JPH02103464A - サンプル中の損傷細胞及びインタクト細胞を識別するための方法 - Google Patents
サンプル中の損傷細胞及びインタクト細胞を識別するための方法Info
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- JPH02103464A JPH02103464A JP1150348A JP15034889A JPH02103464A JP H02103464 A JPH02103464 A JP H02103464A JP 1150348 A JP1150348 A JP 1150348A JP 15034889 A JP15034889 A JP 15034889A JP H02103464 A JPH02103464 A JP H02103464A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、インタクト（損傷を受けていない）細胞及び
損傷を受けた細胞を識別する方法に関し、更に詳細には
、インタクト細胞及び損傷細胞が核酸染色により差別的
に染色される、抹消血中のインタクト細胞及び損傷細胞
を識別するための方法に関する。
損傷を受けた細胞を識別する方法に関し、更に詳細には
、インタクト細胞及び損傷細胞が核酸染色により差別的
に染色される、抹消血中のインタクト細胞及び損傷細胞
を識別するための方法に関する。
（従来の技術）
造血系中の細胞型の検出及び同定は長い間に渡り有益な
研究用及び臨床用道具であった。数多くの自動化方法が
研究者や臨床医を助けるために存在している。これらの
方法の中にはフローサイトメトリー及び蛍光顕微鏡検査
法がある。最近、前者の方法は益々精巧化してきており
、細胞型及び一つの細胞型内での種々の機能及び／又は
成熟サブセットの同定もしくは識別のための補助的道具
として一般に認められてきている。
研究用及び臨床用道具であった。数多くの自動化方法が
研究者や臨床医を助けるために存在している。これらの
方法の中にはフローサイトメトリー及び蛍光顕微鏡検査
法がある。最近、前者の方法は益々精巧化してきており
、細胞型及び一つの細胞型内での種々の機能及び／又は
成熟サブセットの同定もしくは識別のための補助的道具
として一般に認められてきている。
フローサイトメーターは、検知区域を通過する個々の細
胞上の複数の独立のパラメーターを検出することにより
不均質なサンプル中の白血球の異なる集団を同定するた
めに使用されていたものであり、それについては米国特
許第４，６６１，９１３号、第４，２８４，４１２号及
び第３，８２６，３６４号明細書並びにヘルゼンベルグ
（Ｈｅｒｘｅｎｂｅｒｇ）らのサイ・アム（Ｓｃｉ、＾
ｍ、）２３４＋１０８ （１９７６）の記載により一般
的に説明されている。典型的には、これらのパラメータ
ーは前方散乱光（ＦＬＳ、これは相対的粒子サイズの測
定である）、直角方向散乱光（ＯＬ Ｓ 、これは相対
的な顆粒性（ｇｒｉｎｕｌｘｒｉｔｙ）の測定である）
及び蛍光を含んでいる。蛍光は核酸もしくは他の活性染
色を取り込んだ細胞から測定されるか、又は後述するよ
うに、例えば米国特許第４，５２０，１１０号明細書、
蛍光色素と直接的もしくは間接的に結合したモノクロナ
ール抗体（ＭＡｂ）で標識された表面マーカーを持って
いる細胞から測定されるかもしれない。
胞上の複数の独立のパラメーターを検出することにより
不均質なサンプル中の白血球の異なる集団を同定するた
めに使用されていたものであり、それについては米国特
許第４，６６１，９１３号、第４，２８４，４１２号及
び第３，８２６，３６４号明細書並びにヘルゼンベルグ
（Ｈｅｒｘｅｎｂｅｒｇ）らのサイ・アム（Ｓｃｉ、＾
ｍ、）２３４＋１０８ （１９７６）の記載により一般
的に説明されている。典型的には、これらのパラメータ
ーは前方散乱光（ＦＬＳ、これは相対的粒子サイズの測
定である）、直角方向散乱光（ＯＬ Ｓ 、これは相対
的な顆粒性（ｇｒｉｎｕｌｘｒｉｔｙ）の測定である）
及び蛍光を含んでいる。蛍光は核酸もしくは他の活性染
色を取り込んだ細胞から測定されるか、又は後述するよ
うに、例えば米国特許第４，５２０，１１０号明細書、
蛍光色素と直接的もしくは間接的に結合したモノクロナ
ール抗体（ＭＡｂ）で標識された表面マーカーを持って
いる細胞から測定されるかもしれない。
これらのパラメーターを組み合わせ、比較することによ
って、種々の白血球成分を区別することができる。
って、種々の白血球成分を区別することができる。
米国特許第４，７２７，０２０号明細書は、どのように
してフローサイトメーターが作動し、そしてとのように
して白血球亜集団の同定に使用できるか一つの例が提供
している。溶解していない全血か第１のＣＤ ４ ”Ｔ
細胞に対して特異的なフィコエリトリン（Ｐ Ｅ）と結
合したＭＡｂ及び第２のＣＤ８＋Ｔ細胞に対して特異的
なフルオレセインイソチオンアネート（ＦＩＴＣ）と結
合したＭＡｂで処理された。核酸染料、ＬＤＳ−７５１
（励起子）か有核白血球を同定するために添加された。
してフローサイトメーターが作動し、そしてとのように
して白血球亜集団の同定に使用できるか一つの例が提供
している。溶解していない全血か第１のＣＤ ４ ”Ｔ
細胞に対して特異的なフィコエリトリン（Ｐ Ｅ）と結
合したＭＡｂ及び第２のＣＤ８＋Ｔ細胞に対して特異的
なフルオレセインイソチオンアネート（ＦＩＴＣ）と結
合したＭＡｂで処理された。核酸染料、ＬＤＳ−７５１
（励起子）か有核白血球を同定するために添加された。
そして、標識された細胞はフローサイトメトリにより分
析された。ゲートはＬＤＳ−７５１＋細胞について設定
された（即ち、有核白血球についてであり、それにより
赤血球及び血小板を排除している）。その方法は、測定
された種々のパラメーターを比較することによって白血
球亜集団（サブポピユレーション）の分離を可能にしＩ
；。
析された。ゲートはＬＤＳ−７５１＋細胞について設定
された（即ち、有核白血球についてであり、それにより
赤血球及び血小板を排除している）。その方法は、測定
された種々のパラメーターを比較することによって白血
球亜集団（サブポピユレーション）の分離を可能にしＩ
；。
しかしながら、蛍光的な標識ＭＡｂ及び／又は核酸染料
の使用をする全ての方法において一つの固有の問題があ
り、それは標識がサンプル中の損傷細胞又は細胞破砕物
に無差別に結合する傾向を有していることである。この
問題は、標識する細胞を調製するために、その細胞は幾
つかの調製処理法により処理されなければならず、それ
ら全ての調製法はどのようなサンプル中であっても損傷
され若しくは破裂される細胞の数及び比率を増加させる
という事実により倍加される。これらの損傷細胞及び関
連細胞破砕物並びにそれらに伴う蛍光は、残存している
インタクト細胞を十分に検査するためにサンプル全体に
対して識別しなければならない。あるサンプル中の細胞
調製に用いられる方法によって及び同じ方法を用いたサ
ンプル間おいてさえも、サンプル調製はその系にかなり
の変動を与える。結果として、細胞の免疫蛍光分析に使
用される方法は損傷細胞を測定対象である亜集団の一部
として誤って同定してしまうことになる。
の使用をする全ての方法において一つの固有の問題があ
り、それは標識がサンプル中の損傷細胞又は細胞破砕物
に無差別に結合する傾向を有していることである。この
問題は、標識する細胞を調製するために、その細胞は幾
つかの調製処理法により処理されなければならず、それ
ら全ての調製法はどのようなサンプル中であっても損傷
され若しくは破裂される細胞の数及び比率を増加させる
という事実により倍加される。これらの損傷細胞及び関
連細胞破砕物並びにそれらに伴う蛍光は、残存している
インタクト細胞を十分に検査するためにサンプル全体に
対して識別しなければならない。あるサンプル中の細胞
調製に用いられる方法によって及び同じ方法を用いたサ
ンプル間おいてさえも、サンプル調製はその系にかなり
の変動を与える。結果として、細胞の免疫蛍光分析に使
用される方法は損傷細胞を測定対象である亜集団の一部
として誤って同定してしまうことになる。
サンプル中の細胞がインタクトであるか損傷を受けてい
るかを測定するための種々の方法が存在する。生きてい
る、インタクト細胞はフルオレセインジアセテート（Ｆ
ＤＡ）又はヨウ化プロピジウム（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ）
（Ｐ Ｉ ）のどちらかを用いることによって死細胞
から区別することができる。これらの方法においては、
サンプルはＦＤＡ又はＰＩのどちらかで処理され、そし
て蛍光について検査される。ＦＤＡで染色された細胞は
“生きている′と判断され、ＰＩで染色された細胞は“
死んでいる″と判断される。しかし、この方法は、もし
染色が生きている細胞の同定に用いないならば細胞を固
定することができないという制限がある。
るかを測定するための種々の方法が存在する。生きてい
る、インタクト細胞はフルオレセインジアセテート（Ｆ
ＤＡ）又はヨウ化プロピジウム（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ）
（Ｐ Ｉ ）のどちらかを用いることによって死細胞
から区別することができる。これらの方法においては、
サンプルはＦＤＡ又はＰＩのどちらかで処理され、そし
て蛍光について検査される。ＦＤＡで染色された細胞は
“生きている′と判断され、ＰＩで染色された細胞は“
死んでいる″と判断される。しかし、この方法は、もし
染色が生きている細胞の同定に用いないならば細胞を固
定することができないという制限がある。
ＦＤＡを使用する場合の他の制限は、それは明るい蛍光
を有しているために、ＦＩＴＣ及びＰＨのような他の染
色からの免疫蛍光を打ち消してしまいそれらを読み取れ
なくしてしまうことである。
を有しているために、ＦＩＴＣ及びＰＨのような他の染
色からの免疫蛍光を打ち消してしまいそれらを読み取れ
なくしてしまうことである。
インタクト細胞をそのような染料の使用をしないで検出
する方法も存在している。例えばフローサイトメトリー
によるＦＬＳは、サンプル中の細胞が均質な集団から由
来しているときにはインタクト及び損傷細胞を識別する
のに使用することができる。均質ではない集団からの細
胞は、細胞の大きさ及び散乱光の特性の変動のために識
別することはできない。
する方法も存在している。例えばフローサイトメトリー
によるＦＬＳは、サンプル中の細胞が均質な集団から由
来しているときにはインタクト及び損傷細胞を識別する
のに使用することができる。均質ではない集団からの細
胞は、細胞の大きさ及び散乱光の特性の変動のために識
別することはできない。
上記の各方法は、不均質なサンプル中の損傷及びインタ
クト細胞の識別についての一般的方法として適用できな
いという欠点がある。結論として、研究者及び臨床医が
個体から採取された不均質な細胞サンプルを検査して、
そしてサンプル中の損傷を受けた細胞及びインタクト細
胞を識別できるようにする単一の方法は存在しない。
クト細胞の識別についての一般的方法として適用できな
いという欠点がある。結論として、研究者及び臨床医が
個体から採取された不均質な細胞サンプルを検査して、
そしてサンプル中の損傷を受けた細胞及びインタクト細
胞を識別できるようにする単一の方法は存在しない。
（発明の構成）
本発明は体液サンプル中のインタクト細胞及び損傷を受
けた細胞を識別するための方法からなる。
けた細胞を識別するための方法からなる。
本方法は：ｌ）個体から体液サンプルを採取すること；
２）核酸染料を前記サンプルに添加すること；及び３）
前記サンプル中の細胞を、該細胞を一度に実質的に１個
で検知区域を通過させることができ、且つ個々の細胞か
らの蛍光及び散乱光の両方を検出及び記録することので
きる自動化装置において分析すること：の各工程からな
る。
２）核酸染料を前記サンプルに添加すること；及び３）
前記サンプル中の細胞を、該細胞を一度に実質的に１個
で検知区域を通過させることができ、且つ個々の細胞か
らの蛍光及び散乱光の両方を検出及び記録することので
きる自動化装置において分析すること：の各工程からな
る。
好適な実施態様においては、体液サンプルは、赤血球が
溶解された抹消全血からなり、核酸染料はＤＮＡについ
ての優先的染色を含み、そしてそれは放出される蛍光の
量に基づいて損傷を受けた細胞及びインタクト細胞を識
別することもできる。
溶解された抹消全血からなり、核酸染料はＤＮＡについ
ての優先的染色を含み、そしてそれは放出される蛍光の
量に基づいて損傷を受けた細胞及びインタクト細胞を識
別することもできる。
この方法は細胞型を同定するための他の方法と組み合わ
せると特に有益であることは当業者にとっては容易に理
解されるであろう（例えば、蛍光的に標識されたＭＡｂ
を使用する場合）。そのような他の方法の例には活性化
細胞の監視に関する米国特許第４，５９９，３０４号に
記載されているものがある。その場合、ＭＡｂの標識に
使用された蛍光色素及び核酸染料の各放出スペクトルピ
ークは重ならないように十分に異ならなければならない
ことが更に認識されるであろう。同様に、蛍光標識の全
てが同一の波長で励起されることが望ましい。これは、
米国特許第４．７２７．０２０号明細書に記載されてい
るように２重レーザー源を必要とするのと対照的にフロ
ーサイトメタ−において単一レーザー源の使用を可能に
する。
せると特に有益であることは当業者にとっては容易に理
解されるであろう（例えば、蛍光的に標識されたＭＡｂ
を使用する場合）。そのような他の方法の例には活性化
細胞の監視に関する米国特許第４，５９９，３０４号に
記載されているものがある。その場合、ＭＡｂの標識に
使用された蛍光色素及び核酸染料の各放出スペクトルピ
ークは重ならないように十分に異ならなければならない
ことが更に認識されるであろう。同様に、蛍光標識の全
てが同一の波長で励起されることが望ましい。これは、
米国特許第４．７２７．０２０号明細書に記載されてい
るように２重レーザー源を必要とするのと対照的にフロ
ーサイトメタ−において単一レーザー源の使用を可能に
する。
核酸染料及びｌもしくは複数のＭＡｂを別々に含んでい
る容器のセットからなるキットが開示されている。
る容器のセットからなるキットが開示されている。
以下に図面について説明する。第１図は、赤血球が除か
れた全血からの固定されたＰＢＬ （抹消血白血球）に
ついてＯＬＳとＦＬＳ （Ａ、Ｃ−Ｅ）及びｌｏｇＬＤ
ｓ−７５１蛍光とＦＬＳ （Ｂ）の°゛ドツト″゛プＯ
−フト数種相関を表している。
れた全血からの固定されたＰＢＬ （抹消血白血球）に
ついてＯＬＳとＦＬＳ （Ａ、Ｃ−Ｅ）及びｌｏｇＬＤ
ｓ−７５１蛍光とＦＬＳ （Ｂ）の°゛ドツト″゛プＯ
−フト数種相関を表している。
ｖｇ２図は、ＯＬＳとＦＬＳ （Ａ、Ｄ） 、Ｉｏｇｌ
−ＤＳ−７５１蛍光とＦＬＳ （Ｂ）及びＩｏｇＬ Ｄ
Ｓ−７５１蛍光と １ｏ（Ｆ Ｄ Ａ蛍光（Ｃ，Ｅ）
の数種のドツトプロットを表している。ＰＢＬは固定さ
れていない。
−ＤＳ−７５１蛍光とＦＬＳ （Ｂ）及びＩｏｇＬ Ｄ
Ｓ−７５１蛍光と １ｏ（Ｆ Ｄ Ａ蛍光（Ｃ，Ｅ）
の数種のドツトプロットを表している。ＰＢＬは固定さ
れていない。
第３図は、第２図と同様に同一の個体から調製された細
胞について第２図と同様の数種のドツトプロットを表し
ているが、細胞はＬＤＳ−７５１及びＦＤＡで染色され
る前に４８時間保持されてい ｔこ 。
胞について第２図と同様の数種のドツトプロットを表し
ているが、細胞はＬＤＳ−７５１及びＦＤＡで染色され
る前に４８時間保持されてい ｔこ 。
第４図は、以下の２種のＭＡｂと反応させた赤血球が除
去された全血について１ｏｇＣＤ ５ （Ｐ Ｅ ）蛍
光とＣＤ２０ （ＦＩＴＣ）蛍光（Ａ、Ｃ％Ｅ）、ｌｏ
ｇＬＤＳ −７５１蛍光とＦＬＳ（Ｂ）及びＦＬＳと０
ＬＳ（Ｄ）の数種のドツトプロットを表している。
去された全血について１ｏｇＣＤ ５ （Ｐ Ｅ ）蛍
光とＣＤ２０ （ＦＩＴＣ）蛍光（Ａ、Ｃ％Ｅ）、ｌｏ
ｇＬＤＳ −７５１蛍光とＦＬＳ（Ｂ）及びＦＬＳと０
ＬＳ（Ｄ）の数種のドツトプロットを表している。
第５図は、細胞がＣＤＩ ｌ ｂ （ＰＲ）及びＣＤ１
５（ＦＩＴＣ）でも染色されている第１図と同様の数種
のドツトプロットを表している。
５（ＦＩＴＣ）でも染色されている第１図と同様の数種
のドツトプロットを表している。
第６図は、第５図に示されているのと同様の赤血球が除
去されている全血からの固定されたＰＢＬについて ｔ
ｏＩＣＤ １ ｌ ｂ （Ｐ Ｅ）蛍光と ｌｏｇｃＤ
１５（ＦＩＴＣ）蛍光（Ａ、Ｃ−Ｅ）及びｌｏｇＬＤＳ
−７５１蛍光とＦＬＳ（Ｂ）の数種のドツトプロットを
表している。
去されている全血からの固定されたＰＢＬについて ｔ
ｏＩＣＤ １ ｌ ｂ （Ｐ Ｅ）蛍光と ｌｏｇｃＤ
１５（ＦＩＴＣ）蛍光（Ａ、Ｃ−Ｅ）及びｌｏｇＬＤＳ
−７５１蛍光とＦＬＳ（Ｂ）の数種のドツトプロットを
表している。
本発明は体液中の細胞型の同定及びそれらの識別のだめ
の方法からなる。好ましくは、体液は赤血球が除去され
た抹消血である：しかしながら、腹膜、を髄及び脳液、
並びに尿などからサンプルを採取できる。更に、骨髄、
リンパ節、肝臓、肺臓及び胸腺の細胞懸濁液を使用する
ことができる。
の方法からなる。好ましくは、体液は赤血球が除去され
た抹消血である：しかしながら、腹膜、を髄及び脳液、
並びに尿などからサンプルを採取できる。更に、骨髄、
リンパ節、肝臓、肺臓及び胸腺の細胞懸濁液を使用する
ことができる。
本方法は：
１）体液サンプルを個体から採取すること：２）蛍光核
酸染料を前記サンプルに添加すること；及び ３）サンプル中の細胞を、前記細胞を一度に実質的に１
個づつ検知区域を通過させること及び検知区域を通過す
る各細胞からの蛍光及び散乱光の両方を検出、記録でき
る自動化装置中で分析すること； の各工程からなっている。
酸染料を前記サンプルに添加すること；及び ３）サンプル中の細胞を、前記細胞を一度に実質的に１
個づつ検知区域を通過させること及び検知区域を通過す
る各細胞からの蛍光及び散乱光の両方を検出、記録でき
る自動化装置中で分析すること； の各工程からなっている。
本方法は、核酸染料で染色する前にＭＡｂをサンプルに
添加する工程を含むように拡張することができる。１も
しくは１以上のＭＡｂを体液中の細胞表面抗原又は細胞
の検出に使用することができる。本方法は使用されるＭ
Ａｂ又は検出されるべき細胞表面抗原によって制限され
ない；しかしなから、あるＭＡｂの組み合わせは本発明
の実施において有益であり、１９８７年１１月３０日に
米国出願された米国出願番号１２６，３３３号明細書に
述べられているような組み合わせを含んでいる。そのＭ
Ａｂを当業者にはよく知られた方法により１もしくは１
以上の蛍光色素により直接的もしくは間接的に標識する
ことができる。ＭＡｂは直接的に標識されることが好ま
しい。蛍光色素及び核酸染料のピーク放出スペクトル全
部が識別可能であることも好ましい。更に、自動化装置
において単一レーザー源が使用される場合には全ての蛍
光性物質が実質的に同一波長（例えば、アルゴンレーザ
ーを使用するときは４８８ｎｍである。）で励起可能で
あることが望ましい。もし２重レーザー源が使用される
ならば、それらの励起スペクトルは異なる。
添加する工程を含むように拡張することができる。１も
しくは１以上のＭＡｂを体液中の細胞表面抗原又は細胞
の検出に使用することができる。本方法は使用されるＭ
Ａｂ又は検出されるべき細胞表面抗原によって制限され
ない；しかしなから、あるＭＡｂの組み合わせは本発明
の実施において有益であり、１９８７年１１月３０日に
米国出願された米国出願番号１２６，３３３号明細書に
述べられているような組み合わせを含んでいる。そのＭ
Ａｂを当業者にはよく知られた方法により１もしくは１
以上の蛍光色素により直接的もしくは間接的に標識する
ことができる。ＭＡｂは直接的に標識されることが好ま
しい。蛍光色素及び核酸染料のピーク放出スペクトル全
部が識別可能であることも好ましい。更に、自動化装置
において単一レーザー源が使用される場合には全ての蛍
光性物質が実質的に同一波長（例えば、アルゴンレーザ
ーを使用するときは４８８ｎｍである。）で励起可能で
あることが望ましい。もし２重レーザー源が使用される
ならば、それらの励起スペクトルは異なる。
好適な核酸染料はＤＮＡに対し優先性を有しており、そ
れはインタクト細胞及び損傷細胞について異なった蛍光
強度を有している。このようにして、無核細胞、例えば
赤血球及び血小板は染色されない（又は僅かしか染色さ
れない）ので、有核細胞（例えば、白血球）は蛍光強度
に基づいて無核細胞から識別される。好ましい実施態様
においては、染料はＬＤＳ−７５１である；しかしなが
ら、米国特許第４，５４４，５４６号明細書に開示され
ているようなりＮＡに対して優先性を有している他の染
料も使用することかできる。使用される染料の量及び細
胞が染料で染色される時間は動的現象の結果としての異
なった染色を避けるのに十分でなければならない。２４
時間は十分すぎる時間である。
れはインタクト細胞及び損傷細胞について異なった蛍光
強度を有している。このようにして、無核細胞、例えば
赤血球及び血小板は染色されない（又は僅かしか染色さ
れない）ので、有核細胞（例えば、白血球）は蛍光強度
に基づいて無核細胞から識別される。好ましい実施態様
においては、染料はＬＤＳ−７５１である；しかしなが
ら、米国特許第４，５４４，５４６号明細書に開示され
ているようなりＮＡに対して優先性を有している他の染
料も使用することかできる。使用される染料の量及び細
胞が染料で染色される時間は動的現象の結果としての異
なった染色を避けるのに十分でなければならない。２４
時間は十分すぎる時間である。
多種多様な装置が自動化装置の要求を満たすことができ
る。好ましくは、装置は単一のレーザー源ヲ有するフロ
ーサイトメーターからなる。好ましい単一レーザー源は
４８８ｎｍに調整されたアルゴンレーザーである。フロ
ーサイトメーターは、例えばデータの少なくとも５種の
パラメーターを種々の組み合わせでリストし、保存しそ
して分析するのに十分なソフトウェア−を持つパーソナ
ルコンピューターのようなデータ保存及び分析手段を更
に含んでいても良い。本発明の実施に有益なフローサイ
トメーターの例にはＦＡＣ５４４０”ＦＡＣ５ｃａｎ”
及びＦＡＣ５ｔａｒ”（商標）がある（これらは全てベ
クトン・ディキンソン・イムノサイトメトリー・システ
ムズ（ＢｃｃｊｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ １ｍｍｕｎｏ
ｃｙｔｏｍＣｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＢＤＩＳ））か
ら販売されている）。パーソナルコンピューター及び適
当なソフトウェア−の例にはコンソート（Ｃｏｎｓｏｒ
ｔ） ３０データマネジメントシステムズ（ＢＤＩＳ）
及びＦＡＣ５ｃａｎリサーチ又はＰａ ｉ ｎ ｔ −
Ａ−Ｇａ ｔ ｅ”ソフトウェア−（ＢＤＩＳ）がある
。
る。好ましくは、装置は単一のレーザー源ヲ有するフロ
ーサイトメーターからなる。好ましい単一レーザー源は
４８８ｎｍに調整されたアルゴンレーザーである。フロ
ーサイトメーターは、例えばデータの少なくとも５種の
パラメーターを種々の組み合わせでリストし、保存しそ
して分析するのに十分なソフトウェア−を持つパーソナ
ルコンピューターのようなデータ保存及び分析手段を更
に含んでいても良い。本発明の実施に有益なフローサイ
トメーターの例にはＦＡＣ５４４０”ＦＡＣ５ｃａｎ”
及びＦＡＣ５ｔａｒ”（商標）がある（これらは全てベ
クトン・ディキンソン・イムノサイトメトリー・システ
ムズ（ＢｃｃｊｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ １ｍｍｕｎｏ
ｃｙｔｏｍＣｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＢＤＩＳ））か
ら販売されている）。パーソナルコンピューター及び適
当なソフトウェア−の例にはコンソート（Ｃｏｎｓｏｒ
ｔ） ３０データマネジメントシステムズ（ＢＤＩＳ）
及びＦＡＣ５ｃａｎリサーチ又はＰａ ｉ ｎ ｔ −
Ａ−Ｇａ ｔ ｅ”ソフトウェア−（ＢＤＩＳ）がある
。
蛍光顕微鏡を自動化装置と置き換えることができること
は当業者には明らかであろう。この場合、細胞の手動カ
ウント及び同定が必要である。
は当業者には明らかであろう。この場合、細胞の手動カ
ウント及び同定が必要である。
実施例
健康な個体からの抹消血を、抗凝固剤としてＥ Ｄ Ｔ
Ａ （Ｋ ３）を含んでいるバタテイナー（ｖ！ｃｕ
ｔａｉｎｅｒ）チューブ（ベクトン・デイキンソン）に
静脈穿刺によって採取した。赤血球はＮＨ，Ｃ１で溶解
された。血液ｌ容量を１％ＮＨ，ＣＩのＨ２０溶液（ｐ
Ｈ７，３）１５容量と混合し、そして緩やかに混合した
。細胞は３〜５分間溶解され、２００Ｇで５分間室温で
遠心分離した。ベレットを最初の血液容量の１４倍の容
量のＲＰＭ１１６４０（ライツタ力−（ｗｈ口ｔａｋｅ
ｒ））で再懸濁し、２００Ｇで５分間遠心分離した。こ
の洗浄工程は２回繰り返し、そして細胞を最終的には１
％ウシ血清アルブミン、ｌｏ’ｌＥペニシリン／ ｍ
Ｑ 。
Ａ （Ｋ ３）を含んでいるバタテイナー（ｖ！ｃｕ
ｔａｉｎｅｒ）チューブ（ベクトン・デイキンソン）に
静脈穿刺によって採取した。赤血球はＮＨ，Ｃ１で溶解
された。血液ｌ容量を１％ＮＨ，ＣＩのＨ２０溶液（ｐ
Ｈ７，３）１５容量と混合し、そして緩やかに混合した
。細胞は３〜５分間溶解され、２００Ｇで５分間室温で
遠心分離した。ベレットを最初の血液容量の１４倍の容
量のＲＰＭ１１６４０（ライツタ力−（ｗｈ口ｔａｋｅ
ｒ））で再懸濁し、２００Ｇで５分間遠心分離した。こ
の洗浄工程は２回繰り返し、そして細胞を最終的には１
％ウシ血清アルブミン、ｌｏ’ｌＥペニシリン／ ｍ
Ｑ 。
１００Ｕ／ｍＱストレプトマイシン及び２０ｍＭのＨｅ
ｐｅｓを含むリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７，３）（Ｐ Ｂ
Ｓ）中に再懸濁した。残っている抹消血白血球（Ｐ
Ｂ Ｌ）の細胞濃度をｌＸｌ０’／ｍαに調整した。
ｐｅｓを含むリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７，３）（Ｐ Ｂ
Ｓ）中に再懸濁した。残っている抹消血白血球（Ｐ
Ｂ Ｌ）の細胞濃度をｌＸｌ０’／ｍαに調整した。
ＭＡｂをサンプルに添加する場合、予め力価測定された
ＭＡｂ２０μＣを細胞懸濁液１００μａに添加した。氷
上で２０分間インキュベーションした後、細胞を４°Ｃ
のＰＢＳ溶液溶液２マＱ回洗浄した。必要に応じて、そ
の染色方法を第２のＭＡｂについても繰り返した。免疫
蛍光標識された細胞のペレットを１％パラホルムアルデ
ヒドを含むＰＢＳ１ｍｌ！中に再懸濁した。
ＭＡｂ２０μＣを細胞懸濁液１００μａに添加した。氷
上で２０分間インキュベーションした後、細胞を４°Ｃ
のＰＢＳ溶液溶液２マＱ回洗浄した。必要に応じて、そ
の染色方法を第２のＭＡｂについても繰り返した。免疫
蛍光標識された細胞のペレットを１％パラホルムアルデ
ヒドを含むＰＢＳ１ｍｌ！中に再懸濁した。
０．２ ｍ ｇをメタノール１ｍＭに溶解することによ
って、ＬＤＳ−７５１の貯蔵溶液を調製した。
って、ＬＤＳ−７５１の貯蔵溶液を調製した。
貯蔵溶液０−５ ｍｌを含んでいる操作溶液を最終体積
５０ｍαの０１％アジドを含んでいるＰＢＳに希釈した
。ＬＤＳ−７５１操作溶液の１０μＣをパラホルムアル
デヒドで固定された細胞に添加し、そしてフローサイト
メトリー分析の前に一夜放置した。細胞懸濁液は細胞上
の免疫蛍光信号の減衰又は散乱光特性における変化なし
に少なくとも２週間保存することができる。
５０ｍαの０１％アジドを含んでいるＰＢＳに希釈した
。ＬＤＳ−７５１操作溶液の１０μＣをパラホルムアル
デヒドで固定された細胞に添加し、そしてフローサイト
メトリー分析の前に一夜放置した。細胞懸濁液は細胞上
の免疫蛍光信号の減衰又は散乱光特性における変化なし
に少なくとも２週間保存することができる。
ＬＤＳ−７５１及びＦＤＡから得られる蛍光信号に関連
する実験において、ＮＨ，ＣＩ溶解細胞は最終濃度ｌＸ
ｌ０６／ｍＱの濃度となるようにＲＰ Ｍ Ｉ中に再懸
濁された。分析の前に、細胞は細胞の最適散乱光特性が
得られるように１時間ＲＰ Ｍ Ｉ溶液中に保持された
。ＦＤＡ貯蔵溶液はＦＤＡ５ｍｇをアセトン１ｍ１１に
溶解することによって調製された。５μａの貯蔵溶液を
含むＦＤＡの操作溶液は最終体積５ｍ１２の０．１％ア
ジドを含むＰＢＳに希釈される。分析の１５分前に、Ｆ
ＤＡ操作溶液３０μｇを、新しいサンプルについては０
．２μｇ ／ ｍ Ｑ及び４８時間後の古いサンプルに
ついては０．１μｇ／ｍＱの最終濃度となるようにＬＤ
Ｓ−７５１を伴う細胞懸濁液１ｍＱにそれぞれ添加した
。
する実験において、ＮＨ，ＣＩ溶解細胞は最終濃度ｌＸ
ｌ０６／ｍＱの濃度となるようにＲＰ Ｍ Ｉ中に再懸
濁された。分析の前に、細胞は細胞の最適散乱光特性が
得られるように１時間ＲＰ Ｍ Ｉ溶液中に保持された
。ＦＤＡ貯蔵溶液はＦＤＡ５ｍｇをアセトン１ｍ１１に
溶解することによって調製された。５μａの貯蔵溶液を
含むＦＤＡの操作溶液は最終体積５ｍ１２の０．１％ア
ジドを含むＰＢＳに希釈される。分析の１５分前に、Ｆ
ＤＡ操作溶液３０μｇを、新しいサンプルについては０
．２μｇ ／ ｍ Ｑ及び４８時間後の古いサンプルに
ついては０．１μｇ／ｍＱの最終濃度となるようにＬＤ
Ｓ−７５１を伴う細胞懸濁液１ｍＱにそれぞれ添加した
。
ＭＡｂＦＩＴＣ標識Ｌｅｕ−Ｍｌ（ＢＤＩＳ）及びＰＥ
標識ＣＤ１ｌｂ （Ａｎｔ １−Ｌｅｕ−１５、ＢＤ
Ｉ Ｓ）を使用した。この組み合わせによってＮＫ−細
胞及び異なった成熟段階の単核細胞及び好中性の顆粒球
を同定することができる。ＭＡｂＦＩＴＣ標識ＣＤ２０
（Ａｎｔ １−Ｌｅｕ−１６、ＢＤ Ｉ Ｓ）及びＰ
Ｅ標識ＣＤ５ （Ａｎ ｔ ｉ −Ｌｅｕ−１、ＢＤＩ
Ｓ）も使用された。
標識ＣＤ１ｌｂ （Ａｎｔ １−Ｌｅｕ−１５、ＢＤ
Ｉ Ｓ）を使用した。この組み合わせによってＮＫ−細
胞及び異なった成熟段階の単核細胞及び好中性の顆粒球
を同定することができる。ＭＡｂＦＩＴＣ標識ＣＤ２０
（Ａｎｔ １−Ｌｅｕ−１６、ＢＤ Ｉ Ｓ）及びＰ
Ｅ標識ＣＤ５ （Ａｎ ｔ ｉ −Ｌｅｕ−１、ＢＤＩ
Ｓ）も使用された。
フローサイトメトリー分析はＦＡＣ５ｃａｎＴＭ（商標
）フローサイトメーターによって行われた。
）フローサイトメーターによって行われた。
この装置は光源として空冷アルゴンイオンレーザを使用
している。レーザーは４８８ｎｍ、１５ｍＷの強度で操
作された。レーザーは、２０μｍＸ６４μｍの楕円ビー
ムを提供できるプリスムエキスパンダー及び平凸レンズ
を用いて細胞のストリーム上に焦点が合わされた。光学
的測定は４３０μｍＸ１８０μｍ長方形フローチャンネ
ルを有する石英フローセルにおいて行われた。安定した
流れを加圧したシート及びサンプル流れによって達成し
た。測定はサンプル流速６０μｌ／分で行われた。
している。レーザーは４８８ｎｍ、１５ｍＷの強度で操
作された。レーザーは、２０μｍＸ６４μｍの楕円ビー
ムを提供できるプリスムエキスパンダー及び平凸レンズ
を用いて細胞のストリーム上に焦点が合わされた。光学
的測定は４３０μｍＸ１８０μｍ長方形フローチャンネ
ルを有する石英フローセルにおいて行われた。安定した
流れを加圧したシート及びサンプル流れによって達成し
た。測定はサンプル流速６０μｌ／分で行われた。
前方方向の散乱光は長方形のビームストップと共に提供
される球形のレンズで集められ（採光角度１−１０度）
そしてソリッドステートシリコン検出器によって検出さ
れた。直角方向の角度の散乱光及び蛍光は光学的ゲルを
有するフローセルと結合したレンス（ＨＯ２，１，２２
ＮＡ）によって集められた（集光角度は２３°と１５７
°の間である）。光は適当な光学的フィルターの組み合
わせを使用した４つの光電子増倍管に導かれる。
される球形のレンズで集められ（採光角度１−１０度）
そしてソリッドステートシリコン検出器によって検出さ
れた。直角方向の角度の散乱光及び蛍光は光学的ゲルを
有するフローセルと結合したレンス（ＨＯ２，１，２２
ＮＡ）によって集められた（集光角度は２３°と１５７
°の間である）。光は適当な光学的フィルターの組み合
わせを使用した４つの光電子増倍管に導かれる。
蛍光信号は、ＦＩＴＣ信号については５３０ｎｍバンド
パスフィルター ＰＥ信号については５８５ｎｍバンド
パスフィルター及びＬＤＳ−７５１からの蛍光について
は６５０ｎｍロングパスフィルターを通して集められた
。散乱光は、プレウスター（Ｂｒｅｖｓｔｅｒ）アング
ルビームスプリンターを用いて光電子増倍管に導かれた
。
パスフィルター ＰＥ信号については５８５ｎｍバンド
パスフィルター及びＬＤＳ−７５１からの蛍光について
は６５０ｎｍロングパスフィルターを通して集められた
。散乱光は、プレウスター（Ｂｒｅｖｓｔｅｒ）アング
ルビームスプリンターを用いて光電子増倍管に導かれた
。
その５種のパラメーターはコンソート（Ｃｏｎｓｏｒｔ
）３０７′（商標）でデジタル化されリスト様式でダイ
レクトメモリーアクセスに記憶された。各測定は２２，
０００細胞を含んでいる。データ収集はＦＡＣ３ｃ ａ
ｎリサーチソフトウェア−で行われｌこ 。
）３０７′（商標）でデジタル化されリスト様式でダイ
レクトメモリーアクセスに記憶された。各測定は２２，
０００細胞を含んでいる。データ収集はＦＡＣ３ｃ ａ
ｎリサーチソフトウェア−で行われｌこ 。
細胞分類（ソーティング）はＦＡＣ３ｃａｎＴ＆′フロ
ーサイトメーターで行われた。各集団について１０，０
００細胞を１０％牛脂児血清（Ｆｅ２）を含むＲＰＭＩ
にソートした。ソートされた細胞を２００Ｇで５分間遠
心し、ｌＯ％ＦＣ５を含むＲＰＭＩ１００μ区に再懸濁
した。サイトスピン調製物はンヤンドン・サイト（Ｓｈ
！ｎｄｏｎ Ｃｙｌｏ） −遠心分離機（サウザン・プ
ロダクト・エルチヂ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｐｒｏｄｕｃ
ｔ Ｌｔｄ、）、アストモーア（ＡｓＬｍｏｏｒ）、イ
ングランド）で作製された。そのスライドはうイト・ス
ティン（Ｗｒｌｈｌ Ｓｔ＆ｉｏ）で染色されそして光
学顕微鏡で検査された。
ーサイトメーターで行われた。各集団について１０，０
００細胞を１０％牛脂児血清（Ｆｅ２）を含むＲＰＭＩ
にソートした。ソートされた細胞を２００Ｇで５分間遠
心し、ｌＯ％ＦＣ５を含むＲＰＭＩ１００μ区に再懸濁
した。サイトスピン調製物はンヤンドン・サイト（Ｓｈ
！ｎｄｏｎ Ｃｙｌｏ） −遠心分離機（サウザン・プ
ロダクト・エルチヂ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｐｒｏｄｕｃ
ｔ Ｌｔｄ、）、アストモーア（ＡｓＬｍｏｏｒ）、イ
ングランド）で作製された。そのスライドはうイト・ス
ティン（Ｗｒｌｈｌ Ｓｔ＆ｉｏ）で染色されそして光
学顕微鏡で検査された。
ＰＢＬは赤血球をＮＨ，ＣＩで溶解することにより得ら
れた。これらの細胞はＰＥ及びＦＩＴＣ標識ＭＡｂによ
って標準的免疫蛍光方法によって標識された。洗浄後、
細胞を１％パラホルムアルデヒド中で固定し、そして核
酸染料、ＬＤＳ−７５１をその細胞に添加した。
れた。これらの細胞はＰＥ及びＦＩＴＣ標識ＭＡｂによ
って標準的免疫蛍光方法によって標識された。洗浄後、
細胞を１％パラホルムアルデヒド中で固定し、そして核
酸染料、ＬＤＳ−７５１をその細胞に添加した。
装置の閾値は分析中に血小板及び細胞破砕物を含めるた
めに前方散乱光チャンネルにおいて低いレベルに設定さ
れた。第１図Ａを参照すると、リンパ球、単球、顆粒球
、及び好酸球（第１図Ａにおいてそれぞれ５％Ｍ、Ｎ、
ＥＯと表される）を含む主白血球集団は前方及び直角方
向散乱光信号によって血小板及び細胞破砕物から区別す
ることができる。
めに前方散乱光チャンネルにおいて低いレベルに設定さ
れた。第１図Ａを参照すると、リンパ球、単球、顆粒球
、及び好酸球（第１図Ａにおいてそれぞれ５％Ｍ、Ｎ、
ＥＯと表される）を含む主白血球集団は前方及び直角方
向散乱光信号によって血小板及び細胞破砕物から区別す
ることができる。
第１図Ｂの前方散乱光及びＬＤＳ−７５１蛍光の関連お
いて、かなりの散乱光を有する中間的染色細胞の集団が
同定された。第１図Ｂの集団Ｉを参照されたい。この集
団は前方及び右角度散乱光によって同定されるように全
てインタクト細胞である（第１図り参照）。最も多いＬ
ＤＳ−７５１蛍光を有する集団、第１図ＢのＤＡは前方
及び直角方向散乱光の中間的量よりも低かった。第１図
Ｃを参照。集団ＤＡ内でのイベント（ｅｖｅｎｔ）の比
率はサンプル毎に変化し、調製方法の変化によって異な
った。低い散乱光信号及びサンプル毎の変化はこれらの
イペン、トは細胞破砕物であることを示した。これは第
１図８１：８いて同定された細胞集団をソートすること
によって確認された。集団■中の細胞は顕微鏡検査によ
ればインタクト細胞である。ＤＡで表される細胞は損傷
を受けた細胞、裸の核、又は凝集した血小板であった。
いて、かなりの散乱光を有する中間的染色細胞の集団が
同定された。第１図Ｂの集団Ｉを参照されたい。この集
団は前方及び右角度散乱光によって同定されるように全
てインタクト細胞である（第１図り参照）。最も多いＬ
ＤＳ−７５１蛍光を有する集団、第１図ＢのＤＡは前方
及び直角方向散乱光の中間的量よりも低かった。第１図
Ｃを参照。集団ＤＡ内でのイベント（ｅｖｅｎｔ）の比
率はサンプル毎に変化し、調製方法の変化によって異な
った。低い散乱光信号及びサンプル毎の変化はこれらの
イペン、トは細胞破砕物であることを示した。これは第
１図８１：８いて同定された細胞集団をソートすること
によって確認された。集団■中の細胞は顕微鏡検査によ
ればインタクト細胞である。ＤＡで表される細胞は損傷
を受けた細胞、裸の核、又は凝集した血小板であった。
集団Ｐ内で同定された粒子は血小板及び赤血球であった
。
。
この後者の集団は第１図Ｅに示されるような散乱光特性
を有している。
を有している。
第１図Ｃ及びＤの比較は散乱光のみの使用では、いくら
かの損傷を受けた細胞かインタクト細胞集団に含まれて
しまうことが示されている。散乱光のみによる集団の同
定に対する損傷を受けた細胞の寄与を正常な２０のドナ
ーについて測定した（第１表）。
かの損傷を受けた細胞かインタクト細胞集団に含まれて
しまうことが示されている。散乱光のみによる集団の同
定に対する損傷を受けた細胞の寄与を正常な２０のドナ
ーについて測定した（第１表）。
第１表
朱土 履古 刊 標準偏差
インタクト有核細胞（ｂゝ １３ ６６ ３４
１４．６散乱光ゲート３°ゝ インタクトリンパ球 ７８ ９９ ８８
７．１インタクト単球 ８ ８８ ５６
２１．４インタクト好中球 ４７ ９１
７６ １１．４インタクト好酸球 １１
７８ ４１ １６．７”’ Ｐ Ｂ ＬはＮＨ，Ｃ
Ｉ溶解、１％パラホルムアルデヒド中での固定及びＬＤ
Ｓ−７５１での染色によって得られた。
１４．６散乱光ゲート３°ゝ インタクトリンパ球 ７８ ９９ ８８
７．１インタクト単球 ８ ８８ ５６
２１．４インタクト好中球 ４７ ９１
７６ １１．４インタクト好酸球 １１
７８ ４１ １６．７”’ Ｐ Ｂ ＬはＮＨ，Ｃ
Ｉ溶解、１％パラホルムアルデヒド中での固定及びＬＤ
Ｓ−７５１での染色によって得られた。
ｌ）第１図Ｂで゛冒″で示される領域に存在する細胞（
％はそれらの数を有核細胞の総数（即ち、１＋ＤＡ）で
割って×１００％）。
％はそれらの数を有核細胞の総数（即ち、１＋ＤＡ）で
割って×１００％）。
３°〕第１図り中に示されるような細胞型について典型
的な散乱光ゲート中ｔこ存在するインタクト有核細胞の
数を第１図Ａに設定された同一のゲート中に存在する細
胞数で割って×１００％。
的な散乱光ゲート中ｔこ存在するインタクト有核細胞の
数を第１図Ａに設定された同一のゲート中に存在する細
胞数で割って×１００％。
免疫蛍光を妨害するかもしれない細胞のパーセンテージ
を測定するために、インタクト細胞のパーセントをりン
バ球、単球、好中球、顆粒球、及び好酸性顆粒球（それ
ぞれ第１図りのり、Ｍ、Ｎ。
を測定するために、インタクト細胞のパーセントをりン
バ球、単球、好中球、顆粒球、及び好酸性顆粒球（それ
ぞれ第１図りのり、Ｍ、Ｎ。
ＥＯ）について典型的な散乱光領域で測定した。
この表は少数の細胞（平均３４％インタクト有核細胞）
のみがサンプル調製手順を生き残ったことを示している
。更に、これらの損傷を受けた細胞のかなりの両分は散
乱光特性のみに基づいては除去されなかった。例えば、
リンパ球散乱光ゲート内（第１図Ｄ：Ｌ）においては、
細胞の平均８８％のみがＬＤＳ−７５１蛍光に基づいて
インタクトであった。溶解手順を生き残った赤血球は有
核細胞（第１図Ｅ）について典型的な散乱光領域中に出
現することに注意しなければならない。それらはＬＤＳ
−７５１に染色されず、そしてそれゆえに有核細胞から
識別されることができるので、更に他の蛍光パラメータ
ーを用いることによって、その細胞は集団Ｐ（第１図Ｂ
）に限定される。
のみがサンプル調製手順を生き残ったことを示している
。更に、これらの損傷を受けた細胞のかなりの両分は散
乱光特性のみに基づいては除去されなかった。例えば、
リンパ球散乱光ゲート内（第１図Ｄ：Ｌ）においては、
細胞の平均８８％のみがＬＤＳ−７５１蛍光に基づいて
インタクトであった。溶解手順を生き残った赤血球は有
核細胞（第１図Ｅ）について典型的な散乱光領域中に出
現することに注意しなければならない。それらはＬＤＳ
−７５１に染色されず、そしてそれゆえに有核細胞から
識別されることができるので、更に他の蛍光パラメータ
ーを用いることによって、その細胞は集団Ｐ（第１図Ｂ
）に限定される。
実施例２．生細胞の検出
固定されていない、生きているサンプルにこの技術の適
用を広げることはＬＤＳ−７５１は損傷を受けている細
胞からインタクト細胞を識別できることの確証を追加す
ることになる。ＬＤＳ−７５１は生きている白血球の染
色に使用することができる。これは固定していないサン
プル中の生存度を評価する慣用の染料とＬＤＳ−７５１
染色の相関関係を可能にする。
用を広げることはＬＤＳ−７５１は損傷を受けている細
胞からインタクト細胞を識別できることの確証を追加す
ることになる。ＬＤＳ−７５１は生きている白血球の染
色に使用することができる。これは固定していないサン
プル中の生存度を評価する慣用の染料とＬＤＳ−７５１
染色の相関関係を可能にする。
ＰＢＬはＮＨ，ＣＩを使用してそれに続く固定をせずに
調製された。このサンプルの散乱光特性は第２図Ａに示
されている。ＦＤＡを用いて生存していると同定された
細胞もＬＤＳ−７５１蛍光に基づいて識別することがで
きる。第２図Ｃを参照されたい。細胞の９８％以上がＦ
ＤＡ及びＬＤＳ−７５１蛍光の両方によって陽性である
と同定された。
調製された。このサンプルの散乱光特性は第２図Ａに示
されている。ＦＤＡを用いて生存していると同定された
細胞もＬＤＳ−７５１蛍光に基づいて識別することがで
きる。第２図Ｃを参照されたい。細胞の９８％以上がＦ
ＤＡ及びＬＤＳ−７５１蛍光の両方によって陽性である
と同定された。
同様の実験において、ＬＤＳ−７５１及びＦＤＡで染色
するまえにサンプル中の死細胞を増加させるために、固
定されていない細胞をＮＨ４Ｃｌで溶解後４８時間保持
した（第３図）。その時、細胞（７） ７１ ％ノみが
ＦＤＡ及びＬＤＳ−７５１蛍光に基づいて生存していた
。ＬＤＳ−７５１及び散乱光にゲートすることによって
、第３図のように、本質的には生存細胞の全てが含まれ
ており（０，９％）そしてＦＤＡ蛍光に基づいて僅が（
８，６％）のもののみが死んでいた。これらのデータは
ＬＤＳ−７５１は生きている状態及び固定後の両方にお
いて損傷を受けた細胞からインタクト細胞を識別できる
ことを確証している。
するまえにサンプル中の死細胞を増加させるために、固
定されていない細胞をＮＨ４Ｃｌで溶解後４８時間保持
した（第３図）。その時、細胞（７） ７１ ％ノみが
ＦＤＡ及びＬＤＳ−７５１蛍光に基づいて生存していた
。ＬＤＳ−７５１及び散乱光にゲートすることによって
、第３図のように、本質的には生存細胞の全てが含まれ
ており（０，９％）そしてＦＤＡ蛍光に基づいて僅が（
８，６％）のもののみが死んでいた。これらのデータは
ＬＤＳ−７５１は生きている状態及び固定後の両方にお
いて損傷を受けた細胞からインタクト細胞を識別できる
ことを確証している。
実施例３．ＬＤＳ−７５１と免疫蛍光の組み合わせ
４８８ｎｍでのＬＤＳ−７５１の励起及びその遠赤外（
Ｉｘｒ ｒｅｄ）エミッション（放出）はこの染料とＦ
ＩＴＣやＰＥ蛍光免疫試薬の双方との組み合わせを可能
にする。スペクトル補償を、ＬＤＳチャンネルに入り込
むＰＥエミッションを補正するために染料間で行わなけ
ればならないが（１０％を差し引く）、他の方向におい
ては最小の補正のみか行わなければならない（２％を差
し引く）。
Ｉｘｒ ｒｅｄ）エミッション（放出）はこの染料とＦ
ＩＴＣやＰＥ蛍光免疫試薬の双方との組み合わせを可能
にする。スペクトル補償を、ＬＤＳチャンネルに入り込
むＰＥエミッションを補正するために染料間で行わなけ
ればならないが（１０％を差し引く）、他の方向におい
ては最小の補正のみか行わなければならない（２％を差
し引く）。
ＦＩＴＣ及びＬＤＳ−７５１チヤンネルの間では補償は
必要ではなかった。
必要ではなかった。
リンパ球サブ集団分析において損傷を受けた細胞を同定
するにはＬＤＳ−７５１の使用が有利であることが第４
図に示されている。この実施例では赤血球を溶解し、全
血をＣＤ５（ＰＥＸＴ細胞及びＢ 細胞ノサブ集団）及
びＣＤ２０ （ＦＩＴＣ）（Ｂ細胞）と反応させた。イ
ンタクト細胞はＬＤＳ−７５１及び前方散乱光の間の相
関において同定された。第４図Ｃ参照。ＣＤ５”／ＣＤ
２Ｏ−ＣＤ５”／ＣＤ２０＋及びＣＤ５−／ＣＤ２０＋
リンパ球（第４図Ｅ）の比較的稀な集団を前方及び直角
方向散乱光に更にゲートを設けることによって同定する
ことができる。第４図りを参照されたい。
するにはＬＤＳ−７５１の使用が有利であることが第４
図に示されている。この実施例では赤血球を溶解し、全
血をＣＤ５（ＰＥＸＴ細胞及びＢ 細胞ノサブ集団）及
びＣＤ２０ （ＦＩＴＣ）（Ｂ細胞）と反応させた。イ
ンタクト細胞はＬＤＳ−７５１及び前方散乱光の間の相
関において同定された。第４図Ｃ参照。ＣＤ５”／ＣＤ
２Ｏ−ＣＤ５”／ＣＤ２０＋及びＣＤ５−／ＣＤ２０＋
リンパ球（第４図Ｅ）の比較的稀な集団を前方及び直角
方向散乱光に更にゲートを設けることによって同定する
ことができる。第４図りを参照されたい。
インタクト細胞を同定することなしに散乱光のみにゲー
トを設けることによって、二重に標識されたＣＤ５”、
ＣＤ２Ｑ＋細胞の比率が５０％に増加した（第４図Ｃ参
照）。
トを設けることによって、二重に標識されたＣＤ５”、
ＣＤ２Ｑ＋細胞の比率が５０％に増加した（第４図Ｃ参
照）。
インタクト細胞の同定と免疫蛍光の組み合わせの重要性
を示している第２の実施例は第５図及び第６図に示され
ている。この実施例中の細胞はＣＤ１５（ＦＩＴＣ）及
びＣＤＩ ｌ ｂ （ＰＥ）で標識された。標識された
これらの異なった細胞型（即ち、単球、顆粒球及びＮＫ
細胞）を標識されている量的差異及びそれらの散乱光特
性の違いに基づいて識別することができる。ＣＤ１５Ｍ
Ａｂは、それは１ｇＭイソタイプであって標的細胞上の
抗原部位の数が多いので、好中球を凝集することが知ら
れている。この凝集は、第５図Ａ及び第１図Ａの好中球
の相対頻度を比較することによって観察することができ
、これらのサンプルは同の′細胞調製物から得られたか
らである。より少数の好中球のみがＣＤ１５ＭＡｂと反
応したサンプル中において散乱光により観察されたこと
は明白である。細胞はサンプル内にまだ存在することが
示された。上記に示したように、インタクト細胞、第５
図Ｂ（集団Ｉ）を集団ＡＧ中に同定されたより明るく標
識されたより大きな細胞から識別することができた。２
０％インタクト細胞集団からなるこれらの凝集細胞は第
５図Ｃにおいてスケール中に入らないくらい明るい散乱
光を有していた。
を示している第２の実施例は第５図及び第６図に示され
ている。この実施例中の細胞はＣＤ１５（ＦＩＴＣ）及
びＣＤＩ ｌ ｂ （ＰＥ）で標識された。標識された
これらの異なった細胞型（即ち、単球、顆粒球及びＮＫ
細胞）を標識されている量的差異及びそれらの散乱光特
性の違いに基づいて識別することができる。ＣＤ１５Ｍ
Ａｂは、それは１ｇＭイソタイプであって標的細胞上の
抗原部位の数が多いので、好中球を凝集することが知ら
れている。この凝集は、第５図Ａ及び第１図Ａの好中球
の相対頻度を比較することによって観察することができ
、これらのサンプルは同の′細胞調製物から得られたか
らである。より少数の好中球のみがＣＤ１５ＭＡｂと反
応したサンプル中において散乱光により観察されたこと
は明白である。細胞はサンプル内にまだ存在することが
示された。上記に示したように、インタクト細胞、第５
図Ｂ（集団Ｉ）を集団ＡＧ中に同定されたより明るく標
識されたより大きな細胞から識別することができた。２
０％インタクト細胞集団からなるこれらの凝集細胞は第
５図Ｃにおいてスケール中に入らないくらい明るい散乱
光を有していた。
これらの細胞集団の免疫蛍光は第６図に示されている。
凝集細胞はＣＤ１５及びＣＤ１１ｂの両方に最も高い結
合を有していた。第６図Ｃ参照。
合を有していた。第６図Ｃ参照。
これらのデータはＬＤＳ−７５１の強度の染色はサンプ
ル中のダブレット（ｄｏｕｂｌｅｔ）又は凝集細胞の同
定に使用することができることを示している。
ル中のダブレット（ｄｏｕｂｌｅｔ）又は凝集細胞の同
定に使用することができることを示している。
ＣＤ１５及びＣＤ１１ｂ結合に基づく細胞集団間の識別
は、損傷を受けた細胞及びダブレットがリストモードフ
ァイルを得ることによってサンフルから除去されたとき
にはより容易に観察された。
は、損傷を受けた細胞及びダブレットがリストモードフ
ァイルを得ることによってサンフルから除去されたとき
にはより容易に観察された。
免疫蛍光によって同定された複数の集団は散乱光によっ
ても認識できた。第５図り及び第６図りの比較において
、免疫蛍光によってマンノされる集団は対応する散乱光
特性（Ｌ、ＭＳＮ、ＥＯ）を有している。好中球（Ｎ）
及び好酸球（ＥＯ）は前方角散乱光及びＣＤ１５蛍光の
強度の両方によって分離された。単球（Ｍ）はそれらの
散乱光特性及びＣＤｌｌｂ発現の両方によってリンパ球
（Ｌ）から識別された。ＮＫ細胞は（Ｌ集団に含まれる
）ＣＤ１１ｂを発現するが、単球（Ｍ）のようにはＣＤ
１５を発現しなかった。これらの細胞集団の同定は形態
学的分析について細胞をソートすることによって確認さ
れた。
ても認識できた。第５図り及び第６図りの比較において
、免疫蛍光によってマンノされる集団は対応する散乱光
特性（Ｌ、ＭＳＮ、ＥＯ）を有している。好中球（Ｎ）
及び好酸球（ＥＯ）は前方角散乱光及びＣＤ１５蛍光の
強度の両方によって分離された。単球（Ｍ）はそれらの
散乱光特性及びＣＤｌｌｂ発現の両方によってリンパ球
（Ｌ）から識別された。ＮＫ細胞は（Ｌ集団に含まれる
）ＣＤ１１ｂを発現するが、単球（Ｍ）のようにはＣＤ
１５を発現しなかった。これらの細胞集団の同定は形態
学的分析について細胞をソートすることによって確認さ
れた。
核酸染料及びｌもしくは２以上のＭＡｂを別々に収納す
る容器からなるキットは本発明の実施に使用することが
できる。好ましい実施態様においては、キットの１つの
容器にはＬＤＳ−７５１が収納される。キットの他の容
器は前記の実施例で述べたいずれかのＭＡｂを別々に含
むことができる。ＭＡｂはキットに入れる前に標識して
も良く、又は蛍光色素を収納する別の容器を別の標識の
ために含めることができることは当業者には理解される
であろう。
る容器からなるキットは本発明の実施に使用することが
できる。好ましい実施態様においては、キットの１つの
容器にはＬＤＳ−７５１が収納される。キットの他の容
器は前記の実施例で述べたいずれかのＭＡｂを別々に含
むことができる。ＭＡｂはキットに入れる前に標識して
も良く、又は蛍光色素を収納する別の容器を別の標識の
ために含めることができることは当業者には理解される
であろう。
本明細書中に述べられた全ての出版物及び特許出願は本
発明が属する分野の当業者のレベルを示すものである。
発明が属する分野の当業者のレベルを示すものである。
全ての出版物及び特許出願は、個々の出版物又は特許出
願が参照により取り込まれるように特定的に個々に示さ
れたと同じ範囲にここに参照により取り込まれる。
願が参照により取り込まれるように特定的に個々に示さ
れたと同じ範囲にここに参照により取り込まれる。
特許請求の範囲及びその思想から離れることなく本発明
において多くの変更及び修飾が可能であることは通常の
当業者には明白であろう。
において多くの変更及び修飾が可能であることは通常の
当業者には明白であろう。
第１図Ａ−Ｅは、フローサイトメーターにより測定され
た蛍光と散乱光を表す模式図である。 第２図Ａ−Ｅは、フローサイトメーターにより測定され
た蛍光と散乱光を表す模式図である。 第３図Ａ−Ｅは、フローサイトメーターにより測定され
た蛍光と散乱光を表す模式図である。 第４図Ａ−Ｅは、フローサイトメーターにより測定され
た蛍光と散乱光を表す模式図である。 第５図Ａ−Ｅは、フローサイトメーターにより測定され
た蛍光と散乱光を表す模式図である。 第６図Ｃ参照は、フローサイトメーターにより測定され
た蛍光と散乱光を表す模式図である。 図面の浄＠（内容に変更なし） ＦＤＡ ＦＤＡ ＦＤＡ ＣＤ１５−ＦＩＴＣ ＣＤ２Ｏ−ＦＩＴＣ ＦＩＧ、６ ＣＤ２０−ＦＩＴＣ
た蛍光と散乱光を表す模式図である。 第２図Ａ−Ｅは、フローサイトメーターにより測定され
た蛍光と散乱光を表す模式図である。 第３図Ａ−Ｅは、フローサイトメーターにより測定され
た蛍光と散乱光を表す模式図である。 第４図Ａ−Ｅは、フローサイトメーターにより測定され
た蛍光と散乱光を表す模式図である。 第５図Ａ−Ｅは、フローサイトメーターにより測定され
た蛍光と散乱光を表す模式図である。 第６図Ｃ参照は、フローサイトメーターにより測定され
た蛍光と散乱光を表す模式図である。 図面の浄＠（内容に変更なし） ＦＤＡ ＦＤＡ ＦＤＡ ＣＤ１５−ＦＩＴＣ ＣＤ２Ｏ−ＦＩＴＣ ＦＩＧ、６ ＣＤ２０−ＦＩＴＣ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ａ）体液サンプルを個体から採取すること； ｂ）核酸染料を前記サンプルに添加すること；及び ｃ）前記サンプルを、サンプル中の細胞を一度に実質的
に１個づつ検知区域を通過させることができ、且つ前記
検知区域を通過する個々の細胞からの蛍光及び散乱光の
両方を１以上の方向で検出及び記録することのできる自
動化装置において分析すること； の各工程からなる体液サンプル中のインダクト細胞及び
損傷を受けている細胞を識別するための方法。 ２、体液サンプルが腹膜液、脊髄液、脳液、尿、及び骨
髄、リンパ節、肝臓、脾臓又は胸腺の細胞懸濁液からな
る請求項１記載の方法。 ３、核酸染料がＤＮＡについて優先性を有している、請
求項１記載の方法。 ４、互いに識別でき且つ核酸染料からも識別できるピー
ク放出スペクトルを有している蛍光標識された少なくと
も１つのＭＡｂが前記核酸染料添加の前にサンプルに添
加される、請求項１記載の方法。 ５、前記自動化装置はフローサイトメーターを含んでい
る、請求項１記載の方法。 ６、ａ）抹消血サンプルを個体から採取すること； ｂ）互いに識別でき且つ核酸染料からも識 別できるピーク放出スペクトルを有している蛍光標識さ
れた少なくとも１つのＭＡｂをサンプルに添加すること
； ｃ）固定剤を前記サンプルに添加すること； ｄ）ＤＮＡについて優先性を有する核酸染料を添加する
こと；及び ｅ）前記サンプルを、サンプル中の細胞を一度に実質的
に１個づつ検知区域を通過させることができ、且つ前記
検知区域を通過する個々の細胞からの蛍光及び散乱光の
両方を１以上の方向で検出及び記録することのできる自
動化装置において分析すること； の各工程からなる抹消血サンプル中のインタクト細胞及
び損傷を受けている細胞を識別するための方法。 ７、血液中の赤血球が溶解している、請求項６記載の方
法。 ８、核酸染料がＬＤＳ−７５１である、請求項６記載の
方法。 ９、自動化装置はフローサイトメーターを含んでいる、
請求項６記載の方法。 １０、ａ）抹消血サンプルを個体から採取すること； ｂ）前記サンプル中の赤血球を溶解すること； ｃ）互いに区別でき且つＬＤＳ−７５１とも区別できる
ピーク放出スペクトルを有している蛍光標識された少な
くとも１つのＭＡｂをサンプルに添加すること； ｄ）パラホルムアルデヒドをサンプルに添加すること； ｅ）ＬＤＳ−７５１を前記サンプルに添加すること：及
び ｆ）前記サンプルを４８８ｎｍに調整された単一レーザ
ーを装備したフローサイトメーターにおいて分析するこ
と； の各工程からなる抹消血サンプル中のインタクト細胞及
び損傷を受けている細胞を識別するための方法。 １１、核酸染料及び１種類もしくは２種類以上のＭＡｂ
を別々に収納する容器からなる体液サンプル中のインタ
クト細胞及び損傷を受けている細胞を識別するためのキ
ット。 １２、核酸染料がＬＤＳ−７５１である、請求項１１記
載のキット。 １３、ＭＡｂが抗−ＣＤ１５（ＦＩＴＣ）及び抗−ＣＤ
１１ｂ（ＰＥ）である、請求項１１記載のキット。 １４、ＭＡｂが抗−ＣＤ２０（ＦＩＴＣ）及び抗−ＣＤ
５（ＰＥ）である、請求項１１記載のキット。 １５、ＭＡｂが抗−ＣＤ４５（ＦＩＴＣ）及び抗−ＣＤ
１４（ＰＥ）である、請求項１１記載のキット。
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|---|---|---|---|
| US07/206,454 US5057413A (en) | 1988-06-13 | 1988-06-13 | Method for discriminating between intact and damaged cells in a sample |
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|---|---|
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000501838A (ja) * | 1995-12-15 | 2000-02-15 | アボツト・ラボラトリーズ | 細胞生存率、有核赤血球、および白血球分類の同時分析方法 |
| JP2002537557A (ja) * | 1999-02-19 | 2002-11-05 | アイデックス ラボラトリーズ インコーポレイテッド | 高開口数流れ血球計算器及びその使用方法 |
| JP2022525832A (ja) * | 2019-01-04 | 2022-05-20 | ジェネクスト テクノロジーズ インコーポレイテッド | 生体内ラジカル線量測定及び生体内ヒドロキシルラジカルのタンパク質フットプリント法 |
Families Citing this family (58)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IE76732B1 (en) * | 1990-08-07 | 1997-11-05 | Becton Dickinson Co | One step test for absolute counts |
| JP2941041B2 (ja) * | 1990-11-16 | 1999-08-25 | シスメックス株式会社 | フローサイトメトリーによる白血球の分類方法 |
| JP3070968B2 (ja) * | 1991-05-14 | 2000-07-31 | シスメックス株式会社 | 尿中の細胞分析用試薬及び方法 |
| US5955295A (en) * | 1992-10-30 | 1999-09-21 | Micro-Med, Inc. | Micro lysis-analysis process to measure cell characteristics and diagnose diseases |
| US5532139A (en) * | 1992-10-30 | 1996-07-02 | Micro-Med, Inc. | Micro lysis-analysis process to measure cell characteristics and diagnose diseases |
| US5610027A (en) * | 1992-10-30 | 1997-03-11 | Micro-Med, Inc. | Microphoto lysis-anlaysis process to measure cell characteristics |
| CA2153257A1 (en) * | 1993-01-06 | 1994-07-21 | Terry J. Fetterhoff | Fluorescent detection of nonviable cells |
| DE69428552T2 (de) * | 1993-01-26 | 2002-04-11 | Becton Dickinson And Co., Franklin Lakes | Verfahren zum Nachweis von seltenen Ereignissen |
| DE69434942T2 (de) * | 1993-02-25 | 2007-11-29 | Abbott Laboratories, Abbott Park | Mehrzweckreagenzsystem zur schnellen lysierung von vollblutproben |
| US5534416A (en) * | 1993-04-13 | 1996-07-09 | Molecular Probes, Inc. | Fluorescent viability assay using cyclic-substituted unsymmetrical cyanine dyes |
| US5436134A (en) * | 1993-04-13 | 1995-07-25 | Molecular Probes, Inc. | Cyclic-substituted unsymmetrical cyanine dyes |
| US5445946A (en) * | 1993-04-13 | 1995-08-29 | Molecular Probes, Inc. | Intravacuolar stains for yeast and other fungi |
| US5545535A (en) * | 1993-04-13 | 1996-08-13 | Molecular Probes, Inc. | Fluorescent assay for bacterial gram reaction |
| US5437980A (en) * | 1993-05-17 | 1995-08-01 | Molecular Probes, Inc. | Phenanthridium dye staining of nucleic acids in living cells |
| ES2156927T3 (es) * | 1994-10-20 | 2001-08-01 | Sysmex Corp | Reactivo y metodo para analizar componentes solidos en orina. |
| US5879900A (en) * | 1994-12-15 | 1999-03-09 | Abbott Laboratories | Method for simultaneous analysis of cell viability, nucleated red blood cells and white blood cell differentials |
| US6329158B1 (en) * | 1995-09-15 | 2001-12-11 | Becton Dickinson And Company | Use of dimly fluorescing nucleic acid dyes in the identification of nucleated cells |
| JP4323571B2 (ja) | 1997-01-31 | 2009-09-02 | エックスワイ， インコーポレイテッド | 光学装置 |
| US6149867A (en) | 1997-12-31 | 2000-11-21 | Xy, Inc. | Sheath fluids and collection systems for sex-specific cytometer sorting of sperm |
| US6911313B2 (en) * | 1998-02-06 | 2005-06-28 | Sysmex Corporation | Process for discriminating and counting erythroblasts |
| FR2782730B1 (fr) * | 1998-08-25 | 2002-05-17 | Biocom Sa | Procede de separation cellulaire pour l'isolation de cellules pathogeniques, notamment cancereuses rares, equipement et reactif pour la mise en oeuvre du procede et application du procede |
| US6673568B1 (en) | 1999-10-25 | 2004-01-06 | Genprime, Inc. | Method and apparatus for prokaryotic and eukaryotic cell quantitation |
| US6787302B2 (en) * | 1999-10-25 | 2004-09-07 | Genprime, Inc. | Method and apparatus for prokaryotic and eukaryotic cell quantitation |
| US7208265B1 (en) | 1999-11-24 | 2007-04-24 | Xy, Inc. | Method of cryopreserving selected sperm cells |
| ATE386815T1 (de) | 2000-01-06 | 2008-03-15 | Caliper Life Sciences Inc | Methoden und syteme zur überwachung intrazellulärer bindereaktionen |
| CA2822983C (en) | 2000-11-29 | 2017-05-09 | Xy, Llc | System to separate frozen-thawed spermatozoa into x-chromosome bearing and y-chromosome bearing populations |
| US7713687B2 (en) | 2000-11-29 | 2010-05-11 | Xy, Inc. | System to separate frozen-thawed spermatozoa into x-chromosome bearing and y-chromosome bearing populations |
| US6793642B2 (en) * | 2001-05-07 | 2004-09-21 | Biomed Solutions, Llc | Flow cytometer |
| US6403378B1 (en) * | 2001-04-26 | 2002-06-11 | Guava Technologies, Inc. | Cell viability assay reagent |
| WO2002092161A1 (en) * | 2001-05-10 | 2002-11-21 | Biophan, Llc | Miniaturized particle analyzer |
| JP4595067B2 (ja) | 2002-08-01 | 2010-12-08 | エックスワイ，エルエルシー | 低圧精子細胞分離システム |
| US8486618B2 (en) | 2002-08-01 | 2013-07-16 | Xy, Llc | Heterogeneous inseminate system |
| CN100570360C (zh) | 2002-08-15 | 2009-12-16 | Xy公司 | 一种流式细胞仪及流式细胞计数方法 |
| US7169548B2 (en) | 2002-09-13 | 2007-01-30 | Xy, Inc. | Sperm cell processing and preservation systems |
| DK2305171T3 (da) | 2003-03-28 | 2022-03-21 | Inguran Llc | Apparat og fremgangsmåder til tilvejebringelse af kønssorteret dyresæd |
| ES2541121T3 (es) | 2003-05-15 | 2015-07-16 | Xy, Llc | Clasificación eficiente de células haploides por sistemas de citometría de flujo |
| US7776529B2 (en) | 2003-12-05 | 2010-08-17 | Life Technologies Corporation | Methine-substituted cyanine dye compounds |
| US7892725B2 (en) | 2004-03-29 | 2011-02-22 | Inguran, Llc | Process for storing a sperm dispersion |
| AU2005266930B2 (en) | 2004-07-22 | 2010-09-16 | Inguran, Llc | Process for enriching a population of sperm cells |
| JP5306811B2 (ja) | 2005-05-11 | 2013-10-02 | ライフ テクノロジーズ コーポレーション | ２本鎖ｄｎａへの高い選択性を有する蛍光化学物質及びそれらの使用 |
| WO2009082218A1 (en) * | 2007-12-20 | 2009-07-02 | Nederlandse Organisatie Voor Toegepast-Natuurwetenschappelijk Onderzoek Tno | Real-time method for the detection of viable micro-organisms |
| WO2010068812A1 (en) * | 2008-12-10 | 2010-06-17 | Abqmr, Inc. | Nuclear magnetic resonance apparatus, methods and associated technology |
| GB201005939D0 (en) | 2010-04-09 | 2010-05-26 | Biostatus Ltd | Method of analysing a cell or other biological material containing nucleic acid |
| US9428547B2 (en) | 2010-04-21 | 2016-08-30 | Dna Electronics, Inc. | Compositions for isolating a target analyte from a heterogeneous sample |
| US9476812B2 (en) | 2010-04-21 | 2016-10-25 | Dna Electronics, Inc. | Methods for isolating a target analyte from a heterogeneous sample |
| US20110262989A1 (en) | 2010-04-21 | 2011-10-27 | Nanomr, Inc. | Isolating a target analyte from a body fluid |
| US8841104B2 (en) | 2010-04-21 | 2014-09-23 | Nanomr, Inc. | Methods for isolating a target analyte from a heterogeneous sample |
| US9434940B2 (en) | 2012-12-19 | 2016-09-06 | Dna Electronics, Inc. | Methods for universal target capture |
| US10000557B2 (en) | 2012-12-19 | 2018-06-19 | Dnae Group Holdings Limited | Methods for raising antibodies |
| US9995742B2 (en) | 2012-12-19 | 2018-06-12 | Dnae Group Holdings Limited | Sample entry |
| US9599610B2 (en) | 2012-12-19 | 2017-03-21 | Dnae Group Holdings Limited | Target capture system |
| US9804069B2 (en) | 2012-12-19 | 2017-10-31 | Dnae Group Holdings Limited | Methods for degrading nucleic acid |
| US9551704B2 (en) | 2012-12-19 | 2017-01-24 | Dna Electronics, Inc. | Target detection |
| EP3165899A1 (de) * | 2015-11-04 | 2017-05-10 | Siemens Healthcare Diagnostics GmbH | Verfahren zum nachweis von neutrophilen extrazellulären fallen |
| US12013400B2 (en) | 2017-05-26 | 2024-06-18 | Gennext Technologies, Inc. | Radical dosimetry methods for in vivo hydroxyl radical protein foot-printing |
| US12016688B2 (en) | 2017-05-26 | 2024-06-25 | Gennext Technologies, Inc. | In vivo radical dosimetry and in vivo hydroxyl radical protein foot-printing |
| EP3906395A4 (en) * | 2019-01-04 | 2022-10-12 | GenNext Technologies, Inc. | IN VIVO RADICAL DOSIMETRY AND IN VIVO HYDROXYL RADICAL PROTEIN FOOT PRINTING |
| EP4314253A2 (en) | 2021-03-25 | 2024-02-07 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Methods and compositions for t-cell coculture potency assays and use with cell therapy products |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5616872A (en) * | 1979-07-13 | 1981-02-18 | Ortho Diagnostics | Automatized identification and counting method of and apparatus for subclass of specified blood cell |
| JPS618664A (ja) * | 1984-03-28 | 1986-01-16 | テクニコン、インストルメンツ、コ−ポレ−シヨン | 特異的結合流動式血球計数法 |
| JPS61195358A (ja) * | 1985-02-25 | 1986-08-29 | ベクトン・デイツキンソン・アンド・カンパニ− | 血球の副細胞集団の分析法 |
| JPS62112067A (ja) * | 1985-10-11 | 1987-05-23 | スミスクライン・ベツクマン・コ−ポレイシヨン | サブセツト分析方法および試薬 |
| JPH01165958A (ja) * | 1987-11-17 | 1989-06-29 | Cell Analysis Syst Inc | 免疫の倍数性分析法と分析装置 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3826364A (en) * | 1972-05-22 | 1974-07-30 | Univ Leland Stanford Junior | Particle sorting method and apparatus |
| US4094745A (en) * | 1973-06-22 | 1978-06-13 | John Scholefield | Method of staining microscopic organisms |
| US4544546A (en) * | 1980-04-21 | 1985-10-01 | Abbott Laboratories | Fluorescent nucleic acid stains |
| US4520110A (en) * | 1981-10-06 | 1985-05-28 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Fluorescent immunoassay employing a phycobiliprotein labeled ligand or receptor |
| JPS59184862A (ja) * | 1983-04-05 | 1984-10-20 | ベクトン・ディッキンソン・アンド・カンパニ− | 試料内細胞の複数副次集団を識別する方法と装置 |
| US4585736A (en) * | 1983-10-18 | 1986-04-29 | The United States Of America As Represented By The United States Department Of Energy | Flow cytometric measurement of total DNA and incorporated halodeoxyuridine |
| US4661913A (en) * | 1984-09-11 | 1987-04-28 | Becton, Dickinson And Company | Apparatus and method for the detection and classification of articles using flow cytometry techniques |
| JPH0663973B2 (ja) * | 1985-08-07 | 1994-08-22 | 東ソー株式会社 | 免疫反応測定に用いる蛍光検出装置 |
| CA1279008C (en) * | 1985-10-11 | 1991-01-15 | Smith Kline & French Canada Ltd. | Methods and reagents for performing subset analysis |
-
1988
- 1988-06-13 US US07/206,454 patent/US5057413A/en not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-05-10 AT AT89304754T patent/ATE97500T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-05-10 EP EP89304754A patent/EP0347039B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-05-10 ES ES89304754T patent/ES2061987T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-05-10 DE DE68910730T patent/DE68910730T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-06-13 JP JP1150348A patent/JP2620810B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5616872A (en) * | 1979-07-13 | 1981-02-18 | Ortho Diagnostics | Automatized identification and counting method of and apparatus for subclass of specified blood cell |
| JPS618664A (ja) * | 1984-03-28 | 1986-01-16 | テクニコン、インストルメンツ、コ−ポレ−シヨン | 特異的結合流動式血球計数法 |
| JPS61195358A (ja) * | 1985-02-25 | 1986-08-29 | ベクトン・デイツキンソン・アンド・カンパニ− | 血球の副細胞集団の分析法 |
| JPS62112067A (ja) * | 1985-10-11 | 1987-05-23 | スミスクライン・ベツクマン・コ−ポレイシヨン | サブセツト分析方法および試薬 |
| JPH01165958A (ja) * | 1987-11-17 | 1989-06-29 | Cell Analysis Syst Inc | 免疫の倍数性分析法と分析装置 |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000501838A (ja) * | 1995-12-15 | 2000-02-15 | アボツト・ラボラトリーズ | 細胞生存率、有核赤血球、および白血球分類の同時分析方法 |
| JP2002537557A (ja) * | 1999-02-19 | 2002-11-05 | アイデックス ラボラトリーズ インコーポレイテッド | 高開口数流れ血球計算器及びその使用方法 |
| JP2022525832A (ja) * | 2019-01-04 | 2022-05-20 | ジェネクスト テクノロジーズ インコーポレイテッド | 生体内ラジカル線量測定及び生体内ヒドロキシルラジカルのタンパク質フットプリント法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0347039B1 (en) | 1993-11-18 |
| ES2061987T3 (es) | 1994-12-16 |
| ATE97500T1 (de) | 1993-12-15 |
| EP0347039A2 (en) | 1989-12-20 |
| JP2620810B2 (ja) | 1997-06-18 |
| EP0347039A3 (en) | 1990-10-24 |
| DE68910730T2 (de) | 1994-05-19 |
| US5057413A (en) | 1991-10-15 |
| DE68910730D1 (de) | 1993-12-23 |
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