KR20110036056A - 전이와 관련된 시그너처 및 결정인자 및 이의 사용 방법 - Google Patents

전이와 관련된 시그너처 및 결정인자 및 이의 사용 방법 Download PDF

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KR20110036056A
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린다 친
케네스 엘 스콧
파피아 고쉬
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다나-파버 캔서 인스티튜트 인크.
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Abstract

본 발명은 바이오마커를 이용한 암의 검출 방법을 제공한다.

Description

전이와 관련된 시그너처 및 결정인자 및 이의 사용 방법{SIGNATURES AND DETERMINANTS ASSOCIATED WITH METASTASIS AND METHODS OF USE THEREOF}
관련 출원
본원은 전문이 본원에 참조 인용되는, 2008년 6월 26일자로 출원된 U.S.S.N. 제61/075,933호의 이익을 주장한다.
기술 분야
본 발명은 일반적으로 암 전이와 관련된 생물학적 시그너처 및 암 전이를 수행하는 유전적 결정인자의 동정, 및 암의 스크리닝, 예방, 진단, 치료, 모니터링 및 예후에 있어서의 상기 생물학적 시그너처 및 결정인자의 사용 방법에 관한 것이다.
전이는 가장 치명적인 고형 종양의 중요한 특성이고, 종양 세포에게 국소 조절을 우회하고 주변 기질을 통해 침습하며, 맥관구조 또는 림프관에서의 이송에 살아남으며, 궁극적으로 외래 표지에서 콜로니를 형성하여 성장하는 능력을 부여하는 유전적 또는 후생적 변경의 조합에 의해 유도되는 복잡한 다단계 생물학적 과정을 나타낸다(문헌[Gaorav P. Gupta and Joan Massague (2006) Cell]). 그러한 전이-부여 유전적 이벤트는 종양이 성장하고 확장함에 따라 추계학적으로 습득될 수 있다는 것은 통상적으로 일치된 사실이고; 실제로, 총 종양 부하량은 전이 위험의 양성 예측인자이다. 한편, 제기된 증거는 일부 종양에 전이 커패시티가 조기 단계로부터 부여되어도 (혹은 부여되지 않아도) 된다는 이론을 고취하였다. 일부 종양이 그것의 수명력에서 조기에서 전이에 대해 "내장된(hard-wired)" 것이라는 것은, 동등한 조기 단계의 종양들(즉, 유사한 종양 부하량)에 있어 광위적으로 다양한 성과들의 임상 관찰에 의해 지지된다. 따라서, 전이의 전사체학적 상태가 다른 전이에 비해 그것의 부합되는 원발성에 더욱 유사한 것으로 나타났다(문헌[Perou et al., 2000]). 또한, 암 게놈에 있어 다수의 게놈 일탈이 양성 단계에서 악성 단계로의 전이 중 조기에 일어남이 입증되었다(문헌[Chin, K., de Solorzano, C. O., Knowles, D., Jones, A., Chou, W., Rodriguez, E. G., Kuo, W. L., Ljung, B. M., Chew, K., Myambo, K., et al. (2004). In situ analyses of genome instability in breast cancer. Nat Genet 36, 984-988.; Rudolph, K. L., Millard, M., Bosenberg, M. W., and DePinho, R. A. (2001). Telomere dysfunction and evolution of intestinal carcinoma in mice and humans. Nat Genet 28, 155-159.]). 다른 저자들에는 [Marcus Bosenberg]가 포함되는데, 그는 진화의 그러한 조기 단계에서 습득된 유전적 이벤트의 특정 보체가 궁극적으로 종양의 적어도 부분적으로 생물학적 거동뿐만 아니라 그것의 전이 가능성을 지시함을 제안한다. 따라서, 본 발명자들은 종양의 전이 가능성의 유전적 결정인자가 조기 단계의 원발성 악성 종양에 선재하며, 그러한 결정인자는 전이성 확산에 원인이 되는 바로 그 공정에서 기능적으로 활성이라는 것을 사실로 받아들인다. 그러므로, 그러한 전이 결정인자는 잠재적 치료 표적일 뿐만 아니라, 암 질병의 공격성의 결정인자이며, 이에 따라 전이성 결정인자는 또한 예후 결정인자이기도 하다.
발명의 개요
본 발명은 부분적으로 특정 생물학적 마커(본원에서 "결정인자(DETERMINANTS)"로 칭해짐), 예컨대 단백질, 핵산, 다형체, 대사물 및 기타 분석물뿐만 아니라 특정 생리학적 병태 및 상태가 전이성 종양 발달의 위험이 증가된 대상 내에 존재하거나 변경된다는 발견에 관한 것이다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 대상 내 전이성 종양의 발달 위험을 평가하는 방법을 제공한다. 전이성 종양의 발달 위험은 대상으로부터의 샘플 내 유효량의 결정인자의 수준을 측정함으로써 결정된다. 대상 내 전이성 종양 발달의 증가된 위험은 샘플 내 결정인자의 수준에서의 임상적으로 유의적인 변경을 측정함으로써 결정된다. 대안적으로, 대상 내 전이성 종양 발달의 증가된 위험은 유효량 결정인자의 수준을 기준 값과 비교함으로써 결정된다. 일부 측면에서, 기준 값은 지수이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상으로부터의 제1 샘플 내 유효량의 결정인자의 수준을 검출하고, 제2 기간에 대상으로부터의 제2 샘플 내 유효량의 결정인자의 수준을 검출하며, 검출된 결정인자의 수준을 기준 값과 비교함으로써, 대상 내 종양의 진행을 평가하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 제1 샘플은 종양에 대한 치료를 받기 전에 대상으로부터 취해지고, 제2 샘플은 종양에 대한 치료를 받은 후에 대상으로부터 취해진다.
다른 한 측면에서, 본 발명은 제1 기간에 대상으로부터의 제1 샘플 내 유효량의 결정인자의 수준을 검출하고, 임의적으로 제2 기간에 대상으로부터의 제2 샘플 내 유효량의 결정인자의 수준을 검출함으로써, 전이성 종양에의 치료 효능을 모니터링하거나 전이성 종양에 대한 치료 섭생법을 선택하는 방법을 제공한다. 제1 기간에 검출된 유효량의 결정인자의 수준은 제2 기간에 검출된 수준 또는 대안적으로는 기준 값과 비교된다. 치료 효능은 대상으로부터의 유효량의 결정인자의 수준에 있어서의 변화에 의해 모니터링된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 종양을 가진 환자를 동정하고(여기서, 유효량의 결정인자는 종양으로부터의 샘플 내 측정 시에 임상적으로 유의적인 방식으로 변경됨), 종양 전이를 예방 또는 감소시키는 치료 섭생법으로 환자를 치료함으로써, 종양을 가진 환자를 치료하는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 유효량의 결정인자의 측정에 의해 전이 위험을 평가함으로써(여기서, 환자로부터의 종양 샘플 내 2개 이상의 결정인자의 임상적으로 유의적인 변경은 환자가 보조 치료를 필요로 함을 가리킴), 보조 치료를 필요로 하는 종양 환자를 선택하는 방법을 제공한다.
다른 한 측면에서, 본 발명은 2개 이상의 결정인자가 임상적으로 유의적인 방식으로 변경될 경우, 환자로부터의 종양 샘플 내 유효량의 결정인자에 대한 정보를 수득하고, 환자 내 종양 전이를 예방 또는 감소시키는 치료 섭생법을 선택함으로써, 종양 환자에 대한 치료 결정을 통지하는 방법을 제공한다.
각종 실시양태에서, 평가/모니터링은 소정의 예측가능성 수준으로 달성된다. 소정의 예측가능성 수준이란, 방법이 허용가능한 수준의 임상적 또는 진단 정확도를 제공함을 의미한다. 임상적 및 진단 정확도는 당업계에 공지된 방법, 예컨대 본원에 기재된 방법에 의해 결정된다.
결정인자에는 예를 들어 본원에 기재된 결정인자 1-360이 포함된다. 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 10개 이상의 개수의 결정인자가 측정된다. 바람직하게, 결정인자 1-25, 41, 61, 62, 63, 66, 74, 96, 99, 103, 126, 135, 137, 138, 177, 190, 210, 212, 217, 218, 227, 239, 261 및 271로부터 선택된 적어도 2개의 결정인자가 측정된다. 임의적으로, 본 발명의 방법은 종양과 관련된 적어도 하나의 표준 매개변수를 측정하는 것을 추가로 포함한다.
결정인자의 수준은 전기영동에 의해 또는 면역화학적으로 측정된다. 예를 들어, 결정인자의 수준은 방사선면역검정, 면역형광검정 또는 효소 결합 면역흡착검정에 의해 검출된다.
대상은 원발성 종양, 재발성 종양, 또는 전이성 종양을 가진다. 일부 측면에서, 샘플은 사전에 종양에 대해 치료를 받은 대상으로부터 취해진다. 대안적으로, 샘플은 종양에 대해 치료를 받기 전에 대상으로부터 취해진다. 샘플은 코어 생검(core biopsy), 절제(excisional) 조직 생검 또는 절개(incisional) 조직 생검, 또는 순환 종양 세포를 가지는 혈액 샘플과 같은 종양 생검이다.
또한 결정인자 1-360로부터 선택된 유효량의 2개 이상의 마커의 마커 수준의 패턴을 포함하는 전이성 종양 기준 발현 프로파일도 본 발명에 포함된다. 바람직하게, 프로파일은 결정인자 1-25, 41, 61, 62, 63, 66, 74, 96, 99, 103, 126, 135, 137, 138, 177, 190, 210, 212, 217, 218, 227, 239, 261 및 271의 마커 수준의 패턴을 포함한다. 또한 하나 이상의 전이성 종양 기준 발현 프로파일 및 임의적으로는 부가적 시험 결과 및 대상 정보를 포함하는 기계로 판독가능한 매체도 포함된다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 상응하는 결정인자를 검출하는 복수개의 결정인자 검출 시약을 포함하는 키트를 제공한다. 검출 시약은 예를 들어 항체 또는 이의 단편, 올리고뉴클레오티드 또는 압타머이다.
다른 한 측면에서, 본 발명은 종양의 전이 또는 진행과 관련된 생리학적 또는 생화학적 경로를 가리키는 1개 이상의 결정인자를 포함하는 결정인자 패널을 제공한다. 생리학적 또는 생화학적 경로는 예를 들어 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 유전자 표적 목록을 생산하는 대조군과 대비하여 질병 내 하나 이상의 차별적 발현 유전자를 동정하고; 질병의 진행의 기능적 측면과 관련된 표적 목록 상의 하나 이상의 유전자를 동정함으로써, 질병에 대해 예후적인 바이오마커를 동정하는 방식을 제공한다. 기능적 측면은 예를 들어, 세포 이동, 혈관형성, 세포외 기질 분해 또는 아노이키스 내성이다. 임의적으로, 본 방법은 제2 유전자 표적 목록을 생산하는 진화적으로 보존된 변화를 포함하는 유전자 표적 목록 상의 하나 이상의 유전자를 동정하는 것을 포함한다. 질병은 예를 들어 암, 예컨대 전이성 암이다.
결정인자의 활성 또는 발현을 조절하는 화합물은, 결정인자를 발현하는 세포를 제공하여, 그 세포를 후보 화합물을 포함하는 조성물과 (예를 들어, 생체내, 체외 또는 시험관내) 접촉시키며; 물질이 결정인자의 활성의 발현을 변경시키는지의 여부를 결정함으로써 동정된다. 화합물의 존재 하에 관찰되는 변경이 세포가 화합물이 결핍된 조성물과 접촉 시에는 관찰되지 않을 경우, 동정된 화합물은 결정인자의 활성 또는 발현을 조절한다.
암은 대상에게 결정인자의 활성 또는 발현을 조절하는 화합물을 투여하거나, 혹은 대상에게 결정인자에 의해 조절되는 화합물의 활성 또는 발현을 조절하는 제제를 투여함으로써, 치료된다. 화합물은, 예를 들어 (i) 결정인자 폴리펩티드; (ii) 결정인자를 코딩하는 핵산, (iii) 결정인자를 코딩하는 핵산의 발현 또는 활성을 감소시키는 핵산 및 이의 유도체, 단편, 유사체 및 상동체, 및 (iv) 결정인자에 대해 특이적인 항체와 같은 결정인자의 발현 또는 활성을 감소시키는 폴리펩티드일 수 있다. 본원에 사용되는 용어 "항체"(Ab)에는 요망되는 생물학적 활성을 나타내는 한, 단클론 항체, 다클론 항체, 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체), 인간화된 항체 또는 인간 항체, Fv 항체, 디아바디 및 항체 단편이 포함된다. 예를 들어, 화합물은 TGFβ이고, 제제는 TGFβ 억제제이다. 또 다른 예는 CXCR4이고, 제제는 CXCR4 길항자이다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련가에 의해 통상 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다. 본원에 기재된 방법 및 물질과 유사하거나 균등한 방법 및 물질이 본 발명의 수행에 사용될 수 있으나, 적당한 방법 및 물질이 이하에 기재된다. 본원에 언급된 모든 공보, 특허 출원 및 기타 참조문헌은 그 전문이 명시적으로 참조 인용된다. 상충하는 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 우선이 될 것이다. 부가적으로, 본원에 기재된 물질, 방법 및 예는 단지 예시적인 것으로, 제한하고자 하는 의도는 없다.
본 발명의 다른 특성 및 이점은 하기 발명의 상세한 설명 및 특허청구범위로부터 명백하게 되며, 그것들에 포함된다.
도 1은 멜라닌세포 특이적 MET 발현이 피부 흑색종의 형성을 촉진함을 도시한다. (A) 멜라닌세포를 표시된 동물로부터 회수하여, 배양에 적합화하였다. 총 RNA를 독시사이클린(DOX)의 존재 또는 부재 하에 성장한 배양된 멜라닌세포로부터 추출하여, MET(Tg MET)의 발현을 도입유전자 특이적 프라이머를 이용한 RT-PCR에 의해 검정하였다. R15, 리보솜 단백질 R15 내부 대조군; -RT, 역전사효소가 없는 PCR 대조군. (B) 원발성 종양(T1-T6)을 독시사이클린에 대해 iMet 동물로부터 회수하여, 유전자 특이적 프라이머를 이용한 RT-PCR에 의해 멜라닌세포 마커 티로시나제, TRP1 및 Dct의 발현에 대해 평가하였다. XB2, 마우스 각질형성세포 세포주; B16F10, 마우스 흑색종 세포주; R15, 리보솜 단백질 R15 내부 대조군; -RT, 역전사효소가 없는 PCR 대조군. (C) MET 유도 원발성 흑색종에서의 S100의 멜라닌세포 특이적 면역조직화학적 염색, t, 종양; f, 난소(folicule); fm, 난소(folicular) 멜라닌세포; a, 지방세포(adipocyte). (D) MET 유도 원발성 흑색종에서의 총 c-Met 및 인산화 c-Met의 면역조직화학적 염색. (E) RT-qPCR을 수행하여, MET 유도 원발성 흑색종(T1-T6)에서의 HGF 발현을 분석하였다. 종양 발현 데이터가 2개의 Ink4a/Arf-/- 멜라닌세포 세포주 내 발현에 대해 정규화되어 있다.
도 2는 Met 활성화가 전이성 흑색종의 발달을 유도하고 폐 파종(seeding)을 촉진함을 도시한다. (A) 보이덴(Boyden) 체임버를 무혈청 배지에서 5×104개 iMet 종양 세포(세포주 BCO 14)로 파종하였다. 체임버를 50 ng/ml 재조합 HGF가 부재 또는 존재하는 화학주성인자(10% 혈청 함유 배지)에 두고, 24 시간 동안 항온배양하였다. 침습성 세포를 크리스탈 바이올렛로 염색하여 가시화하였다. (B) 독시사이클린으로 유도된 iMet 유전자도입 마우스의 등 피부 내의 원발성 피부 축 세포 흑색종, 및 림프절 부신 및 폐에 있는 원위 전이의 H&E 염색 구획. (C) 5×105개 세포를 SCID 및 마우스의 꼬리 정맥에 주입한 후, 폐 결절을 형성시켰는데, 이는 전이성 파종과 상관된다. 좌측 패널: HRAS* 흑색종 세포주를 주입한 SCID 동물 꼬리 정맥으로부터 회수된 무결절 폐 조직의 H&E 염색 구획(0/4 마우스); 우측 패널: MET 유래 BC014 세포주(iMet)를 주입한 SCID 꼬리 정맥으로부터 회수된 결절 침투 폐 조직의 H&E 염색 구획(3/4 마우스), t, 종양.
도 3. 세포 침습에 대한 저복잡도 기능적 유전 스크린과 결부된 다차원 교차종 게놈 분석이 전이 결정인자를 동정함을 도시한다. (A) iHRAS* 및 iMet 피부 흑색종으로부터 생성된 발현 프로파일의 SAM 분석에 의한 차별적 발현 유전자(1597개의 프로브 세트)를, 인간 전이성 흑색종의 증폭 및 검출 영역 내에 상주하는 유전자, 또는 360개 후보를 한정하는 인간 원발성 흑색종과 전이성 흑색종 간의 차별적 발현 유전자와 이종상동성 매핑에 의해 상관교차하였다. (B) iHRAS*와 iMet 마우스 흑색종(1597개의 프로브 세트, 상단)과 교차종 통합 유전자 목록(360개의 여과된 유전자 목록, 하단) 간의 차별적 발현 유전자의 인제뉴어티 패쓰웨이 분석(Ingenuity Pathways Analysis)을 같은 크기의 9개의 무작위 인출 유전자 세트와 비교하였다. 상위 4개의 유의적 기능적 계층이 나와 있다. 점선은 IPA에 의한 유의도를 나타낸다. (C) 침습에 대한 저복잡도 유전 스크린을 나타내는 흐름도. 렌티바이러스계에서 발현된 295개의 상향제어/증폭된 후보 중 199개를 나타내는 230개 클론을 개별적으로 TERT-불멸화 인간 원발성 멜라닌세포(HMEL468) 내로 형질유도하여, 96-웰 마트리젤(matrigel) 침습 플레이트에서 침습에 대해 검정하였다. 침습도를 형광 매개 정량화를 통해 측정하고, 값을 GFP 대조군에 대해 정규화하였다. 2개의 독립적 스크린(n=45)에서 벡터 대조군과 2X 표준 편차 초과로 떨어진 후보 스코어링을 표준 24-웰 마트리젤 침습 체임버를 이용한 HMEL468 또는 WM3211에서의 2차 검증 스크린에 대해 선택하였다. (D) 침습 지지 유전자에 대한 저복잡도 유전 스크린의 히스토그램 요약. HMEL468로 프라이밍된 멜라닌세포를 개별 프로-전이 후보 cDNA 바이러스로 형질유도한 후, 96-웰 트랜스웰 침습 검정 플레이트 상에 로딩하였다. 침습도를 형광 매개 정량화를 통해 측정하고, 값을 빈 벡터 대조군에 대해 정규화하였다. 2개의 독립적 스크리닝 연구에서 GFP 대조군과 침습 2X 표준 편차를 유도하는 후보 cDNA는 일차 스크린 히트로 간주되었다(n=45). (E) 대조군과 대비한 31개의 검증된 전이 결정인자의 침습성 활성의 배수 증가에 대한 요약 히스토그램.
도 4는 (A) 문헌 [Camp, R. L., Chung, G. G., & Rimm, D. L., Automated subcellular localization and quantification of protein expression in tissue microarrays. Nat Med 8 (11), 1323-1327 (2002)]에 기재된 바와 같은, 모반, 원발성 흑색종 및 전이성 흑색종 종양 시편의 조직 마이크로어레이(TMA)로 수행된 대표적 결정인자 Fascin1(FSCN1) 및 (B) HSF1에 대한 단백질 발현의 자동화 정량 분석(AQUA
Figure pct00001
)을 도시한다. 정보성 코어는, 각기 세포질 세포 구획 및 핵 세포 구획에서의 FSCN1 및 HSF1 염색에 대한 AQUA
Figure pct00002
스코어에 대해 평가하였다. 피셔(Fisher's) 시험에 기초한 유의도(S; 5%). 결과 요약에 대해 표 2를 참조한다.
도 5는 295 단계 I-II 유방암의 코호트에서 상기로부터의 2개 하위부류의 전반적 생존(상단) 및 무전이(하단) 생존율에 대한 (A) K-평균 계층적 클러스터링 및 (B) 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 분석을 도시한다[유방암 데이터 출처: 문헌[van de Vijver, M. J. et al., A gene-expression signature as a predictor of survival in breast cancer. N Engl J Med 347 (25), 1999-2009 (2002); van t Veer, L. J. et al., Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature 415 (6871), 530-536 (2002)]].
도 6은 시험관내 아노이키스 스크린 방법을 도시한다. (A) 시험관내 아노이키스 스크린 전략법. (B) 래트 장 상피(RIE) 세포는 저-부착 플레이트에 플레이팅 시에 생육성을 감소시켰다. RIE 세포를 24시간 동안 96-웰 ULC 플레이트 또는 부착 플레이트 상에 플레이팅하였다. ATP 수준을 세포 생육성에 대해 측정하였고, 시간 24 hr/0 hr에서의 수준의 비로 제시된다. (C) RIE는 V5-mTrkB를 발현한다. RIE 세포를 감염시키고, 48시간에 세포 용해물을 단리하여, SDS-PAGE에 의해 분석하였다. α-V5 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 분석을 행하였다.
도 7은 각종 유전자가 RIE 세포에 아노이키스 내성을 부여함을 도시한다. RIE 세포를 초저 클러스터 플레이트 상에 플레이팅된 후보 유전자들 중 하나를 발현하는 레트로바이러스로 감염시켰고, 세포의 생육성을 플레이팅 후 24시간째에 측정하였다. 값은 0 hr 생육성에 대한 상대값으로 주어진다. 모든 판독은 삼벌로 행하였다. 빈 벡터, BDNF 또는 mTrkB(양성 대조군)의 판독이 강조 표시되어 있다.
도 8은 중앙치에서 2 초과의 표준 편차 차이가 있는 래트 장 상피(RIE) 세포에 아노이키스 내성을 부여하는 20개의 후보 유전자를 도시한다. 9개의 후보 유전자(HNRPR, CDC20, PRIM2A, HRP12, ENY2, MGC14141, RECQL, STK3 및 MX2)는 2개의 독립적 스크린에서 중앙치로부터 1 초과의 표준 편차를 제공하였다. 이 유전자는 표시된 염색체 상에 위치한다.
도 9. 유전자가 현탁액 내 유지된 후 RIE 세포를 부착시키는 능력을 부여한다. 후보 유전자를 발현하는 RIE 세포를 ULC 플레이트 상에 24시간 동안 플레이팅하였다. 현탁액 중 세포를 부착 플레이트로 옮기고, 24시간 후에 부착된 세포를 크리스탈 바이올렛로 염색하였다. 세포 생육성은 24 hr/0 hr로 제시된다. 모든 판독은 삼벌로 행해진다.
도 10은 전이 결정인자가 종양발생성을 촉진함을 도시한다. (A) GFP 또는 표시된 전이 결정인자를 안정하게 발현하는 HMEL468 세포를 SCID 마우스에 피하 주사하였고(n=6), 이를 임상 시험에 의해 종양 형성에 대해 모니터링하였다. 주위 근육 섬유(m) 및 지방세포(a)를 통한 국소 침습을 나타내는 대표적 H&E 염색 원발성 종양(t)이 도시되어 있다. (B) 데이터가 요약된 표는 결정인자 유래 종양발생 검정을 구성한다.
도 11은 결정인자 HOXA1이 세포 침습 및 폐 파종 커패시티를 촉진함을 설명한다. (A) HMEL468 내 HOXA1의 이소성 발현은 FAK(Tyr397; 좌측 패널)의 증가된 활성화 및 이에 상응하는 트랜스웰 침습 검정에서의 마트리젤을 통한 침습 증가(우측 패널; 도 11C에 정량화되어 있음)를 초래하였다. (B) 도 11C에서 정량화를 위한, WM1115 및 WM3211 형질유도 세포주에서의 HOXA1 발현(좌측 패널) 및 트랜스웰 침습 검정의 대표적 화상(우측 패널)을 확인하기 위한 H0XA1-V5에 대한 웨스턴 블롯 분석. (C) 도 11A-B에 제시된 침습 체임버 데이터의 정량화. (D) GFP 또는 HOXA1을 안정하게 발현하는 HMEL468 세포를 SCID 마우스(n=6)의 꼬리 정맥에 정맥내 주사하여, 주사 후 12주째에 폐 결절에 대한 검시로 조사하였다. 거시적 (및 미시적) 폐 결절을 HOXA1 코호트(n=3) 중 50%에서 검출하였으나, 어느 대조군에서도 검출하지 않았다. HMEL468-HOXA1를 주사한 동물로부터 절제된 폐 결절(t) 및 주위 폐 실질(1)의 대표적인 H&E 현미경사진. (E) 빈 벡터(EV) 또는 HOXA1을 발현하는 WM115 흑색종 세포를 누드 마우스에 피하 주사하고, 주사후 46시간째에 측정하였다. (F) 피부내 주사한 WM115-H0XA1 세포를 가지는 누드 마우스로부터 단리된 폐의 대표적 전이.
도 12은 HOXA 1 유래 전사체 분석으로 인제뉴어티 패쓰웨이 분석에 의해 정의되는 Smad3 네트워크가 동정됨을 도시한다. 분자 네트워크는 인제뉴어티 패쓰웨이 분석(인제뉴어티 시스템즈 인코포레이티드)(Ingenuity Systems Inc.)로 생성되었다. 네트워크는 마디(유전자) 및 가장자리(마디 간의 생물학적 관계)로서 그래프로 표시되어 있다. 실선은 직접적 상호작용을 나타내고, 점선은 간접적 상호작용을 나타낸다. 적색 및 녹색은 각기 전사체 분석에서 과다발현된 유전자 또는 과소발현된 유전자를 나타낸다. 대상의 모양은 단백질이 속하는 기능적 패밀리를 나타낸다. 유전자 패밀리 및 설명에 대해 표 s3을 참조한다. (B) 표시된 HOXA1로 형질유도된 세포주를 RT-qPCR을 이용하여 SMAD3 발현에 대해 평가하였다. 값을 GAPDH 내부 대조군 및 GFP 실험 대조군에 대해 상대적으로 산출되었다. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다.
도 13은 HOXA1의 이소성 발현이 TGFβ 신호전달 반응의 상향제어를 통해 세포 침습을 증진시킴을 도시한다. (A) HOXA1을 이소발현하는 WM115 세포를 TGFβ-유도성 3TP-Lux 루시퍼라제 리포터로 형질감염한 후, TGFβ로 처리 또는 비처리하여, GFP-발현 대조군 대비 반응성을 평가하였다. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다. 2 테일(Two-tailed) t-테스트: -TGFβ p=0.003; +TGFβ, p<0.0001. (B) TGFβ로 처리 또는 비처리하여 10% 혈청 또는 1% 혈청 중 증식된, GFP 또는 HOXA1를 안정하게 발현하는 WM115 세포로부터의 전세포 용해물을, 표시된 항체를 이용하여 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. (C) HOXA1을 안정하게 발현하는 WM115 세포를 SMAD3 shRNA(shSMAD3) 또는 비표적화 shRNA(shNT)로 형질유도하여, 마트리젤 트랜스웰 침습 체임버로 로딩하여, GFP 대조군 대 (GFP)로 형질유도된 WM115 모 세포주와 대비하여 세포 침습을 검정하였다. 침습 체임버의 대표적인 화상이 우측 패널에 나와 있다. 2-테일 t-테스트: GFP 대 shNT, p=0.0008, shNT 대 shSMAD3, p=0.0022. (D) 빈 벡터(EV) 또는 HOXA1을 발현하는 WM115 흑색종 세포를 누드 마우스에 피하 주사하였다. 생성된 이종이식편 종양 구획을 항-포스포-SMAD3으로 면역염색하여, HOXA1 종양 시편에서의 SMAD3 활성화를 확인하였다.
도 14. FSCN1 또는 HOXA1을 과다발현하는 HRAS*(M3HRAS)로 형질유도된 Ink4a/Arf-/- 마우스 유래 멜라닌세포는 (A) 트랜스웰 침습 검정에서의 마트리젤을 통한 침습을 증진시켰고, (B) 누드 마우스에서 피하 종양 성장을 증가시켰으며, (C) SCID 마우스 내로의 정맥내 꼬리 정맥 주사 후의 폐 결절 형성을 증가시켰다. C에서, FSCN1 코호트에 대한 폐/신체 질량 지수 차이는, 극히 아픈 HOXA1 코호트에 의해 지배되는 검정 종점에서 상기 동물의 상대적으로 양호한 건강으로 인해 유의적이지 않음을 주목한다.
도 15. 빈 벡터(대조군) 또는 HOXA1(군 1)을 발현하는 (A) WM115 흑색종 세포 및 (B) 형질전환된 인간 멜라닌세포(HMEL468)로부터 추출된 RNA을 RT2 프로파일러(RT2 Profiler) PCR 어레이(수퍼어레이(Superarray))를 이용한 정량 qPCR 분석에 사용하여, 전이와 관련된 유전자의 패널의 발현을 분석하였다. 생성된 이종이식편 종양 구획을 항-CXCR4로 면역염색하여, HOXA1 종양 시편 내 과다발현을 확인하였다(도 13). 대조군과 실험군 간의 역가 차별 발현을 충족하는 유전자가 나와 있다.
도 16. 빈 벡터(EV) 또는 HOXA1을 발현하는 WM115 흑색종 세포 및 형질전환된 인간 멜라닌세포(HMEL468)를 누드 마우스에 피하 주사하였다. 생성된 이종이식편 종양 구획을 항-CXCR4로 면역염색하여, HOXA1 종양 시편 내 과다발현을 확인하였다.
도 17. (A) 스피츠(Spitz) 모반 및 흑색종 FFPE 시편의 코호트 내 UBE2C의 RNA 발현의 정량유전자 분석. (B) 원발성 Ink4a / Arf 결핍 MEF를 HRASV12, MYC 및 UBE2C를 발현하는 표시된 벡터로 형질감염시켰다. Vec = LacZ 벡터 대조군; 막대는 ±SD를 가리킨다.
도 18. (A) 빈 벡터(ev), 제미닌(Geminin) 또는 Nedd9(양성 대조군)를 안정하게 발현하는 WM3211 흑색종 세포를 트랜스웰 침습 검정에서 마트리젤을 통한 침습에 대해 검정하였다. (B) 빈 벡터(ev), 제미닌 또는 카베올린1(Caveolin1)(음성 대조군)을 안정하게 발현하는 WM3211 세포로부터 추출된 총 세포 용해물의 면역블롯 분석. 항-포스포 FAK 및 항-포스포 ERK는 각기 활성화된 FAK 종 및 ERK 종을 나타낸다. (C) 빈 벡터(EV) 또는 제미닌(GEMN)을 안정하게 발현하는 WM3211 세포를 포스포-FAK에 대해 면역염색하여(P-FAK, 적색), 도 18B에서 관찰되는 증가된 FAK 활성화를 확인하였다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 전이성 종양 또는 전이성 종양의 발병 위험과 관련된 시그너처, 또는 대상에게 전이성 종양 또는 전이성 종양의 발병 위험을 부여하는 결정인자의 동정에 관한 것이다.
인간 데이터와 마우스 데이터 간의 교차종 비교는 인간 흑색종 생물학에 대한 원인성 암 유전자의 동정을 위한 생물학적 필터를 제공하는 것으로 입증되었다. 현 연구에서, 뚜렷한 전이 가능성을 나타내는 원발성 종양을 가지는 흑색종의 2개의 마우스 모델을 사용하여, 전이에서 차별적으로 발현된 유전자를 동정하였다. 전이성(iMet) GEM 모델 및 비전이성(iHRAS*) GEM 모델로부터 비롯된 원발성 종양의 발현 프로파일 비교로써 교차종 분석에 의한 생물학적 여과에 의해 우선순위지정되는 1597개의 차별적 발현 유전자의 목록이 동정되었고, 이는 어레이-CGH에 의해 수득된 증폭 및 검출의 패턴과 중첩된다. (예를 들어 마우스 및 인간에서의) 진화적으로 보존된 변화는 필수적일 경향이 더 큰 것으로 가설 제기되었고; 이에 따라 GEM 모델로부터의 발현 데이터(이는 한정된 유전적 배경 및 명확한 표현형 상관관계의 이점을 가짐)와 인간 전이성 종양으로부터의 게놈 데이터의 삼각 측량은 우선순위지정하도록 하였고, 1597개 후보에 대한 인간 관련성을 지정하였다.
295개의 상향제어/증폭된 유전자 및 65개의 하향제어/결실 유전자의 표현형 유래의 진화적으로 보존된 전이 후보 목록을, 피부 흑색종의 2개의 유전적으로 조작된 마우스 모델의 전사체를 차별적 전이 가능성과 비교한 후, 인간 원발성 흑색종 및 전이성 흑색종의 게놈 프로파일과 전사체학 프로파일을 삼각 측량함으로써 동정하였다. 이 후보를 전이 확산에 있어서의 3개 주요 단계(즉, 원발성 종양 부위에서의 이탈, 순환, 원위 외래 부위에서의 최종 콜로닝 형성 및 증폭)에 상응하는, 침습, 아노이키스 내성 또는 생존에 대한 저복잡도 유전 스크린에 포함시켰다. 따라서, 침습 스크린은 TERT-불멸화 인간 멜라닌세포 및 흑색종 세포에 침습 지지 활성을 부여할 수 있는 31개의 검증된 전이 결정인자를 한정하였다. 전이 후보의 독립적 서브세트는 있다해도 단지 부분적으로만, 침습 스크린으로부터의 결정인자와 중첩되는 아노이키스 내성 또는 콜로니 형성 스크린으로부터의 부가적 결정인자로서 정의될 것으로 예상된다. 따라서, 아노이키스 내성 스크린은 침습 결정인자와 중첩되지 않고, 현탁액 중 생존을 부여할 수 있는 9개의 검증된 결정인자를 한정하였다. 이 결정인자들 모두 또는 이들의 서브세트는 전이성 확산에 관련된 주요 단계를 포괄할 것이다.
원발성 종양은 유전적으로 이종성이라는 것이 인식되어 있다. 원발성 종양 내의 하위집단 내 전이 결정인자가 증식 우위를 부여하고, 궁극적으로 그것이 원위 부위에 확산되도록 유도하는 경우, 전이성 유도체가 그것의 원발성 상대에 대해 더욱 동종성이 될 것으로 예상되며, 그러므로 그러한 전이 결정인자의 확산에 대한 진행-상관된 패턴을 나타낸다. 이 결정인자들 중 25개의 발현 패턴을 평가하기 위해, 본 발명자들은 온코마인에 대한 발현 프로파일링 데이터의 개요서를 이용하였다(문헌[Rhodes D. R. et al., ONCOMINE: a cancer microarray database and integrated data-mining platform. Neoplasia 6, 1-6 2004]). 그러나, 대다수의 상기 25개의 전이 결정인자들 중 대다수는 침습 또는 전이 내에 특이적으로 연루되지 않았을지라도, 이들 모두는 흑색종 및 비흑색종 고형 종양 모두에 종양 등급 또는 예후가 진행되는 것과 유의적으로 상관된 발현 패턴을 나타낸다. 예를 들어, 25개 결정인자 중 12개 결정인자가 전이 상대적 원발성 질병에서 증가된 발현을 나타낸다. 뇌(신경교종) 종양, 또 다른 간엽세포 종양, 예컨대 흑색종에서, 전이 결정인자들 중 13개는 진행 상관된 발현 패턴을 나타냈고, 즉 보다 높은 등급의 신경교종에서의 발현을 증가시켰다. 이들 중, 6개의 성과와의 양성 상관관계를 나타냈다. 전립선 선암에서, 전이 결정인자들 중 10개는 원발성에서 전이로의 발현의 유의적 증가를 나타냈다. 폐에서는, 5개가 종양 등급 증가와의 상관관계를 나타냈다. 가장 유의적인 중첩이 유방선암에서 관찰되었는데, 여기서 25개 전이 결정인자들 중 13개는 종양 진행의 단계 또는 등급과의 상관관계를 나타냈고; 또한 결정인자들 중 13개는 예후와 상관된 것으로 보고되었다.
따라서, 본 발명은 전이성 종양을 가지는 대상, 또는 전이성 종양에 대해 증상이 없는 대상을 포함한, 전이성 종양과 관련된 결정인자의 검출에 의해 전이성 종양을 경험할 위험이 있는 대상을 동정하는 방법을 제공한다. 이 시그너처 및 결정인자는 암에 대한 치료 및 요법을 받는 대상을 모니터링하는 데 유용하고, 또한 암을 가진 대상에게 효능적인 요법 및 치료를 선택하거나 변경하는 데 유용하며, 여기서 상기 치료 및 요법의 선택 및 이용은 종양 진행을 감속시키거나, 종양의 개시를 실질적으로 지연 또는 예방시키거나, 혹은 종양 전이의 발병율을 감소 또는 예방한다.
정의
"정확도"란 측정량 또는 산출량(시험 보고값)의 그것의 실제 (또는 진정한) 값에 대한 순응 정도를 지칭한다. 임상적 정확도는 진정한 성과의 분율(진정한 양성(TP) 또는 진정한 음성(TN) 대 잘못 분류된 성과(허위 양성(FP) 또는 허위 음성(FN))에 관한 것이고, 감도, 특이성, 양성 예측성 값 (PPV) 또는 음성 예측성 값 (NPV), 또는 다른 측정값들 중에서도 가능성, 오즈비(odds ratio)로서 언급될 수 있다.
본 발명의 범주 내에서의 "결정인자"는 비제한적으로, 단백질, 핵산 및 대사물뿐만 아니라 이들의 다형체, 돌연변이, 변이체, 변형체, 서브유닛, 단편, 단백질-리간드 복합체 및 분해 산물, 단백질-리간드 복합체, 요소, 관련 대사물, 및 다른 분석물 또는 샘플 유래 측정물을 포괄한다. 결정인자는 또한 돌연변이화된 단백질 또는 돌연변이화된 핵산도 포함할 수 있다. 결정인자는 또한 건강 상태의 비혈액계 인자 또는 비분석물 생리학적 마커, 예컨대 본원에 정의된 "임상적 매개변수"뿐만 아니라 역시 본원에 정의된 "통상적 실험실 위험 인자"도 포괄한다. 결정인자는 또한 수학적으로 발생된 임의의 산출된 지수, 및 일시적 경향 및 차이를 비롯한 상기 측정들 중 임의의 하나 이상의 조합도 포함된다. 이용가능한 경우, 또한 본원에 달리 기재되지 않는다면, 유전자 산물인 결정인자는 엔트레즈 유전자(Entrez Gene)로도 알려진, 국제 인간 게놈 기관 명명 위원회(Human Genome Organization Naming Committee; HGNC)에 의해 지정되어 미국 국립 생명과학 정보 센터(US National Center for Biotechnology Information; NCBI)웹사이트(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=gene)에 본 출원일자에 열거된 공식적 문자 약어 또는 유전자 기호에 기초하여 동정된다.
"결정인자" 또는 "결정인자들"은 전이성 종양을 가지거나 전이성 종양이 발달되게 되어 있거나, 전이성 종양 개별 결정 인자의 위험이 있는 대상에서 수준이 변화하는 모든 핵산 또는 폴리펩티드 중 하나 이상을 포괄한다. 개별 결정인자가 표 1에 요약되어 있고, 본원에서 특히 "전이성 종양 관련 단백질", "결정인자 폴리펩티드", 또는 "결정인자 단백질"로 집합적으로 칭해진다. 폴리펩티드를 코딩하는 상응하는 핵산은 "전이성 종양 관련 핵산", "전이성 종양 관련 유전자", "결정인자 핵산", 또는 "결정인자 유전자"로 칭해진다. 달리 표시되지 않는 한, "결정인자", "전이성 종양 관련 단백질", 및 "전이성 종양 관련 핵산"은 본원에 개시된 서열 중 임의의 것을 칭함을 의미한다. 결정인자 단백질 또는 핵산의 상응하는 대사물도 또한 측정될 수 있을 뿐만 아니라, 상기 통상적 위험 마커 대사물들 중 임의의 것도 측정될 수 있다.
(예를 들어, 연령, 가족력, 및 통상적 위험 인자로 통상 사용되는 기타 측정값과 같은) 건강 상태의 생리학적 마커는 "결정인자 생리학적 성질"로 칭해진다. 상기 부류들의 결정인자들 중 1개 이상, 바람직하게는 2개 이상의 측정값들의 수학적 조합으로 발생된 산출 지수는 "결정인자 지수"로 칭해진다.
"임상적 매개변수"는 대상 건강 상태의 모든 비-샘플 또는 비-분석물 바이오마커, 또는 기타 특징들, 예컨대 단 비제한적으로 연령(Age), 인종(RACE), 성별(Sex), 또는 가족력(FamHX)을 포괄한다.
"순환 내피 세포"("CEC")는 염증을 비롯한, 특정 환경 하에 혈류로 들어가는 혈관의 내벽으로부터의 내피 세포이며, 암 발병과 관련된 신 맥관구조의 형성에 기여한다. CEC는 종양 진행 및/또는 항혈관형성 요법에 대한 반응의 마커로서 유용할 수 있다.
"순환 종양 세포"("CTC")는 전이 시에 원발성 종양으로부터 나와 순환에 들어가는 상피 기원의 종양 세포이다. 말초혈 내 순환 종양 세포의 수는 전이성 암을 가진 환자에서의 예후와 관련된다. 이 세포는 상피 세포를 검출하는 면역학적 방법을 이용하여 분리되고 정량화될 수 있다.
"FN"는 질병 상태 시험에 있어, 질병 대상을 올바르지 않게 무질병 또는 정상으로 분류함을 의미하는 허위 음성이다.
"FP"는 질병 상태 시험에 있어, 정상적 대상을 올바르지 않게 질병을 가진 것으로 분류함을 의미하는 허위 양성이다.
"식(formula)", "알고리즘", 또는 "모델"은 하나 이상의 연속 또는 범주화 입력값(본원에서 "매개변수"로 칭해짐)을 취하여, 간혹 "지수" 또는 "지수 값"으로 칭해지는 출력 값을 계산하는 임의의 수학 방정식, 알고리즘, 분석적 또는 프로그래밍된 공정, 또는 통계학적 기법이다. "식"의 비제한적 예에는 합, 비 및 회귀 작용자, 예컨대 계수 또는 지수, 바이오마커 값 변형 및 정규화(이에는 비제한적으로 임상적 매개변수, 예컨대 성별, 연령 또는 인종이 포함됨), 규칙 및 지침, 통계학적 부류 모델 및 역사적 집단에 대해 훈련된 신경 네트워크에 기초한 상기 정규화 반응식을 포함함)이 포함된다. 결정인자 및 다른 결정인자를 조합하는 데 특히 사용되는 것은, 대상 샘플에서 검출되는 결정인자의 수준과 대상의 전이성 질병 위험 간의 관계를 결정하는 선형 및 비선형 방정식 및 통계학적 부류 분석이다. 패널 및 조합 구성에서, 특히 관심 대상이 되는 것은 무엇보다도 교차상관, 주요 성분 분석(Principal Components Analysis; PCA), 인자 회전, 로지스틱 회귀(Logistic Regression; LogReg), 선형 판별 분석(Linear Discriminant Analysis; LDA), 아이젠진 선형 판별 분석(Eigengene Linear Discriminant Analysis; ELDA), 지지 벡터 기기(Support Vector Machines; SVM), 무작위 포레스트(Random Forest; RF), 재귀 분할 트리(Recursive Partitioning Tree; RPART)뿐만 아니라, 기타 관련 결정 트리 분류 기법, 쉬런켄 센트로이드(Shrunken Centroids; SC), 스텝AIC(StepAIC), K번째-최근접 이웃(Kth-Nearest Neighbor), 부스팅(Boosting), 결정 트리, 신경 네트워크(Neural Networks), 베이스 네트워크(Bayesian Networks), 지지체 벡터 기기, 및 히든 마르코프 모델(Hidden Markov Models)과 같은 확립된 기법을 포함한 패턴 인식 특성을 이용한, 구조적 및 구문 통계학적 부류 알고리즘, 및 위험 지수 구성 방법이다. 다른 기법들이 당업자에게 공지된, 콕스(Cox), 와이불(Weibull), 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 및 그린우드(Greenwood) 모델을 비롯한, 생존 및 위해요소 분석 수행 시간에 사용될 수 있다. 이 기법들 중 상당수가 결정인자 선택 기법, 예컨대 전방 선택, 후방 선택, 또는 단계별 선택, 주어진 크기의 모든 가능한 패널의 완전 열거, 유전적 알고리즘과 조합되어 사용가능하거나, 자체 기법 내에 바이오마커 선택 방법들을 포함할 수도 있다. 이들은 정보 기준, 예컨대 아카이케 정보 기준(Akaike's Information Criterion; AIC) 또는 베이스 정보 기준(Bayes Information Criterion; BIC)과 결부되어, 부가적 바이오마커와 모델 향상 간의 교환을 정량화하고, 오버핏(overfilt)을 최소화하는 것을 도울 수 있다. 생성된 예측성 모델이 다른 연구에서 검증되거나, 부트스트랩(Bootstrap), 리브-온-아웃(Leave-One-Out)(LOO) 및 10배 교차검증(10배 CV)와 같은 기법을 이용하여, 그것이 원래 훈련받았던 연구에서 교차검증되었다. 각종 단계들에서, 허위 발견율을 당업계에 공지된 기법에 따른 값 순열에 의해 평가될 수 있다. "보건 경제 효용 함수"는 관리(care) 표준에 진단 또는 치료 중재법을 도입하기 전 및 후 모두에 있어, 적용가능한 이상화된 환자 집단에서 일정 범위의 임상 성과의 예상 확률들의 조합으로부터 유래되는 식이다. 그것은, 관리(서비스, 용품, 장치 및 약물 등)의 실제 보건 시스템 비용으로부터 유래되고/되거나, 각 성과를 초래하는 품질 조정 연 수명(quality adjusted life year; QALY) 당 허용가능한 평가값으로서 유래될 수 있는, 상기 중재법의 정확도, 효능 및 성능 특징의 평가값, 및 각 성과와 관련된 비용 및/또는 값 측정(유동도)를 포괄한다. 성과에 대한 예측된 집단 크기를 각 성과의 예상 효용과 곱한 값의 예측된 모든 성과들 전반에 걸친 총합은 주어진 관리 표준의 총 보건 경제 효용이다. (i) 중재법 적용 하의 관리 표준에 대해 산출된 총 보건 경제 효용 대 (ii) 중재법 부적용 하의 관리 표준에 대한 총 보건 경제 효용 간의 차이는 중재법의 보건 경제 비용 또는 값의 전반적 측정값을 초래한다. 이는 그 자체가 단위 중재법 당 비용에 도달하고 보건 시스템 수용의 시장 위치지정, 가격설정 및 상정과 같은 결정을 지도하도록, 피분석 전체 환자군 간에 (혹은 중재법 군 간에 단독으로) 분리되어도 된다. 그러한 보건 경제 효용 함수는 통상적으로 중재법의 비용 효능을 비교하는 데 사용되나, 보건 관리 시스템이 지불하고자 하는 QALY 당 허용가능한 값 또는 새 중재법에 필요한 허용가능한 비용 효과적 임상적 성능 특징을 평가하는 것으로 전환되어도 된다.
본 발명의 진단(또는 예후) 중재법에 있어, (질병 부류 진단 시험에서 TP, FP, TN 또는 FN일 수 있는) 각 성과가 상이한 비용을 가지게 됨에 따라, 보건 경제 효용 함수는 임상적 상황 및 개별 성과 비용 및 값에 기초하여 특이성에 비해 감도에 우호적일 수 있거나, NPV에 비해 PPV에 우호적일 수 있으며, 이에 따라 더욱 직접적인 임상적 또는 분석적 성능 측정값과 상이할 수 있는 보건 경제 성능 및 값의 또 다른 측정값을 제공한다. 이 상이한 측정 및 상대적 교환은 일반적으로 오차율이 0인(제로 예측 대상 성과 오차분류 또는 FP 및 FN로도 알려짐) 완전 시험의 경우에만 집중될 것이며, 이들 모두의 성능 측정값은 불완전함보다는 나으나, 정도에 차이가 있다.
"측정하는" 또는 "측정", 또는 대안적으로 "검출하는" 또는 "검출"은 임상적 또는 대상 유래 샘플 내의 주어진 물질의 정성적 또는 정량적 농도 수준의 유도를 비롯한, 그러한 물질의 존재, 부재, 분량, 활성도 또는 양(이는 유효량일 수 있음)을 평가하는 것, 또는 대상의 비분석물 임상적 매개변수의 값 또는 범주화를 평가하는 것을 의미한다.
"음성 예측성 값" 또는 "NPV"는 TN/(TN+FN)에 모든 음성 시험 결과들의 진정한 음성 분율에 의해 산출된다. 그것은 또한 시험하고자 하는 집단의 질병 출현율(prevalence) 및 예비시험 확률에 의해 본래 영향을 받는다.
예를 들어, 시험, 예를 들어 임상적 진단 시험의 특이성, 감도, 및 양성 및 음성 예측성 값을 논의하는 문헌[O' Marcaigh AS, Jacobson RM, "Estimating The Predictive Value Of A Diagnostic Test, How To Prevent Misleading Or Confusing Results," Clin Ped 1993, 32(8) 485-491]을 참조한다. 종종, 연속 진단 시험 측정을 이용한 이원 질병 상태 분류 접근법에 대해, 감도 및 특이성이 문헌[Pepe et al., "Limitations of the Odds Ratio in Gauging the Performance of a Diagnostic, Prognostic, or Screening Marker," Am J Epidemiol 2004, 159(9) 882-890]에 따른 리시버 작용 특징(Receiver Operating Characteristics; ROC) 곡선에 의해 요약되고, 단지 단일값으로의 전범위의 시험 (또는 검정)에 걸친 시험, 검정 또는 방법의 감도 및 특이성을 나타내도록 하는 지시자인, 곡선 아래의 면적(Area Under the Curve; AUC) 또는 c-통계학에 의해 요약된다. 또한, 예를 들어 문헌[Shultz, "Clinical Interpretation Of Laboratory Procedures", chapter 14 in Teitz, Fundamentals of Clinical Chemistry, Burns and Ashwood (eds ), 4th edition 1996, W. B. Saunders Company, pages 192-199]; 및 문헌[Zweig et al., "ROC Curve Analysis An Example Showing The Relationships Among Serum Lipid And Apohpoprotein Concentrations In Identifying Subjects With Coronory Artery Disease," Clin. Chem., 1992, 38(8) 1425-1428]을 참조한다. 가능성 함수, 오즈비, 정보 이론, 예측성 값, 보정(적합성(goodness-of-fit)), 및 재분류 측정을 이용한 한 대안적 접근법이 문헌[Cook, "Use and Misuse of the Receiver Operating Characteristic Curve in Risk Prediction", Circulation 2007, 115 928-935]에 따라 요약되어 있다.
마지막으로, 시험에 의해 한정되는 대상 코호트 내 위해요소 비 및 절대적 및 상대적 위험은 임상적 정확도 및 유용도의 다른 측정값이다. 기준 한도, 차별 한도 및 위험 역가를 비롯한 이상 또는 질병 값을 한정하기 위해, 다중 방법이 빈번하게 이용된다.
"분석적 정확도"란 측정 과정 자체의 재현가능성 및 예측가능성을 지칭하고, 이는 상이한 시간, 사용자, 장비 및/또는 시약을 이용한 동일 샘플 또는 대조군의 변동 계수 및 용어색인 및 보정 시험과 같은 측정에 요약될 수 있다. 새로운 바이오마커를 평가함에 있어서의 상기 고려사항 및 다른 고려사항이 문헌[Vasan, 2006]에 요약되어 있다.
"성능"은 무엇보다도 임상적 및 분석적 정확도, 다른 분석적 및 공정 특징, 예컨대 사용 특징(예를 들어, 안정성, 사용 용이성), 보건 경제 값, 및 시험 성분의 상대 비용을 비롯한, 진단 또는 예후 시험의 전반적 효용 및 품질에 관한 용어이다. 이 인자들 중 임의의 것이 우수한 성능의 공급원 및 이에 따른 시험 효용일 수 있고, 또한 관련되는 경우, AUC, 결과까지의 시간, 반감기 등과 같은 적절한 "성능 측정"에 의해 측정될 수 있다.
"양성 예측성 값" 또는 "PPV"는 TP/(TP+FP) 또는 모든 양성 시험 결과들의 진정한 양성 분율에 의해 산출된다. 그것은 또한 시험하고자 하는 집단의 질병 출현율 및 예비시험 확률에 의해 본래 영향을 받는다.
본 발명의 범주 내에서의 "위험"은 전이성 이벤트로의 전환 시와 마찬가지로, 이벤트가 특정 시간에 걸쳐 일어나게 되는 확률에 관한 것으로, 이는 대상의 "절대적" 위험 또는 "상대적" 위험을 의미할 수 있다. 절대적 위험은 관련 시간 코호트에 대한 실제 관련 후 측정에 대해, 또는 관련 시간에 대해 후속된 통계학적으로 유효한 역사적 코호트로부터 발달된 지수 값에 대해 측정될 수 있다. 상대적 위험은 임상적 위험 인자가 평가되는 방식에 의해 변화할 수 있는 저위험 코호트의 절대적 위험 또는 평균 집단 위험에 대한 대상의 절대 위험의 비를 지칭한다. 오즈비, 즉 주어진 시험 결과에 있어 음성 이벤트에 대한 양성 이벤트의 분율이 또한 비전환에 대해 통상 사용된다(오즈는 식 p/(1-p)(여기서, p는 이벤트의 확률이고, (1-p)는 비-이벤트의 확률임)에 따른 것이다.
본 발명의 범주 내에서의 "위험 평가" 또는 "위험의 평가"는 이벤트 또는 질병 상태가 일어날 수 있는 확률, 배당률, 또는 가능성, 한 질병 상태에서 또 다른 질병 상태로의 이벤트 또는 전환 발생율, 즉 원발성 종양에서 전이성 종양 또는 전이성 발달 위험이 있는 종양으로의 이벤트 또는 전환 발생율, 또는 원발성 전이성 이벤트의 위험에서 추가 2차 전이성 이벤트로의 이벤트 또는 전환 발생율을 예측하는 것을 포괄한다. 위험 평가는 또한 사전에 측정된 집단에 대한 절대적 또는 상대적 관점에서의, 암의 추가 임상적 매개변수, 통상적 실험실 위험 인자 값, 또는 다른 지수의 예측을 포함한다. 본 발명의 방법은 전이성 종양의 위험을 연속 또는 범주화 측정하여, 전이성 종양의 위험이 있는 것으로 정의된 대상의 범주의 위험 범위를 진단하고 정의하는 데 사용될 수 있다. 범주화 경우에, 본 발명은 전이성 종양에 대한 보다 높은 위험이 있는 정상적 대상 코호트와 다른 대상 코호트 간을 구별하는 데 사용될 수 있다. 그러한 차별적 사용은 개별 패널에서의 상이한 결정인자 조합, 수학적 알고리즘, 및/또는 구분점(cut-off point)을 필요로 할 수 있으나, 각기 의도된 용도를 위해 정확도 및 성능을 상기와 같이 측정하게 될 수도 있다.
본 발명의 범주 내에서의 "샘플"은 대상으로부터 단리된 생물학적 샘플이고, 이에는 예로서, 다만 비제한적으로 조직 생검, 전혈, 혈청, 혈장, 혈액 세포, 내피 세포, 림프액, 복수액, 간세포액(또한 "세포외 액"으로도 알려지고, 이에는 세포간 공간에서 발견되는 액, 예컨대 특히 치은열구액이 포함됨), 골수, 뇌척수액 (CSF), 침, 점액, 가래, 땀, 소변, 순환 종양 세포, 순환 내피 세포 또는 임의의 다른 분비, 배설, 또는 기타 채액이 포함된다.
"감도"는 TP/(TP+FN) 또는 질병 대상의 진정한 양성 분율에 의해 산출된다.
"특이성"은 TN/(TN+FP) 또는 무질병 또는 정상적 대상의 진정한 음성 분율에 의해 산출된다.
"통계학적으로 유의적인"이란, 변경이 ("허위 양성"일 수 있는) 단독으로 우연히 일어날 수 있는 것으로 기대될 수 있는 것보다 큼을 의미한다. 통계학적 유의도는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 통상적으로 사용되는 유의도 측정값에는, 데이터 점이 단지 우연한 기회 단독의 결과라고 가정할 때, 적어도 주어진 데이터 점으로서 극적인 결과를 수득하는 확률을 제시하는 p-값이 포함된다. 결과는 종종 0.05 이하의 p-값에서 매우 유의적인 것으로 간주된다.
본 발명의 범주 내에서의 "대상"은 바람직하게는 포유동물이다. 포유동물은 인간, 비인간 영장류, 마우스, 래트, 개, 고양이, 말 또는 소일 수 있으나, 이 예들에 한정되지 않는다. 인간 외의 포유동물은 종양 전이의 동물 모델을 나타내는 대상으로서 유리하게 사용될 수 있다. 대상은 남성 또는 여성일 수 있다. 대상은 원발성 종양 또는 전이성 종양을 가지는 것으로 사전에 진단되었거나 동정되고, 임의적으로는 이미 종양에 대한 치료 중재법을 받았거나 받고 있는 대상일 수 있다. 대안적으로, 대상은 전이성 종양을 가지는 것으로 사전에 진단되지 않은 대상일 수도 있다. 예를 들어, 대상은 전이성 종양에 대한 하나 이상의 위험 인자를 나타내는 자일 수 있다.
"TN"는 질병 상태 시험에 있어, 올바르게 무질병 또는 정상적 대상인 것으로 분류함을 의미하는 진정한 음성이다.
"TP"는 질병 상태 시험에 있어, 올바르게 질병 대상인 것으로 분류함을 의미하는 진정한 양성이다.
"통상적 실험실 위험 인자"는 대상 샘플으로부터 단리되거나 유도된 바이오마커로서, 현재 임상적 실험실에서 평가되고 통상적 범용되는 위험 평가 알고리즘에 사용되는 바이오마커이다. 종양 전이에 대한 통상적 실험실 위험 인자에는 예를 들어 브레슬로우(breslow) 두께, 궤양형성, 증식 지수, 종양-침투 림프구가 포함된다. 종양 전이에 대한 다른 통상적 실험실 위험 인자도 당업자에게 알려져 있다.
본 발명의 방법 및 용도
본원에 개시된 방법은 전이성 종양 발달의 위험이 있는 대상, 이미 전이성 종양을 진단받았거나 받지 않았을 수 있는 대상, 및 원발성 종양 또는 전이성 종양에 대한 치료 및/또는 요법을 받는 대상에 이용된다. 본 발명의 방법은 또한 원발성 종양 또는 전이성 종양을 가지는 대상에 대한 치료 섭생법을 모니터링하거나 선택하는 데 사용되고, 전이성 종양을 가지는 것으로 사전에 진단되지 않은 대상, 예컨대 전이에 대한 위험 인자를 나타내는 대상을 스크리닝하는 데 사용된다. 바람직하게, 본 발명의 방법은 전이성 종양에 대한 증상이 없는 대상을 동정 및/또는 진단하는 데 사용된다. "증상이 없는"이란 통상적 증상을 나타내지 않음을 의미한다.
본 발명의 방법은 또한 통상적 위험 인자에 단지 기초하여 이미 전이성 종양의 보다 높은 위험이 있는 대상을 동정하고/하거나 진단하는 데 사용될 수 있다.
전이성 종양을 가지는 대상은 대상 유래 샘플 내의 유효수(2개 이상일 수 있음)의 결정인자의 양(존재 또는 부재를 포함함)을 측정함으로써 동정될 수 있고, 이어서 양은 바이오마커, 예컨대 단백질, 폴리펩티드, 핵산 및 폴리뉴클레오티드, 단백질, 폴리펩티드, 핵산 및 폴리뉴클레오티드의 다형체, 돌연변이화된 단백질, 폴리펩티드, 핵산 및 폴리뉴클레오티드의 발현의 양 및 패턴에 있어 기준 값 변경과 비교되거나, 또는 기준 값 대비 대상 샘플 내 대사물 또는 다른 분석물의 분자량의 변경을 동정한다.
기준 값은 비제한적으로 동일한 암을 가지는 상기와 같은 대상, 동일한 또는 유사한 연령 범위를 가지는 대상, 동일한 또는 유사한 인종군의 대상을 포함한 집단 연구로부터 유래된 수 또는 값에 대해 상대적일 수 있거나, 암 치료를 받는 대상의 출발 샘플에 대해 상대적일 수 있다. 그러한 기준 값은 암 전이의 수학적 알고리즘 및 계산된 지수로부터 수득된 집단의 통계학적 분석 및/또는 위험 예측 데이터로부터 유도될 수 있다. 기준 결정인자 지수가 또한 통계학적 및 구조적 분류의 알고리즘 및 다른 방법을 이용하여 구성되어 사용될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 기준 값은 전이성 종양이 발달할 위험이 없거나 매우 낮은 하나 이상의 대상으로부터 유래된 대조군 샘플 내 결정인자의 양이다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 기준 값은 전이성 종양에 대한 증상이 없고/없거나 전이성 종양에 대한 통상적 위험 인자가 결여된 대조군 샘플 내 결정인자의 양이다. 다른 한 실시양태에서, 그러한 대상은 전이성 종양의 부재 연속(질병 또는 이벤트가 없이 생존함)을 검증하기 위한 시험 후에, 진단 관련 기간("장기(longitudinal) 연구")에 대해 모니터링하고/하거나 주기적으로 재시험한다. 그러한 기간은 기준 값 결정을 위험 초기 시험일자로부터 1년, 2년 내지 5년, 5년, 5년 내지 10년, 10년, 또는 10년 이상일 수 있다. 또한, 적절하게 축적한 역사적 대상 샘플의 결정인자의 소급 측정은, 상기 기준 값들을 구축함으로써 요구되는 연구 시간이 단축하는 데 사용될 수 있다.
기준 값은 암에 대한 치료 및/또는 요법의 결과로서 전이성 위험 인자의 향상을 나타내는 대상으로부터 유래된 결정인자의 양을 포함할 수 있다. 기준 값은 또한 알려진 침습성 또는 비침습성 기법에 의해 질병이 확인되었거나, 전이성 종양 발병의 위험이 크거나, 전이성 종양을 앓았던 대상으로부터 유래된 결정인자의 양을 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 기준 값은 지수 값 또는 기준선 값이다. 지수 값 또는 기준선 값은 전이성 종양을 가지지 않은 하나 이상의 대상, 또는 전이성 증상이 없는 대상으로부터의 유효량의 결정인자의 복합 샘플이다. 기준선 값은 전이성 종양 위험 인자 결과적으로 암 치료 또는 요법의 결과로서 전이성 종양 위험의 개선을 나타낸 대상으로부터 유래된 샘플 내 결정인자의 양을 포함할 수 있다. 이 실시양태에서, 대상 유래 샘플과 비교하기 위해, 결정인자의 양을 유사하게 산출하여, 지수 값과 비교한다. 임의적으로, 전이성 종양을 가지거나 전이성 종양의 위험이 증가된 것으로 확인된 대상을 선택하여, 암의 진행을 늦추거나, 전이성 종양 발달 위험을 감소시키거나 예방하도록 하는 치료 섭생법을 받게 한다.
전이성 종양의 진행, 또는 암 치료 섭생법의 효능은, 경시적으로 대상으로부터 유효량(2개 이상일 수 있음)의 수득된 샘플 내 결정인자를 검출하여, 검출된 결정인자의 양을 비교함으로써 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 제1 샘플을 수득한 후, 대상에게 치료를 받도록 하고, 1개 이상의 후속 샘플을 대상의 치료 후 또는 치료 동안에 취한다. 결정인자의 양이 기준값에 비해 경시적으로 변화할 경우, 암은 진행 중인 것으로 간주되고(또는 대안적으로, 치료가 진행을 방지하지 못함), 결정인자의 양이 (기준 집단에 비해, 또는 본원에 사용되는 "일정한" 의미의) 일정한 상태로 유지될 경우, 암은 진행 중이지 않다. 본 발명의 범주 내에서 사용되는 용어 "일정한"은 기준 값에 대비의 경시적 변화를 포함하는 것으로 간주된다.
예를 들어, 본 발명의 방법은 종양의 공격성을 평가하고/평가하거나 종양의 단계(예를 들어 단계 I, II, II 또는 IV)를 평가하는 데 사용될 수 있다. 이로써, 환자가 고위험군 또는 저위험군으로 계층 분류되어, 그것에 따라 치료될 수 있다.
부가적으로, 특정 대상으로의 투여에 적당한 치료제 또는 예방제는, 대상으로부터 수득된 유효량(2개 이상일 수 있음)의 샘플 내 결정인자를 검출하고, 대상 유래 샘플 내 결정인자의 양(2개 이상일 수 있음)을 결정하는 시험 화합물에 대상 유래 샘플을 노출함으로써 동정될 수 있다. 따라서, 암을 가진 대상 또는 전이성 종양이 발달한 위험이 있는 대상에 사용하기 위한 치료 또는 치료 섭생법은 대상으로부터 수득된 샘플 내 결정인자의 양에 기초하여 선택될 수 있다. 어떠한 치료 또는 치료 섭생법이 암의 개시를 지연하거나 암의 진행을 늦추기 위해 대상에게 사용하기에 가장 효능적인지를 결정하기 위해, 2개 이상의 치유 또는 치료 섭생법이 병렬 평가될 수 있다.
본 발명은 또한 대상 유래 샘플 내 결정인자의 양(2개 이상일 수 있음)을 결정하고, 기준 샘플 내 결정인자의 양을 비교하며, 기준 샘플과 비교된 대상 샘플 내 양의 변경을 확인함으로써, 전이성 종양과 관련된 마커 발현의 변화를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 유효량의 결정인자가 종양으로부터의 샘플에서 측정된 임상적으로 유의적인 방식으로 변경되는 종양을 가진 환자를 동정하고, 환자를 종양 전이를 예방 또는 감소시키는 치료 섭생법으로 치료함으로써, 종양을 가진 환자를 치료하는 방법을 제공한다.
부가적으로, 본 발명은 환자로부터의 종양 샘플 내 2개 이상의 결정인자의 임상적으로 유의적인 변경이 환자가 보조 치료를 필요로 함을 가리키는 경우 유효량의 결정인자를 측정함으로써 환자에서의 전이 위험을 평가함으로써, 보조 치료를 필요로 하는 종양 환자를 선택하는 방법을 제공한다.
환자로부터의 종양 샘플 내 유효량의 결정인자에 대한 정보를 수득하고, 2개 이상의 결정인자가 임상적으로 유의적인 방식으로 변경될 경우, 종양 전이를 예방 또는 감소시키는 치료 섭생을 선택함으로써, 종양 환자에 대한 치료 결정에 관한 정보가 제공된다.
기준 샘플, 예를 들어 대조군 샘플이 전이성 암을 가지지 않은 대상에서 나온 것일 경우, 또는 기준 샘플이 전이성 종양으로의 급속 진행 가능성이 높은 사람 대비 상대적인 값을 반영할 경우, 시험 샘플 및 기준 샘플에서의 결정인자의 양의 유사도는 치료가 효능적임을 가리킨다. 그러나, 시험 샘플 및 기준 샘플에서의 결정인자의 양의 차이는 보다 좋지 않은 임상적 성과 또는 예후를 가리킨다.
"효능적인"이란 치료가 결정인자 단백질, 핵산, 다형체, 대사물, 또는 다른 분석물의 양 또는 활성의 감소를 초래함을 의미한다. 본원에 개시된 위험 인자의 평가는 표준 임상적 프로토콜을 이용하여 달성될 수 있다. 효능은 전이성 질병을 진단, 동정 또는 치료하기 위한 임의의 알려진 방법과 함께 결정될 수 있다.
본 발명은 또한 전이성 질병, 예를 들어 전이와 관련된 상이한 질병 상태 또는 후유증 간에 구별하거나 배제하는 데 사용될 수 있는 1개 이상의 결정인자와 관련된 일반적인 생리학적 경로를 가리키는 1개 이상의 결정인자를 포함한 결정인자 패널을 제공한다. 단일 결정인자는 본 발명에 따른 상기 특징들 중 수가지를 가질 수 있고, 대안적으로 본 발명의 주어진 용도에 적절한 경우에 하나 이상의 다른 결정인자 대신에 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 2개 이상의 결정인자 단백질, 핵산, 다형체, 대사물, 또는 다른 분석물에 결합되는 검출 시약을 가지는 키트를 포함한다. 또한, 검출 시약, 예를 들어 각기 2개 이상의 결정인자 단백질 또는 핵산에 결합할 수 있는 항체 및/또는 올리고뉴클레오티드의 어레이가 본 발명에 의해 제공된다. 한 실시양태에서, 결정인자는 단백질이고, 어레이는 기준 값 대비 결정인자 발현에 있어서의 통계학적으로 유의적 변경을 측정하는 데 충분한 유효량의 결정인자 1-360에 결합하는 항체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 결정인자는 핵산이고, 어레이는 기준 값 대비 결정인자 발현에 있어서의 통계학적으로 유의적 변경을 측정하는 데 충분한 유효량의 결정인자 1-360에 결합하는 올리고뉴클레오티드 또는 압타머를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 결정인자는 단백질이고, 어레이는 기준 값 대비 결정인자 발현에 있어서의 통계학적으로 유의적 변경을 측정하는 데 충분한 유효량의 결정인자 1-25, 41, 61, 62, 63, 66, 74, 96, 99, 103, 126, 135, 137, 138, 177, 190, 210, 212, 217, 218, 227, 239, 261 및 271에 결합하는 항체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 결정인자는 단백질이고, 어레이는 기준 값 대비 결정인자 발현에 있어서의 통계학적으로 유의적 변경을 측정하는 데 충분한 유효량의 결정인자 1-25, 41, 61, 62, 63, 66, 74, 96, 99, 103, 126, 135, 137, 138, 177, 190, 210, 212, 217, 218, 227, 239, 261 및 271에 결합하는 올리고뉴클레오티드 또는 압타머를 포함한다.
또한, 결정인자의 변경된 양 또는 활성이 전이성 질병의 발달 위험이 적은 하나 이상의 대상, 또는 대안적으로는 전이성 질병에 대한 통상적 위험 인자 중 임의의 것을 나타내지 않는 대상에서 측정된 기준선 값으로 돌아갈 때까지, 하나 이상의 대상으로부터의 샘플 내에 존재하는 변경된 양의 유효량의 결정인자의 존재를 검출하고, 하나 이상의 대상을 암 조절 약물로 치료함으로써, 전이성 종양 발달의 위험이 있는 하나 이상의 대상을 치료하는 방법도 본 발명에 의해 제공된다.
또한, 결정인자의 변경된 양 또는 활성이 전이성 질병의 발달 위험이 적은 하나 이상의 대상에서 측정된 기준선 값으로 돌아갈 때까지, 하나 이상의 대상으로부터의 샘플 내에 존재하는 변경된 수준의 유효량의 결정인자의 존재를 검출하고, 하나 이상의 대상을 암 조절 약물로 치료함으로써, 전이성 종양을 가지는 하나 이상의 대상을 치료하는 방법도 본 발명에 의해 제공된다.
또한, 제1 기간에 대상으로부터의 제1 샘플 내 유효량의 결정인자(2개 이상일 수 있음)를 검출하고, 제2 기간에 대상으로부터의 제2 샘플 내 결정인자의 양을 검출하며, 제1 시간 및 제2 기간에 검출된 결정인자의 양을 비교함으로써, 암이 진단된 대상에 있어서의 전이성 종양의 발달 위험의 변화를 평가하는 방법도 본 발명에 의해 제공된다.
본 발명의 진단 및 예후 표시
본 발명은 전이성 종양의 진단 및 예후를 허용한다. 전이성 종양의 발달 위험은, 시험 샘플(예를 들어, 대상 유래 샘플) 내 유효량의 결정인자 단백질, 핵산, 다형체, 대사물, 및 다른 분석물 (2개 이상일 수 있음)을 측정하고, 유효량을 기준 또는 지수 값과 비교하며, 종종 수학적 알고리즘 또는 식을 이용하여, 다중 개별 결정인자 및 비분석물 임상적 매개변수로부터의 결과에서 나온 정보를 단일 측정 또는 지수에 조합시킴으로써, 검출될 수 있다. 전이성 종양의 증가된 위험을 가지는 것으로 동정된 대상을 임의적으로 선택하여, 치료 섭생법, 예컨대 전이성 종양을 예방하거나 전이성 종양의 개시를 지연시키는 예방 또는 치료 화합물의 투여를 받도록 할 수 있다.
결정인자 단백질, 핵산, 다형체, 대사물, 또는 다른 분석물의 양은 기준 한도, 차별 한도, 또는 구분점 및 이상 값을 한정하는 위험 한정 역가와 같은 기법을 이용하여, 시험 샘플에서 측정되어 "정상적 대조군 수준"과 비교될 수 있다. "정상적 대조군 수준"은 전이성 종양을 앓는 대상에서 전형적으로 발견되는 1개 이상의 결정인자 또는 조합된 결정인자 지수의 수준을 의미한다. 그러한 정상적 대조군 수준 및 구분점은, 결정인자가 단독 사용되는지의 여부에 기초하여 또는 다른 결정인자를 지수에 조합하는 방식으로 변화할 수 있다. 대안적으로, 정상적 대조군 수준은 임상적으로 관련된 시간대(time horizon)에 걸쳐 전이성 종양이 발달되지 않은 미리 시험한 대상으로부터의 결정인자 패턴의 데이터베이스일 수 있다.
본 발명은 전이성 종양으로의 전환 위험의 연속 또는 범주화 측정을 행하고, 이로써 전이성 이벤트를 가질 위험이 있는 것으로 정의된 대상의 범주의 위험 범위를 진단하고 한정하는 데 사용될 수 있다. 범주화 경우에, 본 발명의 방법은 정상적 대상 코호트와 다른 대상 코호트 간을 구별하는 데 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 전이성 이벤트를 가질 위험이 있는 대상을 전이성 이벤트의 진행이 더욱 급속한 대상(또는 전이성 이벤트로의 가능한 시간대가 보다 짧은 대상)과 전이성 이벤트로의 진행이 더욱 느린 대상(또는 전이성 이벤트로의 시간대가 보다 긴 대상)과 구별하거나, 전이성 종양을 가진 대상을 정상과 구별하는 데 사용될 수 있다. 그러한 상이한 사용은 개별 패널에서의 상이한 결정인자 조합, 수학적 알고리즘, 및/또는 구분점을 필요로 할 수 있으나, 각기 의도된 용도를 위해 정확도 및 성능을 상기와 같이 측정하게 될 수도 있다.
전이성 이벤트를 가질 위험이 있는 대상을 동정함으로써, 대상이 전이성 질병 상태로 전환되는 것을 지연, 감소 또는 예방하기 위한 각종 치료 중재법 또는 치료 섭생법을 선택하고 개시할 수 있게 된다. 유효량의 결정인자 단백질, 핵산, 다형체, 대사물, 또는 다른 분석물의 수준은 또한 전이성 질병 또는 전이성 이벤트 과정이 모니터링되도록 한다. 이 방법에서, 생물학적 샘플은 암에 대해 치료 섭생법, 예를 들어 약물 치료를 받는 대상으로부터 제공될 수 있다. 요망되는 경우, 생물학적 샘플은 치료 전, 중 또는 후에 각종 시점들에서 대상으로부터 수득된다.
결정인자가 기능적으로 활성이기 때문에, 그것의 기능을 규명함으로써, 예를 들어 높은 결정인자를 가지는 대상을, 예를 들어 TGFβ 신호전달을 통한 HOXA1 기능화와 같이 상기와 같은 경로를 우선적으로 표적화하는 제제/약물로 관리할 수 있고, 따라서 고 HOXA1 대상을 TGFβ 억제제로 치료할 수 있다. 혹은, HOXA1은 전이에 관여하는 것으로 알려져 있고 TGFb의 상향류에서 작용하는 것으로 보고된 케모카인인 CXCR4를 활성화하고, 이에 따라 CXCR4를 길항하는 제제/약물이 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 임의의 수의 환경들 내 환자 또는 대상 집단을 스크리닝하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 보건 관리 기관, 공중 보건체 또는 학교 보건 프로그램은 상기 기재된 바와 같이, 중재법을 필요로 하는 자들을 동정하기 위해 또는 유행전염병학 데이터 수집을 위해, 대상군을 스크리닝할 수 있다. 보험 회사(예를 들어, 건강, 삶 또는 장애)는 보급률 또는 가격설정 과정에 있어서의 청구인을 스크리닝하거나, 가능한 중재법에 대한 현존 의뢰인을 스크리닝할 수 있다. 그러한 집단 스크린에서 수집된 데이터로서, 특히 암이나 전이성 이벤트와 같은 병태로의 임의의 임상적 진행과 결부된 데이터는 예를 들어 보건 관리 기관, 공중 보건 프로그램 및 보험 회사의 작업에서 중요할 것이다. 그러한 데이터 어레이 또는 집합물은 기계로 판독가능한 매체에 저장되어, 향상된 보건 관리 서비스, 비용 효과적 보건 관리, 향상된 보험 작업 등을 제공하기 위해 임의의 수의 보건 관련 데이터 관리 시스템에 사용될 수 있다. 예를 들어 미국 특허 출원 제2002/0038227호, 미국 특허 출원 제US 2004/0122296호, 미국 특허 출원 제US 2004/0122297호, 및 미국 특허 제5,018,067호를 참조한다. 그러한 시스템은 내부 데이터 저장소로부터 직접 데이터에 접근하거나, 본원에 추가 상세 설명되는 하나 이상의 데이터 저장소로부터 원격으로 데이터에 접근할 수 있다.
기계로 판독가능한 저장 매체는, 기계로 판독가능한 데이터 이용에 대한 지시로 프로그래밍된 기계를 이용할 때 각종 목적들, 예컨대 비제한적으로 경시적 전이성 질병 위험 인자와 관련된 대상 정보 또는 반응 약물 요법에 있어서의 대상 정보에 사용될 수 있는, 기계로 판독가능한 데이터 또는 데이터 어레이로 코딩된 데이터 저장 물질을 포함할 수 있다. 본 발명의 유효량의 바이오마커의 측정 및/또는 상기 바이오마커로부터의 위험의 결과 평가는 특히 프로세서, 데이터 저장 시스템(휘발성 및 비휘발성 기억 및/또는 저장 소자), 적어도 하나의 입력 장치, 및 적어도 하나의 출력 장치를 포함하는 프로그래밍가능한 컴퓨터에서 실행되는 컴퓨터 프로그램에서 이행될 수 있다. 프로그램 코드는 입력 데이터에 적용되어, 상기 기재된 기능들 수행하고 출력 정보를 발생시킬 수 있다. 출력 정보는 당업계에 공지된 방법에 따라 하나 이상의 출력 장치에 적용될 수 있다. 컴퓨터는 예를 들어 개인용 컴퓨터, 마이크로컴퓨터, 또는 종래 디자인의 워크스테이션일 수 있다.
각 프로그램은 컴퓨터 시스템과 소통하기 위해 높은 수준의 절차 또는 대상 지향 프로그래밍 언어로 이행될 수 있다. 그러나, 프로그램은 요망되는 경우, 어셈블리 또는 기계 언어로 이행될 수 있다. 언어는 컴파일 언어 또는 통합 언어일 수 있다. 그러한 각 컴퓨터 프로그램은, 저장 매체 또는 장치가 본원에 기재된 절차를 수행하기 위해 컴퓨터에 의해 판독될 때 컴퓨터를 구성하고 작동시키기 위해, 일반적 목적 또는 특수 목적의 프로그래밍가능한 컴퓨터에 의해 판독가능한 저장 매체 또는 장치(예를 들어, ROM 또는 자기 디스켓 또는 본 개시내용의 다른 부분에서 정의된 바와 같은 기타 매체 또는 장치)에 저장될 수 있다. 본 발명의 보건 관련 데이터 관리 시스템은 또한 컴퓨터 프로그램과 함께 구성되는, 컴퓨터로 판독가능한 저장 매체로서 이행되는 것으로 간주될 수 있고, 여기서 상기와 같이 구성된 저장 매체는 컴퓨터가 본원에 기재된 각종 기능들을 수행하기 위한 기정의 특수 방식으로 작동하도록 한다.
이어서, 유효량의 결정인자 단백질, 핵산, 다형체, 대사물 또는 다른 분석물의 수준을 결정하여, 기준 값, 예를 들어 전이성 상태가 알려져 있는 대조군 대상이나 집단, 또는 지수 값 또는 기준선 값과 비교할 수 있다. 기준 샘플 또는 지수 값 또는 기준선 값은 치료에 노출된 하나 이상의 대상으로부터 취해지거나 유도될 수 있거나, 암 또는 전이성 이벤트 발달 위험이 낮은 하나 이상의 대상으로부터 취해지거나 유도될 수 있거나, 치료에의 노출의 결과로서 개선이 있었던 대상으로부터 취해지거나 유도될 수 있다. 대안적으로, 기준 샘플 값, 또는 지수 값 또는 기준선 값을 치료에 노출되지 않은 대상으로부터 취해지거나 유도될 수 있다. 예를 들어, 샘플은 암 또는 전이성 이벤트에 대한 초기 치료, 및 치료의 진행을 모니터링하기 위한 암 또는 전이성 이벤트에 대한 후속 치료를 받은 대상으로부터 회수될 수 있다. 기준 값은 또한 본원에 개시된 것들과 같은 집단 연구로부터의 위험 예측 알고리즘 또는 계산된 지수로부터 유래된 값도 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 결정인자는 암을 가지지 않거나 전이 이벤트를 가질 위험이 없고, 또한 암 또는 전이성 이벤트를 가질 것으로 예상되지 않는 대상의 "기준 결정인자 프로파일"을 발생시키기 위해 사용될 수 있다. 본원에 개시된 결정인자는 또한 암을 가지거나 전이성 이벤트를 가질 위험이 있는 대상으로부터 취해진 "대상 결정인자 프로파일"을 발생시키기 위해 사용될 수 있다. 대상 결정인자 프로파일을 기준 결정인자 프로파일과 비교하여, 암 또는 전이성 이벤트 발달 위험이 있는 대상을 진단하거나 동정할 수 있고, 질병의 진행뿐만 아니라 질병의 진행 속도를 모니터링할 수 있고, 또한 치료 방식의 유효성을 모니터링할 수 있다. 본 발명의 기준 및 대상 결정인자 프로파일은 기계로 판독가능한 매체, 예컨대 단 비제한적으로 무엇보다 VCR, CD-ROM, DVD-ROM, USB 플래쉬 매체에 의해 판독가능한 아날로그 테이프 유사 매체에 포함될 수 있다. 그러한 기계로 판독가능한 매체는 또한 부가적 시험 결과, 예컨대 비제한적으로 임상적 매개변수 및 통상적 실험실 위험 인자의 측정을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 기계로 판독가능한 매체는 또한 의료 이력 및 임의의 관련 가족력과 같은 대상 정보도 포함할 수 있다. 기계로 판독가능한 매체는 또한 본원에 기재된 것들과 같은 다른 질병-위험 알고리즘 및 계산된 지수에 관한 정보도 포함할 수도 있다.
대상의 유전적 구성의 차이는 암 또는 전이성 이벤트의 증상 또는 위험 인자를 조절할 수 있는, 각종 약물을 대사하는 상대적 능력의 차이를 초래할 수 있다. 암을 가지거나 암 또는 전이성 이벤트 발달 위험이 있는 대상은 연령, 인종 및 다른 매개변수가 다양할 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 결정인자의 단독 사용 또는 약물 대사에 대해 공지된 유전적 인자와의 조합 사용으로, 선택된 대상에서 시험하는 추정 치료제 또는 예방제가 대상에서의 암 또는 전이성 이벤트의 치료 또는 예방에 적당할 것이라는 예측가능성이 소정의 수준으로 허용된다.
특정 대상에 적절한 치료제 또는 약물을 동정하기 위해, 시험 대상으로부터의 샘플을 또한 치료제 또는 약물에 노출할 수 있고, 결정인자 단백질, 핵산, 다형체, 대사물 또는 다른 분석물 중 하나 이상의 수준을 결정할 수 있다. 1개 이상의 결정인자의 수준을 치료제 또는 약물에의 처리 또는 노출 전 및 후에 대상으로부터 유래된 대상과 비교할 수 있거나, 그러한 처리 또는 노출의 결과로서 위험 인자(예를 들어, 임상적 매개변수 또는 통상적 실험실 위험 인자)의 개선을 나타낸 하나 이상의 대상으로부터 유래된 샘플과 비교할 수 있다.
대상 세포(즉, 대상으로부터 단리된 세포)를 후보 제제의 존재 하에 항온처리할 수 있고, 시험 샘플 내 결정인자 발현의 패턴을 측정하여, 기준 프로파일, 예를 들어 전이성 질병 기준 발현 프로파일 또는 무질병 기준 발현 프로파일 또는 지수 값 또는 기준선 값과 비교한다. 시험 제제는, 식이 보충물을 비롯한 임의의 화합물 또는 조성물 또는 이들의 조합일 수 있다. 예를 들어, 시험 제제는 암 치료 섭생법에 빈번하게 사용되는 제제이고, 본원에 기재되어 있다.
본 발명의 상기 방법은 암이 진단되었고 수술 중재법을 받은 대상의 진행 및/또는 개선을 평가하거나 모니터링하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 성능 및 정확도 측정값
본 발명의 성능 및 이에 따른 절대적 및 상대적 임상적 유용성은 상기 언급된 다중 방식들로 평가될 수 있다. 성능의 각종 평가들 중, 본 발명은 임상적 진단 및 예후에 정확도를 제공하기 위한 것이다. 진단 또는 예후 시험, 검정 또는 방법의 정확도는 암을 가지고 있거나 암 또는 전이성 이벤트의 위험이 있는 대상을 구분하는 시험, 검정 또는 방법의 능력에 관한 것이고, 이는 대상이 결정인자의 수준에 있어 "유의적 변경"(예를 들어, 임상적으로 유의적인 "진단적으로 유의적인 변경")을 가지는지의 여부에 기초한다. "유효량"이란, 결정인자(들)에 대한 소정의 구분점(또는 역가값)과 상이하고 이에 따라 대상이 암을 가지거나 전이성 이벤트를 가질 위험이 있음을 가리키는 "유의적 변경"(예를 들어, 결정인자의 발현 또는 활성의 수준)을 발생시키는 적절한 수의 결정인자(1개 이상일 수 있음)의 측정이 결정인자임을 의미한다. 정상과 이상 간의 결정인자의 수준의 차이는 통계학적으로 유의적인 것이 바람직하다. 하기 나타낸 바와 같이, 또한 본 발명에 의해 어떠한 식으로도 제한되지 않으면서, 통계학적 유의도를 달성하고, 이에 따라 바람직한 분석적, 진단적, 및 임상적 정확도를 달성하는 것은, 항상은 아니나 일반적으로, 통계학적으로 유의적인 결정인자 지수를 달성하기 위해 수가지 결정인자들의 조합이 패널에서 함께 사용되고 수학적 알고리즘과 조합되어야 할 것을 요구한다.
질병 상태의 범주화 진단에 있어, 시험 (또는 검정)의 차단점(cut point) 또는 역가 값을 변화시키는 것은 통상 감도 및 특이성을 변화시키나, 정성적으로는 역 관계에 있다. 그러므로, 대상의 병태를 평가하기 위해 제안된 의료 시험, 검정 또는 방법의 정확도 및 효용을 평가할 때, 통상의 자는 항상 감도 및 특이성 모두를 고려해야 하고, 감도 및 특이성이 차단점 범위에 걸쳐 유의적으로 변화할 수 있기 때문에 어떠한 차단점에서 감도 및 특이성이 보고되는지를 염두해두어야 한다. 모든 잠재적 차단점 값들을 포괄하는, AUC와 같은 통계학의 이용이 본 발명을 이용한 대부분의 범주화 위험 측정에 바람직하고, 한편 연속 위험 측정에 있어서는, 관찰된 결과 또는 다른 금본위제에의 적합성 및 보정의 통계학이 바람직하다.
소정의 예측가능성 수준이란, 방법이 허용가능한 수준의 임상적 또는 진단 정확도를 제공함을 의미한다. 그러한 통계학을 이용하여, "허용가능한 진단 정확도"가 본원에서 AUC(시험 또는 검정에 있어 ROC 곡선 아래의 면적)이 적어도 0.60, 바람직하게 적어도 0.65, 더욱 바람직하게 적어도 0.70, 바람직하게는 적어도 0.75, 더욱 바람직하게는 적어도 0.80, 및 가장 바람직하게는 적어도 0.85인 시험 또는 검정(예컨대, 결정인자의 임상적으로 유의적인 존재를 결정하고, 이로써 암 및/또는 전이성 이벤트 발병 위험의 존재를 가리키도록 하는 본 발명의 시험)으로서 정의된다.
"매우 높은 진단 정확도"란, AUC(시험 또는 검정에 있어 ROC 곡선 아래의 면적)이 적어도 0.75, 0.80, 바람직하게는 적어도 0.85, 더욱 바람직하게는 적어도 0.875, 바람직하게는 적어도 0.90, 더욱 바람직하게는 적어도 0.925, 및 가장 바람직하게는 적어도 0.95인 시험 또는 검정을 의미한다.
대안적으로, 본 방법은 암, 전이성 암, 또는 요법에 대한 반응의 존재 또는 부재를 적어도 75% 정확도, 더욱 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 정확도로 예측한다.
임의의 시험의 예측성 값은 시험의 감도 및 특이성, 및 시험하는 집단에서의 병태의 출현율에 의존한다. 베이스(Bayes') 정리에 기초한 이 개념은, 스크리닝하는 병태가 개체 또는 집단에 존재할 가능성(시험전 확률)이 보다 크고, 양성 시험 유효성이 보다 크고, 결과가 진정한 양성일 가능성이 보다 크도록 한다. 따라서, 존재하는 병태의 가능성이 낮은 임의의 집단에서의 시험을 이용할 때의 문제는, 양성 결과가 제한된 값을 가진다는 것이다(즉, 허위 야성일 가능성이 더욱 큼), 마찬가지로, 고위험 집안에서는, 음성 시험 결과가 허위 음성일 가능성이 더 크다.
결과적으로, ROC 및 AUC는 저 질병 매개변수 시험 집단의 임상적 유용도(연별 발생율(발병율)이 1% 미만, 또는 특정된 시간대에 걸친 10% 미만의 누적 매개변수를 가지는 것으로 정의됨)에 대한 허위 판단일 수 있다. 대안적으로, 본 개시내용의 다른 부분에 정의된 바와 같은 절대적 위험 및 상대적 위험 비는 시험하는 대상의 집단에서 임상적 유용도의 정도로서 정의되는 임상적 비로서, 이는 또한 시험의 측정 값들에 의해 사분위수로 범주화될 수 있는데, 여기서 상단 사분위수(집단의 25%)가 암 또는 전이성 이벤트 발병의 상대적 위험이 최고인 대상의 군을 포함하고, 하단 사분위수가 암 또는 전이성 이벤트 발병의 상대적 위험이 최저인 대상의 군을 포함한다. 일반적으로, 저 매개변수 집단에서 상단 내지 하단 사분위수에서의 상대적 위험의 2.5배 초과인, 시험 또는 검정에서 유도된 값은 "높은 진단 정확도"를 가지는 것으로 간주되고, 각 사분위수에 대한 상대적 위험의 5 내지 7배인, 시험 또는 검정에서 유도된 값은 "매우 높은 진단 정확도"를 가지는 것으로 간주된다. 그럼에도 불구하고, 각 사분위수에 대한 상대적 위험의 단지 1.2 내지 2.5배인, 시험 또는 검정에서 유도된 값은 임상적으로 유용한 상태로 남고, 이는 총 콜레스테롤의 경우와 같이 질병에 대한 위험 인자로서, 또한 향후 전이성 이벤트의 예측에 대한 많은 염증성 바이오마커로서 널리 사용된다. 종종 그러한 보다 낮은 진단 정확도 시험은 상기 보편적 위험 평가 지수로 행해지는 바와 같이, 치료 중재법에 대한 유의한 임상적 역가를 유도하기 위해 부가적 매개변수와 조합되어야 한다.
보건 경제 효용 함수는 각각에 대한 임상적 값 및 경제적 값의 실제 측정에 기초한, 잠재적 범주화 시험 성과로 구성되는 주어진 시험의 성능 및 임상적 값을 측정하는 또 다른 수단이다. 보건 경제 성능은, 보건 경제 효용 함수가 올바른 분류의 이점 및 시험 대상의 그릇된 분류의 비용에 대한 경제적 값을 구체적으로 지정하므로, 정확도와 밀접히 관련된다. 성능 측정값으로서, 시험이 시험의 표적 비용을 초과하는 (시험 비용 전) 시험당 보건 경제 값의 증가를 초래하는 성능의 수준을 달성할 것을 요함은 비범하지 않다.
일반적으로, 진단 정확도를 결정하는 대안적 방법은, 치료 용도에 대한 역가가 확립되지 않거나 예비 질병의 진단에 대한 금본위제가 없는 경우인, 질병 범주 또는 위험 범주(예컨대, 전이성 이벤트를 가질 위험이 있는 범주)가 관련 의료 사회 및 의약 실행에 의해 명확히 정의되지 않은 경우에, 연속 측정을 위해 통상 사용된다. 위험의 연속 측정을 위해, 산출된 지수에 대한 진단 정확도의 측정은 전형적으로 예측된 연속 값과 실제의 관찰 값(또는 역사적 지수 산출된 값) 사이의 곡선 피트 및 보정에 기초하고, R 제곱, 호스머-레메쇼(Hosmer-Lemeshow) P-값 통계값 및 신뢰도 간격과 같은 측정을 이용한다. 그러한 알고리즘을 이용하는 예측 값이 제노믹 헬쓰 인코포레이티드(Genomic Health, Inc., 미국 캘리포니아주 레드우드 시티 소재)에 의해 상용되는 추가 유방암 재발의 위험에 대한 시험에서와 같이, 역사적 관찰 코호트의 예측에 기초하여 신뢰 간격(통상 90% 또는 95% CI)을 포함하는 것으로 보고됨은 비범하지 않다.
일반적으로, 진단 정확도, 즉 ROC 곡선 상에서의 차단점을 정의하고, 허용가능한 AUC 값을 정의하며, 본 발명의 유효량의 결정인자를 구성하는 것의 상대 농도의 허용가능한 범위를 결정함으로써, 당업자는 소정의 예측가능성 수준 및 성능으로 대상을 동정, 진단 또는 예후하기 위해 결정인자를 사용할 수 있게 된다.
본 발명의 위험 마커 (결정인자)
본 발명의 바이오마커 및 방법으로 인해, 당업자는 암 또는 전이성 이벤트의 어떠한 증상도 나타내지 않으나, 그럼에도 불구하고 암 또는 전이성 이벤트 발달 위험이 있는 대상을 동정하거나 진단하거나 다른 식으로 평가할 수 있게 된다.
1593개 바이오마커가 전이성 질병을 가지는 대상에서 변경 또는 변형된 존재 또는 농도 수준을 가지는 것으로 밝혀진 것으로 확인되었다.
표 1은 본 발명의 360개의 과다발현/증폭되거나 하향제어/결실된 표현형 유래 진화-구상 결정인자를 포함한다. 결정인자 1-25, 41, 61, 62, 63, 66, 74, 96, 99, 103, 126, 135, 137, 138, 177, 190, 210, 212, 217, 218, 227, 239, 261 및 271은 침습 지지 결정인자로 동정되었다.
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당업자는, 본원에 제시된 결정인자는 비제한적으로, 다형체, 이소형, 돌연변이, 유도체, 전구체, 예를 들어 핵산 및 프로-단백질, 절단 산물, 수용체(가용성 및 막횡단 수용체 포함), 리간드, 단백질-리간드 복합체, 및 번역후 변형된 변이체(예컨대 가교 또는 글리코실화), 단편, 및 분해 산물뿐만 아니라, 완전 조립 구조의 구성 서브유닛들 중 임의의 것으로 구성된, 임의의 다중단위 핵산, 단백질, 및 당단백질 구조를 비롯한, 모든 형태들 및 변이체들을 포괄함을 인식할 것이다.
당업자는, 상기 열거된 결정인자가 전이성 질병과 관련된 것으로 통상 받아들여지지 않는 상당수를 비롯한, 다양한 세트의 생리학적 및 생물학적 경로들로부터 나옴을 인지할 것이다. 이러한 군분류의 상이한 결정인자, 심지어 고유의도 세그먼트 내의 상기 결정인자는 단계의 상이한 신호 또는 질병의 진행 속도를 예지할 수 있다. 그러한 구분된 군분류의 결정인자는, 결정인자로부터의 더욱 생물학적으로 상세하고 임상적으로 유용한 신호뿐만 아니라, 다중 결정인자 신호들을 조합하는 결정인자 알고리즘 내의 패턴 인식 기회를 허용할 것이다.
본 발명은 한 측면에서 결정인자의 한 서브세트; 상기 표 1에 열거되지 않으나 이 생리학적 및 생물학적 경로들과 관련된 다른 결정인자 및 심지어 바이오마커는 이 연구들로부터 제공되는 주어진 신호 및 정보에 유용한 것으로 입증될 수 있다. 다른 바이오마커 경로 참가인자(즉, 상기 표 1의 결정인자의 목록 내에 포함되는 그 바이오마커와 공통된 경로에의 다른 바이오마커 참가인자)가 또한 암 또는 전이성 이벤트에 있어 관련된 경로 참가인자인 정도로, 그것은 예를 들어 표 1에 상기 개시된 CXCR4와 같은 바이오마커와 기능적으로 동등할 수 있다. 이 다른 경로 참가인자도 또한 본원의 범주 내의 결정인자로서 간주되는데, 다만 본원에 개시된 생물학 공정에서의 향상뿐만 아니라, 유용한 신호 대 노이즈 비로 또한 유용하고 접근가능한 샘플 기질, 예컨대 혈청 중에서의 상기 마커와의 생체유용성과 같은 분석적으로 중요한 특징을 포함하는, 양호한 바이오마커의 특정의 한정된 특징을 부가적으로 공유한다. 그러한 요건은 전형적으로 생물학적 경로의 많은 구성원들의 진단 효용을 제한하고, 빈번하게 세포의 원형질막에 접근가능한 것만 아니라 암 또는 전이성 이벤트의 질병 진행과 관련되거나 관련되지 않은지에 상관없이 아포프토시스로 인해 혹은 내피 리모델링 또는 다른 세포 교체 또는 세포 괴사 공정과 같은 다른 이유로 인해 세포 사멸 시에 혈청 내에 방출되는 물질인 분비 물질을 구성하는 경로 구성원 내에서만 빈번하게 일어난다. 그러나, 결정인자에 대한 이러한 높은 표준을 충족하는 현 바이오마커 및 향후 바이오마커가 매우 중요할 가능성이 크다.
또한, 열거되지 않은 다른 바이오마커는 표 1에 결정인자로 열거된 바이오마커와 매우 상관될 것이다(본 용도의 목적을 위해, 임의의 2개의 변수는 0.5 이상의 결정 계수(R 2 )를 가질 경우, "매우 고도로 상관된" 것으로 간주될 것이다). 본 발명은 상기 결정인자에 대한 기능적 균등물 및 통계학적 균등물을 포괄한다. 또한, 그러한 부가적 결정인자의 통계학적 유용도는 실질적으로 다중 바이오마커들 간의 교차 상관에 의존하고, 임의의 신규 바이오마커는 종종 기저 생물학의 의미를 상술하기 위해서는 패널 내에 작용할 필요가 있을 것이다.
열거된 결정인자들 중 1개 이상, 바람직하게는 2개 이상이 본 발명의 수행 시에 검출될 수 있다. 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280개 이상, 또는 290개 이상의 결정인자가 검출될 수 있다.
일부 측면에서, 본원에 열거된 360개의 결정인자가 모두가 검출될 수 있다. 그러한 수의 결정인자가 검출될 수 있는 바람직한 범위에는 총 알려진 결정인자 한도까지의 임의의 최대수, 특히 5, 10, 20, 50 및 75과 쌍을 이루는, 1 내지 360, 특히 2, 5, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 210, 220, 230, 240, 250로부터 선택되는 임의의 최소수에 의해 한정되는 범위가 포함된다. 특히 바람직한 범위에는 2-5, 2-10, 2-50, 2-75, 2-100, 5-10, 5-20, 5-50, 5-75, 5-100, 10-20, 10-50, 10-75, 10-100, 20-50, 20-75, 20-100, 50-75, 50-100, 100-125, 125-150, 150-175, 175-200, 200-210, 210-220, 220-230, 230-240, 240-250 및 250-260이 포함된다.
결정인자 패널의 구성
결정인자의 군분류가 "패널"에 포함될 수 있다. 본 발명의 범주 내에서의 "패널"은 하나 초과의 결정인자들을 포함하는 바이오마커의 군(이들이 결정인자, 임상적 매개변수, 또는 통상적 실험실 위험 인자인지의 여부 불문)을 의미한다. 패널은 또한 표 1에 열거된 결정인자들의 선택된 군과 함께 암 또는 암 전이에 존재하거나 그것과 관련된 것으로 알려진, 부가적 바이오마커, 예를 들어 임상적 매개변수, 통상적 실험실 위험 인자를 포함할 수 있다.
상기 나타낸 바와 같이, 단독 사용되고 결정인자의 다중 바이오마커 패널의 구성원으로서는 사용되지 않는, 열거된 개별 결정인자, 임상적 매개변수, 및 통상적 실험실 위험 인자 중 다수는 개별 정상적 대상, 대상 전이성 이벤트를 가질 위험이 있는 대상, 및 암을 가진 대상을 서로 신뢰가능하게 구분하는 데 임상적 용도를 가지거나 거의 가지지 않으며, 이에 따라 대상을 그 3가지 상태들로 분류하는 데 단독으로 신뢰가능하게 사용될 수 없다. 심지어 충분히 수행되는 연구에서 통상적으로 일어나는 바와 같이 각각의 상기 집단들에서의 그 평균 측정에 통계학적으로 유의적 차이가 있는 경우에도, 상기 바이오마커는 개체 대상에의 그 적용가능성이 제한된 상태로 남아 대상의 진단 또는 예후 예측에 거의 기여하지 않을 수 있다. 통계학적 유의도의 통상의 측정값은 p-값이며, 이는 우연히 단독 관찰을 행하게 되는 확률을 가리키고, 그러한 p-값은 0.05 이하이며, 이는 우연히 관심 관찰을 행하게 되는 기회의 5% 이하임을 나타낸다. 그러한 p-값은 수행하는 연구의 수행력에 유의적으로 의존한다.
이 개별 결정인자 성능, 및 단지 통상적 임상적 매개변수와 극소수의 통상적 실험실 위험 인자를 조합하는 식의 일반적 성능에도 불구하고, 본 발명자들은 2개 이상의 결정인자들의 특정 조합이 또한 하나 이상의 생리학적 또는 생물학적 경로에 관련된 것으로 알려진 결정인자들의 조합을 포함하는 다중바이오마커 패널로서도 사용될 수 있다는 것과, 그러한 정보가 통계학적 분류 알고리즘 및 기타를 포함하고 개별 결정인자들의 수행 특징을 넘어서는 조합의 성능 특징을 조합하고 많은 경우에는 그 성능 특징을 연장하게 되어 조합되어 임상적으로 유용해질 수 있음을 주목하였다. 이 특정 조합은 허용가능한 수준의 진단 정확도를 나타내고, 다중 결정인자들로부터의 충분한 정보가 훈련된 식으로 조합될 때, 한 집단에서 또 다른 집단으로부터 이송가능한 고수준의 진단 정확도를 종종 신뢰가능하게 달성한다.
보다 덜 특징적이거나 보다 낮게 수행하는 2개의 결정인자가 어떻게 의도된 지시를 위해 신규의 보다 유용한 조합체로 조합되는지의 일반 개념이 본 발명의 핵심 측면이다. 다중 바이오마커는 적절한 수학 및 임상 알고리즘이 사용될 때 개별 성분보다 더 양호한 성능을 산출할 수 있고; 이는 종종 민감도 및 특이도 모두에 있어 명백하고, 보다 큰 AUC를 초래한다. 두 번째로, 새로운 식을 통해 향상된 수준의 민감도 또는 특이도를 달성하기 위해 필요한 바대로, 종종 현존 바이오마커에 있어 신규 비인식 정보가 있다. 이 숨겨진 정보는 일반적으로 자체적으로 차선의 임상적 성능을 가지는 것으로 간주되는 바이오마커에 대해 진정한 것으로 유지될 수 있다. 실제로, 단독 측정된 단일 바이오마커에 대한 높은 허위 양성 비율의 측면에서의 차선의 성능은, 제2 바이오마커와 수학식과의 조합이 부재하는 것으로 규명되지 않은 정보와 같은 일부 중요한 부가적 정보가 바이오마커 결과 내에 포함된다는 지시자임은 매우 당연하다.
당업계에 알려진 수가지 통계학적 알고리즘 및 모델링 알고리즘은 결정인자를 결정하는 선택을 돕고, 이들 선택을 조합하는 알고리즘을 최적화할 수 있다. 인자 및 교차바이오마커 상관관계/공분산 분석과 같은 통계학적 도구는 패널 구성에 대한 더욱 합리적 접근을 가능하게 한다. 결정인자들 간의 유클리드 표준화 거리를 나타내는 수학적 클러스터링 및 분류 트리가 유리하게 사용될 수 있다. 그러한 통계학적 분류 기법의 경로 공지 파종도 또한, 특정 경로 또는 생리학적 기능에 걸친 참가로 인해 개별 결정인자의 선택에 기초한 합리적 접근법과 마찬가지로 이용될 수 있다.
궁극적으로, 통계학적 분류 알고리즘과 같은 식은, 결정인자를 선택할 뿐만 아니라, 다중 결정인자로의 결과를 단일 지수에 조합하는 데 필요한 최적 식을 선택하고 훈련하는 데 사용될 수 있다. 종종 전방 선택(0의 잠재적 설명 매개변수로부터의 선택) 및 후방 선택(모든 이용가능한 잠재적 설명 매개변수로부터의 설명)과 같은 기법이 사용되고, 정보 기준, 예컨대 AIC 또는 BIC를 사용하여, 패널의 성능 및 진단 정확도와 사용된 결정인자의 수 간의 교환을 정량화한다. 전방 또는 후방 선택된 패널 상에의 개별 결정인자의 위치는 알고리즘에 대한 증분 정보 내용의 제공과 밀접히 관련될 수 있으므로, 기여 순서는 패널 내 다른 구성 결정인자에 매우 의존적이다.
임상적 알고리즘의 구성
임의의 식을 사용하여, 결정인자 결과를 본 발명을 수행하는 데 유용한 지수에 조합할 수 있다. 상기 표시된 바와 같이 또한 비제한적으로, 그러한 지수는 각종 다른 표시들 중에서도, 확률, 가능성, 절대적 또는 상대적 위험, 한 질병 상태에서 다른 질병 상태로의 전환 시간 또는 전환 속도를 가리킬 수 있거나, 혹은 전이성 질병의 향후 바이오마커 측정을 예측할 수 있다. 이는 특정 시간 또는 시간대 동안, 혹은 평생 위험 상태인 시간 동안일 수 있거나, 단순히 또 다른 기준 대상 집단에 대한 상대적인 지수로서 제공될 수 있다.
각종 바람직한 식들이 본원에 기재되어 있으나, 본원 및 상기 정의에 언급된 식들 외에도 수가지 다른 모델들 및 식 유형들이 당업자에 공지되어 있다. 사용된 실제 모델 유형 또는 식 자체가 훈련 집단에서의 그 결과의 성능 및 진단 정확도 특징에 기초하여 잠재적 모델의 분야로부터 선택될 수 있다. 식의 특성사항 특이사항은 통상적으로 관련 훈련 집단에서의 결정인자 결과로부터 유래될 수 있다. 무엇보다도, 그러한 식은 1개 이상의 결정인자 입력값으로부터 유래된 특성 공간을 대상 부류의 한 세트(예를 들어, 대상을 정상적 대상, 전이성 이벤트를 가질 위험이 있는 대상 및 암을 가지는 대상의 부류 구성원 소속을 예측하는 데 유용한 세트)로 매핑하여, 베이스(Bayesian) 접근법을 이용하여 위험(예를 들어, 암 또는 전이성 이벤트의 위험) 의 확률 함수 평가를 유도하거나, 또는 부류-병태 확률을 평가한 후, 베이스 규칙을 이용하여, 이전 경우에서와 같이 부류 확률 함수를 발생시키기 위해 의도될 수 있다.
바람직한 식에는 통계학적 분류 알고리즘의 광범위한 부류, 및 특히 판별 분석의 사용이 포함된다. 판별 분석의 목적은, 특성의 사전 동정된 세트의 특성으로부터 부류 구성원 소속을 예측하는 것이다. 선형 판별 분석(LDA)의 경우, 일부 기준에 의해 군들 중 분리를 최대화하는 특성의 선형 조합이 동정된다. 특성은, 상이한 역가(ELDA)에 기초한 원리분대(eigengene) 기재의 접근법, 또는 분산의 다변량 분석(MANOVA)에 기초한 스테핑 알고리즘을 이용하여, LDA에 대해 동정될 수 있다. 호텔링-로리(Hotelling-Lawley) 통계학에 기초한 분리가 없을 확률을 최소화하는 전방 알고리즘, 후방 알고리즘, 및 단계별 알고리즘을 수행할 수 있다.
원리분대 기재의 선형 판별 분석(ELDA)은 문헌[Shen et al. (2006)]에 의해 개발된 특성 선택 기법이다. 그 식은 가장 중요한 고유벡터와 관련된 특성을 동정하기 위해 변형된 고유 분석을 이용하는 다가변량 프레임워크 내 특성(예를 들어 바이오마커)을 선택한다. "중요하다"는 것은 일부 역가에 대해 상대적으로 분류되도록 하고자 하는 샘플들 간의 차이의 대부분의 분산을 설명하는 고유벡터로 정의된다.
지지 벡터 기계(SVM)는 두 부류를 분리하는 초평면을 찾기 위해 시도하는 분류 식이다. 이 초평면은 초평면으로부터 떨어진 정확한 여백 거리인 데이터 점인 지지 벡터를 포함한다. 분리 초평면이 데이터의 현 차원으로 존재하지 않는 가능한 경우, 차원이 원래의 변수의 비선형 함수를 취하여 큰 차원으로 데이터를 투사함으로써 크게 확장된다(문헌[Venables and Ripley, 2002]). 요구되지는 않으나, SVM에 대한 특성의 여과는 종종 예측을 향상시킨다. 특성(예를 들어, 바이오마커)가 최적의 단일변량 특성을 선택하기 위해 비매개변수 크루스칼-발스(Kruskal-Walhs)(KW) 시험을 이용하여 지지 벡터 기계에 대해 동정될 수 있거나(문헌[RF, Breiman, 2001]), 혹은 재발 분획화(RPART, 문헌[Breiman et al., 1984])를 또한 별도로 또는 조합하여 사용함으로써, 가장 중요한 바이오마커 조합을 동정할 수 있다. KW 및 RF 모두는 다수의 특성들이 총체로부터 선택될 것을 요한다. RPART는 이용가능한 바이오마커의 서브세트를 이용하여 단일 분류 트리를 생성시킨다.
다른 식은 예측성 식에 제시되기 전에 개별 결정인자 측정의 결과를 더욱 중요한 형태의 정보로 미리 처리할 수 있다. 가장 중요하게, 집단의 평균 값 등에 대한, 정상 분포 위치 또는 기타 분포 위치로서 대수 함수 또는 기호논리학 함수와 같은 통상의 수학적 변형을 이용한 바이오마커 결과의 정규화는 모두 당업자에게 공지되어 있다. 특히 관심이 되는 것은 연령, 성별, 인종 또는 성과 같은 임상적 매개변수에 기초한 정규화 세트이며, 여기서 특정 식이 한 부류 내의 대상에 대해서만 사용되거나, 입력값으로서 임상적 매개변수를 연속적으로 조합한다. 다른 경우에, 분석물 기재의 바이오마커가 산출된 변수로 조합될 수 있고, 그 변수는 후속하여 식에 제시된다.
정규화될 수 있는 한 대상의 개별 매개변수 값에 부가하여, 모든 대상들 또는 임의의 알려진 부류의 대상들에 대한 전체 예측성 식 그 자체는 문헌[D'Agostino et al., (2001) JAMA 286 180-187]에 나와있는 기법 또는 다른 유사한 정규화 및 재보정 기법에 따라, 집단의 예상 매개변수 및 평균 바이오마커 매개변수 값에 대한 보정에 기초하여 재보정되거나 다른 식으로 조정될 수 있다. 그러한 유행전염병학 조정 통계학값은 기계로 판독가능할 수 있는, 모델에 제시된 과거 데이터의 등록을 통해, 다른 식으로 또는 임시적으로 상기 매개변수 및 통계학값의 역사적 연구에 대한 기준의 회고적 질의를 통해, 포착, 확인, 향상 및 업데이트될 수 있다. 식 재보정 또는 다른 보정의 대상이 될 수 있는 부가적 예에는 오즈비의 한도에 관한 문헌[Pepe, M. S. et al., 2004]; ROC 곡선에 관한 문헌[Cook, N R, 2007]에 의한 연구에서 사용되는 통계학이 포함된다. 마지막으로, 분류자(classifier) 식 자체의 수치 결과는, 절대적 위험에 대해 보정하고 분류자 또는 위험 식의 제시를 위한 신뢰도 구간을 제공하기 위해, 실제 임상적 집단 및 연구 결과와 관찰 종점을 기준으로 함으로써 후처리로 변환될 수 있다. 이의 한 예는 절대적 위험, 및 제노믹 헬쓰 인코포레이티드(Genomic Health, Inc., 미국 캘리포니아주 레드우드 시티 소재)의 온코타입 Dx 제품에서 재발 스코어 식의 출력을 기준으로 하여 선택되는, 실제 임상 연구를 이용하여 유도된 상기 위험에 대한 신뢰도 구간의 제시이다. 한 추가 변형은 분류자 또는 위험 식의 출력에 기초하고 연령 또는 성별과 같은 임상적 매개변수에 의해 정의되고 선택되는, 보다 작은 연구 하위집단에 대해 보정이다.
임상적 매개변수 및 통상적 실험 위험 인자의 조합
상기 임상적 매개변수들 중 임의의 매개변수는 본 발명의 수행 시에 식으로의 결정인자 입력값으로서 또는 결정인자 패널 및 식을 이용하여 측정하는 관련 집단을 한정하는 예비선택 기준으로서 사용될 수 있다. 상기 나타낸 바와 같이, 임상적 매개변수는 또한 바이오마커 정규화 및 전처리, 또는 결정인자 선택, 패널 구성, 식 유형 선택 및 유도, 및 식 결과 후처리에 유용할 수 있다. 한 유사한 접근법이 식에의 입력값으로서 또는 예비선택 기준으로서 통상적 실험실 위험 인자와 함께 취해질 수 있다.
결정인자의 측정
수준 또는 결정인자의 양의 실제 측정은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용하여 단백질 또는 핵산 수준에서 결정될 수 있다. 예를 들어 핵산 수준에서, 노던(Northern) 및 서던(Southern) 혼성화 분석뿐만 아니라, 상기 서열들 중 하나 이상을 특이적으로 인식하는 리보뉴클레아제 보호 검정을 사용하여, 유전자 발현을 결정할 수 있다. 대안적으로, 결정인자의 양은 역전사 기재의 PCR 검정(RT-PCR)을 이용하여, 예를 들어 유전자의 차별적 발현 서열에 대해 특이적인 프라이머를 이용하거나, 파노믹스 인코포레이티드(Panomics, Inc.)에 의한 측쇄 사슬 RNA 증폭 및 검출 방법에 의해 측정될 수 있다. 결정인자의 양은 또한 단백질 수준에서, 예를 들어 본원에 기재된 유전자 산물에 의해 코딩되는 펩티드, 또는 세포 이하의(subcellular) 부위 또는 이의 활성의 수준을 예를 들어 AQUA와 같은 기술 플랫폼을 이용하여 측정함으로써 결정될 수 있다. 그러한 방법은 당업계에 공지되어 있고, 이에는 예를 들어 유전자, 압타머 또는 분자 임프린트에 의해 코딩되는 단백질에 대한 항체에 기초한 면역검정이 포함된다. 임의의 생물학적 물질은 단백질 또는 그것의 활성의 검출/정량화를 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 분석되는 각 단백질의 활성에 따라 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 활성을 결정하기 위해 적당한 방법이 선택될 수 있다.
결정인자 단백질, 폴리펩티드, 돌연변이, 및 이의 다형체가 임의의 적당한 방식으로 검출될 수 있으나, 전형적으로는 결정인자 단백질, 폴리펩티드, 돌연변이, 또는 다형체에 결합하는 항체와 접촉시킨 후, 반응 산물의 존재 또는 부재를 검출함으로써 검출된다. 항체는 상기 논의된 바와 같이 단클론, 다클론, 키메라 또는 이들의 단편일 수 있고, 반응 산물의 검출은 임의의 적당한 면역검정으로 수행될 수 있다. 대상으로부터의 샘플은 전형적으로 상기 기재된 바와 같은 생물학적 유체이고, 상기 기재된 방법을 수행하는 데 사용되는 생물학적 유체의 동일한 샘플일 수 있다.
본 발명에 따라 수행되는 면역검정은 동종성 검정 또는 이종성 검정일 수 있다. 동종성 검정에서, 면역학적 반응은 통상 특이적 항체(예를 들어, 항결정인자 단백질 항체), 표지화된 분석물, 및 관심 샘플을 수반한다. 표지에서 발생하는 신호는 항체가 표지화된 분석물에 결합할 때 직접적으로 또는 간접적으로 변형된다. 면역학적 반응 및 이의 정도 검출 모두는 동종성 용액 중에서 수행될 수 있다. 이용되는 면역화학적 표지에는 유리 라디칼, 방사선동위원소, 형광 염료, 효소, 박테리오파지, 또는 보조효소가 포함된다.
이종성 검정 접근법에서, 시약은 통상 샘플, 항체, 및 검출가능한 신호 생성 수단이다. 상기 기재된 바와 같은 샘플이 사용될 수 있다. 항체는 지지체, 예컨대 비드(예컨대 단백질 A 및 단백질 G 아가로스 비즈), 플레이트 또는 슬라이드 상에 고정화되어, 액체상으로 항체를 포함하는 것으로 의심되는 시편과 접촉될 수 있다. 이어서, 지지체는 액체상으로부터 분리되고, 지지체상 또는 액체상은 그러한 신호를 생성하는 수단을 이용하는 검출가능한 신호에 대해 조사된다. 신호는 샘플 내 분석물의 존재와 관련된다. 검출가능한 신호 생성 수단에는 방사선활성 표지, 형광 표지 또는 효소 표지가 포함된다. 예를 들어, 검출되는 항원이 제2 결합 부위를 포함하는 경우, 그 부위에 결합하는 항체가 검출가능한 기에 접합되어, 분리 단계 전에 액체상 반응 용액에 부가될 수 있다. 고체 지지체 상의 검출가능한 기의 존재는 시험 샘플 내 항원의 존재를 가리킨다. 적당한 면역검정의 예는 올리고뉴클레오티드, 면역블로팅, 면역형광 방법, 면역석출, 화학발광 방법, 전기화학발광(ECL) 또는 효소 결합 면역검정이다.
본원에 개시된 방법을 수행하는 데 유용할 수 있는 다수의 특이적 면역검정 형태 및 이의 변형태가 당업자에게 자명할 것이다. 일반적으로, 문헌[E. Maggio, Enzyme-Immunoassay, (1980) (CRC Press, Inc, Boca Raton, Fla)]를 참조하고, 또한 미국 특허 제4,727,022호(Skold et al., 발명의 명칭: "Methods for Modulating Ligand-Receptor Interactions and their Application"), 미국 특허 제4,659,678호(Forrest et al., 발명의 명칭: "Immunoassay of Antigens"), 미국 특허 제4,376,110호(David et al., 발명의 명칭: "Immunometric Assays Using Monoclonal Antibodies"), 미국 특허 제4,275,149호(Litman et al., 발명의 명칭: " Macromolecular Environment Control in Specific Receptor Assays"), 미국 특허 제4,233,402호(Maggio et al., 발명의 명칭: "Reagents and Method Employing Channeling"), 및 미국 특허 제4,230,767호(Boguslaski et al., 발명의 명칭: "Heterogenous Specific Binding Assay Employing a Coenzyme as Label")을 참조한다.
항체는 알려진 기법, 예컨대 수동 결합에 따라 진단 검정(예를 들어, 비즈, 예컨대 단백질 A 또는 단백질 G 아가로스, 마이크로스피어, 플레이트, 슬라이드, 또는 라텍스 또는 폴리스티렌과 같은 물질로 형성된 웰)에 적당한 고체 지지체에 접합될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 항체가 마찬가지로, 알려진 기법에 따라, 검출가능한 표지 또는 기, 예컨대 방사선표지(예를 들어, 35S, 125I, 131I), 효소 표지(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제), 및 형광 표지(예를 들어, 플루오레신, 알렉사(Alexa), 녹색 형광 단백질, 로다민)에 접합될 수 있다.
항체는 또한 결정인자 단백질, 폴리펩티드, 돌연변이, 및 다형체, 예컨대 티로신 인산화, 트레오닌 인산화, 세린 인산화, 글리코실화(예를 들어, O-GlcNAc)의 번역후 변형에 유용할 수 있다. 그러한 항체는 관심 단백질 또는 단백질들 내의 인산화된 아미노산을 특이적으로 검출하고, 본원에 기재된 면역블로팅, 면역형광, 및 ELISA 검정에 사용될 수 있다. 이 항체는 당업자에게 공지되어 있고, 상업적으로 이용가능한 번역후 변형도 또한 반영자 매트릭스-지원 레이저 탈착 이온화-시간 비행 시간 분광분석(MALDI-TOF)으로 전이가능한 이온을 이용하여 결정될 수 있다(문헌[Wirth, U. et al.(2002) Proteomics 2(10) 1445-51]).
효소 활성을 가지는 것으로 알려진 결정인자 단백질, 폴리펩티드, 돌연변이, 및 다형체에 있어, 활성이 당업계에 공지된 효소 검정을 이용하여 시험관내 결정될 수 있다. 그러한 검정에는 다수의 다른 것들 중에서도 비제한적으로 키나제 검정, 포스파타제 검정, 리덕타제 검정이 포함된다. 효소 활성의 동력학 성질의 조절은 알려진 알고리즘, 예컨대 힐 플롯(Hill plot), 마이클리스-멘텐(Michaelis-Menten) 방정식, 선형 회구 플롯, 예컨대 라인위버-버크(Lineweaver-Burk) 분석, 및 스캐차드(Scatchard) 플롯을 이용한 속도 상수 KM을 측정함으로써 결정될 수 있다.
결정인자 서열에 대한 데이터베이스 목록에 의해 제공되는 서열 정보를 이용하여, 결정인자 서열의 발현이 당업자에게 공지된 기법을 이용하여, (존재하는 경우) 검출되어, 측정될 수 있다. 예를 들어, 결정인자 서열에 상응하는 서열 데이터베이스 목록 내의 서열, 또는 본원에 개시된 서열 내의 서열을 사용하여, 예를 들어 노던 블롯 혼성화 분석 또는 특이적이고 바람직하게 핵산 서열을 정량 증폭하는 방법으로, 결정인자 RNA 서열을 검출하기 위한 프로브를 구성할 수 있다. 또 다른 예로서, 서열은, 예를 들어 증폭 기재의 검출 방법, 예컨대 역전사 기재의 중합효소 사슬 반응(RT-PCR)에서 결정인자 서열을 특이적으로 증폭시키기 위한 프라이머를 구성하는 데 사용될 수 있다. 유전자 발현 내 변경이 유전자 증폭, 검출, 다형체, 및 돌연변이와 관련된 경우, 시험 집단 및 기준 집단에서의 서열 비교는 시험 및 기준 세포 집단 내 조사된 DNA 서열의 상대량을 비교함으로써 행해질 수 있다.
본원에 개시된 유전자의 발현은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용하여 RNA 수준에서 측정될 수 있다. 예를 들어, 유전자 발현은 이 서열들 중 하나 이상을 특이적으로 인식하는 프로브를 이용한 노던 혼성화 분석을 사용하여 결정될 수 있다. 대안적으로, 발현은 역전사 기재의 PCR 검정(RT-PCR)을 이용하여, 예를 들어 차별적 발현 서열에 대해 특이적인 프라이머를 이용하여 측정될 수 있다. RNA는 또한 예를 들어 다른 표적 증폭 방법(예를 들어, TMA, SDA, NASBA), 또는 신호 증폭 방법(예를 들어, bDNA) 등을 이용하여 정량화될 수 있다.
대안적으로, 결정인자 단백질 및 핵산 대사물이 측정될 수 있다. 용어 "대사물"에는 대사 공정의 임의의 화학적 또는 생화학적 산물, 예컨대 생물학적 분자(예를 들어, 단백질, 핵산, 탄수화물, 또는 지질)의 처리, 절단 또는 소모에 의해 생성되는 임의의 화합물이 포함된다. 대사물은 회절 지수 분광법(RI), 자외선 분광법(UV), 형광 분석, 방사선화학적 분석, 근적외선 분광법(near-IR), 핵자기 공명 분광법(NMR), 광 분산 분석(LS), 질량 분광분석, 열분해 질량 분광분석, 혼탁법, 분산 라만 분광법, 질량 분광분석과 조합된 기체 크로마토그래피, 질량 분광분석과 조합된 액체 크로마토그래피, 질량 분광분석과 조합된 매트릭스-지원 레이저 이온화-시간 비행 분석(MALDI-TOF), 질량 분광분석과 조합된 이온 분무 분광법, 모세관 전기영동, NMR 및 IR 검출을 비롯한, 당업자에게 공지된 각종 방법들로 검출될 수 있다. (각기 전문이 본원에 참조 인용되는 WO 04/056456 및 WO 04/088309를 참조한다). 이와 관련하여, 다른 결정인자 분석물이 상기 검출 방법, 또는 당업자에게 알려진 기타 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 순환 칼슘 이온(Ca2 +)이 무엇보다 플루오(Fluo) 계열, 푸라(Fura)-2A, 로드(Rhod)-2와 같은 형광 염료를 이용하여 샘플 내에서 검출될 수 있다. 다른 결정인자 대사물이 그러한 대사물을 검출하기 위해 특이적으로 설계되거나 미세조정된 시약을 이용하여 유사하게 검출될 수 있다.
키트
본 발명은 또한 키트의 형태로 함께 팩키징된 결정인자 핵산에 의해 코딩되는 단백질에 대한 결정인자 핵산 또는 항체의 부분에 대해 상보적인, 올리고뉴클레오티드 서열과 같은 상동성 핵산 서열을 가짐으로써, 1개 이상의 결정인자 핵산을 특이적으로 동정하는 핵산을 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 결정인자 유전자의 단편일 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 길이가 200, 150, 100, 50, 25, 10개 이하의 뉴클레오티드일 수 있다. 키트는 분리된 용기 내에 무엇보다 핵산 또는 항체(이미 고체 매트릭스에 결합되어 있거나, 매트릭스에 그것을 결합시기키 위해 시약으로 분리하여 팩키징됨), 조절 제제(양성 및/또는 음성), 및/또는 검출가능한 표지, 예컨대 플루오레신, 녹색 형광 단백질, 로다민, 시아닌 염료, 알렉사 염료, 루시퍼라제, 방사선표지를 포함할 수 있다. 검정을 수행하기 위한 사용설명서(예를 들어, 서면, 테이프, VCR, CD-ROM 등)가 키트 내에 포함될 수 있다. 검정은 예를 들어 당업계에 공지된 바와 같은 노던 혼성화 또는 샌드위치 ELISA의 형태일 수 있다.
예를 들어, 결정인자 검출 시약은 다공성 스트립과 같은 고체 매트릭스 상에 고정화되어, 적어도 하나의 결정인자 검출 부위를 형성할 수 있다. 다공성 스트립의 측정 또는 검출 부위는 핵산을 함유한 복수개의 부위를 포함할 수 있다. 시험 스트립은 또한 음성 및/또는 양성 대조군에 대한 부위를 포함할 수 있다. 대안적으로, 대조군 부위가 시험 스트립으로부터의 분리된 스트립 상에 위치할 수 있다. 임의적으로, 상이한 검출 부위는 상이한 양의 고정화된 핵산을, 예를 들어 제1 검출 부위에는 보다 높은 양으로, 또한 후속 부위에는 보다 적은 양으로 포함할 수 있다. 시험 샘플의 부가 시에, 검출가능한 신호를 표시하는 부위의 수는 샘플 내에 존재하는 결정인자의 양의 정량 표시를 제공한다. 검출 부위는 임의의 적당하게 검출가능한 모양의 형태로 될 수 있고, 전형적으로는 시험 스트립 폭 전반에 걸친 막대 또는 점의 모양으로 있다.
대안적으로, 키트는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 핵산 기질 어레이를 포함한다. 어레이 상의 핵산은 결정인자 1-360에 의해 표시되는 하나 이상의 핵산 서열을 특이적으로 동정한다. 각종 실시양태에서, 결정인자 1-360에 의해 표시되는 서열 중 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 40, 50, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 275 이상의 발현이 어레이에 대한 결합에 의해 동정될 수 있다. 기질 어레이는, 예를 들어 고체 기질, 예를 들어 미국 특허 제5,744,305호에 기재된 바와 같은 "칩(chip)" 상에 있을 수 있다. 대안적으로, 기질 어레이는 용액 어레이, 예를 들어 xMAP(루멕스(Lummex), 미국 텍사스주 오스틴 소재), 사이베라(Cyvera)(일루미나(Illumina), 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재), 셀카드(CellCard)(비트라 바이오사이언스(Vitra Bioscience), 미국 캘리포니아주 마운틴뷰 소재) 및 콴텀 도츠 모자이크(Quantum Dots' Mosaic)(인비트로젠(Invitrogen), 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)일 수 있다.
결정인자의 검출을 위한 항체에 적당한 공급원에는 예를 들어, 아바자임(Abazyme), 압노바(Abnova), 어피니티 바이오라지칼즈(Affinity Biologicals), 안티바디숍(AntibodyShop), 바이오제네시스(Biogenesis), 바이오센스 라보라토리즈(Biosense Laboratories), 칼바이오켐(Calbiochem), 셀 사이언시스(Cell Sciences), 케미콘 인터내셔널(Chemicon International), 케모카인(Chemokine), 클론테크(Clontech), 사이토랩(Cytolab), 다코(DAKO), 다이아그노스틱 바이오시스템즈(Diagnostic BioSystems), 이바이오사이언스(eBioscience), 엔도크린 테크놀로지즈(Endocrine Technologies), 엔조 바이오켐(Enzo Biochem), 유로젠텍(Eurogentec), 퓨젼 안티보디즈(Fusion Antibodies), 제네시스 바이오테크(Genesis Biotech), 글로보자임스(GloboZymes), 헤마톨로직 테크놀로지즈(Haematologic Technologies), 이뮤노디텍트(Immunodetect), 이뮤노다이아그노스틱(Immunodiagnostik), 이뮤노메트릭스(Immunometrics), 이뮤노스타(Immunostar), 이뮤노비젼(Immunovision), 바이오제넥스(Biogenex), 인비트로젠, 잭슨 이뮤노리서치 라보라토리(Jackson ImmunoResearch Laboratory), KMI 다이아그노스틱스(KMI Diagnostics), 코마 바이오테크(Koma Biotech), 랩프론티어 라이프 사이언스 인스티튜트(LabFrontier Life Science Institute), 리 라보라토리즈(Lee Laboratories), 라이프스크린(Lifescreen), 마인 바이오테크놀로지 서비시스(Maine Biotechnology Services), 메디클론(Mediclone), 마이크로팜 리미티드(MicroPharm Ltd.), 모디퀘스트(ModiQuest), 몰레큘러 이노베이션즈(Molecular Innovations), 몰레큘러 프로브즈(Molecular Probes), 메오클론(Neoclone), 뉴로믹스(Neuromics), 뉴잉글런드 바이오랩스(New England Biolabs), 노보카스트라(Novocastra), 노부스 바이오라지칼즈(Novus Biologicals), 온코젠 리서치 프로덕트(Oncogene Research Product), 오르비젠(Orbigen), 옥스포드 바이오테크놀로지(Oxford Biotechnology), 판베라(Panvera), 퍼킨엘머 라이프 사이언시스(PerkinElmer Life Sciences), 파민젠(Pharmingen), 피닉스 파마슈티칼즈(Phoenix Pharmaceuticals), 피어스 케미칼 컴퍼니(Pierce Chemical Company), 폴리문 사이언티픽(Polymun Scientific), 폴리사이언시스 인코포레이티드(Polysiences, Inc.), 프로메가 코포레이션(Promega Corporation), 프로테오제닉스(Proteogenix), 프로토스 이뮤노리서치(Protos Immunoresearch), QED 바이오사이언시스 인코포레이티드(QED Biosciences, Inc.), R&D 시스템즈(R&D Systems), 레플리젠(Repligen), 리서치 다이아그노스틱스(Research Diagnostics), 로보스크린(Roboscreen), 산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology), 세이카가쿠 아메리카(Seikagaku America), 세로라지칼 코포레이션(Serological Corporation), 세로텍(Serotec), 시그마알드리히(SigmaAldrich), 스템셀 테크놀로지즈(StemCell Technologies), 시냅틱 시스템즈 게엠베하(Synaptic Systems GmbH), 테크노팜(Technopharm), 테라 노바 바이오테크놀로지(Terra Nova Biotechnology), 티터맥스(TiterMax), 트릴륨 다이아그노스틱스(Trillium Diagnostics), 업스테이트 바이오테크놀로지(Upstate Biotechnology), US 바이오라지칼(US Biological), 벡터 라보라토리즈(Vector Laboratories), 와코 퓨어 케미칼 인더스트리즈(Wako Pure Chemical Industries) 및 젭토메트릭스(Zeptometrix)와 같은 상업적으로 이용가능한 공급원들이 포함된다. 그러나, 당업자라면 표 1의 결정인자 중 임의의 것에 대한 항체, 핵산 프로브, 예를 들어 올리고뉴클레오티드, 압타머, siRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드를 통상적 방식으로 제작할 수 있을 것다.
실시예
실시예 1: 일반적 방법
유전자도입 마우스 및 원발성 종양
(문헌[Ganss, Montoliu et al. 1994]; 문헌[Chin, Pomerantz et al. 1997]; 문헌[Chin, Tam et al. 1999])에 기재된 바와 같이 역 테트라사이클린 전사촉진제, Tet 프로모터 및 티로시나제 인핸서/프로모터 도입유전자를 사용하였다. 마우스 c-Met cDNA(죠지 F 반데-우드(George F Vande-Woude)제, 미국 미시간주 그랜드 래피드즈 소재)를 (문헌[Chin, nature 1999])에 기재된 바와 유사한 Tet 프로모터의 조절 하에 클로닝하였다. 다중 도입유전자 기반인자 세포주를 예상 빈도로 생성시켰다. 잘 정의된 활성자 세포주(문헌[Tyr/rtTA, line 37-Chin, Nature 1999]) 및 3개의 독립적 리포터 세포주(Met15, Met28 및 Met40)를 이들 연구에 사용하였다.
체내 도입유전자 발현을 활성화하기 위해, MET 유전자도입 마우스에 이유기에 식수 중(수크로스 물 중 2 ug/ml) 독시사이클린을 공급하여, 자발적 종양 발달에 대해 관찰하였다. 동물(3주령)의 한 서브세트를 아베르틴(0.5 g/kg 체중)으로 복강내 마취하여, 20-mm 직사각형 외상으로 등에 상처낸 후, 봉합하였다. 종양 발달 또는 나쁜 건강 출현에 대해 동물을 격주로 관찰하였다. 사망전 동물 또는 유의적 종양 부하량을 갖는 동물을 희생시킨 후, 상세 부검을 행하였다. 종양 시편을 10% 포르말린 중에 고정하고, 기전에 기술된 바와 같이 조직학적 분석을 위해 파라핀 중에 포매하였다(문헌[Chin, L. et al. Genes and Dev, 1997). 충분한 시편을 이용한 경우, 원발성 종양을 후속 분석을 위해 급속 냉동하였고, 세포주를 발생시켰다.
세포 배양. 흑색종 세포주를 콜라게나제+히알루로니다제(2 mg/ml; 시그마(Sigma))로 2시간 동안 분해한 후, 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 함유의 RPMI 1640 배지(기브코 BRL(Gibco BRL))과 함께 배양함으로써 마우스 종양으로부터 유도하였다. 멜라닌세포 배양액을 전술된 바와 같이10, 갓태어난 마우스 내피로부터 발생시켜, 5% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 200 pM 콜레라 독소, 200 nM 12-O테트라데카노일포르볼-13-아세테이트(TPA) 함유의 RPMI 1640 중에 유지시켰다. 독시사이클린을 2 ug/ml로 첨가함으로써 배양된 세포 중에 유전자도입 c-Met 발현을 유도하였다. M3 BRAF 멜라닌세포, HMEL468 프라이밍된 멜라닌세포, WM3211 및 WM115를 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신 함유의 RPMI 1640 중에 유지시켰다. HMEL468은 [Garraway et al.]11에 의해 기재된 바와 같이 PMEL/hTERT/CDK4(R24C)/p53DD/BRAFv600E 세포의 서브클론을 동정한다.
조직학적 분석 및 면역조직화학적 염색. 마우스를 연구소 지침에 따라 희생하였고, 기관을 10% 완충 포르말린 중에 고정하고 파라핀 중에 포매하였다. 조직 구획을 H&E로 염색하여, 병변 분류 및 종양 전이의 검출을 가능하게 하였다. c-Met 단백질의 검출 및 그것의 활성화 상태의 결정을 위해, 종양 샘플을 셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology)제의 총 c-Met 및 포스포 c-Met(Tyr1349) 항체로 면역염색시켰다. 종양을 시그마제의 S100 항체로 면역염색시켰다.
RT - PCR 및 실시간 정량 PCR 에 의한 유전자 발현. 유전자 발현의 분석을 위해, 제조자의 프로토콜에 따라 트리졸(Trizol)(기브코 BRL)을 이용하여 총 RNA를 원발성 피부 흑색종 또는 배양된 세포로부터 단리하였다. 총 RNA를 RQ1 DNAse(프로메가)로 처리하였고, 1 ug 총 RNA를, 올리고(dT)로 프라이밍된 수퍼스크립트 II 중합효소(인비트로젠)를 이용한 역 전사 반응을 위해 사용하였다. 코딩 영역을 Mx3000P 실시간 PCR 시스템(스트라타젠(Stratagene)) 상에 SYBR 그린(Green)(어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))을 이용하여 PCR 또는 정량 실시간 PCR에 의해 증폭시켰다. 리보솜 단백질 R15을 내부 발현 대조군으로 사용하였다. 프라이머 서열은 이하와 같다: c-Met: 5'-TCTGTTGCCATCCCAAGACAACATTGATGG, 5'-AAATCTCTGGAGGAGGTTGG; HGF; 5'-CAAGGCCAAGGAGAAGGTTA, 5'-TTTGAAGTTCTCGGGAGTGA; Tyr; 5'-CCAGAAGCCAATGCACCTAT, 5'-AGCAATAACAGCTCCCACCA; TRP1; 5'-ATTCTGGCCTCCAGTTACCA, 5'-GGCTTCATTCTTGGTGCTTC; DCT; 5'-AACAACCCTTCCACAGATGC, 5'-TCTCCATTAAGGGCGCATAG; R15; 5'-CTTCCGCAAGTTCACCTACC, 역-TACTTGAGGGGGATGAATCG. SMAD3 프라이머는 수퍼어레이로부터 수득된 것이었다.
유전자 발현 프로파일링 및 데이터 분석. Met 유래 및 HRas 유래 마우스 종양 RNA를 상기 기재된 바와 같이 추출하여, 표지화하고, 제조자의 프로토콜에 따라 다나-파머 캔서 인스티튜트 마이크로어레이 코어 퍼실러티(Dana-Farber Cancer Institute Microarray Core Facility)에 의해 어피매트릭스 진칩 마우스 게놈(Affymetrix GeneChip Mouse Genome) 430 2.0 어레이에 혼성화하였다. R/바이오컨덕터(R/bioconductor) 팩키지(www.bioconductor.org)를 이용하여 발현 데이터를 처리하였다. 기재된 바와 같이12, 분석을 수행하였다. 간략히 말해, 배경 수정 방법은 MAS(v4.5)였고, 정규화 방법은 일정하였으며, PM 조정 방법은 MAS(v5)였으며, 발현 값 요약 방법은 중위수 다듬기(medianpolish; RMA)였다. P/M/A 콜 방법은 MAS5였다. 6개의 iMet 종양 대 6개의 iHRas 종양 간의 추가 차별적 발현을 위해, 모든 12개의 종양 샘플들 중 적어도 2개의 존재 콜을 가지는 프로브 세트(16,434개 프로브 세트)를 선택하였다. 차별적 발현 분석을 위해 마이크로어레이(SAM 2.0, http://www-stat.Stanford.edu/~tibs/SAM/)의 유의도 분석을 사용하였다13. 쌍을 형성하지 않은 2개 부류의 샘플 분석을 수행한 후, 최소 2개 변화에 대해 여과하고 델타 값 조정을 행하여, 허위 발견율이 0.05 미만이 되도록 한다. GFP 또는 HOXA1로 형질유도된 세포(HMEL468, WM115, WM3211)로부터 추출된 RNA를 이용하여 상기 기재된 바와 같은 SAM에 의해 HOXA1 유도 전사 분석을 수행한 후, 제조자의 프로토콜에 따라 다나-파머 캔서 인스티튜트 마이크로어레이 코어 퍼실러티에 의해, 표지화된 cDNA를 어피매트릭스 진칩 휴먼 게놈 U133Plus2.0 상에 혼성화하였다. 인제뉴어티 패쓰웨이 분석 프로그램(http://www.ingenuity.com/index.html)을 이용하여, 전이성 흑색종에서 유의적으로 제어되는 세포 기능 및 경로를 추가 분석하였다.
마우스 유전자 발현 및 인간 어레이 CGH 데이터의 비교. (상기 기재된) 마우스 종양의 발현 분석으로부터 수득된 비중복형의 차별적 발현 프로브 세트를 어레이-CGH(GEO 등록 #GSE7606)에 의해 동정된 인간 전이성 흑색종에서의 복제수 일탈을 나타낸 인간 이종상동체에 매핑하였다. 호몰로진(Homologene) 데이터베이스(NCBI)를 사용하여, iMet 대 iRas 종양에서 차별적으로 발현된 것들에 대해 이종상동성 인간 유전자를 동정하였다. 각기 iMet 종양(대 iRas 종양)에서 상향제어 또는 하향제어되고, 인간 전이에서 증폭 또는 결실된 유전자를 선택하였다.
비감독 클러스터링 및 카플란- 마이어 생존 분석. 전이성 결정인자의 발현 프로파일을 사용하여, R(http://www.r-project.org/)을 이용하여 295개의 유방 종양14;15을 k-평균 클러스터링에 의해 2개의 군으로 클러스터링하였다. 2개의 클러스터링된 군에 대한 카플란-마이어 생존 분석을 R에서 생존 팩키지를 이용하여 수행하였고, P-값을 R에서 생존 통계학적 팩키지를 이용하여 계산하였다.
DNA 구성물 및 저복잡도 라이브러리. pRetrosuperSmad3 및 p3TPLux는 애드젠(Addgene)제(각기 #15726 및 11767)였다. 저복잡도 cDNA 라이브러리의 경우, 199개의 유전자를 나타내는 230개의 cDNA를 ORFeome 콜렉션(다나-파이버 1서 인스티튜트)으로부터 수득하여, 높은 처리량으로 제조자의 제안에 따라 게이트웨이(Gateway) 재조합을 통해 pLenti6/V5 DEST(인비트로젠)에 전달하였다. 침습 스크린에서의 후보 cDNA 스코어링은 V5 에피토프를 이용하여 확인된 서열 및 발현이었고, 모든 침습 검증 연구에 대해 동종성 클론 제제를 이용하였다.
96-웰 바이러스 생산, 형질유도 및 트랜스웰 침습 검정. 대략 3×104개의 293T 세포를 DMEM+10%FBS(항생제) 중 형질감염(~90% 컨플루언스) 전 24시간에 96-웰 편평한 바닥 플레이트에 각 웰 당 100 ul로 파종하였다. 각 웰 형질감염을 위해, 150 ng 바이러스 골격 및 110 ng 렌티바이러스 팩키징 벡터를 옵티-MEM(Opti-MEM)(인비트로젠)을 이용하여 15 ul로 희석하였다. 생성된 벡터 믹스를 0.6 ul 리포펙타민(Liptofectamine) 2000(인비트로젠)을 함유하는 15 ul 옵티-MEM과 조합하여, 20분 동안 실온에서 항온배양하며, 293T 세포를 커버하는 100 ul 배지에 첨가하였다. 배지를 형질감염 후 대략 10시간째에 DMEM+10%FBS+P/S로 교체하였고, 4개의 바이러스 상등액 수집물을 형질감염 후 36시간째에 출발하여 취하고, 조합하였다. 8 ug/ml 폴리브렌 함유의 150 ul 바이러스 상등액을 표적 세포(HMEL468)에 첨가하였고, 그 세포는 감염(70-80% 컨플루언스) 전 24시간째에 96-웰 편평한 바닥 플레이트에 파종하였다. 세포를 2회 감염시켰고, 제2 감염 후 24시간 동안 RPMI+10%FBS+P/S 중에 회수되도록 하였으며, 그 후에 세포를 트립신화하여, 제조자의 권장사항에 따라 플레이팅된 96-웰 종양 침습(BD 바이오사이언스(BD Bioscience))에 적용하였다. 침습된 세포를 4 uM 칼세인(Calcein) AM(BD 바이오사이언스)를 이용한 생체내 표지로 검출하였고, 494/517 nm(Abs/Em)에서 형광에 의해 측정하였다. 양성-스코어링 후보는 벡터 대조군으로부터 2x 표준 편차를 기록하는 것으로 확인되었다.
트랜스웰 침습 검정. 표준 24-웰 침습 체임버(BD 바이오사이언스)를 이용하여, 제조자의 제안에 따라 침습도를 평가하였다. 간략히 말해, 세포를 트립신화하여, PBS로 2회 세정하여, 무혈청 RPMI 1640 배지 중에 재현탁하였으며, HMEL468에 대해서는 7.5×104 세포/웰로 파종하였고, WM3211에 대해서는 2.0×104 세포/웰로 파종하였으며, WM115에 대해서는 5.0×104 세포/웰로 파종하였다. 체임버를 삼벌로 또는 사벌로 파종하여, 입력 대조군으로서의 이벌의 세포 배양 플레이트뿐만 아니라 화학주성인자로서의 10% 혈청-함유 배지에 두었다. 22시간 항온배양한 후, 체임버를 10% 포르말린 내에 고정화하고, 수동 계수를 위해 또는 아도브 포토샵(Adobe Photoshop; 아도브(Adobe))을 이용한 픽셀 정량화에 의해 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 세포 수 차이를 조절하기 위해 데이터를 입력 세포에 정규화하였다(로딩 조절). HOXA1 매개 침습에 대한 SMAD3 녹다운의 평가를 위해, SMAD3을 표적으로 하는 검증된 shRNA 구성물(pSUPER-shSMAD3), 및 바이러스를 표준 레트로바이러스 생산 프로토콜을 이용하여 발생시켰다. 침습 비교를 위해 병렬로, 대조군 세포를 비표적 shRNA(pSUPER-shNT)로 형질유도하였다.
이종이식편 및 꼬리 정맥 주사 연구. HMEL468 세포를 GFP 또는 HOXA1 바이러스로 안정하게 형질유도하였다. 이종이식편 연구를 위해, 세포를 CB-17-scid(C.B-Igh-lb/lcrTac-Prkdcscid; 타코닉(Taconic)) 마우스의 양측면에 1×106 세포/부위로 피하 이식하였다. 폐 파종 능력을 평가하기 위해, 5.0×105개 세포를 CB-17-scid 마우스의 꼬리 정맥에 조사하였다. 모든 동물들을 종양 발달에 대해 모니터링한 후, 검시 및 종양 조직학적 분석을 행하였다.
TGFβ 리포터 검정. 세포를 p3TPLux 리포터(웰당 1 ug) 및 대조군 리포터(레닐라(Renilla), 웰당 20 ng)로의 형질감염 전 24시간에 6웰 플레이트에서 삼벌로 웰당 2×105 세포로 파종하였다. 24시간 동안 항온배양한 후, 세포를 TGFβ(20 ng/ml, R&D 시스템즈)로 24시간 동안 처리하고, 루맷(Lumat) LB9507 루미노미터(Luminometer)를 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 루시퍼라제 분석(프로메가)을 행하여, 반딧불/레닐라 비에 의해 표시되는 바와 가은 리포터 활성화를 평가하였다. 2-테일 T 테스트를 이용하여 p-값을 계산하였다.
면역블로팅 분석. 세포를 20 ng/ml TGFb(R&D 시스템즈)를 이용하여 표시된 대로 처리한 후, PBS 중에 2x로 세정하고, 1 mM PMSF, 1x 프로테아제 억제제 칵테일(시그마) 및 1x 포스파타제 억제제(칼바이오켐(Calbiochem))를 함유하는 RIPA 완충액(150 mM NaCl, 50 mM 트리스-HCl, pH 7.5, 500 μM, EDTA, 100 μM, EGTA, 1.0% 트리톤(Triton) X-100, 및 1% 데옥시콜산나트륨)을 이용하여 세포용해시켰다. 4℃에서 세포용해 완충액 중에 30분간 항온배양한 후, 전 세포 추출물을 분리하여, 4℃에서 10k 10분으로 원심분리하여 맑게 한 후, DC 프로틴 어세이(DC Protein Assay)(바이오래드)로 단백질 농도를 결정하였다. 단백질을 NuPAGE 4-12% 비스-트리스(Bis-Tris) 젤(인비트로젠) 상에의 분리에 의해 가시화하고, PBS+트윈(Tween)-20 중 %5 밀크로 차단된 PVDF(밀리포어(Millipore), 미국 매사추세츠주 빌러리카 소재)에 블로팅한 후, 표시된 항체와 함께 항온배양하였다. 면역블로팅을 위해 하기 항체를 사용하였다: pSmad3 및 총 Smad3(셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology)), 알파-튜불린(시그마), V5(인비트로젠), 포스포-FAK(pY397, 인비트로젠).
파노믹스 ( Panomics ) 기술에 의한 RNA 기재의 발현 검정. 단백질 기재의 발현 분석에 대한 한 대안으로서, 콴티진 플렉스(QuantiGene Plex) 기술(파노믹스)를 또한 이용하여, PD의 RNA 발현을 평가하였다. 콴티진 플랫폼은 분지형 DNA 기술, 서열보다는 리포터 신호를 증폭시킴으로써 RNA 검출 및 정량화를 위한 특유의 접근법을 제공하는 샌드위치 핵산 혼성화 검정(문헌[Flagella, M., Bui, S., Zheng, Z., Nguyen, C. T., Zhang, A., Pastor, L., Ma., Y., Yang, W., Crawford, K. L., McMaster, G. K. et al.(2006) A multiplex branched DNA assay for parallel quantitative gene expression profiling. Anal Biochem 352, 50-60)에 기초한다. 이 기술은 프레쉬 냉동 또는 포르말린-고정, 파라핀-포매(FFPE) 조직 파쇄액(homogenate)에서 RNA 발현을 신뢰가능하게 측정할 수 있다(문헌[Knudsen, B. S., Allen, A. N., McLerran, D. F., Vessella, R. L., Karademos, J., Davies, J. E., Maqsodi, B., McMaster, G. K., and Kristal, A. R.(2008) Evaluation of the branched-chain DNA assay for measurement of RNA in formalin-fixed tissues J. Mol. Diagn. 10, 169-176]). 도 17A에 나와 있는 바와 같이, 개연성 파일럿은 본 발명자들이 FFPE 블록에서 21개 스피츠 모반 시편 및 22개 악성 흑색종 시편에서의 UBE2C의 RNA 발현을 신뢰가능하게 측정할 수 있다는 것을 보여주었다. 각 유전자의 분석은 8-9% 범위 내의 변동 계수(CV) 값으로 우수한 재현성을 달성하였고, 이에 따라 최대 품질 관리 표준을 충족하게 된다. 따라서, 이 방법은 본 발명자들이 이용가능한 항체없이 관심 후보의 발현 패턴으로의 첫 통찰을 얻도록 하는 이상적 대안을 제공한다. 중요하게는, UBE2C의 콴티진 플렉스 분석은 UBE2C의 발암 활성을 나타내는 결과를 입증하였다. 구체적으로, 본 발명자들은 분류 공동변환 검정을 이용하여, UBE2C가 활성화된 HRASV12 와 상호협력하여, Ink4a / Arf-결핍 원발성 마우스 배아 섬유아세포에서 형질전환된 병소 형성을 증가시킴을 보여준다(도 17B).
자동화된 정량 분석( AQUA
Figure pct00011
) 은 문헌[Camp, R. L., Chung, G. G., & Rimm, D. L., Automated subcellular localization and quantification of protein expression in tissue microarrays. Nat Med 8 (11), 1323-1327 (2002)]의 모든 부분에 상세히 기재된 바와 같이 세포 이하의 부위 내에서 단백질 농도를 정확히 측정하도록 한다. 간략히 말해, 일련의 고해상 단색 화상들을 PM-2000 현미경으로 포착하였다. 각 히스토스폿(histospot)에 있어, DAPI로부터의 신호, 사이토케라틴 및 원발성 항체 특이적 신호를 이용하여 초점내외 화상을 수득하였다. 사이토케라틴 및 S100 신호로부터 종양 "마스크"를 발생시킴으로써, 종양을 기질 요소 및 비기질 요소와 구분되었다. 이로써, 히스토스폿을 육안 검사함으로써 강도 역가에 기초하여 이원성 마스크(각 픽셀은 "온(on)" 또는 "오프(off)"임)를 발생시켰다. (0-255 규모로 스코어링되는) 신호 강도를 특정 구획의 면적으로 나눔으로써, 각 세포 이하의 부위에서의 관심 단백질의 AQUA
Figure pct00012
스코어를 산출하였다. 스폿 당 5% 종양 면적 미만인 시편은 상응하는 종양 시편의 전형이 아니기 때문에 자동화된 정량 분석에 포함되지 않았다.
실시예 2: 표현형-유래 진화적 보존 전이 시그너처의 동정
매우 상이한 전이 가능성을 가지는 흑색종의 유전적으로 조작된 마우스(GEM) 모델을 여기서 무엇보다 미소 전이 또는 거대 전이의 기록 및 후속처리(follow-up)의 기간과 관련된 변수들을 포함한 인간 암 분석에 있어 고유학 교락 불확실성을 경감시키는 하나의 생물학적 시스템으로서 사용하였다. 이용된 2개의 마우스 흑색종 모델은 (i) Ink4a / Arf 눌(null) 배경에서의 티로시나제 유래 rtTA 및 tet-Met 도입유전자를 포함하는 새로 개발된 Met 유래 GEM 모델(Tyr - rtTA ; Tet - Met ; Ink4a/Arf -/- , 이후 "iMet"이라 함) 및 (ii) 기존 기술된 HRAS V12G 유래 마우스 흑색종 모델(Tyr - rtTA ; Tet - HRAS V12G ; Ink4a / Arf -/- , 이후 "iHRAS*"라 함)12였다. 표현형 특징분석은, iMet 마우스의 75%가 12주의 평균 잠복기로 생검 부위에 흑색종을 발달시킴을 나타냈다. 이 종양은 멜라닌세포 마커 양성이고, 인광체-활성화 Met 수용체 및 HGF 발현을 나타내며(도 5A-E); 부가적으로, 유도체 iMet 흑색종 세포는 재조합 HGF에 대한 반응으로 트랜스웰 체임버 침습 검정에서 강력한 침습 활성을 나타낸다(도 2A). 인간의 진전된 전이성 흑색종에서의 HGF-MET 신호전달의 활성화와 일관되게1 3, 데노보 유전자도입 동물에서의 iMet 흑색종은, 각각 인간 흑색종에서의 전이성 파종의 통상적 부위인 부신 및 폐 실질로의 임시 확산에 부가하여, 림프절로 균일하게 전이된다(도 2B). 이 매우 침투성인 전이성 표현형은 비전이성 원발성 피부 흑색종을 특징으로 하는 iHRAS* 흑색종 모델과 뚜렷이 대조된다12 ;14. 이 대조되는 전이 가능성은, 원발성 흑색종으로부터 유래된 세포주인, iHRAS*가 아닌 iMet가 꼬리-정맥 검정에서 폐를 파종할 수 있다는 것을 입증함으로써 보강되었다(도 2C).
iHRAS*와 iMet 전이성 경향 간의 명백한 차이는 iHRAS* 및 iMet 모델의 원발성 피부 흑색종의 전사체학 비교에 기초하여 표현형 유래 원발성 종양 전이 시그너처가 발생되도록 하였다. 허위 발견율 <0.05에서 ≥2배 차별적 발현을 가지는 1597개의 프로브 세트를 포함하는 상기 마우스 전이 시그너처는, (i) 인간 전이성 흑색종에서 복제수 일탈(CNA)에 상주하고/상주하거나 (ii) 인간 원발성 흑색종 및 전이성 흑색종 간에 차별적 발현을 발현하여, 295개의 상향제어/증폭된 유전자 및 65개의 하향제어/결실된 유전자를 발생시키는 유전자의 큰 개요와 다음에 접하게 된다(도 3A; 표 4). 이 유전자들에 의해 부여되는 생물학적 활성의 유형에 대한 조기 통찰을 얻기 위해, 본 발명자들은 360개의 여과된 유전자 목록 대 보다 큰 1597개의 쥐 전이 시그너처에 이해 유의적으로 스코어링하는지를 정의하기 위해, 인제뉴어티 패쓰웨이 분석(IPA)(인제뉴어티 시스템즈 인코포레이티드(Ingenuity Systems Inc.), 미국 캘리포니아주 레드우드 시티 소재)을 이용하여, 지식 기재의 경로 분석을 수행하였다. IPA 콜의 유의도를 평가하기 위해, 본 발명자들은 병렬 분석을 위해 동일한 크기의 무작위 인출 목록을 생성시켰다. 도 3B에서 보는 바와 같이, 본 발명자들은 쥐 전이 발현 시그너처가 DNA 복제 및 재조합, 암, 세포 주기 및 세포 사멸과 관련된 유전자 기능을 무작위 인출 목록에 비해 상대적으로 약간 과다표시함을 나타냄을 밝혀냈다. 비교에 의해, 교차종/교차플랫폼 여과 목록은 단지 쥐 발현 시그너처에서 명백하지 않은 새 기능적 네트워크, 즉 '세포 조립 및 조직화(Cell Assembly and Organization)'의 출현에 부가하여 상기 동일한 기능들에 있어 현저히 더 강한 풍부함을 나타냈다(도 3B). 이 비교는 표현형 유래 전이 시그너처의 삼각 측량 및 교차종 비교가 종양발생 및 전이의 과정에 강하게 연결된 유전자 네트워크를 풍부하게 하는 작용을 할 수 있음을 제안하였다.
실시예 3: 전이 결정인자에 대한 기능적 유전 스크린
특히, 세포 조립 및 조직화 유전자의 강한 강화는 확산 암 세포의 완전 능력인 세포 이동 및 침습에의 관련성 부여를 고무하였다. 이 관찰은 유전자 유도 침습의 동정에 대해 저복잡도로 유전적으로 스크리닝하는 것을 이행토록 자극을 부었고(도 3C); 또한 이 스크린은 가능한 치료 잠재능이 주어지는 경우 상향제어된 유전자에만 초점을 두었다. 구체적으로 295개의 특유의 상향제어/증폭된 후보들 중 199개에 상응하는 230개의 이용가능한 ORF(표 5)가 인간 ORFeome(http://horfdb.dfci.harvard.edu/)에서 입수되어, TERT-불멸화 원발성 인간 멜라닌세포주15인 HMEL468에의 형질유도를 위한 렌타바이러스 발현 시스템으로 전달되었다. 일차 스크린을 위해, 본 발명자들은 형광측적 판독값과 함께 96-웰 트랜스웰 침습 검정을 이용하여, 후보 결정인자 유전자의, 세포외 기질을 자극하는 마트리젤을 통한 HMEL468의 이동 및 침습을 증진시키는 능력을 측정하였다. 음성 및 양성 대조군으로서, GFP 및 NEDD916 렌티바이러스를 각기 사용하였다. 일차 스크린을 2회 반복하였고, GFP 대조군으로부터의 2 표준 편차를 재현가능하게 기록하는 45개 후보를 일차 스크린 히트로 간주하였다(도 3C-D). 이어서, 45개 원발성 히트의 이차 검증 스크린을 표준 24-웰 마트리젤 트랜스웰 침습 체임버를 이용하여 삼벌로 수행하였고, 이에 HMEL468 멜라닌세포에서 GFP 대조군에 비해 침습을 적어도 1.5배 증진할 수 있는 25개 유전자를 산출하였다(도 3E 및 표 3). 부가적으로, 관련 유전자 또는 이 25개 결정인자 중 하나와 복합되는 유전자를 또한 기능적 검정에 제공하여, 부가적 6개의 결정인자를 동정하였다.
실시예 4: 인간 원발성 및 전이 흑색종 TMA 에서의 발현의 진행과의 상관관계
전이 결정인자의 발현을 악성 흑색종의 진행과 상관시키기 위해, 본 발명자들은 문헌[Camp, R. L, Dolled-Filhart, M., King, B. L., and Rimm, D. L.(2003)]에 기재된 AQUA에 의해 대표적 결정인자에 대한 상업적으로 이용가능한 항체를 이용하여, 양성 모반, 원발성 흑색종 및 흑색종 전이의 시편을 포함한 조직 마이크로어레이(TMA)의 HC 분석을 수행하였다. 유방암 조직 마이크로어레이의 정량 분석은, 높은 수준 및 정상 수준 모두의 HER2 발현이 좋지 않은 성과와 관련됨을 보여준다. 문헌[Cancer Res 63, 1445-1448]. 표 2 및 도 4A-B 중 대표적 데이터에서 보는 바와 같이, BRRN1을 제외하고는, 시험한 다른 모든 결정인자(HSF1, MCM7, HOXA1, FSCN1, ACP5, UBE2C 및 KNTC2)들은 전이의 원발성 대 양성 모반에 있어 유의적으로 보다 높은 발현을 나타낸다.
결정인자 모반 대 원발성 모반 대 전이 원발성 대 모반 항체 발현 개요
HSF1 0.0236* 0.0024* 0.3537 압노바(Abnova); H00003297-A01 전이/원발성이 모반보다 높음
HOXA1 <0.0001* <0.0001* 0.9017 압노바; H00003198-B01P 전이/원발성이 모반보다 높음
FASCIN 0.2669 0.2621 0.0264* 산타 크루즈; sc21743 전이가 원발성/모반보다 높음
ACP5 0.2502 0.0014* 0.0262* 압캄(Abcam); ab49507 전이가 원발성보다 높고, 원발성이 모반보다 높은 경향이 있음
UBE2C 0.0046* 0.7833 0.0162* 압캄; 12290 모반이 가장 높고, 원발성이 모반보다 높은 흥미로운 경향이 있음
KNTC2 0.2248 0.3579 0.0338* 압노바; H00010403-M01 전이가 원발성/모반보다 높음
MCM7 0.0246* 0.0025* 0.3527 압노바; H00004176-M01 전이/원발성이 모반보다 높음
BRRN1 0.0349* 0.0607* 0.8057 베틸(Bethyl); A300-603A 모반이 원발성보다 높음
값은 표시된 AQUA
Figure pct00013
스코어 비교의 P-값 시험을 가리킴
* = 피셔 시험에 의한 유도성, 5%.
실시예 5: 전이 결정인자는 비계통적 특이적이고 예후적이다
게놈 불안정성이 종양발생을 유도하고, 이에 따라 공통 및 구분된 유전 프로파일을 가지는 세포의 이종성 하위집단을 포함하는 원발성 종양이 생성된다는 것이 잘 확립되어 있다. 따라서, 원발성 종양 내의 전이 결정인자 발현 하위집단에 증식 우위가 부여되어 궁극적으로는 확산되는 경우, 전이 결정인자의 발현은 더욱 동종성인 유도체 전이성 병변에서 더 많이 나타나게 됨으로 인해 증가할 것이라는 것은 당연하다. 그러한 진행 관련 발현에 대해 평가하기 위해, 25개의 결정인자를 온코마인24에 대한 발현 프로파일링 데이터의 큰 개요서에서 조사하였다. 원발성 흑색종에 대한 전이성 흑색종에서의 발현 증가를 나타내는 7개의 결정인자에 부가하여, 모든 25개는 이 25개의 전이 결정인자들 중 대부분이 예전이 종양 진행에 연루되지 않았을지라도, 하나 이상의 비흑색종 고형 종양에서 진행-상관된 발현 패턴을 나타냈다(표 3). 예를 들어, 9개 결정인자가 보다 높은 급의 신경교종에서의 발현의 통계학적으로 유의적 증가를 나타냈다. 전립선 선암에서, 전이 결정인자들 중 9개가 원발성에서 전이성으로의 발현에서 유의적 증가를 나타냈다. 마찬가지로, 폐에서, 5개는 종양 등급 증가와의 상관관계를 나타냈다. 대부분의 유의적 중첩이 유방선암에서 나타났는데, 여기서 25개의 전이 결정인자들 중 12개가 종양 진행의 단계 또는 등급과의 상관관계를 나타냈다.
유방선암 프로파일에서 유의적 중첩을 고려해볼 때, 본 발명자들은 그 다음으로 유방5 ;6에서의 공개된, 성과가 주석으로 달린 전사체 데이터를 이용하여, 이 결정인자들의 보다 넓은 잠재적 예후 유의도를 탐구하였다. 유방암 전사체 데이터세트는 20개의 전이 결정인자 중 19개에 대한 프로브를 포함하였고, 이들은 k-평균 비감독 분류 알고리즘에 의해 295개의 유방 종양의 코호트를 계층분류하기 위한 시그너처로 사용하였다(도 5A; 표 7). 생성된 하위군은 전체 생존(p=2.6-9) 및 무전이 생존(p=2.1-6)에서 유의적 차이를 가지는 것으로 밝혀졌다(도 5B). 분류를 계층적 클러스터링을 이용하여 수행하는 경우에, 유사한 분리가 수득되었다(데이터 미표시).
조기 단계의 유방암에서의 강력한 예후 가능성 및 다중 비흑색종 암 유형의 진행과 상관된 발현의 넓은 패턴은, 이 25개의 전이 결정인자가 이들 대부분이 문헌에서 침습 또는 전이에 연루되지 않았을지라도, 계통 특이적이지 않고, 또한 다양한 종양 유형들에서 작용하는 주도가능한 핵심 과정임을 가리킨다. 그 대신, 많은 것들이 축 확인점 제어 또는 염색체 축합에서 알려진 역할을 가지는 세포 사이클 또는 증식 유전자로서 암-존재론(Gene-Ontology)에 대해 주석이 달려있다. 예를 들어, 수가지 결정인자(예를 들어 BRRN1, KNTC2, SPAG5, UBE2C, CENPM 및 MCM7)가 DNA 유사분열의 진행, 유사분열의 축 및 DNA 복제의 과정을 제어하는 것으로 알려져 있다. 한편, BRRN1, KNTC2 및 UBE2C가 전이되지 않는 원발성 종양에 비해 상대적으로 전이한 원발성 유방 종양과 관련된 전이성 유방암 시그너처에 풍부한 20-유전자 기능 모듈에 포함된다25. 마찬가지로, MCM7는 전립선 암을 비롯한 다중 침습성 암에 대한 좋지 않은 예후 마커로서 동정되었다26. 어떻게 이 단백질들이 직접적으로 또는 간접적으로 세포 침습 및 전이 유도에 기여하는지는 명백하지 않으나, 함께 조합해볼 때, 본 발명자들은 이 유사분열의 확인점 단백질이 세포 이동에 대한 세포골격 기작을 조절하는 데 이중 역할을 할 수 있는 것으로 추측한다.
실시예 6: 아노이키스 내성을 부여하는 유전자의 동정
전이는 복잡한 다중단계 과정이다(문헌[Gupta, G. P., and Massague, J.(2006) Cancer metastasis: building a framework. Cell 127, 679-69]). 완전 전이가 일어나기 위해서는, 종양 세포가 원발성 종양 부위에서 증식하고, 순환계 또는 림프계 내로 주입되며, 순환 동안 생존하고, 외부로 배출되어, 2차 종양을 형성할 수 있어야 한다. 이를 달성하기 위해, 순환 종양 세포가 아노이키스, 또는 기질 부착의 손실에 의해 유도되는 아포프토시스를 극복할 수 있어야 한다(문헌[Simpson, C. D., Anyiwe, K., and Schimmer, A. D.(2008) Anoikis resistance and tumor metastasis Cancer Lett 272, 177-185]). 아노이키스 민감성 세포에 대한 아노이키스 내성을 부여하는 유전자를 동정하기 위해, 본 발명자들은 아노이키스 감도에 대한 시험관내 스크린을 최적화하였다(도 6A). 본 발명자들은 세포 표면 부착을 막은 히드로-겔 층으로 코팅된 플레이트(초저 클러스터) 상에 파종된 세포가 순환 중에 세포의 생체내 현탁액을 시험관내 부분적으로 발생 반복할 것이라고 가설을 세웠다.
파일럿 연구에서, 본 발명자들은 흑색종 세포주의 코호트를 스크리닝하였고, 모두가 흑색종 단계(예를 들어 국소화, 침습성)와 상관없이 모두 아노이키스 내성이 있음을 밝혀 내었다. 그 대신에, 본 발명자들 등은 래트 장 상피(RIE) 세포가 부착 소실 시 생존율을 감소시킨 것을 밝혀내었다(도 6B)(문헌[Douma, S., Van Laar, T., Zevenhoven, J., Meuwissen, R., Van Garderen, E., and Peeper, D. S.(2004) Suppression of anoikis and induction of metastasis by the neurotrophic receptor TrkB. Nature 430, 1034-1039]). RIE 세포는 불멸화되기는 하나 형질전환되지는 않은 세포주이다. 아노이키스를 겪는 세포는 아포프토시스 경로를 개시한, 부착 소실 시에 생육성을 가지는 것들은 아노이키스 내성을 나타낸다. 그러므로, 본 발명자들은 세포 생육성의 정량가능하고 민감한 척도로서 세포 대사를 가리키는 ATP 발생을 측정하였다.
게이트웨이 재조합 시스템을 이용하여, 본 발명자들의 교차종 암게놈을 통해 동정된 후보 ORF 중 199개를 레트로바이러스 벡터 MSCV/V5 내로 클로닝하였다. 웨스턴 블롯에 의해 분석된 바와 같이, mTrkB 및 다양한 cDNA 크기의 클론의 무작위 샘플링이 RIE에서 발현되었고, 이로써 본 발명자의 발현 시스템에 대한 기능성을 입증하였다(도 6C 및 데이터는 나와 있지 않음).
아노이키스 내성 스크린에 있어, 293T 세포를 6-웰 플레이트 상에 플레이팅하여, 팩키징 벡터, pCL-Eco, 및 하나의 ORF를 포함한 MSCV/V5로 동시 형질감염시켰다(도 6A). 세포를 리포펙타민 2000(인비트로젠)으로 형질감염시키고, 바이러스를 다회 시점에 수거하였다. RIE 세포를 6-웰에 플레이팅하고, 플레이팅 후 24시간째에 48시간 바이러스 상등액 및 72시간 바이러스 상등액에 차례로 일련으로 감염시켰다. RIE를 최종 감염 후 24시간째에 수거하였고, 단일-세포 현탁액을 생성시킨 후, 7000 세포/웰을 96-웰 ULC 플레이트 상에 삼벌로 플레이팅하였다(0시간). 기준선 세포 수를 결정하기 위해, 세포를 0시간에 용해시키고, ATP 수준을 측정하였다(셀 티터(Cell Titer) Glo, 프로메가). ULC 플레이팅 후 24시간째에, 세포를 셀 티터 Glo로 용해시켰고, 용해물을 판독을 위해 96-웰 불투명 웰 루미노미터로 옮겼다. 본 발명자들의 분석에서, ATP 수준을 0시간 대비 24시간에서 비교함으로써, ATP 수준의 배수 변화를 수득하였다(도 7).
신경영양성 수용체 TrkB는 아노이키스 민감성 세포에 시험관내 아노이키스 내성을 부여하고 생체내 종양 형성 및 폐 파종을 촉진하는 것으로 나타냈다(3). 본 발명자들은 쥐 TrkB(mTrkB) 및 TrkB에 대한 인간 리간드, BDNF가 벡터 단독보다 큰 RIE에 아노이키스 내성을 부여했기 때문에, 본 발명자들의 스크린에서의 확신을 증가시켰다(도 7). 동일한 이중 스크린에서, 유전자들의 21%의 평균이 모든 후보 유전자들의 중위수에서의 1 초과 표준 편차를 부여하였다. 20개의 유전자는 스크린의 적어도 한 패스에서 중위수로부터의 2 초과의 표준 편차를 제공하였다(도 8). 이 유전자들 중 9개가 양 스크린 모두에서 중위수로부터의 1 초과의 표준 편차를 부여한 반면, 이 9개 중 7개의 유전자가 스크린의 적어도 한 패스에서 중위수부터의 2초과의 표준 편차를 제공하였다(HNRPR, CDC20, PRIM2A, HRP12, ENY2, MGC14141, RECQL). 흥미롭게도, 9개의 유전자들 중, STK3, PRIM2A, CDC20, RECQL, HNRPR, ENY2 및 MGC14141이 정상적 대 흑색종 또는 원발성 대 전이(온코마인, GEO)에서, 흑색종 샘플에서의 보다 큰 발현을 나타냈다. 부가적으로, 모든 9개의 유전자가 유방, 폐 또는 뇌 종양 중에서 증가된 발현을 나타냈는데, 이는 본 발명자들의 우선순위 목록이 다른 암 유형들에서도 유효성을 가짐을 입증한다(온코마인).
비부착 병태에서 본 발명자들의 9개의 후보 유전자를 발현하는 세포의 증가된 생육성을 확인하기 위해, 본 발명자들은 부착 손실 기간 후의 부착 능력 보유를 조사하였다. 관심 유전자 발현 RIE를 ULC 플레이트로 옮기고, 24시간 후에 현탁액 중 모든 세포를 부착 플레이트로 옮겼다. 부착 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하여, 생육성 세포를 정량화하였다. 도 9에 도시된 바와 같이, RIE 세포는 24시간 동안 현탁액 중에 둔 후 부착 플레이트에 부착되는 능력을 감소시켰다. 그러나, 모든 9개의 유전자는 세포가 현탁액 중에 있은 후에 재부착하고 생육성 상태로 남는 RIE의 증가된 능력을 부여하였다(도 9). 그러한 능력은 이차 부위에 콜로니를 형성하도록 된 순환 종양 세포의 필수 특징일 것이다.
실시예 7: 전이 결정인자는 발암성이다
전이 결정인자가 형질전환 과정에서 조기에 습득되고 원발성 종양에 선재하기 때문에, 이 전이 유전자가 원발성 종양에 증식 우위를 제공하는 진실된 암 유전자일 수도 있음이 상정되었다2 ;22. 이를 해결하기 위해, 본 발명자들은 TERT-불멸화 멜라닌세포, HMEL468에 실질적 종양발생성을 부여할 수 있는지의 여부를 물었다. HOXA1에 부가하여, 본 발명자들은 또한 시험을 위해 3개의 다른 결정인자들, 즉 ANLN, BRRN1 및 KNTC2을 선택하였는데, 이는 이들이 흑색종에서 무전이 생존율과 역상관된 254-유전자 시그너처 상에 포함되기 때문이다23. 실제로, HOXA1로 형질유도된 HMEL468은 12주 후에 33%의 투과율(6개의 피하 이식 부위의 n=2)로 국소 침습의 병리조직학 증거에 따라(도 10A) 큰 종양(2 cm)을 발달시킨 반면, 벡터로 형질유도된 대조군은 주사후 21주를 통해 어떠한 종양도 발달시키지 않았다(도 10B). 유사하게도, ANLN, BRRN1 및 KNTC2로 형질유도된 세포는 벡터 대조군에 비해 증진된 종양발생성을 나타냈다(도 3B). 모두 조합하여, 본 발명자들은 전이 결정인자가 실제로 자체가 침습성 거동도 또한 유도할 수 있는 진실된 발암 유전자인 것으로 결론을 내린다.
실시예 8: 시험관내 및 생체내 검증 데이터 FOR HOXA1 및 FSCN1
전이 결정인자를 동정하는 수단으로서 상기 통합된 접근법을 추가로 검증하기 위해, 본 발명자들은 다음으로 호메오박스(homeobox) 전사 인자, HOXA1의 상세한 검증을 수행하였다. HOXA1 상향제어는, 침습 및 전이에서의 역할이 제안되지 않았으나, 유방암, NSCLC 및 흑색종을 비롯한 다수 암에서 보고되었다17 ;18;19. 과다발현 연구에서, 강화된 HOXA1은 성장 인자의 제어 및 인테그린-자극 세포 이동성 및 침습에 있어 핵심 신호전달 분자인 국소 부착 키나제, FAK(도 11A)의 극적으로 증가된 인산화를 도출하였다20. 따라서, HOXA1을 과다발현하는 HMEL468은 시험관내 침습의 10배 증가를 나타냈고, 생체내 폐 파종 능력을 습득하였다(도 11A, D). 중요하게도, 이 침습 지지 활성은, HOXA1이 WM115 및 WM3211 인간 흑색종 세포의 침습을 유사하게 증진시킬 수 있었던 바, HMEL468 멜라닌세포 세포주에 대해 특이적이지 않았다(도 11B-C). 실제로, 표 3에 요약되어 있는 바와 같이, WM115 및 WM3211 흑색종 세포에서 침습 검정에 적용된 결정인자들 중 다수가 또한 HMEL468 멜라닌세포를 넘어선 침습 지지 활성을 나타냈다. 약하게 발암성인 흑색종 세포주인 WM115를 이용하여 HOXA1의 발암 및 전이 가능성을 시험하는 부가적 검증 검정은, 다른 인간 및 마우스 세포주를 이용한 데이터와 일관되게도, HOXA1 과다발현이 누드 마우스 내 이종이식된 세포의 종양 성장을 현저하게 증진시킴을 가리킨다(도 11E). HOXA1 과다발현은 또한 누드 마우스의 옆구리로 피부내 이식될 때 WM115 세포의 증가된 종양 성장을 초래하고, 생성되는 원발성 종양은 종양 발달 후 폐로 용이하게 전이되는 반면(도 11F), 대조군(빈 벡터 세포)은 원발성 종양을 형성하지 않는다.
인간 세포주에서의 이들 연구에 부가적으로, 본 발명자들은 또한 마우스 세포주를 이용하여 HOXA1 및 팍신(Fascin) 1(FSCN1)을 시험하였다. 인간 세포 시스템을 이용한 침습 결과와 일관되게도(도 11A-C), 양 후보 모두의 발현은 HRAS*(M3HRAS 세포로도 알려짐, 문헌[Kim, M., Gans, J. D., Nogueira, C., Wang, A., Paik, J. H., Feng, B., Brennan, C., Hahn, W. C., Cordon-Cardo, C., Wagner, S. N., et al.(2006)])로 형질유도된 Ink4a / Arf -/- 마우스 유래의 멜라닌세포의 기질 침습 능력을 현저하게 증가시켰다(도 12A). 비교용 암게놈은 NEDD9을 흑색종 전이 유전자로 동정한다(문헌[Cell 125, 1269-1281]). 부가적으로, HOXA1 및 팍신 1 양자 모두의 과다발현은 누드 마우스의 옆구리에 이종이식될 때 M3HRAS 세포의 증식 능력(도 12B)과 전이에 대한 대리 검정인 정맥내 꼬리 정맥 주사 후 거시적인 폐 결절을 형성하는 능력(도 12C)을 유의적으로 증진시켰다.
실시예 9: HOXA1 은 TGF β 신호전달의 조절을 통해 침습을 촉진할 수 있는 암유전자이다 .
다음으로, HOXA1의 침습성 활성의 분자적 기초를 탐구하기 위해, 본 발명자들은 대조군 및 HOXA1로 형질유도된 HMEL468, WM115 및 WM3211 세포의 발현 프로파일링에 기초한 HOXA1-전사체를 결정하였다(도 11B). 차별적 발현 유전자 목록의 지식 기재의 분석은 주요 노드로서 SMAD3를 중심으로 둔 TGFβ 신호전달 유전자 네트워크를 밝혀냈다(도 13A 및 표 6). 전이에서의 그것의 알려진 역할을 고려해볼 때21, 본 발명자들은 이에 따라 TGFβ 신호전달이 HOXA1에 의해 조절되는지의 여부를 평가하였다. TGFβ-반응성 리포터 구성물(p3TP-Lux)을 이용하여, 본 발명자들은 HOXA1의 이소성 발현이 기저 리포터 활성을 증진시켰을 뿐만 아니라(11.0배, p=0.003), 대조군에 비해 TGFβ 리간드에 대한 반응으로 9.3배 증가를 초래하였다(p=0.0001; 도 14A). 따라서, 활성화된 p-SMAD3 및 총 SMAD3은 RNA 발현 분석에 의해 증명되는 바(도 13B), TGFβ 자극 시에 10% 혈청 배양 병태 하에서 뿐만 아니라 1% 혈청 배양 병태 하에서 상승되었다(도 14B). 또한, HOXA1로 매개되는 침습은 SMAD3의 녹다운에 의해 없어지고(도 14C), 따라서 HOXA1의 침습 지지 활성을 TGFβ-SMAD 신호전달로 기능적으로 연결하게 되며, 이는 암 전이를 지배하는 중추 경로이다21.
HOXA1 과다발현이 종양에서 SMAD3 인산화 상태에 영향을 미치는지의 여부를 조사하기 위해, 본 발명자들은 SMAD3에 대한 포스포-특이적 항체를 이용한 면역조직화학 분석을 위해, 빈 벡터 또는 HOXA1를 발현하는 WM115 흑색종 세포로부터 유래된 이종이식편 종양 시편을 이용하였다(도 11E). HOXA1 과다발현이 SMAD3의 증가된 인산화를 초래한다는 본 발명자들의 관찰과 일관되게도(도 14B), 본 발명자들은 HOXA1 과다발현 종양에서의 증가된 SMAD3 인산화를 밝혀내었다(도 14D).
실시예 : CXCR4
HOXA1의 생물학적 기능에 대한 통찰을 얻기 위해, 본 발명자들은 RT2 프로파일러 PCR 어레이(수퍼어레이)에 사용하기 위해 빈 벡터 및 HOXA1 과다발현 WM115 흑색종 세포 및 HMEL468 멜라닌세포로부터 cDNA를 제조하여, 전이와 관련된 유전자의 패널의 발현을 분석하였다. 2개의 세포주 사이에 공유된 상단의 과다발현된 유전자는 케모카인 기질 유래-인자-1(SDF-1)에 대해 특이적인 수용체인 케모카인 수용체 CXCR4(도 15)였다. 종양 세포에 의한 CXCR4 발현은 많은 유형의 암들에서 좋지 않은 예후와 상관되었고, SDF-1 발현 기관에 대한 화학주성 구배의 확립을 통해 세포 전이에서 중요한 역할을 한다(문헌[Fulton AM. Curr Oncol Rep. 2009 Mar; 11(2): 125-31]). HOXA1과 CXCR4 간의 관계를 추가 조사하기 위해, 본 발명자들은 면역조직화학을 이용하여 빈 벡터- 및 HOXA1-과다발현 이종이식편 종양의 CXCR4 발현을 평가하였다. RT2 프로파일러 분석과 일관되게도, 본 발명자들은 CXCR4 발현이 WM115-H0XA1 및 HMEL468-HOXA1 이종이식편 종양 모두에서 현저히 증가하였다(도 16). 이 데이터는 모델과 일관되고, 이로써 HOXA1은 CXCR4의 증가된 발현을 초래하며, 이는 다시 HOXA1의 과다발현에 의해 개시되는 전이성 신호전달 프로그램에 영향을 준다.
요약컨대, 통합적 기능적 게놈 접근법은 침습의 활성 유도자이자 진실된 발암유전자인 전이 결정인자의 동정을 가능하게 하였다. 흑색종의 범주에서 발견된 이 전이 결정인자는 조기 단계 유방선암에서 예후적인 것으로 입증되었고, 다양한 비흑색종 종양 유형들에서 진행-상관된 발현을 나타냈다. 이 발견내용은, 전이 결정인자가 일부 조기-단계 원발성 종양에 존재하고, 이 종양이 공격적으로 거동하도록 예정화할 수 있으며, 이로써 좋지 않은 임상적 성과를 부여할 수 있는 실험적 증거를 제공한다. 이 결정인자들 중 대다수가 암 또는 전이로 연결되지 않은 바, 이들은 기능적 기재의 예후 바이오마커 및 신규 치료 진출로를 위한 기초를 제공할 수 있다.
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도 13A에서의 Smad3 관련 생물학적 네트워크 내 유전자의 전체 설명
유전자 ID 이름 설명 패밀리
Akt 군
알칼리성 포스파타제 군
250 ALPP 알칼리성 포스파타제, 태반(리간(Regan) 동종효소) 포스파타제
1052 CEBPD CCAAT/인핸서 결합 단백질(C/EBP), 델타 전사 조절자
1513 CTSK 카텝신 K 펩티다제
1893 ECM1 세포외 기질 단백질 1 수송자
2047 EPHB1 EPH 수용체 B1 키나제
2065 ERBB3 v-erb-b2 적혈모구 백혈병 바이러스 암 유전자 3 키나제
Fgf 군
9518 GDF15 성장 분화 인자 15 성장 인자
2707 GJB3 간극 연접 단백질, 베타 3, 31 kDa 수송자
3039 HBA1 헤모글로빈, 알파 1 수송자
3040 HBA2 헤모글로빈, 알파 2 수송자
8091 HMGA2 고이동성 군 AT-훅 1 기타
인테그린 복합체
3910 LAMA4 라미닌, 알파 4 효소
51176 LEF1 림프양 인핸서-결합 인자 1 전사 조절자
4147 MATN2 마트릴린 2 기타
4162 MCAM 흑색종 세포 접착 분자 기타
Mek1/2 군
4286 MITF 소안구증 관련 전사 인자 전사 조절자
2660 MSTN 미오스타틴 성장 인자
4751 NEK2 NIMA(유사분열 유전자 a에서는 절대 없음) 관련 키나제 2 키나제
56034 PDGFC 혈소판 유래 성장 인자 C 성장 인자
8613 PPAP2B 포스파티드산 포스파타제 유형 2B 포스파타제
Rb 군
860 RUNX2 런트병 관련 전사 인자 2 전사 조절자
6285 S100B S100 칼슘 결합 단백질 B 기타
4088 SMAD3 SMAD 패밀리 구성원 3 전사 조절자
6662 SOX9 SRY(성 결정 영역 Y)-박스 9 전사 조절자
10253 SPRY2 초파리 상동체 2(드로소필라(Drosophila)) 기타
81848 SPRY4 초파리 상동체 4(드로소필라) 기타
6781 STC1 스탄니오칼신 1 키나제
80328 ULBP2 UL16 결합 단백질 2 막통과 수용체
9839 ZEB2 아연 핑거 E-박스 결합 호메오박스 2 전사 조절자
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참조문헌
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Claims (45)

  1. 소정의 예측가능성 수준으로 대상에서 전이성 종양의 발병 위험성을 평가하는 방법으로서,
    a. 대상으로부터의 샘플에서 결정인자(DETERMINANTS) 1-25, 41, 61, 62, 63, 66, 74, 96, 99, 103, 126, 135, 137, 138, 177, 190, 210, 212, 217, 218, 227, 239, 261 및 271로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상의 결정인자의 수준을 측정하는 단계, 및
    b. 샘플에서 2개 이상의 결정인자 수준의 임상적으로 유의한 변경을 측정하는 단계로서, 여기서 변경은 대상에서 전이성 종양 발병의 위험성 증가를 가리키는 것인 단계
    를 포함하는, 평가 방법.
  2. 제1항에 있어서, 결정인자 26-40, 42-60, 64, 65, 67-73, 75-95, 97, 98, 100-102, 104-125, 127-134, 136, 139-176, 178-189, 191-209, 211, 213-216, 219-226, 228-238, 240-260, 262-270, 272-360으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 결정인자의 유효량를 측정하는 단계를 추가로 포함하는 평가 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 종양과 관련된 하나 이상의 표준 매개변수를 측정하는 단계를 추가로 포함하는 평가 방법.
  4. 제1항에 있어서, 결정인자의 수준은 전기영동에 의해 또는 면역화학적으로 측정되는 것인 평가 방법.
  5. 제4항에 있어서, 면역화학적 검출은 방사선면역검정, 면역형광검정 또는 효소 결합 면역흡착 검정에 의한 것인 평가 방법.
  6. 제1항에 있어서, 대상은 원발성 종양, 재발성 종양 또는 전이성 종양을 가지는 것인 평가 방법.
  7. 제1항에 있어서, 샘플은 종양 생검인 평가 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 생검은 코어 생검(core biopsy), 절제(excisional) 조직 생검, 또는 절개(incisional) 조직 생검인 평가 방법.
  9. 제1항에 있어서, 5개 이상의 결정인자의 발현 수준이 측정되는 것인 평가 방법.
  10. 소정의 예측가능성 수준으로 대상에서 전이성 종양의 발병 위험성을 평가하는 방법으로서.
    a. 대상으로부터의 샘플에서 결정인자 1-25, 41, 61, 62, 63, 66, 74, 96, 99, 103, 126, 135, 137, 138, 177, 190, 210, 212, 217, 218, 227, 239, 261 및 271로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상의 결정인자의 수준을 측정하는 단계, 및
    b. 2개 이상의 결정인자의 수준을 기준 값과 비교하는 단계
    를 포함하는, 평가 방법.
  11. 제10항에 있어서, 기준 값은 지수 값인 평가 방법.
  12. 소정의 예측가능성 수준으로 대상에서 종양의 진행을 평가하는 방법으로서,
    a. 제1 기간에 대상으로부터의 제1 샘플에서 결정인자 1-25, 41, 61, 62, 63, 66, 74, 96, 99, 103, 126, 135, 137, 138, 177, 190, 210, 212, 217, 218, 227, 239, 261 및 271로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상의 결정인자의 수준을 검출하는 단계;
    b. 제2 기간에 대상으로부터의 제2 샘플에서 2개 이상의 결정인자의 수준을 검출하는 단계; 및
    c. 단계 (a)에서 검출된 2개 이상의 결정인자의 수준을 단계 (b)에서 검출된 양, 또는 기준 값과 비교하는 단계
    를 포함하는, 평가 방법.
  13. 제12항에 있어서, 제1 샘플은 종양에 대해 치료하기 전에 대상으로부터 취해지는 것인 평가 방법.
  14. 제2항에 있어서, 제2 샘플은 종양에 대해 치료한 후에 대상으로부터 취해지는 것인 평가 방법.
  15. 소정의 예측가능성 수준으로 전이성 종양에 대한 치료 효능을 모니터링하는 방법으로서,
    a. 제1 기간에 대상으로부터의 제1 샘플에서 결정인자 1-25, 41, 61, 62, 63, 66, 74, 96, 99, 103, 126, 135, 137, 138, 177, 190, 210, 212, 217, 218, 227, 239, 261 및 271로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상의 결정인자의 수준을 검출하는 단계;
    b. 제2 기간에 대상으로부터의 제2 샘플에서 2개 이상의 결정인자의 수준을 검출하는 단계; 및
    c. 단계 (a)에서 검출된 2개 이상의 결정인자의 수준을 단계 (b)에서 검출된 양, 또는 기준 값과 비교하는 단계로서, 여기서 치료 효능은 대상으로부터의 2개 이상의 결정인자 수준의 변화에 의해 모니터링되는 것인 단계
    를 포함하는, 모니터링 방법.
  16. 제15항에 있어서, 대상은 전이성 종양에 대해 사전에 치료를 받은 것인 모니터링 방법.
  17. 제15항에 있어서, 제1 샘플은 전이성 종양에 대해 치료하기 전에 대상으로부터 취해지는 것인 모니터링 방법.
  18. 제15항에 있어서, 제2 샘플은 전이성 종양에 대해 치료한 후에 대상으로부터 취해지는 것인 모니터링 방법.
  19. 소정의 예측가능성 수준으로 종양 진단된 대상에 대한 치료 섭생법(treatment regimen)을 선택하는 방법으로서,
    a. 제1 기간에 대상으로부터의 제1 샘플에서 결정인자 1-25, 41, 61, 62, 63, 66, 74, 96, 99, 103, 126, 135, 137, 138, 177, 190, 210, 212, 217, 218, 227, 239, 261 및 271로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상의 결정인자의 유효량 수준을 검출하는 단계,
    b. 임의적으로, 제2 기간에 대상으로부터의 제2 샘플에서 2개 이상의 결정인자의 유효량 수준을 검출하는 단계; 및
    c. 단계 (a)에서 검출된 2개 이상의 결정인자의 수준을 기준 값, 또는 임의적으로는 단계 (b)에서 검출된 양과 비교하는 단계
    를 포함하는, 선택 방법.
  20. 제19항에 있어서, 대상은 종양에 대해 사전에 치료를 받은 것인 선택 방법.
  21. 제19항에 있어서, 제1 샘플은 종양에 대해 치료하기 전에 대상으로부터 취해지는 것인 선택 방법.
  22. 제19항에 있어서, 제2 샘플은 종양에 대해 치료한 후에 대상으로부터 취해지는 것인 선택 방법.
  23. 결정인자 1-25, 41, 61, 62, 63, 66, 74, 96, 99, 103, 126, 135, 137, 138, 177, 190, 210, 212, 217, 218, 227, 239, 261 및 271로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상의 마커의 유효량의 마커 수준 패턴을 포함하는, 전이성 종양 기준 발현 프로파일.
  24. 제20항의 프로파일을 생성시키는데 충분한, 결정인자 1-25, 41, 61, 62, 63, 66, 74, 96, 99, 103, 126, 135, 137, 138, 177, 190, 210, 212, 217, 218, 227, 239, 261 및 271로 이루어진 군으로부터 선택되는 상응하는 결정인자를 검출하는 복수개의 결정인자 검출 시약을 포함하는 키트.
  25. 제24항에 있어서, 검출 시약은 하나 이상의 항체 또는 이의 단편을 포함하는 것인 키트.
  26. 제24항에 있어서, 검출 시약은 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것인 키트.
  27. 제24항에 있어서, 검출 시약은 하나 이상의 압타머를 포함하는 것인 키트.
  28. 제23항에 따른 하나 이상의 전이성 종양 기준 발현 프로파일, 및 임의적으로 부가적 시험 결과 및 대상 정보를 포함하는, 기계로 판독가능한 매체.
  29. 생리학적 또는 생화학적 경로 관련된 전이를 가리키는 1개 이상의 결정인자를 포함하는 결정인자 패널.
  30. 제26항에 있어서, 생리학적 또는 생화학적 경로는 세포 이동, 혈관형성, 세포외 기질 분해 또는 아노이키스(anoikis)를 포함하는 것인 패널.
  31. 종양의 진행을 가리키는 1개 이상의 결정인자를 포함하는 결정인자 패널.
  32. 질병에 대한 예후가 되는 바이오마커를 동정하는 방법으로서,
    a) 대조군과 대비하여 상기 질병에서 차별적으로 발현되는 하나 이상의 유전자를 동정하여 유전자 표적 목록을 생성하는 단계, 및
    b) 상기 질병 진행의 기능적 측면과 관련된 상기 표적 목록 상의 하나 이상의 유전자를 동정함으로써, 상기 질병에 대한 예후가되는 바이오마커를 동정하는 단계
    를 포함하는, 동정 방법.
  33. 제32항에 있어서, 진화적으로 보존된 변화를 포함하는 상기 유전자 표적 목록 상의 하나 이상의 유전자를 동정하여 제2 유전자 표적 목록을 생성하는 단계를 추가로 포함하는 동정 방법.
  34. 제32항에 있어서, 상기 질병은 암인 동정 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 암은 전이성 암인 동정 방법.
  36. 제32항에 있어서, 상기 기능적 측면은 세포 이동, 혈관형성, 세포외 기질 분해 또는 아노이키스인 동정 방법.
  37. 결정인자의 활성 또는 발현을 조절하는 화합물을 동정하는 방법으로서,
    (a) 결정인자를 발현하는 세포를 제공하는 단계;
    (b) 세포를 후보 화합물을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; 및
    (c) 물질이 결정인자의 발현 또는 활성을 변경시키는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하고,
    이를 통해, 화합물의 존재 하에 관찰되는 변경이 세포를 화합물이 없는 조성물과 접촉시킬 때에는 관찰되지 않는 경우, 동정된 화합물은 결정인자의 활성 또는 발현을 조절하는 것인, 동정 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 세포는 생체내, 체외 또는 시험관내 접촉되는 것인 동정 방법.
  39. 대상에서 암을 치료하는 방법으로서,
    결정인자의 활성 또는 발현을 조절하는 화합물을 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 치료 방법.
  40. 대상에서 암을 치료하는 방법으로서,
    결정인자에 의해 조절되는 화합물의 활성 또는 발현을 조절하는 제제를 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 치료 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 화합물은 TGFβ 또는 CXCR4인 치료 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 제제는 TGFβ 억제제 또는 CXCR4 억제제인 치료 방법.
  43. 종양을 갖는 환자를 치료하는 방법으로서,
    종양을 갖는 환자를 동정하는 단계로서, 여기서 결정인자 1-360 중 2개 이상이 종양으로부터의 샘플에서 측정시 임상적으로 유의한 방식으로 변경된 것인 단계, 및
    환자를 종양 전이를 예방 또는 감소시키는 치료 섭생법으로 치료하는 단계
    를 포함하는, 치료 방법.
  44. 보조 치료를 필요로 하는 종양 환자를 선택하는 방법으로서,
    결정인자 1-360 중 2개 이상을 측정함으로써 환자에서 전이 위험성을 평가하는 단계로서, 여기서 환자로부터의 종양 샘플에서 상기 2개 이상의 결정인자의 임상적으로 유의한 변경은 환자가 보조 치료를 필요로 함을 가리키는 것인 단계를 포함하는, 선택 방법.
  45. 종양 환자에 대한 치료 결정을 통지하는(informing) 방법으로서,
    환자로부터의 종양 샘플에서 결정인자 1-360 중 2개 이상에 대한 정보를 수득하는 단계, 및
    상기 2개 이상의 결정인자가 임상적으로 유의한 방식으로 변경된 경우, 환자에서 종양 전이를 예방 또는 감소시키는 치료 섭생법을 선택하는 단계
    를 포함하는, 통지 방법.
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