JP6133297B2 - 試料中の希少標的細胞のサイトメトリー検出のための方法及び組成物 - Google Patents

試料中の希少標的細胞のサイトメトリー検出のための方法及び組成物 Download PDF

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Description

フローサイトメトリーとは、研究において、ユーザが試料流体中の成分を速やかに解析して分取することを可能にする広く認められている手法である。フローサイトメータは、担体流体（例えばシース流体）を使用して、試料成分を略１つずつ照射域に通過させる。各試料成分はレーザなどの光源に照射され、各試料成分により散乱した光が検出されて解析される。試料成分は、照射域を出ると、その光学的特性及び他の特性に基づいて分離され得る。
米国特許第7332288号明細書
循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）とは、対象の血流中に入り、腫瘍から剥離した細胞のことである。この細胞は、血液中に入ると、対象の身体を循環することができ、他の組織に侵入し、新たな腫瘍を成長させることができる。このようにしてＣＴＣは転移に関与し、癌に罹患している対象の主な死因となる。ＣＴＣの検出は極めて困難であるという事実、すなわち、ＣＴＣは並外れて希少であり、正常細胞との識別が困難である場合があるという事実により、ＣＴＣを計数するという取り組みは阻まれてきた。ＣＴＣを検出する現存の手法には感受性及び／又は特異性に限界があり、多くの正常細胞が癌性であると誤判断され、多くの癌細胞が解析で見逃されている。
本開示は、試料中の希少標的細胞を検出するためのサイトメトリー方法を提供する。ある態様では、本方法は、血液などの生体試料中の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）などの希少標的細胞の検出を容易にすることができる。本方法の態様は、希少標的細胞のマーカに特異的に結合する第１及び第２の結合部材に試料を接触させるステップと、試料のサイトメトリーアッセイにより、結合した第１及び第２の結合部材を含む細胞の存在を分析して、試料中の希少標的細胞を検出するステップとを有する。主題の方法を実施するためのシステム、組成物及びキットが更に提供される。
対象とする希少標的細胞には、原核細胞（例えば細菌細胞又は古細菌細胞）及び真核細胞（例えば、神経細胞、筋細胞、上皮細胞（例えば循環腫瘍細胞）などの哺乳類の細胞、幹細胞（例えば造血幹細胞）、脂肪細胞など）が含まれるが、これらに限定されない。希少標的細胞は、インビトロ源（例えば培養で成長させた研究用細胞由来の細胞の懸濁液）から得られた試料、又はインビボ源（例えば哺乳類の対象、ヒト対象など）から得られた試料を含む種々の試料から検出され得る。
主題の方法の実施には種々の結合部材を使用することができる。結合部材は、希少標的細胞のマーカに特異的に結合することができる。対象とするマーカには、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５９、ＣＤ６１、ＣＤ６４、ＣＤ７１、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ９０、ＣＤ１０３、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ２７１、ＣＤ３０３、ＣＤ３０４、ｂｃｌ−２、Ｃ−ｋｉｔ、ＴｄＴ、ＦＭＣ７、ＳＣＡ−１、グリコホリンＡ、サイトケラチン、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＢ４、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、ＨＥＲ２及びＭＵＣ−１が含まれるが、これらに限定されない。ある態様では、マーカは、希少標的細胞の表面上及び／又は希少標的細胞の内部にあってもよい。有核細胞は透過処理されて、第１及び第２の結合部材の細胞内のマーカへの結合を可能にすることができる。主題の方法のある態様では、試料中の非希少細胞を染色しない（例えば、ＣＤ４５については染色しない）。
ある態様では、結合部材に標識を付すことができる。結合部材の標識は、本明細書により詳細に説明する通り、直接的に付されても間接的に付されてもよい。対象とする標識には、インドカルボシアニン（Ｃ３）、インドジカルボシアニン（Ｃ５）、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）−３５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ−５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７００、ＪＯＥ、リサミン（Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ）、ローダミン グリーン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ）、ＢＯＤＩＰＹ、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、カルボキシ−フルオレセイン（ＦＡＭ）、フィコエリトリン、ローダミン、ジクロロローダミン（ｄローダミン）、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、ＬＩＺ、ＶＩＣ、ＮＥＤ、ＰＥＴ、ＳＹＢＲ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎなどが含まれるが、これらに限定されない。
対象とする結合部材には、抗体、及び該抗体の抗原結合性フラグメントが含まれる。ある実施形態では、第１の結合部材及び第２の結合部材が抗体又は該抗体の抗原結合性フラグメントである場合、これらはマーカの同一のエピトープに結合する。
本開示によって、キットが更に提供される。キットは、希少標的細胞のマーカに特異的に結合する第１及び第２の結合部材、及び、生体試料のフローサイトメトリーアッセイにより、結合した第１及び第２の結合部材を含む細胞の存在を分析して、生体試料中の希少標的細胞を検出するための第１及び第２の結合部材の使用説明を備えることができる。本明細書により詳細に説明する通り、組成物及びシステムが更に提供される。
本発明は、添付の図面と併せて読むと、以下の詳細な説明から理解を深めることができる。
本開示による方法の概略図である。この特定の実施例において、（「腫瘍細胞」と称される）希少標的細胞は（ＣＫ）−Ｒｅｄ及びＣＫ−Ｇｒｅｅｎの両方のサイトケラチンで標識が付されているが、非希少細胞（ここでは白血球すなわちＷＢＣ）は標識が付されていない。細胞は、流れを示す矢印で示されているように、フローサイトメータ内を下方に流れる。励起光（「Ｅｘ光」）が当てられて、ＣＫ−Ｒｅｄ及び／又はＣＫ−Ｇｒｅｅｎの蛍光を生じさせる。各標識が蛍光色素である２色の蛍光の組合せが、フローサイトメトリーアッセイで閾値として使用される。得られたＣＫ−Ｒｅｄ蛍光（ｙ軸）対ＣＫ−Ｇｒｅｅｎ蛍光（ｘ軸）の密度プロットが、機器によって検出された腫瘍細胞の数を示す。 パネルＡ〜Ｂは、標識のフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ，パネルＡ）及び標識のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７（パネルＢ）の発光スペクトルを表す。各々へのレーザ励起線が矢印で示されている。 本開示のアッセイ手順のフローチャートである。試料７．５ｍＬを、ＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ ＣＰＴ管中で製造元の指示に従ってスピンさせ、ＷＢＣ部分を分離する。次いで、ＷＢＣ分画を固定し、透過処理し、染色してＦＡＣＳ、例えばＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）フローサイトメータで解析する。 パネルＡ〜Ｄは、ＷＢＣの存在下での、血液からの種々の濃度のＨＴ−２９腫瘍細胞の濃縮及び解析を示す密度プロットである。パネルＡ：１０，０００ＨＴ−２９細胞／ｍＬを含有する血液試料０．５ｍＬに、赤血球溶解、固定及び遠心分離を施した。ＷＢＣ分画を除去して透過処理した。ＣＫ−ＦＩＴＣ及びＣＫ−Ａｌｅｘａ６４７を６０ｍ添加した。試料を、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）フローサイトメータを使用して解析した。パネルＢ：ＨＴ−２９細胞が、出発濃度１，０００ＨＴ−２９細胞／ｍＬで存在した。パネルＣ：ＨＴ−２９細胞が、出発濃度１００ＨＴ−２９細胞／ｍＬで存在した。パネルＤ：ＨＴ−２９細胞が、出発濃度０ＨＴ−２９細胞／ｍＬで存在した。 パネルＡ〜Ｃは、ＷＢＣの存在下での、血液からのＨＴ−２９腫瘍細胞の濃縮及び解析を示す密度プロットである。血液試料を１×ＢＤ ＦＡＣＳ Ｌｙｓｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎで溶解して、試料中の赤血球を溶解した。試料を１×ＢＤ ＦＡＣＳ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ２で透過処理して洗浄し、次いで０．５５ｍＬ Ｒｘ体積のＣＫ Ａｂ−ＦＩＴＣ及びＣＫ Ａｂ−Ａ６４７の結合体で細胞内で染色し、この混合物０．３６ｍＬを、更なる洗浄はせずに中流速（３６μＬ／分）にて、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）フローサイトメータで製造元の指示に従って計数した。パネルＡ：血液７．５ｍＬ及び濃度１０，０００ＨＴ−２９細胞／ｍＬを使用しての陽性計数。プロットは１分の計数を示す。パネルＢ：血液７．５ｍＬ及び濃度０ＨＴ−２９細胞／ｍＬを使用しての陰性計数。プロットは１０分の計数を示す。パネルＣ：緩衝液のみ、１５分の計数。累積すると、パネルＡ〜Ｃは、３４，３６３，６３６個のＷＢＣを背景に、１個のＨＴ−２９腫瘍細胞が観察され、１５分の稼働中に「緩衝液のみ」には偽陽性のドットが記録されなかったことを示す。 パネルＡ〜Ｃは、本開示の方法の識別効率を示す。ＷＢＣ及びＨＴ−２９腫瘍細胞を含有する試料を、本明細書に記載する通りに調製し、ＣＫ−ＡＰＣ及びＣＫ−ＦＩＴＣで試料に標識を付した。パネルＡ及びＢ：ＳＳＣ対ＡＰＣ（パネルＡ）及びＦＩＴＣ（パネルＢ）を示す標準的な１色の密度プロット。ＨＴ−２９腫瘍細胞は、プロット中に濃い目のドットで表されているが、非特異的な事象から容易に検出することができなかった。パネルＣ：試料中のＡＰＣ及びＦＩＴＣの両方を測定すると、狭い対角線上に下降するドットプロットが得られ、腫瘍細胞が容易に特定される。 パネルＡ〜Ｃは図６の試料の陰性試料を示す。これらの試料中にＨＴ−２９腫瘍細胞は存在していなかった。パネルＡ及びＢ：ＳＳＣ対ＡＰＣ（パネルＡ）及びＦＩＴＣ（パネルＢ）を示す１色の密度プロットが多くの偽陽性を示した。パネルＣ：偽陽性の事象が観察されなかった。 パネルＡ〜Ｃは、種々の出発濃度を使用したときの、試料中のＨＴ−２９腫瘍細胞の画像を示す。ＷＢＣ及びＨＴ−２９細胞を含有する試料を、ＣＫ−ＦＩＴＣ及びＣＫ−ＰＥで染色した。ＨＴ−２９細胞は、濃度５，０００細胞／ｍＬ（パネルＡ）、濃度５００細胞／ｍＬ（パネルＢ）又は濃度０．０細胞／ｍＬ（パネルＣ）で存在していた。ＰＥチャネルでは、ＨＴ−２９細胞の濃度が０．０細胞／ｍＬ（パネルＣ）の場合でも事象が観察された。 パネルＡ〜Ｂは、アッセイプロトコル及びＷＢＣの存在下での血液からのＨＴ−２９腫瘍細胞の画像を示す。パネルＡ：細胞を撮像するためのアッセイ手順。試料を図５に関して上述した通りに調製し、水銀灯を使用したＺＥＩＳＳ顕微鏡を使用して撮像した。パネルＢ：左から右へ夫々、細胞を含有するＣＫ−ＦＩＴＣ（ＦＩＴＣチャネル）の画像、細胞を含有するＣＫ−Ａｌｅｘａ６４７（ＡＰＣチャネル）の画像、及び重ね合わせた画像。全ての図は１００の画像を表わす。 試料の調製技術を比較するプロットを示す。「溶解」と示されたプロットは、溶解及び遠心分離を使用して血液中のＨＴ−２９腫瘍細胞を処理することを要件とする。 試料の調製技術を比較するプロットを示す。「ＣＰＴ」と示されたプロットは、ＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ ＣＰＴ管を使用して処理することを要件とする。
本開示は、試料中の希少標的細胞を検出するためのサイトメトリー方法を提供する。本方法の態様は、希少標的細胞のマーカに特異的に結合する第１及び第２の結合部材に試料を接触させるステップと、試料のサイトメトリーアッセイにより、結合した第１及び第２の結合部材を含む細胞の存在を分析して、試料中の希少標的細胞を検出するステップとを有する。主題の方法を実施するためのシステム、組成物及びキットが更に提供される。
本発明を更に詳細に説明する前に、本発明は、説明される特定の実施形態に限定されておらず、言うまでもなく変更され得ることを理解すべきである。更に、本発明の範囲が添付の請求項によってのみ限定されているので、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためだけに用いられており、限定することを意図していないことを理解すべきである。
ある範囲の値が与えられる場合、その範囲の上限及び下限の間の、文脈が別段に明示しない限りは下限の単位の１０分の１までの各介在値、及びその記載された範囲内の任意の他の記載された値又は介在する値が本発明に包含されることを理解されたい。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、より小さい範囲内に独立して含まれてもよく、記載された範囲内の任意の具体的に除外された限度を条件として本発明に包含される。記載された範囲が限度のうちの一方又は両方を含む場合、これらの含まれた限度の一方又は両方を除外した範囲も本発明に包含される。
本明細書に使用されている全ての技術的な用語及び科学的な用語は、別の方法で定義されていない限り、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同一の意味を有する。本明細書に述べられている方法及び材料と同様の又は相当する全ての方法及び材料が本発明の実施又は試験で更に使用され得るが、典型的な例示となる方法及び材料を説明する。
本明細書に引用されている全ての刊行物及び特許は、個々の刊行物又は特許が、具体的に且つ個別に参照によって組み込まれると示されているかのように参照によって本明細書に組み込まれ、刊行物の引用に関連する方法及び／又は材料を開示して記載すべく、参照によって本明細書に組み込まれる。任意の刊行物の引用は、出願日前のその開示に関するものであって、先行発明を理由として、本発明がこのような刊行物に先行する権限がないことを認めるものであるとみなされるべきではない。更に、提供される刊行物の日付は、実際の公開日とは異なる場合があり、個別に確認する必要がある。
単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」が、本明細書及び請求項で用いられている場合、文脈が別段に明示しない限り、複数の指示対象を含むことを留意すべきである。更に、請求項がいかなる選択的な要素も排除して記載されていることを留意すべきである。従って、この記述は、請求項の要素の記載に関する「唯一の（ｓｏｌｅｌｙ）」、「のみの（ｏｎｌｙ）」等の排他的用語の使用、又は「否定的な（ｎｅｇａｔｉｖｅ）」限定の使用のための先行記載として機能すべく意図される。
当業者が本開示を読むと明らかであるように、本明細書に説明され例示された個々の実施形態は夫々、別々の構成要素及び特徴を有しており、別々の構成要素及び特徴は、本発明の範囲又は趣旨から逸脱することなく、他の複数の実施形態のいずれかの特徴から容易に分離されてもよく、又はいずれかの特徴と容易に組み合わされてもよい。全ての記載された方法は、記載された事象の順序で、又は論理的に可能な任意の他の順序で実行され得る。
方法
上記の通り、本開示は、試料中の希少標的細胞を検出するためのサイトメトリー方法を提供する。「サイトメトリー方法」という用語は、本明細書において、フローサイトメトリー方法及び／又はイメージングサイトメトリー方法を記載するために使用される。従って、「サイトメトリーアッセイ」とはフローサイトメトリーアッセイ及び／又はイメージングサイトメトリーアッセイを意味し、「サイトメータ」はフローサイトメータ及び／又はイメージングサイトメータを意味することができる。
本発明の実施形態の態様は、希少標的細胞のマーカに特異的に結合する少なくとも第１及び第２の結合部材に試料を接触させるステップを有する。サイトメトリーで試料を調べて、結合した第１及び第２の結合部材を含む細胞の存在を検出することによって、希少標的細胞を試料中に検出することができる。
ある実施形態では、試料中の希少標的細胞を検出する本発明の方法は定性的であり、希少標的細胞の検出は定性的である。例えば、標的細胞が試料中に存在するか又は存在しないという判定がなされる。ある実施形態では、試料中の希少標的細胞を検出する本発明の方法は定量的であり、希少標的細胞の検出は定量的である。本方法は、試料中の希少標的細胞の数の定量的測定値を決定するステップを有することができる。ある実施形態では、試料中の希少標的細胞の数を定量するステップは、存在する希少標的細胞の数が所定の閾値を上回るか又は下回るかを決定するステップを有する。
本方法の種々のステップ及び態様を、以下に更に詳細に記載する。
希少標的細胞
上記の通り、本開示は、試料中の希少標的細胞を検出するためのサイトメトリー方法を提供する。「希少標的細胞」という用語は、本明細書で使用する場合、試料中に存在するある型の細胞を意味するために使用され、ある型の細胞の数が、試料中の細胞の総数の５０．０％未満であり、例えば、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、１％未満、０．１％未満、０．０１％未満又は０．００１％未満である。ある態様では、細胞試料中、非希少細胞の数が希少標的細胞の数より例えば１０5 倍以上、１０6 倍以上、１０7 倍以上、１０8 倍以上又は１０9 倍以上を含む１０4 倍以上多い。対象とする希少標的細胞型には、原核細胞（例えば細菌細胞又は古細菌細胞）及び真核細胞（例えば神経細胞、筋細胞、上皮細胞（例えば循環腫瘍細胞）などの哺乳類の細胞、幹細胞（例えば造血幹細胞）、希少リンパ球（例えば制御性Ｔ細胞）、脂肪細胞など）が含まれるが、これらに限定されない。
「非希少細胞」という用語は、希少標的細胞ではない試料中の細胞を意味するために使用することができる。非希少細胞は、原核細胞（例えば細菌細胞又は古細菌細胞）及び真核細胞（例えば、神経細胞、白血球、筋細胞、上皮細胞、脂肪細胞などの哺乳類の細胞）を含むが、これらに限定されない任意の型の細胞とすることができる。主題の方法のある態様では、サイトメトリー解析の前に、非希少細胞は特異的に標識が付されない及び／又は染色されない。例えば、ある態様では、非希少細胞はＣＤ４５について染色されない。ある態様では、非希少細胞は、希少細胞より標識が付される数が大幅に少ない場合がある（例えば非特異結合のため）。このようなある態様では、希少細胞は、サイトメトリー解析によって、標識が付された大幅に少ない非希少細胞と識別され得る。
試料
本明細書で使用する「試料」及び「細胞試料」という用語は、懸濁液中に１又は複数の別個の細胞を任意の所望の濃度で含有する任意の試料を意味する。例えば、細胞試料は、１ミリリットル当たり１０11個以下、１０10個以下、１０9 個以下、１０8 個以下、１０7 個以下、１０6 個以下、１０5 個以下、１０4 個以下、１０3 個以下、５００個以下、１００個以下、１０個以下又は１個の細胞を含有することができる。試料は既知の数の細胞又は未知の数の細胞を含有することができる。好適な細胞には、真核細胞（例えば哺乳類の細胞）及び／又は原核細胞（例えば細菌細胞又は古細菌細胞）が含まれる。
本発明の方法の実施において、試料は、インビトロ源（例えば培養で成長させた研究用細胞由来の細胞の懸濁液）、又はインビボ源（例えば哺乳類の対象、ヒト対象など）から得られる。ある実施形態では、細胞試料はインビトロ源から得られる。インビトロ源には、原核（例えば細菌、古細菌の）細胞培養物、原核及び／又は真核（例えば哺乳動物、プロテスト（ｐｒｏｔｅｓｔ）、真菌などの）細胞を含有する環境試料、真核細胞培養物（例えば、樹立細胞株の培養物、既知の細胞株又は購入した細胞株の培養物、不死化細胞株の培養物、初代細胞の培養物、研究用酵母の培養物など）、組織培養物などが含まれるが、これらに限定されない。
ある実施形態では、試料はインビボ源から得られ、組織から得られる試料（例えば、組織生検由来の細胞懸濁液、組織試料由来の細胞懸濁液など）及び／又は体液（例えば、全血、分画した血液、血漿、血清、唾液、リンパ液、間質液など）を含むことができる。場合により、対象由来の細胞、液又は組織が、評価の前に培養されるか、保管されるか又は処理される。インビボ源は、生きている多細胞生物を含み、非診断用細胞試料でも診断用細胞試料でも生成することができる。
ある実施形態では、試料源は「哺乳動物」又は「哺乳類」であり、これらの用語は、肉食動物（例えばイヌ及びネコ）、齧歯目（例えばマウス、モルモット及びラット）、及び霊長目（例えばヒト、チンパンジー及びサル）の各目を含む哺乳綱の生物を記載するために広く使用される。場合により、対象はヒトである。本方法は、両性及び任意の発生段階（すなわち、新生児、乳児、若年、青年、成人）のヒト対象から得られる試料に適用することができ、ある実施形態では、ヒト対象は、若年、青年又は成人である。本発明はヒト対象由来の試料に適用することができる一方、本方法は、トリ、マウス、ラット、イヌ、ネコ、家畜及びウマなどであるがこれらに限定されない他の動物対象由来の試料に（すなわち「非ヒト対象」に）実施することができると理解すべきである。
本方法に使用される試料は、あらゆる便宜的な方法で得られる。ある態様では、試料は静脈穿刺によって得られる血液である。血液はサイトメトリー解析の前に、対象から得て処理されてもよい。サイトメトリー解析用に試料を得て処理する方法は当該技術分野において周知である。例えば、ある態様では、図３に提示したアッセイを使用して試料を処理してもよい。この例の場合、血液試料は、標準的な静脈穿刺プロトコルに従って対象から静脈穿刺によって得られる。細胞試料をＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）ＣＰＴ管中に採取し、製造元の指示に従って処理する。この管を、略室温（約１８℃〜約２５℃）で２０分以上、相対遠心力約１５００〜約１８００にて遠心分離する。遠心分離後、単核細胞層及び血小板層を回収して再懸濁する。この分画を、あらゆる便宜的なプロトコルを使用して、例えばＢＤ ＦＡＣＳ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ２などの市販の試薬を使用することによって固定する及び／又は透過処理することができる。
結合部材
上記の通り、本発明の態様は、希少標的細胞のマーカに特異的に結合する少なくとも第１及び第２の結合部材に試料を接触させるステップを有することができる。本明細書で使用する「結合部材」という用語は、希少標的細胞のマーカに特異的に結合するあらゆる作用物質（例えばタンパク質、小分子など）を意味する。「特異的な結合」、「特異的に結合する」などの用語は、溶液又は反応混合物中での他の分子又は部分と比較してある分子に優先的に結合することを意味する。ある実施形態では、結合部材と結合部材が特異的に結合する希少標的細胞のマーカとの親和性は、これらが互いに特異的に結合して結合複合体になると、Ｋd （解離定数）１０-6Ｍ以下、例えば１０-7Ｍ以下、１０-8Ｍ以下、例えば１０-9Ｍ以下、１０-10 Ｍ以下、１０-11 Ｍ以下、１０-12 Ｍ以下、１０-13 Ｍ以下、１０-14 Ｍ以下、１０-15 Ｍ以下を特徴とする。「親和性」とは、結合の強さを意味し、結合親和性の増加がＫd の低下と相関関係にある。
本発明のある態様では、試料を希少標的細胞のマーカに特異的に結合する２より多い結合部材、例えば３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、約１０〜１５又は約１５以上の結合部材と接触させてもよい。
結合部材は、希少標的細胞のマーカに特異的に結合することができる。「マーカ」という用語は、本明細書で使用する場合、希少標的細胞の表面又は内部に存在する任意の分子を意味するために広く一般的に使用され、マーカは、希少標的細胞にある濃度と同一の濃度で正常な非希少細胞に通常存在しない。ある態様では、結合部材は、希少標的細胞の異なるマーカ（例えばＥｐＣａｍ及びサイトケラチンなどの異なる型のマーカ）に特異的に結合することができる。ある態様では、マーカは希少標的細胞の表面に存在してもよい。他の態様では、マーカは希少標的細胞の内部に含有される。かかる態様では、試料の細胞は、第１及び第２の結合部材が細胞内のマーカに特異的に結合することができるように、透過処理される必要がある場合がある。試料の細胞を透過処理する方法は当該技術分野において周知であり、例えばＢＤ ＦＡＣＳ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ２の使用などの、市販の試薬及びプロトコルを含む。本方法の実施において、細胞を透過処理するあらゆる便宜的な手段を使用してもよい。
対象とするマーカには、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５９、ＣＤ６１、ＣＤ６４、ＣＤ７１、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ９０、ＣＤ１０３、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ２７１、ＣＤ３０３、ＣＤ３０４、ｂｃｌ−２、Ｃ−ｋｉｔ、ＴｄＴ、ＦＭＣ７、ＳＣＡ−１、グリコホリンＡ、サイトケラチン、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＢ４、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、ＨＥＲ２及びＭＵＣ−１が含まれるが、これらに限定されない。
ある実施形態では、結合部材は標識又は標識が付された結合部材を含む。「標識」及び「検出可能な標識」という用語は、本明細書で使用する場合、検出可能な分子を意味し、放射性同位元素、蛍光体、化学発光体、発色団、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、発色団、染料、金属イオン、金属ゾル、リガンド（例えばビオチン、アビジン、ストレプトアビジン又はハプテン）、挿入染料などを含むがこれらに限定されない。「蛍光体」という用語は、検出可能な範囲に蛍光を呈することができる物質又は該物質の一部を意味する。
対象とする標識は、直接的及び間接的に検出可能な標識の両方を含む。本明細書に記載する方法の使用に好適な標識は、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、光学的手段、化学的手段又は他の手段によって間接的又は直接的に検出可能なあらゆる分子を含む。対象とする標識には、フルオレセイン及びフルオレセインの誘導体、ローダミン及びローダミンの誘導体、シアニン及びシアニンの誘導体、クマリン及びクマリンの誘導体、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ及びＣａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅの誘導体、Ｌｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ及びＬｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗの誘導体、ＢＯＤＩＰＹ及びＢＯＤＩＰＹの誘導体などが含まれるが、これらに限定されない。対象とする標識には、インドカルボシアニン（Ｃ３）、インドジカルボシアニン（Ｃ５）、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ−３５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ−５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７００、ＪＯＥ、リサミン（Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ）、ローダミン グリーン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ）、ＢＯＤＩＰＹ、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、カルボキシ−フルオレセイン（ＦＡＭ）、フィコエリトリン、ローダミン、ジクロロローダミン（ｄローダミン）、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、ＬＩＺ、ＶＩＣ、ＮＥＤ、ＰＥＴ、ＳＹＢＲ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎなどのような蛍光色素分子も含まれる。
蛍光標識は、（例えばフローサイトメータ内の）放射光を検出するための光検出器を使用して検出され得る。酵素標識は通常、酵素に基質を加え、酵素の基質への作用によって生成する反応生成物を検出することによって検出され、比色標識は、着色した標識を単に可視化することによって検出されることができ、抗原標識は、抗原標識に特異的に結合する抗体（又は抗体の結合フラグメント）を付与することによって検出され得る。抗原標識に特異的に結合する抗体は、直接的又は間接的に検出可能となる。例えば抗体は、信号（例えば蛍光）を発する標識部分（例えば蛍光色素分子）に結合され得る。抗体は、適切な基質（例えば蛍光チラミド、ＦａｓｔＲｅｄなど）を与えられると検出可能な生成物（例えば蛍光生成物）を生成する酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼなど）に結合され得る。
本方法の結合部材に、異なる標識が付されてもよい。ある態様では、標識が互いに識別され得るように標識が選択され、例えば第１の標識の発光スペクトル及び第２の標識の発光スペクトルが略重なり合わないように選択される。例えば、図２のパネルＡ〜Ｂは略重なり合わない２つの標識、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ，パネルＡ）及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７（パネルＢ）の発光スペクトルを表す。ＦＩＴＣは波長約４８８ｎｍの光を使用して励起させられ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７の発光スペクトルと略重なり合わないＦＩＴＣの発光スペクトルはフィルタ（例えば５３０／３０フィルタ）を使用して検出され得る。検出可能な発光スペクトルが重なり合わない２つの異なる標識を利用すると、得られるフローサイトメトリーアッセイの結果を、ｙ軸上の第１の標識の蛍光対ｘ軸上の第２の標識の蛍光の密度プロットとしてプロットすることが可能になる（例えば図１を参照）。
ある態様では、結合部材は抗体又は抗体の抗原結合性フラグメントであってもよい。「抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、抗体又は任意のアイソタイプの免疫グロブリン、抗原への特異的結合を保つ抗体のフラグメントを含み、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ及びＦｄの各フラグメント、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、抗体の抗原結合部分及び非抗体タンパク質を含む融合タンパク質を含むがこれらに限定されない。抗体は、特異的結合対の部材、例えばビオチン（ビオチン−アビジン特異的結合対の部材）など、他の部分に更に結合されてもよい。Ｆａｂ’、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）2 、及び又は抗原への特異的結合を保つ他の抗体フラグメント、並びにモノクローナル抗体もこの用語に包含される。
試料は、希少標的細胞の同一のマーカに特異的な少なくとも２つの結合部材に接触することができる。従って、結合部材が抗体である場合、希少標的細胞のマーカは抗体に結合される１又は複数の抗原を含むことができる。「抗原」とは当該技術分野においてよく理解されている用語であり、抗体分子又はＴ細胞受容体の抗原結合部位によって特異的に結合され得るあらゆる物質を含む。「エピトープ」とは、特異的Ｂ細胞及び／又はＴ細胞が反応する抗原上の部位を意味する。同一のエピトープを認識する抗体は、１つの抗体が標的抗原への別の抗体の結合を阻止する能力を示す簡易な免疫測定法で特定され得る。ある態様では、複数の抗体（例えば第１の結合部材、第２の結合部材、第３の結合部材など）が同一のエピトープに結合する。他の態様では、複数の抗体は異なるエピトープに結合する。
対象とする所与のマーカに種々の結合部材を使用することができる。例えば、対象とするマーカがＣＤ４５である場合、対象とする結合部材には、クローンＣ０−Ｆ１１、ＨＩ１００、ＨＩ３０、ＵＣＨＬ１、３０−Ｆ１１、２Ｄ１、Ｌ４８、ＲＡ３−６Ｂ２及びＤ０５８−１２８３によって生成された市販の抗体（全てＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）が含まれるが、これらに限定されない。しかし、場合により、本方法にはＣＤ４５についての染色ステップが含まれない。
マーカがサイトケラチンである場合、対象とする結合部材には、クローンＣＡＭ５．２によって生成され、主にヒトサイトケラチン７及びサイトケラチン８と反応する市販の抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）、クローンＫＡ４によって生成され、主にヒトサイトケラチン１４、１５、１６及び１９と反応する抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）、クローンＲＣＫ１０２によって生成され、主にヒト、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、イヌ及び／又はウサギサイトケラチン５及び８と反応する抗体（ロディッシュ（Ｌｏｄｉｓｈ）等著，「ＭＣＢ」，２０００年，ｐ．７９５−８４７に記載されており、その開示は参照によって本明細書に組み込まれる）、クローンＲＣＫ１０５によって生成され、主にヒト、マウス、ラット、ハムスター、ブタ及び／又はイヌサイトケラチン７と反応する抗体（ロディッシュ（Ｌｏｄｉｓｈ）等著，上記に記載）、クローンＡＥ１／ＡＥ３によって生成された抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）、クローンＣ−１１によって生成された抗体（ミカリアン（Ｍｉｋａｅｌｉａｎ）等著，「Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｐａｔｈｏｌ」，２００４年，３２版，ｐ．１８１−１９１に記載されており、その開示は参照によって本明細書に組み込まれる）、クローンＬｄｓ１０３によって生成された抗体（サウスゲート（Ｓｏｕｔｈｇａｔｅ）等著，「Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．」，１９８７年，５６版，ｐ．２１１−２２３に記載されており、その開示は参照によって本明細書に組み込まれる）、及びクローンＣＫ２によって生成された抗体（ワッチャー（Ｗａｃｈｔｅｒ）等著，「Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．」，１９９０年，１１版，ｐ．２３２−２３９に記載）が含まれるが、これらに限定されない。
対象とするＥｐＣＡＭ結合部材には、抗ＥｐＣＡＭ抗体ＢｅｒＥＰ４（シェバーニ（Ｓｈｅｉｂａｎｉ）等著，「Ａｍ Ｊ Ｓｕｒｇ Ｐａｔｈｏｌ．」，１９９１年８月，１５版８号，ｐ．７７９−７８４に記載され、その開示は参照によって本明細書に組み込まれる）、ＫＳ１／４（アントロヴィック（Ａｎｔｏｌｏｖｉｃ）等著，「ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ」，２０１０年，１０版，３５に記載され、その開示は参照によって本明細書に組み込まれる）、クローンＧ８．８によって生成され、主にマウスＥｐＣＡＭと反応する抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）、及びクローンＥＢＡ−１によって生成され、主にヒトＥｐＣＡＭと反応する抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）が含まれるがこれらに限定されない。
対象とするＥＧＦＲ結合部材には、クローン１３／ＥＧＦＲによって生成された抗体、クローン９Ｈ２によって生成された抗体、クローンＥＧＦＲ．１によって生成された抗体、クローン１２Ａ３によって生成された抗体、及びクローン１７／ｅｐｓ１５によって生成された抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）が含まれるが、これらに限定されない。
対象とするＣＥＡ結合部材には、クローンＣＯＬ−１によって生成された抗体、クローンＢ１．１／ＣＤ６６によって生成された抗体、及びクローンＢ６．２／ＣＤ６６によって生成された抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）が含まれるが、これらに限定されない。
対象とするＨＥＲ２結合部材には、クローンＮｅｕ２４．７によって生成された抗体、クローン４２／ｃ−ｅｒｂＢ−２によって生成された抗体、クローン３Ｂ５によって生成された抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）、及びクローン９Ｇ６によって生成された抗体（ハンコック（Ｈａｎｃｏｃｋ）等著，「Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．」，１９９１年，５１版，ｐ．４５７５−４５８９に記載され、その開示は参照によって本明細書に組み込まれる）が含まれるが、これらに限定されない。
対象とするＭＵＣ−１結合部材には、クローンＨＭＰＶによって生成された抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）が含まれるが、これに限定されない。
サイトメトリー解析
本開示の方法は、試料のフローサイトメトリーアッセイを含んでもよい。フローサイトメトリーアッセイの手順は当該技術分野において周知である。例えば、オーメロッド（Ｏｒｍｅｒｏｄ）編，「Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，１９９７年、ジャロチェスキー（Ｊａｒｏｓｚｅｓｋｉ）等編，「Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」，９１号，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，１９９７年、「Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ」，第３編，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，１９９５年、ヴィルゴ（Ｖｉｒｇｏ）等著，「Ａｎｎ Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊａｎ」，２０１２年，４９（ｐｔ１），１７−２８、リンデン（Ｌｉｎｄｅｎ）等著，「Ｓｅｍｉｎ Ｔｈｒｏｍ Ｈｅｍｏｓｔ．」，２００４年１０月，３０版５号，ｐ．５０２−１１、アリソン（Ａｌｉｓｏｎ）等著，「Ｊ Ｐａｔｈｏｌ」，２０１０年１２月，２２２版４号，ｐ．３３５−３４４、及びハービッグ（Ｈｅｒｂｉｇ）等著，「Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．」，２００７年，２４版，３号，ｐ．２０３−２５５を参照されたい。これらの開示は参照によって本明細書に組み込まれる。ある態様では、試料のフローサイトメトリーアッセイは、複数の蛍光色素分子の同時励起及び検出が可能なフローサイトメータ、例えば製造元の指示に従って実質的に使用されるＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）フローサイトメータの使用を含む。本開示の方法は、ホールデン（Ｈｏｌｄｅｎ）等著，「Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ」，２００５年，２版，ｐ．７７３及びヴァレット等著（Ｖａｌｅｔ），「Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ」，２００４年，５９版，ｐ．１６７−１７１に記載されているようなイメージサイトメトリーを含んでもよく、これらの開示は参照によって本明細書に組み込まれる。
本方法のある態様では、サイトメトリーアッセイは、前方光散乱（ＦＳＣ）及び／又は側方光散乱（ＳＳＣ）を含む。他の態様では、サイトメトリーアッセイは、第１の結合部材の標識及び第２の結合部材の標識の両方を検出することを含み（図４のパネルＡ〜Ｄ及び図５のパネルＡ〜Ｃ）、この場合、散乱光ではなく標識の組合せ（例えば各標識が蛍光色素である２色の蛍光の組合せ）がアッセイにおける閾値として使用される。かかる態様では、試料中の希少標的細胞の特定には、第１の標識及び第２の標識の両方の検出を必要とする場合がある。ある態様では、試料中の希少標的細胞の特定には、３以上の標識の検出（例えば第３の結合部材、第４の結合部材など）を必要とする場合がある。
ある態様では、サイトメトリー解析の前に、非希少細胞を試料から分離してもよい。非希少細胞を試料から除去するあらゆる便宜的な手段を使用することができる。対象とする分離方法には、磁気分離技術、例えば米国特許第５９４５２８１号明細書、米国特許第６８５８４４０号明細書、米国特許第６６４５７７７号明細書、米国特許第６６３０３５５号明細書及び米国特許第６２５４８３０号明細書、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０３２４２３号明細書、及びホッペナー（Ｈｏｅｐｐｅｎｅｒ）等著，「Ｒｅｃｅｎｔ Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．」，２０１２年，１９５版，ｐ．４３−５８に記載されているものが含まれるがこれらに限定されず、これらの開示は参照によって本明細書に組み込まれる。対象とする分離方法には、例えば米国特許第６９２９７５０号明細書に記載されているような音波による濃縮器又は分離器を含む方法が更に含まれ、その開示は参照によって本明細書に組み込まれる。
サイトメトリー解析に分取を含めてもよい。希少標的細胞と特定された試料中の細胞を分取し、次いであらゆる便宜的な解析技術によって解析することができる。対象とする解析技術には、シークエンシング、ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈによるアッセイ（米国食品医薬品局，「Ｆｉｎａｌ ｒｕｌｅ． Ｆｅｄ Ｒｅｇｉｓｔ ６９」，２００４年，ｐ．２６０３６−２６０３８に記載）、ＣＴＣ Ｃｈｉｐによるアッセイ（ナグラス（Ｎａｇｒａｔｈ）等著，「Ｎａｔｕｒｅ」，２００７年，４５０版，ｐ．１２３５−１２３９に記載）、ＭａｇＳｗｅｅｐｅｒによるアッセイ（タラサ（Ｔａｌａｓａｚ）等著，「Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ」，２００９年，１０６版，ｐ．３９７０−３９７５に記載）及びナノ構造基材によるアッセイ（ワン エス（Ｗａｎｇ Ｓ）等著，「Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ」，２０１１年，５０版，ｐ．３０８４−３０８８に記載）が含まれるが、これらに限定されない。これらの開示は参照によって本明細書に組み込まれる。所望の場合、分取プロトコルに、生存希少細胞及び死滅希少細胞の識別を含めてもよく、その場合、かかる細胞を特定するあらゆる便宜的な染色プロトコルを本方法に組み入れてもよい。
システム
主題の方法を実施するためのサイトメトリーシステムを更に提供する。サイトメトリーシステムは、下記のようにサイトメトリー試料流体サブシステムを備えてもよい。加えて、サイトメトリーシステムは、サイトメトリー試料流体サブシステムに流体的に連結されたサイトメータを備えている。本開示のシステムは、複数の追加の構成要素、例えばデータ出力デバイス（例えばモニタ、プリンタ及び／又はスピーカ）、データ入力デバイス（例えばインターフェースポート、マウス、キーボードなど）、流体処理構成要素、電源などを備えてもよい。
ある態様では、サイトメトリーシステムは、希少標的細胞を含む試料を、希少標的細胞のマーカに特異的に結合する第１及び第２の結合部材に接触させるように構成されたサイトメトリー試料流体サブシステムを備えている。サイトメトリー試料流体サブシステムは、試料中の非希少細胞に特異的に標識が付されない及び／又は試料中の非希少細胞が染色されない（例えばＣＤ４５については染色されない）ように更に構成されてもよい。サイトメトリーシステムは、サイトメトリー試料流体サブシステムに流体的に連結されたサイトメータを備えてもよい。
他の態様では、システムは、希少標的細胞を含む試料を、希少標的細胞のマーカに特異的に結合する第１及び第２の結合部材に接触させるように構成されたサイトメトリー試料流体サブシステム、及びフローサイトメトリー試料流体サブシステムに流体的に連結され、試料のアッセイにより、結合した第１及び第２の結合部材を含む細胞の存在を分析して、試料中の希少標的細胞を検出するように構成されたサイトメータを備えてもよい。ある態様では、サイトメータは、第１の結合部材に結合した第１の標識及び第２の結合部材に結合した第２の標識の蛍光の組合せを検出閾値として使用するように構成されている。
キット
上記の方法の１又は複数の実施形態を実施するためのキットを更に提供する。主題のキットは、様々な構成要素及び試薬を備えてもよい。場合によっては、キットは、本方法に使用される試薬（例えば上記の通り）と、コンピュータプログラムが格納され、コンピュータにロードされると、コンピュータプログラムがコンピュータを作動させて本明細書に記載のサイトメトリーアッセイを実施するコンピュータ可読媒体と、コンピュータプログラムを取得するためのアドレスを有する物理的な基板とを少なくとも備えている。
上述した構成要素に加えて、主題のキットは、本方法を行うための使用説明を更に備えてもよい。これらの使用説明は、主題のキット内に様々な形態で備えられてもよく、使用説明のうちの一又は複数がキット内に備えられてもよい。これらの使用説明が備えられる一形態は、好適な媒体又は基板上に印刷された情報であり、例えば、情報が印刷されている一又は複数の紙片、キットの包装体、又は添付文書等である。更なる別の手段は、情報が記録されているコンピュータ可読媒体であり、例えば、ＣＤ、ＤＶＤ、ブルーレイ、フラッシュメモリ等である。存在し得る更なる別の手段は、転送されるサイトの情報にアクセスするためにインターネットを介して使用可能なウェブサイトアドレスである。あらゆる簡便な手段がキット内に設けられ得る。
有用性
主題の方法、組成物、システム及びキットは、試料中の希少標的細胞を検出することが望ましい種々の異なる用途に使用される。
本開示の非限定的且つ例示的な実施形態を以下に提供する。
付記１．試料中の希少標的細胞を検出する方法であって、
前記希少標的細胞のマーカに特異的に結合する第１及び第２の結合部材に前記試料を接触させるステップと、
前記試料のサイトメトリーアッセイにより、結合した第１及び第２の結合部材を含む細胞の存在を分析して、前記試料中の希少標的細胞を検出するステップと
を有することを特徴とする方法。
付記２．前記試料のサイトメトリーアッセイは、前記試料のフローサイトメトリーアッセイを有することを特徴とする付記１に記載の方法。
付記３．前記試料のサイトメトリーアッセイは、前記試料のイメージサイトメトリーアッセイを有することを特徴とする付記１又は２に記載の方法。
付記４．前記希少標的細胞のマーカに特異的に結合する第３の結合部材に前記試料を接触させるステップと、
前記試料のサイトメトリーアッセイにより、結合した第１、第２及び第３の結合部材を含む細胞の存在を分析して、前記試料中の希少標的細胞を検出するステップと
を更に有することを特徴とする付記１乃至３のいずれか１つに記載の方法。
付記５．少なくとも前記第１及び第２の結合部材は抗体又は該抗体の抗原結合性フラグメントであることを特徴とする付記１乃至４のいずれか１つに記載の方法。
付記６．前記抗体又は該抗体の抗原結合性フラグメントは、前記マーカ上の重複するエピトープに結合することを特徴とする付記５に記載の方法。
付記７．前記抗体又は該抗体の抗原結合性フラグメントは、前記マーカ上の同一のエピトープに結合することを特徴とする付記６に記載の方法。
付記８．前記第１及び第２の結合部材に標識を付すことを特徴とする付記１乃至７のいずれか１つに記載の方法。
付記９．前記第１及び第２の結合部材に標識を直接付すことを特徴とする付記８に記載の方法。
付記１０．前記第１の結合部材又は前記第２の結合部材に、インドカルボシアニン（Ｃ３）、インドジカルボシアニン（Ｃ５）、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ−３５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ−５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７００、ＪＯＥ、リサミン（Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ）、ローダミン グリーン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ）、ＢＯＤＩＰＹ、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、カルボキシ−フルオレセイン（ＦＡＭ）、フィコエリトリン、ローダミン、ジクロロローダミン（ｄローダミン）、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、ＬＩＺ、ＶＩＣ、ＮＥＤ、ＰＥＴ、ＳＹＢＲ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ及びＲｉｂｏＧｒｅｅｎから選択される標識を付すことを特徴とする付記８又は９に記載の方法。
付記１１．前記第１の結合部材の標識及び前記第２の結合部材の標識は異なる標識であることを特徴とする付記８乃至１０のいずれか１つに記載の方法。
付記１２．前記試料中の非希少細胞を特異的に染色しないことを特徴とする付記１乃至１１のいずれか１つに記載の方法。
付記１３．前記試料中の非希少細胞をＣＤ４５について染色しないことを特徴とする付記１乃至１２のいずれか１つに記載の方法。
付記１４．前記マーカは細胞内のマーカであることを特徴とする付記１乃至１３のいずれか１つに記載の方法。
付記１５．前記試料中の有核細胞を透過処理剤で透過処理するステップを有することを特徴とする付記１４に記載の方法。
付記１６．前記マーカは、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５９、ＣＤ６１、ＣＤ６４、ＣＤ７１、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ９０、ＣＤ１０３、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ２７１、ＣＤ３０３、ＣＤ３０４、ｂｃｌ−２、Ｃ−ｋｉｔ、ＴｄＴ、ＦＭＣ７、ＳＣＡ−１、グリコホリンＡ、サイトケラチン、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＢ４、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、ＨＥＲ２及びＭＵＣ−１から選択されることを特徴とする付記１乃至１５のいずれか１つに記載の方法。
付記１７．前記試料は血液であることを特徴とする付記１乃至１６のいずれか１つに記載の方法。
付記１８．前記試料は全血であることを特徴とする付記１乃至１７のいずれか１つに記載の方法。
付記１９．前記試料を哺乳類の対象から得ることを特徴とする付記１乃至１８のいずれか１つに記載の方法。
付記２０．前記試料をヒト対象から得ることを特徴とする付記１乃至１９のいずれか１つに記載の方法。
付記２１．前記希少標的細胞は上皮細胞であることを特徴とする付記１乃至２０のいずれか１つに記載の方法。
付記２２．前記上皮細胞は循環腫瘍細胞であることを特徴とする付記２１に記載の方法。
付記２３．前記マーカは、ＣＫ４、ＣＫ７、ＣＫ８、ＣＫ１０、ＣＫ１３、ＣＫ１４、ＣＫ１８、ＣＫ１９及びＣＫ２０から選択されるサイトケラチンであることを特徴とする付記２２に記載の方法。
付記２４．前記第１及び第２の結合部材は抗体であり、クローンＣＡＭ５．２、ＫＡ４、ＲＣＫ１０２、ＲＣＫ１０５、Ｃ−１１、Ｌｄｓ１０３又はＣＫ２によって生成された抗体として、実質的に同一のエピトープに結合することを特徴とする付記２２に記載の方法。
付記２５．前記試料のサイトメトリーアッセイは、分取を有することを特徴とする付記１乃至２４のいずれか１つに記載の方法。
付記２６．前記希少標的細胞を回収することを特徴とする付記２５に記載の方法。
付記２７．前記希少標的細胞のアッセイを、その後に行うことを特徴とする付記２６に記載の方法。
付記２８．マーカを含む希少標的細胞、及び
該希少標的細胞のマーカに特異的に結合する第１及び第２の結合部材
を含むことを特徴とする細胞試料。
付記２９．前記希少標的細胞のマーカに特異的に結合する第３の結合部材を更に含むことを特徴とする付記２８に記載の細胞試料。
付記３０．前記第１及び第２の結合部材は抗体又は該抗体の抗原結合性フラグメントであることを特徴とする付記２８又は２９に記載の細胞試料。
付記３１．前記抗体又は該抗体の抗原結合性フラグメントは、前記マーカ上の重複するエピトープに結合することを特徴とする付記３０に記載の細胞試料。
付記３２．前記抗体又は該抗体の抗原結合性フラグメントは、前記マーカ上の同一のエピトープに結合することを特徴とする付記３１に記載の細胞試料。
付記３３．前記第１及び第２の結合部材は標識が付されていることを特徴とする付記２８乃至３２のいずれか１つに記載の細胞試料。
付記３４．前記第１及び第２の結合部材は標識が直接付されていることを特徴とする付記３３に記載の細胞試料。
付記３５．前記第１又は第２の結合部材は、インドカルボシアニン（Ｃ３）、インドジカルボシアニン（Ｃ５）、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ−３５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ−５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７００、ＪＯＥ、リサミン（Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ）、ローダミン グリーン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ）、ＢＯＤＩＰＹ、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、カルボキシ−フルオレセイン（ＦＡＭ）、フィコエリトリン、ローダミン、ジクロロローダミン（ｄローダミン）、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、ＬＩＺ、ＶＩＣ、ＮＥＤ、ＰＥＴ、ＳＹＢＲ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ及びＲｉｂｏＧｒｅｅｎから選択される標識が付されていることを特徴とする付記３３又は３４に記載の細胞試料。
付記３６．前記第１の結合部材の標識及び前記第２の結合部材の標識は異なる標識であることを特徴とする付記３３乃至３５のいずれか１つに記載の細胞試料。
付記３７．前記細胞試料中の非希少細胞が特異的に染色されていないことを特徴とする付記２８乃至３５のいずれか１つに記載の細胞試料。
付記３８．前記細胞試料中の非希少細胞がＣＤ４５について染色されていないことを特徴とする付記２８乃至３７のいずれか１つに記載の細胞試料。
付記３９．前記マーカは細胞内のマーカであることを特徴とする付記２８乃至３８のいずれか１つに記載の細胞試料。
付記４０．前記マーカは、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５９、ＣＤ６１、ＣＤ６４、ＣＤ７１、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ９０、ＣＤ１０３、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ２７１、ＣＤ３０３、ＣＤ３０４、ｂｃｌ−２、Ｃ−ｋｉｔ、ＴｄＴ、ＦＭＣ７、ＳＣＡ−１、グリコホリンＡ、サイトケラチン、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＢ４、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、ＨＥＲ２及びＭＵＣ−１から選択されていることを特徴とする付記２８乃至３９のいずれか１つに記載の細胞試料。
付記４１．血液であることを特徴とする付記２８乃至４０のいずれか１つに記載の細胞試料。
付記４２．全血であることを特徴とする付記２８乃至４１のいずれか１つに記載の細胞試料。
付記４３．哺乳類の対象から得られたものであることを特徴とする付記２８乃至４２のいずれか１つに記載の細胞試料。
付記４４．ヒトから得られたものであることを特徴とする付記２８乃至４３のいずれか１つに記載の細胞試料。
付記４５．前記希少標的細胞は上皮細胞であることを特徴とする付記２８乃至４４のいずれか１つに記載の細胞試料。
付記４６．前記上皮細胞は循環腫瘍細胞であることを特徴とする付記４５に記載の細胞試料。
付記４７．希少標的細胞を含む試料を、該希少標的細胞のマーカに特異的に結合する第１及び第２の結合部材に接触させるように構成され、前記試料中の非希少細胞に標識が付されていないサイトメトリー試料流体サブシステム、及び
該サイトメトリー試料流体サブシステムに流体的に連結されたサイトメータ
を備えていることを特徴とするサイトメトリーシステム。
付記４８．前記サイトメトリー試料流体サブシステムはフローサイトメトリー試料流体サブシステムであり、前記サイトメータはフローサイトメータであることを特徴とする付記４７に記載のサイトメトリーシステム。
付記４９．希少標的細胞を含む試料を、該希少標的細胞のマーカに特異的に結合する第１及び第２の結合部材に接触させるように構成されたサイトメトリー試料流体サブシステム、及び
該サイトメトリー試料流体サブシステムに流体的に連結され、前記試料のアッセイにより、結合した第１及び第２の結合部材を含む細胞の存在を分析して、前記試料中の希少標的細胞を検出するように構成されたサイトメータ
を備えていることを特徴とするサイトメトリーシステム。
付記５０．前記サイトメトリー試料流体サブシステムはフローサイトメトリー試料流体サブシステムであり、前記サイトメータはフローサイトメータであることを特徴とする付記４９に記載のサイトメトリーシステム。
付記５１．試料中の希少標的細胞を特定するためのキットであって、
前記希少標的細胞のマーカに特異的に結合する第１及び第２の結合部材、及び
前記試料のフローサイトメトリーアッセイにより、結合した第１及び第２の結合部材を含む細胞の存在を分析して、前記試料中の希少標的細胞を検出するための前記第１及び第２の結合部材の使用説明
を備えていることを特徴とするキット。
実施例
上記の本開示から理解され得る通り、本開示には多種多様な用途がある。従って、以下の実施例は、本発明を構成して使用する方法の完全な開示及び記載を当業者に提供するために提示されており、本発明者が自身の発明であるとみなすものの範囲を限定するものではなく、以下の実施例は、行われた全ての実験例又は行われた唯一の実験例であることを示すものでもない。当業者は、実質的に同様の結果を得るために変更されるか又は変形されてもよい種々の非臨界パラメータを容易に認識する。従って、以下の実施例は、本発明を構成して使用する方法の完全な開示及び記載を当業者に提供するために提示されており、本発明者が自身の発明であるとみなすものの範囲を限定するものではなく、以下の実施例は、行われた全ての実験例又は行われた唯一の実験例であることを示すものでもない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して正確さを確保するように努力しているが、多少の実験誤差及び偏差は考慮されるべきである。
材料及び方法
以下の実施例で使用される一般的な材料及びプロトコルを以下に示す。
精製した抗サイトケラチン抗体をＢＤ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）から得た。抗体を２つの集団に分離し、ＦＩＴＣ又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７の蛍光色素を集団の抗体に夫々結合することによって、蛍光色素が結合した抗サイトケラチン抗体の集団を２つ生成した。ＨＴ−２９結腸腺癌細胞をＡＴＣＣから得た（ＡＴＣＣ ＨＴＢ３８）。
血液試料を１×ＢＤ ＦＡＣＳ溶解液を使用して溶解した。試料を、１×ＢＤ ＦＡＣＳ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ２を使用して透過処理した。全てのフローサイトメトリーアッセイを、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）フローサイトメータを使用して実施した。全ての試薬及び材料を、製造元のプロトコルに従って使用した。
実施例１：血液試料中の腫瘍細胞の検出
正常なドナーの静脈血を、ヘパリンナトリウムを含むＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ管に採取した。ＨＴ−２９腫瘍細胞を、血液試料に濃度（ｉ）１０，０００ＨＴ−２９細胞／ｍＬ、濃度（ｉｉ）１，０００ＨＴ−２９細胞／ｍＬ、濃度（ｉｉｉ）１００ＨＴ−２９細胞／ｍＬ、又は濃度（ｉｖ）０ＨＴ−２９細胞／ｍＬで添加した。４つの試料の各々について、７．５ｍＬを抜き取り、ＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ ＣＰＴ管中でスピンさせＷＢＣ部分を分離した。ＣＰＴ試料調製技術は、溶解及び遠心分離を使用するプロトコルと同様であった（図１０Ａ及び図１０Ｂ）。次いで、ＷＢＣ分画を固定し、透過処理し、ＣＫ−ＦＩＴＣ及びＣＫ−Ａｌｅｘａ６４７で６０分間染色してＦＡＣＳで解析した（図３）。
ＡＰＣチャネル（ｙ軸）対ＦＩＴＣチャネル（ｘ軸）の得られた密度プロット（図４のパネルＡ〜Ｄ）は、ＨＴ−２９腫瘍細胞の出発濃度が（ｉ）１０，０００ＨＴ−２９細胞／ｍＬ（パネルＡ）、（ｉｉ）１，０００ＨＴ−２９細胞／ｍＬ（パネルＢ）、及び（ｉｉｉ）１００ＨＴ−２９細胞／ｍＬ（パネルＣ）である試料中の細胞集団を示す。各プロットで観察された細胞の数は、ＨＴ−２９腫瘍細胞の出発濃度に比例して減少した。ＨＴ−２９腫瘍細胞の出発濃度が０細胞／ｍＬの場合、細胞は観察されなかった（パネルＤ）。
ＨＴ−２９腫瘍細胞は、ＷＢＣの背景レベルが高い場合でも検出することができた（図５のパネルＡ〜Ｃ）。ＨＴ−２９細胞を濃度１０，０００細胞／ｍＬで含有する血液試料（７．５ｍＬ）を１×ＦＡＣＳ溶解液で溶解し、１×ＢＤ ＦＡＣＳ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ２で透過処理し、洗浄し、次いで０．５５ｍＬ Ｒｘ体積のＣＫ Ａｂ−ＦＩＴＣ及びＣＫ Ａｂ−Ａ６４７の結合体で染色し、この混合物０．３６ｍＬを、更なる洗浄はせずに中流速（３６μＬ／分）にてＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）フローサイトメータで計数した。３４，３６３，６３６個のＷＢＣを背景に、１個のＨＴ−２９腫瘍細胞が観察され、（パネルＡ〜Ｂ）、１５分の稼働中に「緩衝液のみ」には偽陽性のドットが記録されなかった（パネルＣ）。
偽陽性の事象からのＨＴ−２９細胞の識別は、少なくとも第１及び第２の結合部材の検出を必要とすることで改善された。例えば、ＨＴ−２９腫瘍細胞は、１つの結合部材のみの結合しか観察されない非特異的な事象からは容易に検出することができなかった（図６のパネルＡ〜Ｂ、図７のパネルＡ〜Ｂ）。第１及び第２の結合部材の検出を必要とすることにより、狭い対角線上に下降するドットプロットが得られ、ＨＴ−２９細胞が容易に特定され（図６のパネルＣ）、同時に偽陽性の事象が排除された（図７のパネルＣ）。
撮像によって、１つの結合部材のみの測定では、多くの偽陽性の事象が観察され得ることが更に明らかになった。例えば、図８のパネルＡ〜Ｃは、種々の出発濃度でのＨＴ−２９腫瘍細胞の画像を示す。ＷＢＣ及びＨＴ−２９腫瘍細胞を含有する試料を、ＣＫ−ＦＩＴＣ及びＣＫ−ＰＥで染色した。ＨＴ−２９細胞は、濃度５，０００細胞／ｍＬ（パネルＡ）、５００細胞／ｍＬ（パネルＢ）、又は０．０細胞／ｍＬ（パネルＣ）で存在した。ＰＥチャネルでは、ＨＴ−２９細胞の濃度が０．０細胞／ｍＬ（パネルＣ）の場合でも事象が観察された。
ＺＥＩＳＳ顕微鏡及び水銀灯を使用して個々の細胞を更に撮像した（図９のパネルＡ〜Ｂ）。試料を上記の通り調製し、個々の細胞を、水銀灯を使用したＺＥＩＳＳ顕微鏡を使用して撮像した。ＦＩＴＣチャネルから撮像した画像では、個々の細胞中のＣＫ−ＦＩＴＣの存在が明らかになり、ＡＰＣチャネルでは個々の細胞中のＣＫ−Ａｌｅｘａ６４７の存在が明らかになり、重ね合わせでは細胞中に存在するＣＫ−ＦＩＴＣ及びＣＫ−Ａｌｅｘａ６４７の両方が示された（パネルＢの右の画像）。各試料につき１００画像を撮像した。
上記の発明は、理解の明瞭化のために、図示及び例示によりある程度詳しく説明されているが、ある変更及び調整が、添付の請求項の趣旨又は範囲から逸脱することなく本発明になされてもよいことが、本発明の教示を考慮すると当業者に容易に明らかとなる。
従って、前述の内容は本発明の本質を単に示しているに過ぎない。本明細書に明示的に説明されていないか又は示されていないが、本発明の本質を具体化して本発明の趣旨及び範囲に含まれる様々な構成を当業者が考案することが可能であることは明らかである。更に、本明細書に述べられている全ての実施例及び条件的な用語は、本発明の本質を理解する際に読者を支援することを本質的に意図するものであり、このように具体的に述べられた実施例及び条件に限定するものではない。更に、本発明の本質、態様及び実施形態だけでなく、本発明の具体的な実施例を述べている本明細書における全ての記載は、本発明の構造的且つ機能的な等価物の両方を含むことを意図するものである。加えて、このような均等物は、現時点で既知の均等物及び今後開発される均等物の両方、すなわち構造に関わらず同一の機能を有する開発された全ての要素を含むことを意図するものである。従って、本発明の範囲は、本明細書に示され説明された例示的な実施形態に限定されることを意図するものではない。むしろ、本発明の範囲及び趣旨は、添付の特許請求の範囲により具体化される。
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２０１１年９月６日に出願された米国仮特許出願第６１／５３１５７５号明細書の出願日の優先権を主張している。その開示は参照によって本明細書に組み込まれる。

Claims (15)

  1. 試料中の循環腫瘍細胞を検出する方法であって、
    前記循環腫瘍細胞の同一のマーカに特異的に結合する、識別可能に標識が付された第１及び第２の結合部材に前記試料を接触させるステップと、
    前記試料のサイトメトリーアッセイにより、結合した第１及び第２の結合部材を含む細胞の存在を分析して、前記試料中の前記循環腫瘍細胞を検出するステップと
    を有することを特徴とする方法。
  2. 前記第１及び第２の結合部材は、抗体又は該抗体の抗原結合性フラグメントであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. 前記抗体又は該抗体の抗原結合性フラグメントは、前記マーカの同一のエピトープに結合することを特徴とする請求項２に記載の方法。
  4. 前記第１及び第２の結合部材に蛍光標識を付すことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  5. 前記第１及び第２の結合部材に標識を直接付すことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  6. 前記試料中の非循環腫瘍細胞に標識を付さないことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  7. 前記試料中の有核細胞を透過処理剤で透過処理するステップを更に有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
  8. 前記マーカはサイトケラチンであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  9. 前記マーカは、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６１、ＣＤ６４、ＣＤ７１、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ１０３、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ２７１、ＣＤ３０３、ＣＤ３０４、ｂｃｌ−２、ＴｄＴ、ＦＭＣ７、グリコホリンＡ、サイトケラチン、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＢ４、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、ＨＥＲ２及びＭＵＣ−１から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  10. 前記試料は全血であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  11. 前記試料をヒトから得ることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  12. マーカを含む循環腫瘍細胞、及び
    該循環腫瘍細胞の同一のマーカに特異的に結合する、識別可能に標識が付された第１及び第２の結合部材
    を含むことを特徴とする細胞試料。
  13. 循環腫瘍細胞を含む試料を、該循環腫瘍細胞の同一のマーカに特異的に結合する、識別可能に標識が付された第１及び第２の結合部材に接触させるように構成され、前記試料中の非循環腫瘍細胞は標識が付されていないサイトメトリー試料流体サブシステム、及び
    該サイトメトリー試料流体サブシステムに流体的に連結されたサイトメータ
    を備えていることを特徴とするサイトメトリーシステム。
  14. 循環腫瘍細胞を含む試料を、該循環腫瘍細胞の同一のマーカに特異的に結合する、識別可能に標識が付された第１及び第２の結合部材に接触させるように構成されたサイトメトリー試料流体サブシステム、及び
    該サイトメトリー試料流体サブシステムに流体的に連結され、前記試料のアッセイにより、結合した第１及び第２の結合部材を含む細胞の存在を分析して、前記試料中の前記循環腫瘍細胞を検出するように構成されたサイトメータ
    を備えていることを特徴とするサイトメトリーシステム。
  15. 試料中の循環腫瘍細胞を特定するためのキットであって、
    前記循環腫瘍細胞の同一のマーカに特異的に結合する、識別可能に標識が付された第１及び第２の結合部材、及び
    前記試料のサイトメトリーアッセイにより、結合した第１及び第２の結合部材を含む細胞の存在を分析して、前記試料中の前記循環腫瘍細胞を検出するための前記第１及び第２の結合部材の使用説明
    を備えていることを特徴とするキット。
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