.
MPN (n=20) AML (n=12) MDS (n=7) Control
(n=9)		 p-value*
Gender 10 males10 females 11 males
1 females		 2 males
5 females		 8 males
1 females
Age 55 (39, 63) 59
(43, 72)		 70
(59, 81)		 63
(47, 66)		 0.335
Hb (g/L) 124 (105, 144) 79
(69, 83)		 86
(66, 93)		 135
(131, 146)		 <0.0001
WBC count (10 9 /L) 19.31
(10.45, 107.23)		 3.37
(2.36, 9.61)		 2.38
(1.61, 3.12)		 6.22
(4.32, 7.30)		 <0.0001
Neutrophil count (10 9 /L) 14.43 (7.49, 68.80) 0.74
(0.23, 1.65)		 0.50
(0.43, 1.09)		 3.78
(2.55, 4.31)		 <0.0001
Platelet count (10 9 /L) 620 (404, 849) 49
(24, 116)		 78
(52, 127)		 255
(209, 300)		 <0.0001
CRP (mg/dL) 0.100 (0.030, 0.465) 8.390
(1.202, 12.255)		 0.400
(0.324, 0.845)		 0.080
(0.058, 0.161)		 0.001
eGFR|| (mL/min/1.73 m2) 94.50(79.81, 109.68) 86.72
(69.36, 94.50)		 80.95
(66.37, 99.18)		 92.15
(85.24, 102.29)		 0.453
NGAL gene normalized counts 40032.64(18328.19, 79735.56) 211.72 (25.07, 3631.79) 1638.79 (1129.19, 4946.41) 13965.96 (11045.95, 44238.40) <0.0001
Variable Comparison groups p-value*
Hb MPN vs. AML <0.0001
MPN vs. MDS 0.002
AML vs. Control <0.0001
MDS vs. Control 0.001
WBC count MPN vs. MDS <0.0001
Neutrophil count MPN vs. AML <0.0001
MPN vs. MDS <0.0001
Platelet count MPN vs. AML <0.0001
MPN vs. MDS 0.001
CRP MPN vs. AML 0.002
AML vs. Control 0.003
NGAL normalized counts MPN vs. AML <0.0001
MPN vs. MDS 0.001
AML vs. Control 0.005
그 결과, AML 및 MDS 군은 대조군보다 현저히 낮은 Hb 수준을 나타냈고, Hb, 호중구 수, 혈소판 수 및 NGAL 유전자 발현 수준이 MPN 군보다 AML 군 및 MDS 군에서 유의하게 낮은 것으로 나타났다 (표 1 및 2).
실시예 3. 데이터 분석
3-1. 단순 회귀 분석
NGAL 유전자 발현 수준 및 48개 사이토카인의 유전자 발현 수준 사이의 관계를 분석하기 위해, 전체 환자군 (n=48)을 대상으로 단순 회귀 분석(simple regression analysis)을 시행하였다.
Figure pat00001
† 조정된 알파(Adjusted alpha)는 0.026로 결정됨; ‡ 발현 수준(normalized count)은 중앙값(median [quartile1 (Q1), Q3] values)으로 표시됨; * 다중 회귀 모델에서 독립 변수로 사용됨; 및 P-values > 0.05는 볼드체로 표시함.
그 결과, BM MNCs (n=48)에서 NGAL [median (Q1, Q3)]의 발현 수준은 11978.32 (2106.77, 41460.04)였으며, 단순 회귀 분석을 통해 NGAL 발현 수준의 중요한 예측 변수로서 48개의 사이토카인 유전자들 중 통계적으로 유의한 26개의 사이토카인 유전자의 발현 수준(normalized count)을 도출하였다 (표 3).
3-2. 다중 회귀 분석 및 최적 다중 회귀 모델 도출
NGAL 유전자 수(gene counts)와 통계적으로 유의한 것으로 나타난 사이토카인의 유전자 발현 수준 간의 관계를 동시에 분석하기 위해, 상기 실시예 3-1의 단순 회귀 분석에서 확인된 26개의 유의한 예측 변수 (26개의 사이토카인 유전자의 발현 수준)를 독립 변수로 사용하고, NGAL 발현 수준을 종속 변수로 사용하여 다중 회귀분석을 시행하였다. 또한, 다중 회귀 분석에서 밀접하게 관련된 독립 변수를 식별하기 위해, 다중 공선성 분석을 진행하여 독립 변수가 VIF(variance influence factor) 값>10이면 다중 공선성을 가지는 것으로 간주함으로써 공선성을 보이는 변수는 제외하고 최적의 다중 회귀 모델을 도출하였다. 다중 회귀 모델의 예측 정확도는 AIC(Akaike's information criterion) 및 조정된 R2 값을 이용하여 평가되었다. 통계적 유의성은 p<0.05로 설정되었으며, 통계 분석은 SPSS version v25.0 (IBM SPSS Statistics, Armonk, NY, USA)를 이용하여 수행되었다.
Coefficient t-value P-value† VIF Adj R 2 AIC
Model 1
Constant 4165.283 1.718 0.093 0.936 885.642
TLR4 7.676 1.602 0.117 17.277
IL5 882.859 3.769 0.001 1.374
STAT3 6.792 4.532 <0.001 22.683
TLR2 -27.477 -5.789 <0.001 5.534
TLR1 16.348 4.567 <0.001 8.671
IRAK4 -35.902 -4.424 <0.001 4.539
Model 2
Constant 4316.825 1.749 0.088 0.933 886.557
IL5 844.226 3.558 0.001 1.359
STAT3 9.056 17.792 <0.001 2.522
TLR2 -28.206 -5.862 <0.001 5.484
TLR1 17.540 4.919 <0.001 8.296
IRAK4 -42.524 -5.979 <0.001 3.362
†통계적 유의성 (P<0.05)
그 결과, 하기의 모델 1 (수학식 1) 및 모델 2 (수학식 2)의 두 개의 다중 회귀 분석 모델이 개발되었다 (표 4). AIC 값은 모델 2보다 모델 1이 낮고, 수정된 R 2 값은 모델 1이 모델 2보다 높아, NGAL 발현 수준 예측 정확도가 모델 1이 모델 2보다 다소 높은 것으로 나타났으나 (표 4), 다중 회귀 분석에서 모델 1의 두 독립 변수인 TLR4 (VIF=17.277) 및 STAT3 (VIF=22.683) 간에 다중 공선성을 보여 (표 4), 예측 변수에서 TLR4를 제외한 모델 2가 모델 1보다 NGAL의 발현 수준을 예측하는데 더욱 적합하다고 판단하였다. 또한, TLR4 및 STAT3의 발현 수준이 다중 공선성을 나타내므로, 이들의 발현 수준 사이에 산포도(scatter plot)가 생성되었으며 (도 1), 이를 단순 회귀 분석을 통해 BM에서 두 변수 간의 관계를 추가로 분석한 결과, 하기 수학식 3의 관계를 나타냈다.
Figure pat00002
Figure pat00003
Figure pat00004
실시예 4. 혈액 종양 질환에서 NGAL 및 사이토카인의 발현 수준 분석
각 혈액 종양 질환 (MPN, AML 및 MDS) 및 대조군 별 NGAL 발현 수준과 다중 회귀 모델에 포함된 사이토카인 (STAT3, IL5 및 TLR4)의 발현 수준의 분포를 분석하였다.
그 결과, 대조군에서 NGAL 발현 수준의 중앙값(median (Q1, Q3))은 13965.96 (11045.95, 44238.40)로 나타났고, MPN 군 (n=20)에서 가장 높게 나타났다 [40032.64 (18328.19, 79735.56)]. MPN 군은 AML 및 MDS 군에 비해 통계적으로 더 높은 NGAL 발현 수준을 나타냈으며, AML은 가장 낮은 NGAL 발현 수준 [211.72 (25.07, 3631.79)]을 나타냈고, 이는 대조군보다도 통계적으로 유의하게 낮았다 (도 2A). 또한, 대조군에서 STAT3 발현 수준의 중앙값(median (Q1, Q3))은 1506.65 (882.89, 3092.34)로 나타났고, MPN 군 (n=20)에서 가장 높은 값을 나타냈다 [4087.45 (1982.02, 8171.37)]. MPN 군은 MDS 군보다 통계적으로 더 높은 STAT3 발현 수준을 나타냈으며, MDS 군은 가장 낮은 STAT3 발현 수준 [982.35 (489.12, 2499.36)]을 나타냈다 (도 2B). 또한, 대조군에서 IL5 발현 수준의 중앙값은 5.57 (1.52, 11.02)로 나타났고, MPN은 가장 높은 IL5 발현 수준 [7.25 (3.80, 11.96)]을 나타냈다. MPN 군은 AML 군보다 통계적으로 더 높은 IL5 발현 수준을 나타냈으며, AML군에서 IL5 발현 수준 [1.69 (1.04, 4.57)]이 가장 낮게 나타났다 (도 2C). 아울러, 대조군에서 TLR4 발현 수준의 중앙값은 477.72 (270.69, 566.27)로 나타났고, MPN 군이 가장 높은 TLR4 발현 수준을 나타냈다 [1138.15 (393.43, 2012.43)]. MPN 군은 AML 및 MDS 군에 비해 통계적으로 더 높은 TLR4 발현 수준을 나타냈으며, MDS 군이 가장 낮은 TLR4 발현 수준 [127.36 (82.84, 417.55)]을 나타냈다 (도 2D).
이를 통해, 골수성 혈액암(myeloid malignancy)의 진단에 있어 상호작용에 관여하는 HSCs(hematopoietic stem cells) 및 MSCs(mesenchymal stromal cells)를 포함하는 MNCs에서 사이토카인의 연관성을 확인할 수 있었으며, 특히, STAT3, TLR4, IL5, TLR1 및 TLR2와 같은 사이토카인 유전자와 NGAL의 연관성을 확인할 수 있었다.

Claims (18)

  1. BCL2L1, CRP, CXCL2, Caspase-1, IL10, IL11, IL2, IL28A/B, IL29, IL3, IL5, IL6, IL7, INFB, IRAK4, IRF7, NF-kB, RAGE, STAT3, STAT4, TLR1, TLR2, TLR4 및 TLR5으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 mRNA 또는 단백질 수준에서 측정하는 제제를 포함하는, 혈액 종양 질환 진단용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 혈액 종양 질환은 골수증식성 종양(myeloproliferative neoplasm, MPN), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia, AML) 또는 골수 이형성 증후군(myelodysplastic syndromes, MDS)인, 혈액 종양 질환 진단용 조성물.
  3. 제 2항에 있어서, 골수증식성 종양은 만성골수성백혈병(chronic myeloid leukemia, CML), 적혈구증가증(polycythemia vera, PV), 본태성혈소판증가증(essential thrombocythemia, ET), 원발골수섬유증(primary myelofibrosis, PMF) 또는 분류불능 골수 증식 종양(MPN-unclassifiable, MPN-U)인, 혈액 종양 질환 진단용 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, STAT3, IL5, TLR1, TLR2 및 IRAK4 유전자의 발현 수준을 mRNA 또는 단백질 수준에서 측정하는 제제를 포함하는, 혈액 종양 질환 진단용 조성물.
  5. 제 4항에 있어서, STAT3, IL5, TLR1, TLR2 및 IRAK4 유전자의 발현 수준을 하기 수학식 2에 대입하여 NGAL(neutrophil gelatinase-associated lipocalin) 유전자의 발현 수준을 예측하는, 혈액 종양 질환 진단용 조성물:
    [수학식 2]
    NGAL 유전자 발현 수준=4316.825 + 9.056 × STAT3 유전자 발현 수준 + 844.226 × IL5 유전자 발현 수준 + 17.540 × TLR1 유전자 발현 수준 - 28.206 × TLR2 유전자 발현 수준 - 42.524 × IRAK4 유전자 발현 수준.
  6. 제 1항에 있어서, TLR4, STAT3, IL5, TLR1, TLR2 및 IRAK4 유전자의 발현 수준을 mRNA 또는 단백질 수준에서 측정하는 제제를 포함하는, 혈액 종양 질환 진단용 조성물.
  7. 제 6항에 있어서, STAT3, IL5, TLR1, TLR2 및 IRAK4 유전자의 발현 수준을 하기 수학식 1에 대입하여 NGAL 유전자의 발현 수준을 예측하는, 혈액 종양 질환 진단용 조성물:
    [수학식 1]
    NGAL 유전자 발현 수준=4165.283 + 7.676 × TLR4 유전자 발현 수준 + 882.859 × IL5 유전자 발현 수준 + 6.792 × STAT3 유전자 발현 수준 - 27.477 × TLR2 유전자 발현 수준 + 16.348 × TLR1 유전자 발현 수준 - 35.902 × IRAK4 유전자 발현 수준.
  8. 제 1항에 있어서, 골수(bone marrow, BM)에서의 유전자 발현 수준인, 혈액 종양 질환 진단용 조성물.
  9. 제 1항에 있어서, 골수 흡인액(BM aspirates) 내의 단핵구(mononuclear cell, MNCs)에서의 유전자 발현 수준인, 혈액 종양 질환 진단용 조성물.
  10. 제 1항의 조성물을 포함하는 혈액 종양 질환 진단용 키트.
  11. (a) 검사 대상체로부터 분리한 골수 흡인액에서 단핵구를 분리하는 단계;
    (b) 단핵구에서 mRNA를 추출하는 단계; 및
    (c) BCL2L1, CRP, CXCL2, Caspase-1, IL10, IL11, IL2, IL28A/B, IL29, IL3, IL5, IL6, IL7, INFB, IRAK4, IRF7, NF-kB, RAGE, STAT3, STAT4, TLR1, TLR2, TLR4 및 TLR5으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준(normalized count)을 측정하는 단계를 포함하는, 혈액 종양 질환의 분류, 진단 또는 예후 판단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 검사 대상체에서 TLR4 유전자의 발현 수준이 대조군에 비해 높은 경우 골수증식성 종양(myeloproliferative neoplasm, MPN)인 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는, 혈액 종양 질환의 분류, 진단 또는 예후 판단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  13. 제 11항에 있어서, 검사 대상체에서 STAT3 유전자의 발현 수준이 대조군에 비해 높은 경우 골수증식성 종양(myeloproliferative neoplasm, MPN)인 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는, 혈액 종양 질환의 분류, 진단 또는 예후 판단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  14. 제 11항에 있어서, 검사 대상체에서 STAT3 유전자의 발현 수준이 대조군에 비해 낮은 경우 골수 이형성 증후군(myelodysplastic syndromes, MDS)인 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는, 혈액 종양 질환의 분류, 진단 또는 예후 판단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  15. 제 11항에 있어서, 검사 대상체에서 IL5 유전자의 발현 수준이 대조군에 비해 높은 경우 골수증식성 종양(myeloproliferative neoplasm, MPN)인 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는, 혈액 종양 질환의 분류, 진단 또는 예후 판단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  16. 제 11항에 있어서, (d) STAT3, IL5, TLR1, TLR2 및 IRAK4 유전자의 발현 수준을 하기 수학식 2에 대입하여 NGAL 유전자의 발현 수준을 예측하는 단계; 및 (e) NGAL 발현 수준이 대조군에 비해 높은 경우 골수증식성 종양(myeloproliferative neoplasm, MPN)인 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는, 혈액 종양 질환의 분류, 진단 또는 예후 판단에 필요한 정보를 제공하는 방법:
    [수학식 2]
    NGAL 유전자 발현 수준=4316.825 + 9.056 × STAT3 유전자 발현 수준 + 844.226 × IL5 유전자 발현 수준 + 17.540 × TLR1 유전자 발현 수준 - 28.206 × TLR2 유전자 발현 수준 - 42.524 × IRAK4 유전자 발현 수준.
  17. 제 11항에 있어서, (d) TLR4, STAT3, IL5, TLR1, TLR2 및 IRAK4 유전자의 발현 수준을 하기 수학식 1에 대입하여 NGAL 유전자의 발현 수준을 예측하는 단계; 및 (e) NGAL 발현 수준이 대조군에 비해 높은 경우 골수증식성 종양(myeloproliferative neoplasm, MPN)인 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는, 혈액 종양 질환의 분류, 진단 또는 예후 판단에 필요한 정보를 제공하는 방법:
    [수학식 1]
    NGAL 유전자 발현 수준=4165.283 + 7.676 × TLR4 유전자 발현 수준 + 882.859 × IL5 유전자 발현 수준 + 6.792 × STAT3 유전자 발현 수준 - 27.477 × TLR2 유전자 발현 수준 + 16.348 × TLR1 유전자 발현 수준 - 35.902 × IRAK4 유전자 발현 수준.
  18. 생물학적 시료에서 측정한 STAT3, IL5, TLR1, TLR2 및 IRAK4 유전자의 발현 수준을 하기 수학식 2에 대입하여 NGAL 유전자 발현 수준을 예측하는 방법:
    [수학식 2]
    NGAL 유전자 발현 수준=4316.825 + 9.056 × STAT3 유전자 발현 수준 + 844.226 × IL5 유전자 발현 수준 + 17.540 × TLR1 유전자 발현 수준 - 28.206 × TLR2 유전자 발현 수준 - 42.524 × IRAK4 유전자 발현 수준.
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