KR102569513B1 - 췌장암 진단 또는 예후 예측용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 출원은 췌장암 진단 또는 예후 예측용 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로서, 일 예에 따른 방법 또는 조성물은 간단히, 높은 정확도로 췌장암을 조기에 진단하고, 췌장암의 예후를 정확히 판단할 수 있다.

Description

췌장암 진단 또는 예후 예측용 조성물 및 이의 용도{Composition for diagnosing pancreatic cancer or predicting prognosis and use thereof}

본 출원은 췌장암 진단 또는 예후 예측용 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.

바이오마커(Biomarker)란 외부적인 영향으로 인해 생명체 내부에서 유발된 변화를 알아낼 수 있는 지표를 의미하며, 암, 신경계 질환 등 각종 질병을 진단하거나 특정 치료제의 효능을 예측하기 위한 용도로 연구가 활발히 진행되고 있다

한편, 췌장(Pancreas)은 위장의 뒤쪽에 위치한 20cm 정도의 길이의 소화액과 호르몬을 분비하는 장기로서, 일반적으로 췌장암이라고 하면 췌관암을 의미하는 것일 수 있다. 췌장암은 서양식 식사가 보편화되면서 점차 증가추세이며, 주로 남자에게서 많이 발생하는 것으로 알려져 있고, 사망률이 높다. 췌장암은 초기에는 증상이 잘 나타나지 않아 조기발견이 어렵고, 흡연, 커피, 음주, 육식위주의 식사습관, 당뇨, 만성 췌장염, 비용종성 대장암 증후군 등의 병력과 베타나프틸아민(Beta-naphthylamine), 벤지딘(Benzidine) 등의 물질이 원인으로 알려져 있다.

췌장암은 초기에는 별로 증세를 느끼지 않으며, 이미 전신전이가 일어난 후에 통증과 체중 감소 등의 증세가 나타나는 것이 보통이어서, 사망률이 매우 높다.

따라서, 췌장암의 조기 진단 뿐만 아니라 예후 예측법의 개발이 요구된다.

대한민국 공개특허 제10-2020-0090404호

일 예는 CD24 (cluster of differentiation 24), CD44 (cluster of differentiation 44), SLC16A1 (solute carrier family 16 member 1), 및 이들의 암호화 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 췌장암 진단 또는 예후 예측을 위한 바이오마커를 제공한다.

다른 예는 CD24 (cluster of differentiation 24), CD44 (cluster of differentiation 44), SLC16A1 (solute carrier family 16 member 1), 및 이들의 암호화 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 검출 가능한 제제를 포함하는, 췌장암 진단 또는 예후 예측용 조성물 또는 췌장암 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공한다.

다른 예는 대상으로부터 분리된 생물학적 시료에서 CD24 (cluster of differentiation 24), CD44 (cluster of differentiation 44), SLC16A1 (solute carrier family 16 member 1), 및 이들의 암호화 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 검출하는 단계를 포함하는, 췌장암 진단, 예후 예측 방법이나 췌장암 진단 또는 예후를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 상기 검출하는 단계는 생물학적 시료에서 시료에서 CD24 (cluster of differentiation 24), CD44 (cluster of differentiation 44), SLC16A1 (solute carrier family 16 member 1), 및 이들의 암호화 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 존재 여부, 양성 여부, 및/또는 수준을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.

이하, 보다 상세히 설명한다:

췌장암 진단 또는 예후

본 명세서에서, "췌장암"은 췌장에 생기는 종양을 총칭하는 것으로, 장액성 낭성 종양, 점액성 낭성 종양, 췌관내 유두상 점액 종양, 고형 유두상 종양, 림프 상피성 낭종, 낭종성 기형종 등의 낭성 종양 (물혹)과 같은 양성 종양, 및 췌관 선암종, 선방세포 암종, 신경내분비 종양 등의 악성 종양 등을 예시할 수 있다. 본 명세서에서 제공되는 바이오마커에 의하여 진단 가능한 췌장암은 상기한 췌장암 중에서 선택될 수 있고, 예컨대, 악성 종양 중에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서, ‘진단’은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것으로서, 특정 질병 또는 질환 (예를 들면, 췌장암)에 대한 치료 효과를 확인하는 것, 특정 질병 또는 질환에 대한 대상체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 대상체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics) (예를 들면, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 대상체 (개체)의 상태를 모니터링 하는 것) 등을 의미할 수 있다.

본 명세서에서, '예후'란 췌장암의 재발, 전이성 확산이나 약물 내성을 비롯한 암-기인성 사망, 및/또는 진행의 가능성 등의 병의 경과 및 완치 여부를 의미할 수 있다.

본 명세서에서, 췌장암의 진단 또는 예후 예측은 대상 (대상체, 개체, subject)에서의 상기한 췌장암의 발병 여부, 발병 가능성 (위험성), 췌장암 조직 성장 가능성 (또는 조직 성장능, 췌장암 세포 수 증가, 췌장암 조직 크기 증가), 및/또는 췌장암의 전이 가능성 (또는 전이능)을 확인하는 것을 의미할 수 있다.

췌장암 진단을 위한 바이오마커

본 명세서에서, 췌장암 진단을 위한 바이오마커로서, CD24 (cluster of differentiation 24), CD44 (cluster of differentiation 44), SLC16A1 (solute carrier family 16 member 1), 또는 이들의 조합이 제공된다. 본 명세서에 기재된 바이오마커는 단백질 및/또는 이를 암호화하는 유전자를 의미할 수 있다.

일 예에 따른 방법이, 상기 CD24, CD44, SLC16A1 모두를 췌장암 진단 또는 예후 예측을 위한 바이오마커로 사용하면, 췌장암 진단의 정확도가 높아지고, 췌장암의 전이 가능성 (예를 들면, 췌장암이 전이될 가능성, 췌장암 세포 및/또는 조직의 전이능, 침윤능, 또는 침습능), 췌장암 조직 성장 가능성 (예를 들면, 췌장에서 발생한 췌장암 세포의 수 및/또는 종양 조직의 크기가 증가)에 대한 정보를 제공할수 있고/있거나 췌장암 환자의 예후 (예를 들면, 생존율)을 예측할 수 있어, 췌장암 치료 전략에 중요한 정보를 제공할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 췌장암 진단을 위한 바이오마커는 CD24 (cluster of differentiation 24), CD44 (cluster of differentiation 44), SLC16A1 (solute carrier family 16 member 1)일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 췌장암 진단을 위한 바이오마커는 시료에서 CD24 (cluster of differentiation 24), CD44 (cluster of differentiation 44), 및/또는 SLC16A1 (solute carrier family 16 member 1)의 조합 (예를 들면, CD24, CD44, SLC16A1 모두)일 수 있다.

상기 “CD24 (cluster of differentiation 24)”는 Homo sapiens의 6번 염색체에 존재하는 유전자에 의해 암호화될 수 있고, 대부분의 B 림프구와 분화 신경 아세포 및 호중구 등에서 발현되고 리코실 포스파티딜 이노시톨 (GPI) 링크를 통해 세포 표면에 고정될 수 있다.

상기 “CD44 (cluster of differentiation 44)”는 Homo sapiens의 11 번 염색체에 존재하는 유전자에 의해 암호화될 수 있고, 많은 포유류 세포 유형에서 세포 표면에 발현이 되어 히알루론산(hyaluronic acid)의 수용체로 작용할 수 있다.

상기 “SLC16A1 (solute carrier family 16 member 1)”은 Homo sapiens의 1번 염색체에 존재하는 유전자에 의해 암호화될 수 있고, 발현시 MCT1 (Monocarboxylate transporter 1)으로 불리며 세포 외 기질에 개방 된 기질 결합 부위를 가지고 있어 lactate uptake에 관여할 수 있다.

일 예에 따른 바이오마커는 하기 표 1의 서열을 포함하거나 서열로 이루어지는 것일 수 있고, 하기 표 1의 서열을 포함하거나 이루어진 단백질을 암호화하는 유전자일 수 있다.

마커	유전자 Accession No.	단백질 Accession No.	아미노산 서열 (N→C)	서열번호
CD24	NM_001291737.1	NP_001278666.1	1 mgramvarlg lgllllalll ptqiyssett tgtssnssqs tsnsglapnp tnattkaagg 61 alqstaslfv vslsllhlys	1
CD44	NM_000610.4	NP_000601.3	1 mdkfwwhaaw glclvplsla qidlnitcrf agvfhvekng rysisrteaa dlckafnstl 61 ptmaqmekal sigfetcryg fieghvvipr ihpnsicaan ntgvyiltsn tsqydtycfn 121 asappeedct svtdlpnafd gpititivnr dgtryvqkge yrtnpediyp snptdddvss 181 gssserssts ggyifytfst vhpipdedsp witdstdrip attlmstsat atetatkrqe 241 twdwfswlfl psesknhlht ttqmagtssn tisagwepne enederdrhl sfsgsgiddd 301 edfisstist tprafdhtkq nqdwtqwnps hsnpevllqt ttrmtdvdrn gttayegnwn 361 peahpplihh ehheeeetph ststiqatps stteetatqk eqwfgnrwhe gyrqtpkeds 421 hsttgtaaas ahtshpmqgr ttpspedssw tdffnpishp mgrghqagrr mdmdsshsit 481 lqptanpntg lvedldrtgp lsmttqqsns qsfstshegl eedkdhptts tltssnrndv 541 tggrrdpnhs egsttllegy tshyphtkes rtfipvtsak tgsfgvtavt vgdsnsnvnr 601 slsgdqdtfh psggshtthg sesdghshgs qegganttsg pirtpqipew liilasllal 661 alilavciav nsrrrcgqkk klvinsgnga vedrkpsgln geasksqemv hlvnkesset 721 pdqfmtadet rnlqnvdmki gv	2
MCT1	NM_001166496.2	NP_001159968.1	1 mppavggpvg ytppdggwgw avvigafisi gfsyafpksi tvffkeiegi fhattsevsw 61 issimlavmy gggpissilv nkygsrivmi vggclsgcgl iaasfcntvq qlyvcigvig 121 glglafnlnp altmigkyfy krrplangla magspvflct laplnqvffg ifgwrgsfli 181 lgglllnccv agalmrpigp kptkagkdks kaslekagks gvkkdlhdan tdligrhpkq 241 ekrsvfqtin qfldltlfth rgfllylsgn vimffglfap lvflssygks qhysseksaf 301 llsilafvdm varpsmglva ntkpirpriq yffaasvvan gvchmlapls ttyvgfcvya 361 gffgfafgwl ssvlfetlmd lvgpqrfssa vglvtivecc pvllgppllg rlndmygdyk 421 ytywacgvvl iisgiylfig mginyrllak eqkaneqkke skeeetsidv agkpnevtka 481 aespdqkdtd ggpkeeespv	3

췌장암 진단 또는 예후 예측 방법

본 명세서에서 제공되는 췌장암 진단 또는 예후 예측 방법 (또는 진단 또는 예후 예측에 정보를 제공하는 방법)의 일 양상은

대상으로부터 분리된 생물학적 시료에서 CD24 (cluster of differentiation 24), CD44 (cluster of differentiation 44), SLC16A1 (solute carrier family 16 member 1), 및 이들을 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 검출하는 단계를 포함하는 췌장암 진단 또는 예후를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공할 수 있다. 상기 “이들의 암호화 유전자”는 CD24를 암호화하는 유전자, CD44를 암호화하는 유전자, 및/또는 SLC16A1을 암호화하는 유전자를 의미할 수 있다.

일 예에 따른 췌장암 진단 또는 예후를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법은 상기 단계에서 측정된 CD24, CD44, SLC16A1, 및 이들을 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 방법에 있어서, 상기 바이오마커를 검출하는 단계는 상기 시료 내의 바이오마커의 존재 여부 확인, 바이오마커의 수준 (농도) 측정, 또는 이들 모두를 수행하는 단계일 수 있다. 일 예에서 상기 바이오마커를 검출하는 단계는 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 노던 블롯팅(northern blotting) 웨스턴 블롯팅(western blotting), 방사선면역분석법(radioimmunoassay; RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation), 유세포분석법(flow cytometry), 면역형광염색법(immunofluorescence), 오우크테로니(ouchterlony), 보체 고정 분석법(complement fixation assay), 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.

본 명세서에서, "생물학적 시료" 또는 "시료"는 혈액 및 생물학적 기원의 기타 액상 시료, 생검 표본, 조직 배양과 같은 고형 조직 시료, 및/또는 이로부터 유래된 세포를 의미할 수 있고, 개체 (예를 들면, 암 질환이 있는 개체 및/또는 췌장암 발명 가능성이 있는 개체)로부터 분리된 것일 수 있다. 생물학적 시료는 예를 들면 조직, 추출물, 세포 용해물, 전혈, 혈장, 혈청, 침, 안구액, 뇌척수액, 땀, 분뇨, 분, 뇨, 젖, 복수액, 활액, 복막액 등일 수 있다. 일 예에서, 상기 생물학적 시료는 췌장 조직, 췌장 세포, 및/또는 상기 세포의 배양액일 수 있다. 일 예에서, 상기 생물학적 시료는 동물, 예를 들면, 포유동물, 또는 인간으로부터 수득될 수 있고, 예를 들면 상기 생물학적 시료는 췌장암 환자로부터 분리된 것일 수 있다. 상기 생물학적 시료는 검출하는 단계 전에 전처리될 수 있고, 예를 들면, 균질화 (homogenization), 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등의 전처리 단계를 수행할 수 있다.

상기 대상 (개체, 대상체)은 췌장암 질환이 의심되는 개체 및/또는 췌장암 질환을 갖는 개체일 수 있다.

일 예에서, 상기 대상 및/또는 상기 대상으로부터 분리된 생물학적 시료는 CD24 단백질, CD44 단백질, SLC16A1 단백질 및/또는 이들의 암호화 유전자의 발현이 검출되는 것일 수 있다.

일 예에 따른 췌장암 진단 또는 예후를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법은 췌장암 진단 또는 예후 예측을 위한 바이오마커로서 CD24 (단백질 또는 유전자), CD44 (단백질 또는 유전자), SLC16A1 (단백질 또는 유전자) 모두를 검출할 수 있다. 이 경우에 췌장암 진단의 정확도가 높아질 수 있고, 췌장암의 전이 가능성 (췌장암 (예를 들면, 췌장암 세포)이 전이 및/또는 침윤될 가능성), 췌장암 조직 성장 가능성 (췌장에서 존재하는 암 세포의 수 및/또는 췌장에 존재하는 종양 조직의 크기가 증가), 및/또는 췌장암 환자의 예후 (예를 들면, 생존율)을 예측할 수 있어, 췌장암 치료 전략에 중요한 정보를 제공할 수 있다.

일 예에 따른 췌장암 진단 또는 예후를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법은 상기 검출하는 단계에서 측정된 CD24, CD44, SLC16A1, 및 이들을 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 출원에서 '대조군 시료'는 정상인 개체 (예를 들면, 동일 성별 및 유사한 연령대의 개체 중에서 췌장암 질환을 갖지 않는 정상인 개체); 췌장암 (또는 췌장암 조직, 췌장암 세포)이 췌장 외의 다른 조직 및/또는 세포로 전이되지 않은 췌장암 질환자; 췌장암에서 암세포 (종양 세포) 및/또는 암조직 (종양 조직)의 성장능이 낮은 췌장암 질환자; 및/또는 상기 대상과 동일한 개체이나, 특정 약물 및/또는 특정 치료방법이 적용되기 전 개체로부터 분리된 생물학적 시료이거나 상기 대상과 동일한 개체로부터 분리되었으나, 상기 생물학적 시료를 분리(채취, 채집)하기 전에 (예를 들면, 상기 생물학적 시료 분리 12개월 전, 6개월 전, 3개월 전, 1개월 전, 2주 전, 또는 1주 전) 분리된 시료일 수 있다. 생물학적 시료에 대해서는 전술한 바와 같다.

일 예에서 상기 대조군 시료는 전이능 및/또는 조직 성장능 (예를 들면, 암세포 수 증가능 및/또는 암조직 크기 증가능)이 낮은 췌장암 세포일 수 있으며, 예를 들면, Panc0203 세포일 수 있다. 일 예에서 상기 대조군 시료는 전이능 및/또는 조직 성장능 (예를 들면, 암세포 수 증가능 및/또는 암조직 크기 증가능)이 다른 췌장암 세포 보다 낮은 수 있고, 정상인으로부터 분리한 세포와 유사할 수 있다.

일 예에 따른 방법은 췌장암 전이 가능성을 예측할 수 있는 정보를 제공할 수 있다. 일 예에 따른 췌장암 진단 또는 예후를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법은 상기 검출하는 단계 및/또는 비교하는 단계에서 하기 (1) 내지 (3)의 특징이 확인된 경우, 상기 대상은 (대조군 보다) 췌장암 전이 위험(췌장암 전이 가능성, 췌장암 전이능)이 높은 것으로 확인(결정, 판단)하는 것일 수 있다. 일 예에서, 하기 (1) 내지 (3)의 특징은 췌장암 전이 위험이 높은 것으로 확인하기 위한 필수 요건일 수 있다:

(1) CD44 단백질 발현 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현이 검출 (또는 CD44 양성, 또는 CD44 발현 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현이 기준값 이상임)되거나 CD44 단백질 발현 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현이 (대조군 시료 보다) 높으며,

(2) 대조군 시료 보다 CD24 단백질 발현 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현이 낮고,

(3) 대조군 시료 보다 SLC16A1단백질 발현 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준이 높은 경우.

일 예에 따른 방법은 췌장암 조직 성장능 (예를 들면, 췌장암에서 암세포 수의 증가 및/또는 암 조직의 크기 증가)을 예측할 수 있는 정보를 제공할 수 있다. 일 예에 따른 췌장암 진단 또는 예후를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법은 상기 검출하는 단계 및/또는 비교하는 단계에서 하기 (1) 내지 (3)의 특징이 확인된 경우, 상기 대상은 (대조군 보다) 췌장암 조직 크기가 감소 (췌장암에서 암세포 수의 증가 및/또는 암 조직의 크기가 증가)된 것일 수 있다:

(1) CD44 단백질 발현 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현이 검출 (또는 CD44 양성, 또는 CD44 발현 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현이 기준값 이상임)되거나 CD44 단백질 발현 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현이 (대조군 시료 보다) 높으며,

(2) 대조군 시료 보다 CD24 단백질 발현 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준이 낮고,

(3) 대조군 시료 보다 SLC16A1단백질 발현 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준이 높은 경우.

일 예에 따른 방법은 췌장암 조직 성장능 (예를 들면, 췌장암에서 암세포 수의 증가 및/또는 암 조직의 크기 증가)을 예측할 수 있는 정보를 제공할 수 있다. 일 예에 따른 췌장암 진단 또는 예후를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법은 상기 검출하는 단계 및/또는 비교하는 단계에서 하기 (i) 내지 (iii)의 특징이 확인된 경우, 상기 대상은 (대조군 보다) 췌장암 조직 크기가 증가 (췌장암에서 암세포 수의 증가 및/또는 암 조직의 크기가 증가)된 것으로 확인(결정, 판단)하는 것일 수 있다. 일 예에서, 하기 (i) 내지 (iii)의 특징은 췌장암 조직 크기가 증가 (췌장암에서 암세포 수의 증가 및/또는 암 조직의 크기가 증가)된 것으로 확인하기 위한 필수 요건일 수 있다:

(i) CD44 단백질 발현 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현이 검출 (또는 CD44 양성, 또는 CD44 발현 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현이 기준값 이상임)되거나 CD44 단백질 발현 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현이 (대조군 시료 보다) 높으며,

(ii) 대조군 시료 보다 CD24 단백질 발현 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준이 높고,

(iii) 대조군 시료 보다 SLC16A1단백질 발현 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준이 높은 경우.

일 예에서 CD44 양성은 일정 수준 이상으로 상기 생물학적 시료에서 CD44의 발현이 유전자 및/또는 단백질 수준에서 검출되거나, 예를 들면, 항 CD44 항체를 이용한 면역조직화학 염색에서 염색반응을 보이는 세포의 수가 전체 세포의 수에 비하여, 1% 이상, 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상인 경우를 의미할 수 있다. 일 예에서 CD44 발현 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현이 기준값 이상이 되었다는 것은, Panc0203 세포를 기준으로 CD44의 유전자 발현(FPKM) 및/또는 단백질 발현이 0.1 배 이상, 0.2배 이상, 0.5배 이상, 0.7배 이상이 되는 것을 의미할 수 있다.

일 예에 따른 방법은 췌장암의 예후를 예측할 수 있고, 예를 들면, 췌장암 환자의 전체 생존율 및/또는 무병 생존율을 예측할 수 있다. 상기 '전체 생존율(overall survival, OS)'은 질환, 예를 들면 췌장암으로 진단되거나 그에 대해 치료된 후 한정된 시간 동안 살아 있는 환자를 기재하는 임상적 종점을 포함할 수 있고, 췌장암의 재발 여부에 관계없이 생존하는 가능성을 의미할 수 있고, 상기 '무병 생존율(disease-free survival, DFS)'은 특정 질환(예를 들면, 췌장암)에 대한 치료 후 재발 없이 환자가 생존하는 기간을 포함할 수 있다.

일 예에 따른 췌장암 진단 또는 예후를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법은 상기 비교하는 단계에서,

대조군 시료 보다 CD44 단백질 발현 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준이 높고,

대조군 시료 보다 SLC16A1단백질 발현 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준이 높은 경우, 췌장암 환자의 예후가 나쁜 것 (예를 들면, 췌장암 환자의 생존율 (예를 들면, 전체 생존율 및/또는 무병 생존율)이 낮은 것)으로 확인할 수 있다.

또 다른 예에서, 췌장암 진단 또는 예후 예측 방법 및/또는 췌장암 진단 또는 예후 예측에 정보를 제공하는 방법은,

(a) 대상으로부터 분리된 생물학적 시료에서 CD24, CD44, 및 SLC16A1, 및 이들의 암호화 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 바이오마커를 검출하는 단계, 및

(b) 상기 생물학적 시료 내에 상기 바이오마커 (예를 들면, CD44, SLC16A1, 및/또는 이를 암호화하는 유전자)가 존재하거나, 비교대상시료(대조군 시료)보다 높은 수준으로 존재하는 경우, 상기 시료 또는 상기 시료가 유래한 대상을 췌장암 환자로 진단 (또는 확인 또는 결정)하는 단계

를 포함할 수 있다.

또한, 상기 바이오마커의 측정이 시료 내 바이오마커 수준을 측정하는 것인 경우, 상기 방법은,

(a) 대상으로부터 분리된 생물학적 시료에서 CD24, CD44, 및 SLC16A1, 및 이들의 암호화 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 바이오마커의 수준을 측정하는 단계, 및

(b) (i) 상기 생물학적 시료에서 측정된 바이오마커 수준을 비교대상시료 내의 바이오마커의 수준과 비교하는 단계,

(ii) 시료에서 측정된 바이오마커 (예를 들면, CD44, SLC16A1, 및/또는 이를 암호화하는 유전자)의 수준이 비교대상시료보다 높은 경우, 상기 시료 또는 상기 시료가 유래한 대상을 췌장암 환자로 진단 (또는 확인 또는 결정)하는 단계, 또는

(iii) 상기 단계 (i) 및 (ii) 모두

를 포함할 수 있다. 임의로, 상기 방법은 상기, 단계 (b) (단계 (i) 및/또는 (ii)) 이전에, 비교대상시료 내의 바이오마커의 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

일 예에서, “바이오마커의 수준이 높다(high)”함은 시료 내 바이오마커의 농도 또는 상기 바이오마커를 발현하는 세포의 수가 비교대상시료 (대조군 시료) 대비 약 1.1배 이상, 약 1.2배 이상, 약 1.3배 이상, 약 1.5배 이상, 약 1.8배 이상, 약 2배 이상, 약 2.5배 이상, 약 3배 이상, 약 3.5배 이상, 약 4배 이상, 약 4.5배 이상, 또는 약 5배 이상인 것을 의미할 수 있다.

일 예에서, “바이오마커의 수준이 낮다(low)”함은 시료 내 바이오마커의 농도 또는 상기 바이오마커를 발현하는 세포의 수가 비교대상시료 (대조군 시료) 대비 약 1.1배 이상, 약 1.2배 이상, 약 1.3배 이상, 약 1.5배 이상, 약 1.8배 이상, 약 2배 이상, 약 2.5배 이상, 약 3배 이상, 약 3.5배 이상, 약 4배 이상, 약 4.5배 이상, 또는 약 5배 이하인 것을 의미할 수 있다.

본 명세서에서 제공되는 췌장암 진단 또는 예후 예측 방법 또는 췌장암 진단 또는 예후 예측에 정보를 제공하는 방법은, 상기 검출하는 단계, 비교하는 단계, 및/또는 진단하는 단계 이후에,

췌장암 환자로 진단된 대상에게 췌장암 치료를 수행하는 단계

를 추가로 포함할 수 있다.

상기 췌장암 치료는 췌장암 치료제(예컨대, 항암제: 5-플루오로유라실(5-fluorouracil), 젬시타빈(gemcitabine), 타르세바(tarceva; erlotinib), 항체 등)의 투여와 같은 화학적 요법, 방사선 치료, 외과적 수술, 또는 이들 중 2 이상의 조합을 의미할 수 있다.

바이오마커의 검출 가능한 제제

본 명세서에서, 바이오마커의 검출은 시료에서의 바이오마커의 존재 여부 및/또는 바이오마커의 수준 (농도)를 측정하는 것을 의미할 수 있다.

본 명세서에서, 바이오마커, 즉, CD24, CD44, SLC16A1 (MCT1), 및 이들의 암호화 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 검출 가능한 제제는 상기 바이오마커에 결합 가능한 모든 소분자 화합물, 단백질, 핵산 분자들 중에서 선택될 수 있다.

일 예에서, 상기 바이오마커가 CD24, CD44, 및 SLC16A1 (MCT1)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질인 경우, 상기 바이오마커의 검출 가능한 제제는 상기 단백질에 결합하는 단백질 (예컨대, 항체, 항체의 항원결합단편, 항체의 항원결합단편을 포함하는 항체 유사체, 수용체, 등), 펩타이드, 핵산 분자 (예컨대, 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드 등), 소분자 화합물(chemical, small molecule), 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

다른 예에서, 상기 바이오마커가 CD24 암호화 유전자, CD44 암호화 유전자, 및 SLC16A1 (MCT1)암호화 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자(전장 DNA, cDNA, 또는 mRNA)인 경우, 상기 바이오마커의 검출 가능한 제제는 상기 유전자에 결합 (또는 혼성화) 가능한 핵산 분자 (올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 등; 예컨대, 프라이머, 프로브, 압타머, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 등), 소분자 화합물 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 바이오마커의 검출 가능한 제제는 형광 물질, 발색 물질, 발광 물질, 방사성동위원소, 중금속 등의 통상적인 표지 물질로 표지되거나 표지되지 않은 것일 수 있다.

일 예에서, 상기 바이오마커가 CD24, CD44, 및 SLC16A1 (MCT1)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질인 경우, 상기 바이오마커의 검출은 통상적인 효소 반응, 형광, 발광 및/또는 방사선 검출 등과 같은 통상적인 단백질 검출(또는 측정 또는 분석) 방법을 통하여 하여 수행될 수 있으며, 구체적으로, 면역크로마토그래피(Immunochromatography), 면역조직화학염색, 효소결합 면역흡착 분석(enzyme linked immunosorbent assay: ELISA), 방사선 면역측정법(radioimmunoassay: RIA), 효소 면역분석(enzyme immunoassay: EIA), 형광면역분석(Floresence immunoassay: FIA), 발광면역분석(luminescence immunoassay: LIA), 웨스턴블라팅(Western blotting), 마이크로어레이법, 유세포분석법 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의하여 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

다른 예에서, 상기 바이오마커가 CD24 암호화 유전자, CD44 암호화 유전자, 및 SLC16A1 (MCT1) 암호화 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자(전장 DNA, cDNA, 또는 mRNA)인 경우, 상기 바이오마커의 검출은 통상의 유전자 검출(또는 측정 또는 분석) 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 예컨대 상기 유전자와 혼성화 가능한 프라이머, 프로브, 압타머, 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 통상적인 유전자 분석 방법, 구체적으로, 폴리머레이즈 연쇄 반응법 (PCR; 예컨대 qPCR, real-time PCR, real-time qPCR 등), FISH(fluorescent in situ hybridization), 마이크로어레이법, 등을 이용하여 측정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 구체예에서, 상기 프라이머는 상기 유전자 (전장 DNA, cDNA, 또는 mRNA)의 염기서열 중 연속하는 5 내지 1000bp 예컨대 10 내지 500bp, 20 내지 200bp, 또는 50 내지 200bp의 유전자 단편을 검출할 수 있는 것으로, 상기 유전자 단편의 3'-말단 및 5'-말단 각각의 연속하는 5 내지 100bp, 예컨대, 5 내지 50bp, 5 내지 30bp, 또는 10 내지 25bp 부위와 혼성화 가능한 (예컨대, 상보적인) 염기서열을 포함하는 프라이머쌍일 수 있다. 상기 프로브, 압타머, 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 총 길이가 5 내지 1000 bp, 5 내지 500 bp, 5 내지 200 bp, 5 내지 100 bp, 5 내지 50bp, 5 내지 30bp, 또는 5 내지 25bp인 것일 수 있으며, CD24, CD44, 및 SLC16A1 (MCT1)을 암호화하는 유전자 (전장 DNA, cDNA, 또는 mRNA)의 염기서열 중 연속하는 5 내지 1000 bp, 5 내지 500 bp, 5 내지 200 bp, 5 내지 100 bp, 5 내지 50bp, 5 내지 30bp, 또는 5 내지 25bp의 유전자 단편과 결합 가능하거나 혼성화 가능한 (예컨대, 상보적) 염기서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 '결합 가능'하다 함은 상기 유전자의 전부 또는 일부와 공유 결합 등의 화학적 및/또는 물리적 결합에 의하여 결합할 수 있음을 의미할 수 있고, 상기 '혼성화 가능'하다 함은 상기 유전자 부위의 염기서열과 80% 이상, 예컨대 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 상보성을 가짐으로써 상보적 결합이 가능함을 의미할 수 있다.

췌장암 진단 또는 예후 예측용 조성물 및 키트

본 명세서에서 제공되는 췌장암 진단 또는 예후 예측용 조성물은 앞서 설명한 바이오마커의 검출 가능한 제제를 포함하는 것일 수 있다.

본 명세서에서 제공되는 췌장암 진단용 키트는 앞서 설명한 바이오마커의 검출 가능한 제제 또는 이를 포함하는 췌장암 진단용 조성물, 및 상기 검출 수단을 포함하는 것일 수 있다. 상기 검출 수단은 상기 바이오마커의 검출 가능한 제제로 검출한 바이오마커의 존재 여부 및/또는 수준을 정성적 및/또는 정량적으로 분석할 수 있는 수단일 수 있다. 일 예에서, 상기 검출 수단은 앞서 설명한 단백질 및/또는 유전자 검출 방법에 사용하기 위한 수단들 중에서 선택된 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 키트는 검출시약을 더 포함할 수 있다. 상기 검출시약은 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소, 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지된 접합체일 수 있다. 발색효소는 퍼록시다제, 알칼라인 포스파타제, 또는 산성 포스파타제일 수 있고, 형광물질은 플루오레신카복실산(FCA), 플루오레신 이소티오시아네이트(FITC), 플루오레신 티오우레아(FTH), 7-아세톡시쿠마린-3-일, 플루오레신-5-일, 플루오레신-6-일, 2',7'-디클로로플루오레신-5-일, 2',7'-디클로로플루오레신-6-일, 디하이드로 테트라메틸로사민-4-일, 테트라메틸로다민-5-일, 테트라메틸로다민-6-일, 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸, 또는 4,4-디플루오로-5,7-디페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸, Cy3, Cy5, 폴리 L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 로다민-B-이소티오시아네이트(RITC), PE(Phycoerythrin), 또는 로다민일 수 있다.

일 예에서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

췌장암 치료제의 스크리닝

다른 예에서, 후보 화합물 처리시의 상기 바이오마커의 수준을 측정하여 췌장암 치료, 췌장암 전이 억제, 췌장암 성장 억제 (예를 들면, 췌장암에서 암세포의 수 및/또는 암조직 크기 성장 억제) 약물의 후보 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

보다 구체적으로, 상기 스크리닝 방법은,

생물 시료에 후보 화합물을 접촉시키는 단계;

상기 생물 시료에서의 CD24, CD44, 및 SLC16A1, 및 이들의 암호화 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 바이오마커의 수준을 측정하는 단계; 및

상기 후보 화합물을 접촉시킨 생물 시료에서의 바이오마커의 수준을 후보 물질을 접촉시키지 않은 생물 시료에서의 유비퀴틴 분해효소 및/또는 이를 암호화하는 유전자의 수준과 비교하는 단계

를 포함할 수 있다.

상기 비교하는 단계는 동일한 생물 시료에 대하여 후보 화합물 접촉(처리) 전 후의 바이오마커의 수준을 각각 측정하여 이를 비교하거나, 생물 시료 중 일부에만 후보 화합물을 접촉시키고, 후보 화합물을 접촉시킨 부분과 후보 화합물을 접촉시키지 않은 부분의 바이오마커의 수준을 각각 측정하여 이를 비교함으로써 수행될 수 있다.

상기 후보 화합물을 접촉시킨 생물 시료에서의 바이오마커 (예를 들면, CD44, SLC16A1)의 수준이 후보 물질을 접촉시키지 않은 생물 시료에서의 바이오마커 (예를 들면, CD44, SLC16A1)의 수준보다 감소한 경우, 즉 상기 후보 화합물이 생물 시료에서 바이오마커 (예를 들면, CD44, SLC16A1) 수준을 감소시키거나 발현을 저해한 경우, 상기 후보 화합물을 췌장암의 예방 및/또는 치료 약물의 후보 물질로 판단할 수 있다. 상기 후보 화합물을 접촉시킨 생물 시료에서의 바이오마커 (예를 들면, CD24)의 수준이 후보 물질을 접촉시키지 않은 생물 시료에서의 바이오마커 (예를 들면, CD24)의 수준보다 증가한 경우, 즉 상기 후보 화합물이 생물 시료에서 바이오마커 (예를 들면, CD24) 수준을 증가시키거나 발현을 유도한 경우, 상기 후보 화합물을 췌장암 전이의 예방 및/또는 치료 약물의 후보 물질로 판단할 수 있다. 또한 상기 경우의 조합일 수 있다.

상기 생물학적 시료는 생체, 예컨대, 췌장암 환자로부터 얻어진 (또는 분리된 또는 유래한) 혈액, 혈청, 혈장, 및/또는 이들로부터 분리된 세포를 포함하는 것일 수 있다.

상기 후보 화합물은 각종 화합물, 예컨대, 소분자 화합물, 단백질, 폴리펩타이드, 올리고펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 식물 또는 동물의 추출물 등으로 이루어진 군에서 선택된 것이 수 있다.

상기 생물 시료에서의 바이오마커의 수준 측정은 통상의 유전자 또는 단백질 정량 검출 수단에 의하여 측정하거나, 및/또는 측정된 결과를 평가하여 수행할 수 있다. 그 구체적인 측정 수단은 앞서 설명한 바와 같다.

기타

다른 예에서, 췌장암 환자으로부터 분리된 생물학적 시료에서 CD24 (cluster of differentiation 24), CD44 (cluster of differentiation 44), SLC16A1 (solute carrier family 16 member 1), 및 이들을 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 검출하는 단계; 및

상기 단계에서 측정된 CD24, CD44, SLC16A1, 및 이들을 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계를 추가로 포함하는,

췌장암 환자에서 췌장암 전이능 증가 (전이 위험도), 췌장암 조직 성장 (암세포 수 증가, 암조직 크기 증가) 여부를 예측하는 방법을 제공할 수 있다. 일 예에서 상기 대조군 시료는 상기 생물학적 시료가 분리된 대상과 동일한 대상에서 생물학적 시료를 분리하기 전 또는 췌장암 치료 약물, 치료 방법이 적용되기 전의 개체로부터 분리된 것일 수 있다.

일 예에 따른 방법 또는 조성물은 간단히, 높은 정확도로 췌장암을 조기에 진단하고, 췌장암의 예후를 정확히 판단할 수 있다.

도 1은 Panc 0230, SP0926, SP1030 세포의 CD24 및 CD44 발현에 따른 confocal microscopy 및 flow cytometry 결과를 나타낸다.
도 2a 및 도 2b는 CD24 및/또는 CD44 중화를 통한 SP0926 및 SP1030의 침습성 전이능 억제 또는 증가 결과를 나타낸다.
도 3은 SP0926의 MCT1 의존적 침습 활성 결과를 나타낸다.
도 4는 CD24 발현량에 따른 침습성 전이능 활성의 상대적 변화를 나타낸다.
도 5는 CD24 및/또는 CD44 중화 항체에 의한 Panc0203, SP0926, 및 SP1030의 종양 구 (Tumorsphere) 형성 활성의 억제 결과를 나타낸다.
도 6은 GFP shRNA 및 DMSO 그룹과 비교하여 CD24 shRNA 및 AZD3965에 의한 SP1030의 종양 구 형성 활성의 억제 결과를 나타낸다.
도 7은 일 예에 따른 바이오마커와 췌장암 조직 성장능 및/또는 전이능과의 관계를 나타낸 모식도 이다.
도 8 은 췌장암 환자 177명의 RNAseq를 분석하여 일 예에 따른 바이오마커와 전체 생존율(overall survival, OS)의 관계를 나타낸 결과이다.

본 발명은 하기 실시예를 들어 더욱 자세히 설명할 것이나, 하기 실시예로 권리범위가 한정되는 의도는 아니다.

참고예 1. 세포 배양 조건

Panc0203 (ATCC, CRL-2553), Panc0203-CD24 shRNA, SP0926, SP1030 및 SP1030-CD24 shRNA는 RPMI 1640에 재조합 인간 인슐린 (10 units/㎖)과 15% 소 태아 혈청 (FBS) 및 1 % 페니실린-스트렙토 마이신 용액(PS)이 보충된 배양 배지 내에서 배양하였다. 배양 접시(100mm)에 부착된 세포의 점유 영역이 80 % 이상일 때, 배양 부착 세포를 1 : 2로 새로운 배양 접시에 분할했다. 모든 세포는 37℃에서 5% 이산화탄소로 가습된 표준 배양 조건에서 유지되었다. Panc0203-CD24 shRNA 및 SP1030-CD24 shRNA 세포는 인간 CD24 shRNA lentiviral particles (Santa Cruz, sc-29978-v)을 Panc0203과 SP1030에 처리 후 puromycin selection을 거쳐 제작하였다.

참고예 2. SP0926 및 SP1030 세포 제조

인간의 정상 섬유 아세포 (Human normal fibroblasts) (Neuromics, SC00A5)와 인간의 암 연관 섬유 아세포 (Human cancer-associated fibroblasts) (Neuromics, CAF08)가 1:1로 배양된 배양 접시를 1% 저산소 상태 (hypoxic condition)에서 72시간 동안 배양한 후 해당 배양액을 수집하여 엑소좀이 제거된 소 태아 혈청 (2.5 % exosome-free FBS) 및 Gemcitabine (10 μM)를 추가한 후 Panc0203에 처리하였다. 이때, Panc0203에는 1% 저산소 상태가 제공되며 37℃에서 5 % 이산화탄소로 가습된 배양 조건에서 유지되었다. 총 72 시간이 되는 시점에 부유되어 죽은 세포는 제거하고 소수의 살아남은 세포를 FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorting)로 분리해 낸 후 지속 배양하였다. 독립적인 두 차례의 실험을 통해 SP0926와 SP1030를 각각 얻을 수 있었다.

참고예 3. 침습 분석 (Invasion assay)

무 혈청 RPMI 1640 (200㎕)에 1 x 10⁵ 세포를 200 ㎕ (0.4 mg)의 매트리겔(matrigel)이 고착된 8.0㎛ 기공 및 12 mm 직경의 Millicell 막 삽입물 상부 구획에 첨가하였다. Millicell 막 삽입물이 놓인 24-well plate의 기저(하부) 구획은 15 % FBS 및 10 units/ml 인간 재조합 인슐린을 포함하는 750㎕의 RPMI 1640으로 채웠다. 37℃에서 5 % 이산화탄소로 가습된 배양 조건에서 하룻밤 또는 24 시간 후, 3.7 % 포름알데히드로 2 분 동안 고정 후, 100 % 메탄올 처리 10 분 및 트립판 블루 염색 20분 후, 해당 막 삽입물의 막 정점면 (내부면)에 남아있는 세포를 면봉으로 제거했다. 다음으로 막 삽입물의 막 하단면 (외부면)에 잔여된 세포를 세었다. 모든 단계 사이에 PBS로 세척을 진행하였다. MCT1 억제제의 효과를 관찰하기 위해서는 AZD3965 (20μM)를 세포에 처리하였다. CD24 및/또는 CD44 억제를 위해, 항-인간 CD24 항체를 막 삽입물 (0.4㎍/ 200㎕) 및 하부 구획 (0.6㎍/ 750㎕)에 처리하였고 항-인간 CD44 항체를 막 삽입물 (60ng / 200 ㎕) 및 하부 구획 (90 ng / 750 ㎕)에 처리하였으며, 마우스 IgG를 대조군으로 사용했다.

참고예 4. 종양 구 형성 분석 (Tumorsphere assay)

5 x 10³개의 세포를 ‘DMEM/F12, HEPES’에 5배 농축된 B-27 및 1 % PS가 보충된 배양 배지와 혼합하여 초저 부착 6 웰 플레이트 (ultra-low attachment 6 well plates) 내에서, 플레이트를 방해하지 않고 약 2주 내외로 배양하였다. CD24 및/또는 CD44 중화를 위해, 1㎍의 항-인간 CD24 항체 및 0.15㎍의 항-인간 CD44 항체를 각 웰(well)에 처리했다. MCT1 억제제의 효과를 관찰하기 위해 20μM의 AZD3965를 처리했다. 종양 구를 현미경으로 관찰하고 종양 구의 수와 직경을 ImageJ 프로그램에서 분석했다.

참고예 5. RNA sequence 분석

라이브러리 제작을 위해 제조업체의 프로토콜에 따라 TruSeq Stranded mRNA LT 샘플 준비 키트 (Illumina)를 사용했다. QC 통과 라이브러리의 시퀀싱은 NovaSeq 6000 시퀀싱 시스템 (Illumina)에서 수행되었다. 판독은 스플라이스 접합 처리가 가능한 HISAT2 프로그램을 사용하여 참조 게놈 DNA인 UCSC hg 19 (NCBI의 원본 GRCH37, 2009 년 2 월)에 매핑되었다. 매핑을 읽은 후 StringTie 프로그램을 통해 Transcript 어셈블리 작업을 수행했다. 그 결과, 알려진 전사체에 대한 각 샘플의 발현 프로파일 값을 얻었으며, 전사 / 유전자를 기반으로 판독 횟수 및 FPKM (전사 물의 킬로베이스 당 조각 / 백만 매핑된 판독)을 획득했다. 원래의 원시 데이터 (27,685 개 유전자, 10 개 샘플)에서 TMM 정규화 후 처리된 데이터 (14,972 개 유전자, 10 개 샘플)를 얻은 다음 |fc| ≥2 (raw.p <0.05 조건)를 충족하는 631 개의 중요한 유전자를 포함하는 DEG (Differentially Expressed Genes) 분석을 수행했다.

참고예 6. Confocal microscopy 분석

37℃에서 5 % 이산화탄소로 가습된 배양 조건과 정상 배양 배지에서 성장한 세포를 3.7 % 포름 알데히드 용액으로 15 분 동안 고정한 다음 PBS로 3 회 세척하고 1% BSA 용액을 45 분 동안 처리하였다. PBS로 세척 한 후, 세포에 0.1 % BSA/PBS 용액으로 희석한 항-인간 CD24-PE 및 CD44-APC 항체 (5 μl per 100 μl) (BioLegend)를 45 분 동안 처리했다. 현미경 슬라이드에 장착 된 표본의 CD24 및 CD44 발현은 LSM 880 AiryScan (Zeiss)에 의해 관찰되었다.

참고예 7. flow cytometry 분석

세포 (1 x 10⁶ cells / mL)를 수확하고 3% BSA/PBS 용액으로 희석한 항-인간 CD24-PE (Ex/Em: 564/574 nm) 및 CD44-APC (Ex/Em: 651/660 nm) 항체와 섞어 어두운 곳에서 30분간 방치한 다음 차가운 FACS 완충액)으로 3번 세척하고 LSRFortessa cell analyzer (BD Biosciences)에서 PE와 APC 양성 세포를 분석 하였다.

참고예 8. 췌장암 환자의 예후 측정

TCGA에 공개된 췌장암 환자 총 177명(Stage I = 21 / Stage II = 147 / Stage III = 4 / Stage IV = 5)의 RNAseq 데이터에서 환자별 CD24, CD44 및 SLC16A1의 전사량(FPKM) 수치를 얻었다. CD44의 FPKM cut off 40.42를 기준 (177명 중 FPKM 범위: 3.0 < FPKM < 137.5) 또는 SLC16A1의 FPKM cut off 13.35를 기준 (177명 중 FPKM 범위: 0.5 < FPKM < 32.1)으로 환자를 전사량에 따른 High와 Low로 나누어 전체 생존율 (OS)을 비교하였다. 통계적 분석은 PASW ver. 19 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 사용하여 Kaplan-Meier 생존분석을 시행하였으며 Log Rank (MantelCox) test를 이용하여 p값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판정하였다. 전체 생존율 (OS)에 있어 CD24의 전사량(FPKM)은 통계적 유의성이 있는 cut off가 없었다 (177명 중 FPKM 범위: 1.6 < FPKM < 206).

실시예 1. 췌장암 세포에서 SLC16A1, CD44, CD24 발현 분석

실시예 1-1. RNA 시퀀스 분석을 통한 발현 분석

Panc0203 세포와 상기 참고예 2에서 제조한 SP0926, SP1030 세포에서 상기 참고예 5의 방법과 같이, RNA 시퀀스 분석을 통해 SLC16A1, CD44, CD24 발현 분석하고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

Gene symbol	Gene ID	Fold change (SP0926/ Panc0203)	Fold change (SP1030/ Panc0203)	Volume (SP0926/ Panc0203)	Volume (SP1030/ Panc0203)	Panc0203 RNA_FPKM	SP0926 RNA_FPKM	SP1030 RNA_FPKM
SLC16A1	6566	5.59	4.86	4.08	4.01	7.19	44.67	38.11
CD44	960	-1.39	1.22	6.79	7.18	131.35	93.47	156.5
CD24	100133941	-4.95	17.74	1.39	4.59	6.82	0.6	133.28

표 2에 나타난 바와 같이, 췌장암 부모 세포주 (Panc0203) 및 췌장암 신규 딸 세포주 (SP0926, SP1030)의 RNAseq 분석결과 SLC16A1 전사량의 경우, Panc0203 (FPKM 7.19, low) 대비 딸 세포주 SP0926 (FPKM 44.67, high)과 SP1030 (FPKM 38.11, high)에서 공통적으로 약 4 - 5배 증가 되었다 (상기 SLC16A1 FPKM cut off 13.35 기준 대비). 또한 CD44의 mRNA는 FPKM 수치를 기준으로 Panc0203, SP0926, 및 SP1030 모든 세포에서 높은 것 (각 세포의 FPKM 범위: 93.47 < FPKM < 156.5, high)을 확인하였다 (상기 CD44 FPKM cut off 40.42 기준 대비). 또한, CD24의 경우, Panc0203 (FPKM 6.82, low) 대비 SP0926 (FPKM 0.6, low)에서는 약 5배 감소, SP1030 (FPKM 133.28, high)에서는 17배 이상 증가된 것을 확인하였다 (상기 177명 중 FPKM 범위: 1.6 < FPKM < 206 기준). 이로부터 Panc0203은 CD24 low / CD44 high / SLC16A1 low이며, SP0926은 CD24 low / CD44 high / SLC16A1 high이고, SP1030은 CD24 high / CD44 high / SLC16A1 high인 것을 확인하였다.

실시예 1-2. Confocal microscopy 및 flow cytometry 를 통한 분석

상기 참고예 6 및 7의 방법과 같이, Confocal microscopy 및 flow cytometry 분석을 통해 Panc0203, SP0926, 및 SP1030 세포에서 CD24 및 CD44 발현 양상을 측정하고, 그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타난 바와 같이, CD24 단백질의 발현이 Panc0203 대비 SP0926에서 감소되었고, SP1030에서 증가되었다. 또한, CD44는 Panc0203, SP0926 및 SP1030 모두에서 양성(high)으로 검증되었다.

실시예 2. 암세포 전이능 측정

상기 참고예 3의 방법으로, 세포의 전이능을 측정하였다.

구체적으로 Panc0203, SP0926, 및 SP1030 세포에 항-인간 CD24 중화 항체 및/또는 항-인간 CD44 중화 항체 처리, 그리고 SP0926 세포에 AZD3965 (SLC16A1의 발현 단백질인 MCT1의 활성 저해제) 처리, 그리고 SP1030 세포에 CD24 shRNA를 처리하여 세포 전이능 (침윤능)을 측정하여 그 결과를 도 2a, 도 2b, 도 3, 및 도 4에 나타내었다.

도 2a 및 도 2b에 나타낸 바와 같이, SP0926 (CD24 low / CD44 high / SLC16A1 high)의 경우, SP1030 (CD24 high / CD44 high / SLC16A1 high)에 비하여 세포 전이능 (침윤능)이 높았다. 도 2a 및 도 2b에 나타낸 바와 같이, SP1030 (CD24 high / CD44 high / SLC16A1 high)의 경우, 항-인간 CD24 항체를 처리하여 SP0926 (CD24 low / CD44 high / SLC16A1 high)의 패턴을 유도하면 세포 전이능 (침윤능)이 증가하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, SP1030 (CD24 high / CD44 high / SLC16A1 high)의 경우, 인간 CD24 shRNA를 처리하여 SP0926 (CD24 low / CD44 high / SLC16A1 high)의 패턴을 유도하면 세포 전이능 (침윤능)이 증가하였으나, Panc0203 (CD24 low / CD44 high / SLC16A1 low)에 CD24 shRNA를 처리하였을 때 세포 전이능 (침윤능)에 유의미한 차이가 나타나지 않았다. 따라서, CD24의 감소가 세포 전이능 (침윤능)의 증가에 관여하고, CD24의 감소가 세포 전이능 (침윤능)의 증가에 유의미한 효과를 나타내기 위해서는 CD44 양성(high) 및 SLC16A1 high 증가가 필수 조건임을 확인하였다.

도 2a 및 도 2b에 나타낸 바와 같이, SP0926 (CD24 low / CD44 high / SLC16A1 high)에 항-인간 CD44 항체를 처리하면, 세포 전이능 (침윤능)이 감소하였다. 또한, Panc0203 (CD24 low / CD44 high / SLC16A1 low)와 같이 SLC16A1의 발현이 낮을 경우, 세포 전이능 (침윤능)이 감소되어 있음을 확인하였다. 도 3에 나타난 바와 같이 SP0926 (CD24 low / CD44 high / SLC16A1 high) 세포에 AZD3965 (SLC16A1의 발현 단백질인 MCT1의 활성 저해제)를 처리하면, 세포 전이능 (침윤능)이 감소하였다. 따라서 CD24가 낮은 상태일지라도 CD44 또는 SLC16A1 어느 한 가지 유전자로부터 발현된 단백질 만으로는 세포 전이능 (침윤능)을 유지하지 못함을 확인하였으며, CD24가 낮은 상태일 때 상기 CD44 및 SLC16A1 두 가지 유전자의 발현 단백질이 세포 전이능 (침윤능) 증가에 필수 조건임을 확인하였다.

실시예 3. 암 조직 성장능 측정

상기 참고예 4의 방법으로 암 조직의 성장능을 살펴보고자, 종양 구의 수와 직경을 측정하였다.

구체적으로, Panc0203 (CD24 low / CD44 high / SLC16A1 low), SP0926 (CD24 low / CD44 high / SLC16A1 high), 및 SP1030 (CD24 high / CD44 high / SLC16A1 high) 세포에 항-인간 CD24 항체, 항-인간 CD44 항체를 처리하고 종양 구의 수와 직경을 측정하여 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타난 바와 같이, SP1030 (CD24 high / CD44 high / SLC16A1 high)는 암 조직 성장능이 가장 높았으며, Panc0203 (CD24 low / CD44 high / SLC16A1 low)와 같이 CD24와 SLC16A1이 낮은 경우 그리고 SP0926 (CD24 low / CD44 high / SLC16A1 high)와 같이 CD24가 낮은 경우에는 공통적으로 암 조직 성장능이 낮았다.

또한, 도 5에 나타난 바와 같이, SP1030 (CD24 high / CD44 high / SLC16A1 high) 세포에 CD24, CD44 또는 CD24/CD44를 항체로 중화시킨 경우 암 조직 성장능이 감소한 것을 확인할 수 있었다.

또한, SP1030 (CD24 high / CD44 high / SLC16A1 high) 세포에 AZD3965 및/또는 CD24 shRNA를 처리하고, 종양 구의 수와 직경을 측정하여, 그 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에 나타난 바와 같이, SP1030 (CD24 high / CD44 high / SLC16A1 high)에 CD24 shRNA, AZD3965 또는 CD24 shRNA/AZD3965를 처리한 경우 암 조직 성장능이 감소함을 확인할 수 있었다.

따라서 SLC16A1이 높은 상태일지라도 상기 CD24 또는 CD44 어느 한 가지 유전자로부터 발현된 단백질의 수준이 낮거나 중화될 경우, 암 조직 성장능이 낮아짐을 확인하였으며, CD44가 높은 상태일 때 상기 CD24 또는 SLC16A1 두 가지 유전자의 발현 단백질의 수준이 낮거나 중화될 경우, 암 조직 성장능을 높게 유지하지 못함을 확인하였으므로 CD24 high / CD44 high(CD 44 양성) / SLC16A1 high의 조건이 높은 암 조직 성장능의 필수 조건임을 확인하였다.

또한, 실시예 2 및 실시예 3의 내용을 종합하면, CD44 high / SLC16A1 high일 경우, 잠재적으로 세포 전이능 (침윤능) 및/또는 암 조직 성장능이 높은 세포 군집임을 확인할 수 있으며, 상기 세포 군집 (CD44 high / SLC16A1 high) 내에서 'CD24의 전사량 감소에 의한 세포 전이능 (침윤능) 증가' 또는 'CD24의 전사량 증가에 의존적인 암 조직 성장능 증가'를 판별할 수 있었다.

실시예 4. 췌장암 예후 측정

상기 참고예 8의 방법과 같이, SLC16A1, CD44, CD24 발현에 따라 환자군을 나누고, 각 환자군의 전체 생존율을 확인하여 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타난 바와 같이, CD44 및 MCT1의 발현이 높으면 전체 생존율(OS)이 낮음을 확인할 수 있었으며, CD24 발현의 높고 낮음 간에 전체 생존율(OS)에 차이가 없었다. 따라서, 검체의 mRNA 또는 단백질 상태로서 CD44 high / SLC16A1 (MCT1) high를 측정하여 췌장암의 예후를 예측할 수 있음을 확인하였다.

<110> Ewha University - Industry Collaboration Foundation THE ASAN FOUNDATION University of Ulsan Foundation For Industry Cooperation The Jackson Laboratory <120> Composition for diagnosing pancreatic cancer or predicting prognosis and use thereof <130> DPP20203869KR <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 80 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD24 <400> 1 Met Gly Arg Ala Met Val Ala Arg Leu Gly Leu Gly Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ala Leu Leu Leu Pro Thr Gln Ile Tyr Ser Ser Glu Thr Thr Thr Gly 20 25 30 Thr Ser Ser Asn Ser Ser Gln Ser Thr Ser Asn Ser Gly Leu Ala Pro 35 40 45 Asn Pro Thr Asn Ala Thr Thr Lys Ala Ala Gly Gly Ala Leu Gln Ser 50 55 60 Thr Ala Ser Leu Phe Val Val Ser Leu Ser Leu Leu His Leu Tyr Ser 65 70 75 80 <210> 2 <211> 742 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD44 <400> 2 Met Asp Lys Phe Trp Trp His Ala Ala Trp Gly Leu Cys Leu Val Pro 1 5 10 15 Leu Ser Leu Ala Gln Ile Asp Leu Asn Ile Thr Cys Arg Phe Ala Gly 20 25 30 Val Phe His Val Glu Lys Asn Gly Arg Tyr Ser Ile Ser Arg Thr Glu 35 40 45 Ala Ala Asp Leu Cys Lys Ala Phe Asn Ser Thr Leu Pro Thr Met Ala 50 55 60 Gln Met Glu Lys Ala Leu Ser Ile Gly Phe Glu Thr Cys Arg Tyr Gly 65 70 75 80 Phe Ile Glu Gly His Val Val Ile Pro Arg Ile His Pro Asn Ser Ile 85 90 95 Cys Ala Ala Asn Asn Thr Gly Val Tyr Ile Leu Thr Ser Asn Thr Ser 100 105 110 Gln Tyr Asp Thr Tyr Cys Phe Asn Ala Ser Ala Pro Pro Glu Glu Asp 115 120 125 Cys Thr Ser Val Thr Asp Leu Pro Asn Ala Phe Asp Gly Pro Ile Thr 130 135 140 Ile Thr Ile Val Asn Arg Asp Gly Thr Arg Tyr Val Gln Lys Gly Glu 145 150 155 160 Tyr Arg Thr Asn Pro Glu Asp Ile Tyr Pro Ser Asn Pro Thr Asp Asp 165 170 175 Asp Val Ser Ser Gly Ser Ser Ser Glu Arg Ser Ser Thr Ser Gly Gly 180 185 190 Tyr Ile Phe Tyr Thr Phe Ser Thr Val His Pro Ile Pro Asp Glu Asp 195 200 205 Ser Pro Trp Ile Thr Asp Ser Thr Asp Arg Ile Pro Ala Thr Thr Leu 210 215 220 Met Ser Thr Ser Ala Thr Ala Thr Glu Thr Ala Thr Lys Arg Gln Glu 225 230 235 240 Thr Trp Asp Trp Phe Ser Trp Leu Phe Leu 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Claims (9)

1. 대상으로부터 분리된 생물학적 시료에서 CD24 (cluster of differentiation 24), CD44 (cluster of differentiation 44) 및 SLC16A1 (solute carrier family 16 member 1), 또는 이들을 암호화하는 유전자를 검출하는 단계; 및
   상기 단계에서 측정된 CD24, CD44 및 SLC16A1, 또는 이들을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계를 추가로 포함하고,
   상기 생물학적 시료에서 CD44 단백질 발현 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현이 검출되며,
   대조군 시료 보다 CD24 단백질 발현 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준이 낮고,
   대조군 시료 보다 SLC16A1 단백질 발현 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준이 높은 경우, 췌장암 전이 위험이 높은 것으로 확인하는,
   췌장암 전이를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법.
   
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