JPS618664A - 特異的結合流動式血球計数法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は流動式血球計数法の分野に関し、さらに詳しく
は流動式血球計数系における特異的結合検定の使用に関
する。既に多年の間、種々の特異的結合検定法が流体特
に体液中の物質の測定に適用されてきた。ここ数年流動
式血球計数装置系が入手し得るようになり、各種の測定
特に血液学および細胞免疫学において使用されている。

動植物の細胞はすべて、維持、成長および特殊細胞機能
のために必要な種々の生化学的反応め化学的触媒となる
非常に多種類のタンパク質酵素を具えている。これらの
酵素の中にはごく僅かの、ときには唯一種の細胞内にし
か存在しないサブセットがある。

Ｇｏｍｏｒｉ　（Ｐｒｏｃ、　Ｓｏｃ、　Ｅｘｐ、　Ｂ
ｉｏｌ、　Ｍｅｄ、、　４２゜２３（１９３９））およ
びそれと独立にＴａｋａｍａ−ｔｓｕ　（Ｔｒａｎｓ、
　Ｓｏｃ、　Ｐａｔｈ、　Ｊａｐａｎ、　４　：　２７
７（１９１９））は、適当な物質または物質の組合せを
、そのまたはそれらの物質から光吸収性で不溶性の生成
物を生じ得る酵素が含まれている細胞中に導入するとそ
の酵素を含んでいるすべての細胞が選択的に増色（また
は暗色化）され、光学顕微鏡で観察することによりこの
酵素を欠くすべての他の細胞と容易に識別し得ることを
認め、初めて酵素−細胞化学について報告した。導入さ
れる物質は特定の酵素に対する天然または合成の基質で
あってその酵素と反応すると自ら、または他の導入され
る試剤物質との反応によって、光吸収性姑よび不溶性に
なるものである。

このような方法が生きている細胞について成功するため
には、通常その導入される物質は（ａ）細胞内に入るこ
とができなければならず、（ｂ）細胞に対し有毒であっ
てはならず、（ｃ）極めて不溶性な形に転化しなければ
ならず、かつ（ｃｌ）その転化は極めて迅速に起らなけ
ればならない。細胞の直径は通常数ミクロンから数十ミ
クロンである。水溶液中の分子は通常この距離を数分の
一秒ないし数秒で拡散する。従ってもし酵素反応の後に
不溶形態への転化が遅れたならばそれは酵素から遥かに
離れて、ときには細胞の外部に沈積するであろう。生成
物の濃度はそれが反応の場所から拡散する距離の三乗で
減少するので酵素の場所から僅か離れても溶解度積を超
えることができず、従ってその生成物が極端に不溶性で
ない限り細胞は染色されないままとなる。

生きている細胞に対して上記の規準の全部、特に透過性
と毒性の基準の組合せを同時に満足することは従来極め
て困難であった。少くともこの理由から、酵素−細胞化
学的方法の大部分は死んだ細胞に対して適用されてきた
。染色されてい゛るにせよされていないにせよ、ある細
胞を他の細胞と識別し得るためには、各細胞の本来の外
形および内部構造の幾分かを保持することが重要である
。

この目的のために種々の組織学的および細胞学的固定剤
（固定液）が使用され、このものは、種々の程度に、細
胞を構成しているタンパク質、核酸および多糖ポリマー
類を不溶化する。酵素−細胞化学的染色の前に使用され
る固定剤は研究すべき酵素の触媒的化学活性を破壊して
はならない。

Ｄａｙｉｓら（Ｌ　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ、　ａｎｄ　Ｃ
ｙｔｅ＋ｃｈｅｍ、、　　７　：２９１　（１９５９）
）参照。

固定細胞に対しては透過性と毒性の基準は通常緩和され
るがそれにもかかわらず、残りの基準を同時に満足させ
ることはこれまで極めて困難であった。

初期の酵素−細胞化学的方法、例えば先に述べたような
方法は従って、局所化が極めて不十分であるため染色生
成物の沈殿が特異的酵素を本来含有していた細胞の内部
ばかりでなく外部でもしばしば生ずるような染色パター
ンが特徴であった。

その後何年もの細胞化学者の研究努力の多くは基質の転
化速度が極めて高くかつ転化された（通常着色した）生
成物が極めて不溶性であるような方法の開発に向けられ
た。現在では酵素の数ナノメートル以内に生成物をきれ
いに沈殿させる方法が知られている。最初の真に高鮮明
度の染料を使用する酵素−細胞化学的染色技法は最初に
Ｈｏ１ｔおよびＱＭＳｕｌｌｉｖａｎ　（Ｐｒｏｃ、　
Ｒｏｙ、　Ｓｏｃ、　Ｂ、、　ｉ　４８：４６５（１９
５８））、ＤａｖＮｑおよび０ｒｎｓｔｅｉｎ〔：ｒ、
　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ、　ａｎｄ　Ｃ７ｔＯＣｈｅｍ１
７　：　２９７（１９５９））、Ｄａｖｉｓ　ＣＰｒｏ
ｃ、　Ｓｏｃ、　Ｅｘｐ、　Ｂｉｏｌ。

Ｍｅｄ、＋１０１　：９０（１９５９））、Ｄａｖｉｓ
ら（；ｒ、　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ、　ａｎｄ　Ｃｙｔｏ
ｃｈｅｍ、、　７　：　２９１（１９５９）’）および
Ｌｅｈｒｅｒおよびｏｒｎｓｔｅｉｎ（Ｊ、　Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ、　ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｃｙｔｏｌ、、
　６　：　３９９（１９５９））により報告された。

特異的結合測定技術は液状媒質中に非常に低濃度で存在
し診断、医学、環境および産業上重要な種々の有機物質
の定量のための極めて有用な分析方法を提供してきた。

特異的結合測定法はリガンドすなわち測定すべき結合可
能被分析物とそれに対する結合パートナ−との間の特異
的相互作用に基いている。リガンドおよびその結合ハー
ドナーの７一つがハプテンまたは抗原であり他の一つが
対応する抗体である場合この測定法は免疫検定法として
知られている。

酵素は複合体の形で通常使用される多くの標識の一つで
あって、その複合体においては酵素は被分析物またはそ
の結合パートナ−と゛同類の低分子量リガンドによって
結合タンパク質と結びついている。基質が加えられ、結
合パートナ−相互作用によって可能となる程度まで酵素
と反応し、検出可能な応答を与える。免疫−酵素−細胞
化学的染色法においては、細胞の特殊サブセット上また
は中に存在する独得の分子部位に抗体が非常に高い化学
的特異性をもって選択的に結合することが利用される。

かかる抗体は、高鮮明度の酵素−細胞化学的方法が使用
できる酵素（例えばペルオキシダーゼ酵素、アルカリ性
ホスファターゼ酵素等）に直接または間接に結合される
。このような抗体お、よび酵素をその標的細胞に適正に
結合させると、その調勢物は適当な酵素−細胞化学的方
法によって染色することができるようになり、その標識
された細胞のみがその上または中に光吸収性（着色）生
成物を蓄積する。このような方法は現在広く使用されて
いる。細胞特異的抗体との反応の前に固定剤を使用する
場合は、その固定剤が検討対象たる細胞の抗体に結合す
る部位を破壊しないことが重要である。

免疫細胞学において使用される酵素標識特異的結合技法
の一部類は「免疫ペルオキシダーゼ」法と呼ばれており
、これには五つの基本的な方法がある。以下の方法のう
ちで、結合した一次抗体の各分子量りより多数のペルオ
キシダーゼ分子ヲ結合するものが［酵素増幅ｊにより感
度を増犬婁せる。第一に「直接複合体」法においてはペ
ルオキシダーゼ−抗体複合体は組織抗原と直接結合する
。

第二に「間接複合体」法においては一次抗体は先ず組織
抗原に結合し、次に今度はこれにベルオキシダーぜ一二
次抗体（抗一次抗体）複合体が゛結合する。第三の「標
識抗原」法は本質的に、一次抗体が組織抗原とペルオキ
シダーゼに複合した類似の抗原との両方に結合するサン
ドインチ法である。

第四の「酵素橋」法においては一次および二次抗体が上
記のように結合され、さらに二次抗体にはペルオキシダ
ーゼと複合した第三の抗体が結合する。第五の「ペルオ
キシダーゼ−抗ペルオキシダーゼ」法は酵素橋法に記し
たと同、様であるがさらに、ペルオキシダーゼ−第三抗
体の次に抗ペルオキシダーゼ抗体および過剰のペルオキ
シダーゼカー結合するということが加わる。いずれの方
法においても過酸化水素お′よびレドックス色原体を加
えて、酵素−細胞化学的染色により利用し得るまたは局
在化されたペルオキシダーゼの範囲と、それにより、組
織特異的抗原とを明らかＫする。以上の一般に関しては
Ｆａｌｉｎｉら（Ａｒｃｈ、　Ｐａｔｈｏｌ、　Ｌａｂ
。

Ｍｅａ、、１０７：１０５（１９８３））を参照された
い。

アビジンはビタミンＢ複合体の一つであるビオチンに対
し高い親和力を持つ４個の結合部位を有する分子量６８
．Ｄ　Ｄ　Ｄの糖タンパク質である。この高親和性結合
は免疫組織学において前記標識抗体法に代る方法として
使用されてきた。最も簡単な方法においては、ビオチン
ー一次抗体複合体が直接細胞抗原と結合し、次に今度は
これにアビジン−ペルオキシダーゼ複合体が結合する。

別の方法においては、組織に結合したビオチニル化一次
抗体が標識されていないアビジンと結合し、次にこれに
ペルオキシダーゼで標識されたビオチンが結合する。第
三の方法においては非複合の一次抗体、ビオチニル化さ
れた二次抗体およびアビジン−ビオチン−ペルオキシダ
ーゼ複合体が使用されこのため「ＡＢＣ法ｊとも呼ばれ
る。全般についてはＦａｌｉｎｉら（前出）およびＧｕ
ｅｓａｏｎ、　Ｊ−ＬらＣＪ、　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ、
　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、＋　２７　：　１１３１−１１３
９（１９７９））を参照されたい。

以上に記したものの一例はＨｓｕ、　Ｓ−Ｍら（Ｊ。

Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ、　ｃｙｔｏｃｈｅｍ、　＋　２９
　：　５７７−５８０（１９８１））によって報告され
ており、これし１特にホルマリン固定組織中の抗原の同
定に対するＡＢＣ法の使用に関している。測定はホルマ
リン固定し、パラフィン埋包した甲状腺につき手動によ
り行われた。連続的に切片を切取り、脱パラフィンし、
アルコールから水へと通常の組織処理におけると同様に
処理した。切片を「ＡＢＣ」法によって処理し、最後に
切片を過酸化水素とジアミノベンジジン四塩酸水溶液と
インキュベートして染色反応を行った。

ヒトの白血球は単球、多形核細胞（ＰＭＮ　）およびリ
ンパ球に分類される。リンパ球には二つの主要な種類が
ある。第一のもの（胸腺由来細胞すなわちＴ細胞）は細
胞に仲介される応答を生ずる免疫学的活性があり、第二
のもの（骨髄由来細胞すなわ″ｆＯＢ細胞）は抗体を産
生ずる免疫学的活性がある。現在Ｔ細胞は「ヘルパー」
、「サプレッサー」および「キラー」Ｔ細胞と呼ばれる
少くとも数種の豆類型に分けられることが認められてお
り、それらは（それぞれ）反応を促進し、反応を抑制し
、または異細胞を殺す（溶解する）機能を持っている。

臨床的に興味のあるリンパ球の亜分類は免疫学的方法に
よる以外は容易に識別できない。これらのリンパ球の外
表面上の抗原は特異的抗体によって識別することができ
る。これらの抗原の多くが、細胞の穏オロな化学的また
は物理的処理によっても抗体結合部位が破壊されそして
（または）細胞表面から抗原が引離される結果となり得
るという意味で著しく脆弱であることが見いだされてい
ることを認識し理解することが特に重要である。

リンパ球が液体中に懸濁された状態で免疫−酵素−細胞
化学的方法により染色される場合、これらは通常生きた
ままで、高鮮明度の方法によって染色されてきた。この
場合細胞の外部表面上に着色生成物の微細な斑点を生ず
る。生成物のこの分布は不溶性の着色生成物が酵素分子
（すべて細胞の外部表面上にある）から数ナノメートル
以内に沈殿することから生ずる。生成物の半分またはそ
れ以上は拡散して細胞から離れ去る。この拡散した生成
物が沈殿する場合その多くは水性媒体中に遊離懸濁し、
細胞から抑流されまたは洗い去られる。他の部分は細胞
の方に拡散してゆき、細胞表面上の抗体および抗原分子
の中間および中に沈殿してその網目構造内に捕捉される
か、細胞膜上またはその中にまたは、もし膜が生成物を
透過し得るならば、細胞内部に沈殿する。

このように表面上に斑点を有する細胞は同じ量の着色剤
が細胞の上または内部により均一に分布している細胞に
比較して遥かに少量の光しか吸収しない。Ｂｉｎｅｔら
（Ｂｌｏｏｄ　Ｃｅ１ｌｓ、　６　：　３７１−３７６
（１９８０）’ｌ］はこのような調製物を流動式血球計
数法によって調べた（装置に関しては米国特許第’３，
７４０，１４３号明細書参照）。このように表面の斑点
状となった細胞の発する信号は弱過ぎて染色細胞と非染
色細胞との信号をはっきりと分離することができない。

さらに、同じ生きているリンパ球の全く同様な試料にこ
のような染色を繰返した場合再現性のある染色の度を得
ることが非常に困難であることが発見されたが、これは
恐らくリンパ球の表面抗原に対する損傷およびその損失
が一定でないことおよび生きている細胞が、この種の方
法においてしばしば必要であるように何回も遠心、洗浄
等の処理を受ける場合に起り得る透過性の変化が一定で
ないことに帰することができる。従って染色の度合が低
くしかも一定でないのはある程度、長々と処理を受けた
生きている細胞に対する損傷およびその細胞からの損失
が不定であることに帰することができると思われる。

゛本発明の目的はリンパ球の処理法ならびに酵素−細胞
化学的試薬溶液の組成を改変し、これにより高度に再現
性のある応答が得られるようにし、また最初に細胞の外
部表面上で生成される検出可能な酵素生成物の実質的な
童が細胞上および（または）細胞内に沈殿して、流動式
血球計数器内において未染色のおよび他のリンパ球から
生ずる信号と容易に区別できる大きな吸収信号を生ずる
ようにすることである。

本発明は不均一性細胞懸濁液中の検討対象細胞集団を検
出する流動式血球計数法を提供するものモある。この方
法は個々別々に、細胞懸濁液を前′記対象細胞集団に対
して特異的な一次抗体を含有して成る試薬および固定剤
と合一すること、酵素をその一次抗体に少くとも一つの
リガンドによって結合すること、次に一次抗体の結合し
た対象細胞を含有する前記固定細胞懸濁液をそれと検出
可能な反応を行い得る少くとも一種の組成物と合一する
こと、このように処理した細胞懸濁液を、実質的に一度
に細胞１個づつ、流動式血球計数器中で光輻射の照射光
束中を通しながら通過する細胞により散乱および吸収さ
れる光を測定すること、および、少くとも一部これらの
細胞によって散乱および吸収された光の測定に基いて対
象の集団の細胞を弁別することから成っている。本方法
に使用される抗体およびその他の試薬は細胞試料と、米
国特許第３，７４０．１４３号明細書におけると同様連
続流系内において合一するか、または流動式血球計数計
内における照明点の上流の任意の点で別個の反応室にお
いて合一することができる。

本発明によれば、この方法を種々の集団（主として白血
球の）の自動化測定に使用するとより大量の検出可能な
形のレドックス色原体が周囲の媒質から区別されて検討
対象細胞の表面上および（または）細胞内部に保持され
るようにする効果があることが判明した。従って細胞集
団の弁別を一層良好に行うことが可能となる。

本発明の方法の有用な点は、使用する検出可能な種によ
って、ある細胞特に白血球が選択的にそして濃く着色さ
れ他の細胞が染色されないということである。細胞試料
は例えば全血のものでも不均一白血球試料であってもよ
い。全血試料は、流動式血球計数器への導入前にあらか
じめ赤血球を溶解しておいたものが好ましい。

ここで使用する［特異的結合性タンパク質」なる語は、
検討対象の細胞集団に対してのみ特異的結合親和性を有
しそれ以外の物質に対しては持たない任意の物質または
物質の群を指す。本発明はその態様の大部分において、
免疫化学的に試料と相互作用する特異的結合検定試薬を
含んでいる。

すなわち、試薬および（または）検討対象の細胞集団内
の細胞と結合した抗原の間には抗原−抗体またはハプテ
ン−抗体の関係がある。従ってかかる検定は免疫検定と
呼ばれ、リガンドとその受容体、または結合パートナ−
との間の特殊な相互作用は免疫化学的結合である。特記
しない限りポリクローナルかまたはモノクローナルかの
抗体が使用される。さらに、細胞表面の弁別的特徴と結
合パートナ−との間のその他の結合相互作用がその他の
特異的結合検定の基礎とな９得ることは当業界において
よく理解されているところである。

一次の特異的結合性クンバク質は通常細胞表面標識抗原
に対して特異的な抗体である。かかる抗原は白血球、腫
瘍細胞またはその他の不均一細胞試料内の、種々の群と
して区別することが有用な集団またはサブ集団を弁別す
るものである。例えば、種々のハイシリドーマ細胞系統
からのモノクローナル抗体をはじめとして、リンパ球の
類および豆類を弁別するに有用な数種の抗体が知られて
いる。これらの中には、すべてのヒトＴ細胞、サプレッ
サーＴ細胞、ヘルパーＴ細胞等に対して指示された特異
性を有するマウスモノクローナル抗体が含まれる。かか
る抗体の他のものはヒトのＢ細胞と特異的反応性を有す
ることが知られている。

生きているリンパ球を長々と取扱うことによるこの細胞
に対する損傷および細胞からの損失を防止、または少く
とも減少するため、われわれは細胞をできるだけ早く固
定することにする。固定剤としては細胞特異的表面抗原
の化学的活性も（固定工程が最初の抗体の付与の前に行
われる場合）、この方法の以後の工程に対して必要な付
着された標識または外部に曝された第二次免疫反応性基
の化学的活性も（固定工程が最初の抗体の付与の後で行
われる場合）破壊することなしに細胞な不溶化し、かつ
細胞を相互にまたはその入って（・る容器の壁に付着さ
せることのないものが選ばれる。

モノアルデヒド例えばホルムアルデヒド、パラホルムア
ルデヒドおよびアクロレイン、およびジアルデヒド例え
ばグルタルアルデヒドの単独使用または併用が懸濁液内
の細胞に対して有用であることが判明している。例えば
、米国特許第３．７４１．８７５号明細書および第４，
４１２，００４号明細書を参照されたい。

第二次の特異的結合性タンパク質は通常、一次特異的結
合性タンパク質がその一員であるタンパク質の群、通常
免疫グロブリン、に対する抗体である。すなわち、この
二次抗体は一次抗体群のすべての抗体と反応しこれに対
し特異的である。

好ましい一態様においては、本発明の方法はまたアビジ
ン分子に結合される酵素を含有して成る試薬複合体を使
用する。本発明の方法の別の一態様においては酵素がビ
オチン分子に結合され、次にこれにアビジン分子が結合
して成る試薬複合体が使用される。かかる使用に適当な
酵素の例としてはペルオキシダーゼ（例えばわさび大根
ペルオキシダーゼ）、アルカリ性ホスファターゼ、およ
びこれらと他の酵素の組合せが挙げられる。

使用されるレドックス色原体としては、その反応した形
において反応媒質に不溶であることが絶対必要である。

本発明において有用であると確認されたものの例として
は３−アミノ−９−エチルカルバゾールおよび４−クロ
ロ−１−ナフトールが挙げられる。反応環境に相当溶解
する生成物を生ずる色原体は有用でない。

先に述べた通υ本発明によれば、一次抗体、ビオチニル
化した二次抗体、標識された複合体、酵素基質およびレ
ドックス色原体は、分析すべき細胞試料を本方法を実施
すべき流動式血球計数器に導入する前または導入した後
に、この細胞試料と合一することができる。

細胞試料は流動式血球計数器内の導管ないし分析流路中
を流れている流体流中に導入することが好ましい。これ
は好ましくは、導管ないし分析流路内に流動流体鞘流の
流れをつ〈９、次で前°記試料をこの流動流体鞘流中に
導入することから晟る。

この鞘流は通常細胞試料懸濁媒質と実質的に同一の屈折
率を有する流体から成るものである。鞘流搬送流体を使
用するこの種流動式血球計数器の一つがテクニコンヘマ
ログ（Ｔｅｃｈｎｉｃｏｎ　Ｈｅｍａｌｓｏｇ）　Ｄお
よびＨ−６０００システムに使用されているが、この装
置は日常的の血液学的試験をすべて処理するものである
。ヘマログＤおよびＨ−６０００システムに関する詳細
資料はテクニコン　インスッルメント　コーポレーショ
ン（クリタウン、ニューヨーク州）から入手できる。

本発明によれば、この方法を種々の集団の（主としてリ
ンパ球の）自動化測定に使用すると、検出可能な形のレ
ドツクろ色原体が、周囲の媒質または本分析法が特異的
であるリンパ球゛以外の試料からの他のリンパ球と区別
されて、検討対象のり７２球集団内に生成しそれに保持
される効果があることが認められた。従って細胞集団を
一層良好に弁別することが可能である。

第１図〜第１１図はそれぞれＨ−＋５０００機器システ
ム（テクニコンインスツルメント　コーポレーション、
クリタウン、ニューヨーク州）のペルオキシダーゼ流路
からの二次元表示であって、吸収は横軸に、進行方向か
らの散乱光は横軸に測定値を示しである。各点は１個の
細胞の測定座標な示している。あらかじめ設定した６個
の閾値によって測定者は明確な信号の集団を分離し数え
ることができる。吸収低（ＡＬ）および吸収高（ＡＨ）
は垂直線として、分散像（ＳＬ）は水平線として示す。

Ｈ−６０００によし、ＳＬの上ＡＬの左、ＡＬとＡＨの
間、およびＡＨの右のすべての信号に対し別個の計数が
得られる。ＳＬよシ下の信号は細胞からの信号よシ小さ
な尾のを示すのでこれはすべて無視され、これによシ赤
血球形骸、血小板等による雑音信号は除去される。

これらのリンパ球標識法はリンパ球を富化した試料およ
び全血試料のいずれにも適用される。全血は好中球、好
酸球（いずれもＰＭＮ　）および単球を含有しており、
これらはすべて内因生のペルオキシダーゼを有している
。ペルオキシダーゼ°染色後これらの細胞をペルオキシ
ダーゼで標識したリンパ球と弁別するのに一つ問題が生
ずる可能性がある。後に示すように、好酸球、好中球お
よび若干の単球ははるかに濃く染色されるので、これら
の細胞からの信号と正の（ペルオキシダーゼで標識した
）リンパ球とはＡＨ閾値により容易に分離される。ＡＬ
およびＡＨ閾値の間にある残υの弱く着色した単球は対
照実験で別個に計数し、対応する本実験におけるＡＬお
よびＡＨ閾値間の計数から差引くことができる。

また、最良のリンパ球富化試料でも少数のＰＭＮおよび
単球が混入しているのが通例である（第１〜７図参照）
。適当な対照実験数値を同様に差引くことによってこの
混入は補正される。

以下の実施例は本発明を開発するのに実施した実験を記
載するものである。可能な場合に常に、標準の市販試薬
級化学品を使用した。

例　　１ 可視および近赤外光における流動式血球計数法によるペ
ルオキシダーゼ指示側標識系を使用する免疫検定法によ
るリンパ球サブセットの検出および計数に関し従来の技
術を検討、説明する数個の実験を行った。Ｂｉｎｅｔら
（前出）により記載された方法に従って、マウス　モノ
クローナル全ＴＭ胞抗体であるＴ１０１（ヒブリテク社
、ラジョーラ、カリホルニア州）とそれに続いてペルオ
キシダーゼ複合抗マウス二次抗体（カッベル社、コクラ
ンビル、ペンシルバニア州）とを使用する「間接複合体
」法を使用した。このようにしてＴ細胞の表面に結合さ
れたペルオキシダーゼ酵素は二種の異るレドックス色原
体すなわち６−アミノ−９−エチルカルバゾールおよび
４−クロロ−１−ナフトールのいずれか一方によって染
色した。使用した方法の詳細は次の通シである： 実験Ａ リンパ球富化懸濁液はＢｏｙｕｍ＋Ａ、　［５ｃａｎｄ
、　Ｊ。

（’ｌｉｎ、　Ｌａｂ、工ｎｖｅｓｔ、　＋　２１　＋
　５ｕｐｐｌ、　９７　：　７７（１９６８））の記載
と同様にして調製した。リンパ球フラクションを採取し
細胞を中性リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ　）中に牛血清
アルブミン０．４チを含む液（ＰＢＳ　／　ＢＳＡ　）
中において４００．９で１０分間６回遠心洗浄した。上
澄液は吸引廃棄した。

最後に収穫した細胞に細胞濃度を１０７個／ｄとするに
十分なＰＢＳ／ＢＳＡを添加した。この細胞懸濁液のア
リコー）１０（ｌμｌを試験管に分注した。濃度１０μ
ｇ／ｍｌの１１０１等容（１００μｌ）を試験管に加え
４℃で６０分間インキュベートした。次に細胞をＰＥＳ
　／　ＢＳＡによ！１１１００ｇで４５秒間６回遠心洗
浄し、上澄液の９ウチを廃棄し毎回細胞沈殿物を残した
。次に細胞沈殿物を残留上澄液に再懸濁し１００μｌの
ペルオキシダーゼと複合させた二次抗体（２０μｌ／−
）を加え４℃で１時間インキュベートした。ＰＢＥＩ　
／　ＢＳＡによる洗浄操作を６回繰返した。

次にこの細胞を再懸濁し、６−アミノ−９−エチルカル
バゾール（ＡＥＣ）２ｍｇをジメチルホルムアミド（Ｄ
ＭＦ）　Ｑ、５−に溶解しこれに０．０５　Ｍ酢酸塩緩
衝液（ＰＨ５）９．５属および６％Ｈ２Ｏ２５０μｌを
加えて得た染色混合物１ｍｊＢ中で室温で１０〜２０分
インキュベートした。

次に染色混合物中の細胞懸濁液１ゴをｐＢｓ２ｍＡ’で
希釈しこの細胞を）Ｔ−６０００流動式血球計数器の流
動セル内に導入した。それにはペルオキシダーゼ流路の
流動セルに通ずる嬬動ポンプの試料管路を遮断してマニ
ホールドをバイパスし、遮断した試料管路を直接に、反
応済細胞懸濁液の入った試験管内底部に位置させた。結
果を第１図に示す。

一次抗体を使用しない以外は各工程上記と同様にして負
の対照実験を行った。対照実験の結果を第３図に示す。

第６図（対照）はリンパ球はすべてＡＬの左側にあるこ
とを示している。ＡＬとＡＨとの間の点は混入した単球
である。ＡＨの右の点は混入した好中球および好酸球で
ある。

第１図において、染色されたリンパ球はＡＬを越えてＡ
ＬとＡＨとの間にまで分布している。他のすべての細胞
は対照（第６図）と同じ所にある。

この染色は、染色されたリンパ球全部を染色されないリ
ンパ球から区分するには明かに不適当である。この理由
の一部は、これらの生きている細胞を長々と取扱うこと
により細胞表面への損傷および表面からの損失が一定で
ないことに帰することができる。

実験Ｂ 次に、実験Ａにおける染色混合物中のＡＢＣの代りに４
−クロロ−１−ナフトール２〜を使用する以外実験Ａと
全く同様の操作を行った。Ｂｉｎｅｔらは４−クロロ−
１−ナフトールを含有する彼等ノ染色混合物の詳細につ
いて特に指示を行っていないが、公表された方法に従う
ようにつとめた。結果を第２図に示すがこれは第１図に
示した結果と同様で、染色されたリンパ球と染色されて
いないものとが明瞭に識別できない。なお一次抗体を省
く以外すべての工程を前述と同様にして負の対照実験を
行った。対照実験の結果は第６図に示したものと同様で
ある。

実験に の実験においては、固定されていない細胞とＴ１０１と
を使用して「酸素橋」法を実施した。

この方法はペルオキシダーゼの結合量を増大するもので
、Ｂｉｎｅｔらの時はまだこの種の系には試験されてい
なかった。この実験においては、実験へのペルオキシダ
ーゼ複合二次抗体の代シに残シの工程としてビオケニル
化二次抗体の添加、次にＰＢＳ　／　ＢＳＡで６回洗浄
、次にＡＢＣ複合体、次にＰＢＳ　／　ＢＳＡでさらに
６回洗浄を行う他は実験Ａ、！：すべて同じ工程である
。ベクタースティン・キット（ベクターラボラトリーズ
、バーリンガム、カリホルニア州）中の二次抗体とＡＢ
Ｃとをメーカーの使用説明書に従って使用した。第４図
に示すように着色は若干増加したが、第１図および第２
図の場合と同様染色されたリンパ球と染色されないもの
とはやはり明瞭に識別することができなかった。

実験Ｄ Ｂｉｎｅｔらはときに、細胞を完全に処理した後に（す
なわち例１におけるＡＥＣによる染色工程の後に）細胞
の固定を行った。彼らの方法は、ＡＥＣ細胞懸濁液１ゴ
に０．７％ホルムアルデヒド１１ｎｌを加え、混合物を
室温に１０分間放置し、）１−６０００流動セルに導入
する前にＦＢＩ９１ｍｌで希釈する−のであった。結果
は第１図に示したものと実質的に同一であった。

本例は従来の技術が公知のいかなる改良と組合せてさえ
もリンパ球の弁別に不十分であることを示すものである
。ここに述べたあらゆる努力にもかかわらず、正と負と
のリンパ球は明確に異った集団には分離されず、再現性
は不良であった。、さらにこの従来技術は固定を行わな
いか、または操作手順内の非常に遅い′段階で、細胞が
途中の処理工程によって著しくいためつげられ、着色不
十分な細胞を生じたずっと後で、固定が行われることが
特徴である。

例　　２ ここに報告する諸実験は、ＯＫＴ　３　（オルト・ディ
アグノステイクス社、ラリタン、ニューシアージー州）
またはＴ１０１（ヒプリテク社、ラジョーラ、カリホル
ニア州）を使用する「ＡＢＣ」リンパ球弁別免疫検定を
、前例に述べたと同様にして調製したリンパ球懸濁液を
再び使用して、比較するものである。一つの実験（実験
Ａ）においては、二次抗体とのインキュベーション後に
固定工程を実施した。第二の実験（実験Ｂ）においては
同種の固定を、本発明に従い、二次抗体とのインキュベ
ーションの前に実施した。第三の実験（実験Ｃ）におい
てはＴ１０１を使用する以外第二の実験と同様の実験を
行った。

実験Ａ リンパ球富化懸濁液（例１、実験Ａと同様）のアリコー
ト１００μノ（細胞後１０６個）を清浄な試験管に分注
した。牛血清アルブミン０．４％を含むリン酸塩緩衝食
塩水（ＰＢＳ　／　ＢＳＡ　）　Ｉ　Ｑ　［］μｌおよ
びＯＫＴ　３　（全Ｔ一次抗体、濃度２５μｇ／ｍｌ＞
５μｌを加え、４℃で１５分間インキュよ一トした。エ
チレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ　）　０．３％を含む
ＰＢＳ／ＢＳＡ　（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＫＤＴＡ　）洗浄
液ｉ　ｍｌをこれに加え、過大な数の血／Ｊ’ｌ板を沈
殿させることなく細胞を沈殿させるため混合物を４５秒
間遠心した。

上澄液の９９％を吸引して廃棄し、この洗浄操作（ＰＢ
Ｓ／ＢＳＡ／ＥＤＴＡ　）をさらに２回繰返した。これ
により、ＯＫＴ３結合細胞を含む洗浄′リンパ球゛の沈
殿物を得た。

次にこれらの細胞を残留上澄液に再懸濁し、ベクター法
によって希釈した、ビオチン複合抗マウス免疫グロブリ
ン抗体（ベクターラボラトリーズ、バーリンガム、カリ
ホルニア州）１００μｌを添加した。混合物は４℃で１
５分間インキュベートした。再び、Ｐ］３Ｓ　／　ＢＳ
Ａ　／　ＥＤＴＡで６回洗浄を行った。これによりＯＫ
Ｔ３ン次抗体−ビオチン結合細胞を含有する洗浄リンパ
球の沈殿物を得た。

次に、二次抗体との反応後、細胞を残留上澄液に再懸濁
し０．０７　ＭＰＢ中ホルムアルデヒド４．６−〇液１
．０ｍｌを加え、４℃で１０分間インキュベートした。

混合物を前と同様に６回洗浄した。これにより、０ＫＴ
３／二次抗体〜ビオチン結合細胞を含有する洗浄されホ
ルムアルデヒド固定されたリンパ球の沈殿物を得た。

次にこれらの細胞を残留上澄液に再懸濁し、アビジン−
ビオチン−わさび大根ペルオキシダーゼ複合体（ＡＢＣ
り　１００μ１（９０〜１９０μ〃ｊ）と共に４°Ｃで
１５分間インキュベートした後ＰＢＳ／　ＢＳＡ　／　
ＥＤＴＡを使用して６回洗浄した。これにより固定され
たペルオキシダーゼを担持した細胞を含有する沈殿物を
得た。この沈殿物を残留上澄液に再懸濁し染色溶液のア
リコー）１．０ｄを加えた。

この染色溶液はメタノール゛ｉＱｍＪ中に６−アミノ−
９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）８■を含む液に６％
Ｈ２Ｏ２１００μｌを加え０．０５　Ｍ酢酸ナトリウム
緩衝液（ＰＨ５）で２５ｍＡ’にして調製したものであ
る。室温で１０分後、混合物にＰＢＳ　２．Ｏｍｌを加
え、嬬動ポンプによって吸引して直接にＨ−６０００の
被鞘流動セルを通し、ペルオキシ・ダーゼ流路で細胞信
号を得た。結果を第５図に示す。また一次抗体を省く以
外は各工程とも前述と同様な負の対照実験を行った。こ
の結果は第７図に示す。

第二の抗体との反応後に細胞を固定するこの方法におい
ては、染色されないリンパ球（ＡＬの左）と染色された
リンパ球（ＡＬとＡＨとの間）との間の分離が若干達成
されたことが認められる。かがる分離は取るに足シぬも
のである。

実験Ｂ リンパ球富化懸濁液のアリコート１００μｌを実験Ａと
同様に処理してＯＫＴ　３結合細胞を含有する洗浄リン
パ球の沈殿物を得た。

次にこれらの細胞を残留上澄液に再懸濁し０．０７ＭＰ
Ｂ中ホルムアルデヒド４．６　Ｔｏの液１．０フを加え
、４℃で１０分間インキュベートした。この混合物をＰ
ＢＳ／ＢＳＡ／ＥＤＴＡ　で３回洗浄した。これによシ
固定一次抗体（ＯＫＴ　３）結合細胞を含有する洗浄さ
れた、ホルムアルデヒド固定リンパ球の沈殿物を得た。

次にこれらの細胞をビオチン複合抗マウス免疫グロブリ
ン抗体、ＡＢＣ複合体、および実験Ａに述べた染色溶液
と反応させた。室温で１０分後、この混合物にＰＢＳ２
．Ｑ＋＋＋Ｊを加え前述と同様にしてｕ−６（１００流
動式血球計数器に導入した。結果を第６図に示す。

実験Ｃ 一次抗体としてＯＫＴ　３の代シにＴ１０１を使用した
以外は実験Ｂと全く同様の実験を行った。結果は第６図
の実験Ｂにおいて得られたものと実質的に同じである。

以上の通し、実験Ａ、ＢおよびＣは標識されたリンパ球
のサブセットがもはや、例１、第１．２および４図にお
けるような非標識サブセットとの連続体は形成しないこ
とを示している。すなわち標識サブセットは非標識集団
とは間隙で分離された別個の集団を形成する。この間隙
は第５図（二次抗体仮固定）では狭いが第６図（二次抗
体前固定）では非常に広く、流動式血球計数器において
細胞のサブセットを便利にかつ正確に計数し分類するの
に必要な基本的な条件を満している。間隙の広さは細胞
が操作工程中いかに早い段階で固定されたかに帰するこ
とができる。

例　　に こで報告する通し、リンパ球弁別免疫検定を本発明に従
って、０ＫＴ４（オルト・ディアグノステイクス社、ラ
リクン、ニューシャーシー州）またはコウルタークロー
ンＴ４（コウルター社、ヒアレア、フロリダ州）を一次
抗体として使用して全血試料についても実施した。一つ
の実験（実験Ａ）においては固定工程を一次抗体（ＯＫ
Ｔ　４　）とのインキュベーション後、しかし二次抗体
とのインキュベーションの前に行った。第二の実験（実
験Ｂ）においては同種の固定を一次抗体（コウルターク
ローンＴ４）とのインキュベーションの前に行つた。

実験Ａ 抗凝固処理した全血のアリコニト１００μｌを清浄な試
験管に分注した。これをＯＫＴ’４　Ｔ細胞モノクロー
ナル抗体（オルトディアグノスティックス社、ラリタン
、ニューシャーシー州）約２．５μｇ／ゴを含有する冷
等張緩衝食塩水１００μノと混合し、混合物を４°Ｃで
１５〜３０分間インキュベートした。次に０．８５％Ｎ
Ｈ，Ｏｌ溶液２ゴをよくかきまぜながら室温で添加して
赤血球を溶解した。細胞懸濁液を１５分間ｉｏｏｏｇで
遠心して白血球を採取した。白血球を回収しＰＢＳ／Ｂ
ＳＡ／ＥＤＴＡ中４°Ｃで２回洗浄し、洗浄白血球の沈
殿物を得た。

次にこれらの細胞を残留上澄液に再懸濁し、デキストロ
ース１５％を含む０．０７５　Ｍリン酸塩緩衝７．５チ
ホルムアルデヒドｍＷ　（ｐＨ６，７）　１　ｍｌヲ加
えて固定した。５〜１０分後固定した細胞をＰＢＳ　／
　ＢＳＡ　／　ＥＤＴＡで２回洗浄した。次に、固定後
、細胞を残留上澄液に再懸濁し、ビオチニル化二次抗マ
ウス免疫グロブリン抗体（１２，５μ９／ｍｌ　）０．
１Ｎと室温で１５〜３０分間インキュベートし、ＰＢＳ
　／　ＢＳＡ　／　ＥＤＴＡで２回洗浄した。洗浄した
細胞を残留上澄液に再懸濁し、アビジン−ゎさび大根ペ
ルオキシダーゼ複合体（Ａ　：　ＨＲＰ　）のＰＢＳ溶
液（ｐＢｓｍＪ当Ｊ　Ａ　：　ＨＲＰ　５０〜１００μ
ｇ）０．１　ｖｌとインキュベートした。室温で１５〜
６０分後細胞をＰＢＳ　／　ＢＳＡ　／　ＥＤＴＡで３
回洗浄し、４−り゛ロロー１−す７）−＃０．３’＃、
エタノール１６％、Ｈ２Ｏ２０，０１チを０．０２５　
Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７，５）中に含有する染色溶液
０．５　ｄと混合し室温で１０分間インキュベートした
。染色した細胞懸濁液をリン酸塩緩衝液で１ゴに希釈し
、前述したと同様に直接Ｈ−６０００流動セルを通して
吸引して第８図に示す結果を得た。なお、一次続体を省
いた以外は各工程とも前に記したと同様な負の対照実験
を行った。この結果を第９図に示す。

実験Ｂ 抗凝固処理した全血のアリコートｉ　ｏｏμノを０．８
５　ｆｙ　ＮＨ４０ｇで処理して赤血球を収獲い本例の
実験ＡＫ述ヘタト同様Ｋ　ＰＢｓ／　ＳＢＡ　／　ＥＤ
ＴＡ　テ２回洗浄した。

次に、再懸濁した沈殿物をデキストロース１５チを含む
０．０７５　Ｍ　’）ン酸塩緩衝７．５％ホルムアルデ
ヒド溶液（ｐＨ６，７）１ｍと混合して室温で５〜１０
分間細胞を固定し、ＰＢＳ　／　ＢＳＡ　／　ＥＤＴＡ
で２回洗浄した。細胞沈殿物を残留上澄液に再懸濁しＴ
４−ビオチニル化した一次抗体（コウルター社、ヒアレ
ア、フロリダ州）のＰＢＳ溶液（メーカーの使用説明書
に従って原液から希釈したもの）ｏ、２ゴと室温で１５
〜６ｏ分間インキュベートし、ＰＢＳ　／　ＢＳＡ　／
　ＥＤＴＡで２回洗浄した。得られた沈殿物を再懸濁し
アビジン−ペルオキシダーゼ（５０〜１００　ｄ／ｍｌ
　ＰＢＳ　）　０．１　ｍｌと室温で１５〜６゜分間イ
ンキュベートし、ＰＢＳ　／　ＢＳＡ　／　ＥＤＴＡと
２回洗浄した。得られた沈殿物を再懸濁し、０．０２５
Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７，５）中に４−クロロ−１−
１−７）−＃０．３り、Ｈ２Ｏ２０，０１％１．：Ｉ−
ｐ　／　−ル（またはメタノール）１６チを含む染色溶
液０．５ｄと混合し、室温で１０分間インキュベートし
た。

次に混合物にＰＢＳ２．Ｑｍ／を加え、前に述べたと同
様にして、直接Ｈ−６０００被鞘流動セルを吸引通過さ
せた。その結果を第１０図に示す。また一次続体を省く
以外各工程とも前述と同様にして負の対照実験を行った
。その結果を第１１図に示す。

これらの実験は、全血についてもリンパ球富化懸濁液と
同様優れた分離性と再現性が得られることを示している
。すなわち、二つのリンパ球サブセット（その一つは標
識されている）は別個の分離した集団を形成する。ＰＭ
ＮはＡＨ閾値の右側にある。第９図および第１１図は相
当数の単球がＡＬとＡＨとの間に来ることを示す。これ
らはそれぞれ第８図および１０図のＡＬ、ＡＨ間の計数
から差引き染色されたリンパ球の数を決定する。

これら全血法においても、例２、実験Ｂ（第６図）にお
けると同様早期固定によシ非染色リンパ球と染色リンパ
球との間に大きく有用な間隙が得られる。

【図面の簡単な説明】

第１〜１１図は流動式血球計数器を通過する細胞懸濁液
中の個々の白血球の二次元プロットにおける散乱−分散
パターンを示す説明図である。図中、各白血球は黒点で
表わされる。 第１．２および４図は未固定の白血球富化細胞懸濁液の
処理に従前技術の方法を使用して得た結果に係る。第３
図はかかる従前技術の方法に対する非標識対照実験の結
果に係る。 第５および第６図は細胞懸濁液の固定を、二次抗体を白
血球に作用させる後および前にそれぞれ行う場合に得ら
れる結果に係る。第７図は第５．６図に示したプロセス
に対する非標識対照実験の結果に係る。 第８および第１０図は全血を使用して本発明に従って得
られた結果で、それぞれ一次続体を白血球に作用させる
すぐ後および前に細胞固定を行う場合の結果に係る。第
９および第１１図はそれぞれ第８および第１０図に対す
る非標識対照実験の結果に係る。

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. （１）（ａ）不均一性細胞懸濁液を検討対象細胞集団に
   対し特異的な一次抗体を含有して成る試薬および固定剤
   と合一し、 （ｂ）酵素を前記一次抗体に少くとも一つのリガンドに
   より結合し、 （ｃ）次に前記固定された細胞の懸濁液を少くとも一種
   の組成物と反応させて、前記検討対象細胞集団を染色す
   るための前記結合された酵素との反応を生じさせ、これ
   により前記対象細胞集団の吸収および散乱性の少くとも
   一つを変化させ、（ｄ）次に前記の反応した細胞の懸濁
   液を、実質的に一度に細胞１個づつ、光束中を通過させ
   ながら通過する細胞の前記性質の少くとも一つを測定し
   、そして （ｅ）前記対象集団の細胞を、前記対象細胞の少くとも
   一つの前記性質の測定に基いて弁別することを特徴とす
   る、不均一性細胞懸濁液中の検討対象細胞集団を再現性
   よく検出する流動式血球計数法。
2. （２）酵素の前記一次抗体への結合を低分子量リガンド
   により、かつ前記一次抗体を前記細胞懸濁液と合一する
   前に行う、前項（１）に記載の方法。
3. （３）前記細胞懸濁液が実質的に赤血球を含まない不均
   一性白血球懸濁液から成る、前項（１）または（２）に
   記載の方法。
4. （４）前記細胞懸濁液があらかじめ赤血球を少くとも前
   記工程（ｄ）の前に溶解した全血から成る、前項（１）
   または（２）に記載の方法。
5. （５）工程（ａ）が先ず前記細胞懸濁液を一次抗体と合
   一し、次に少くとも前記細胞懸濁液の抗体結合細胞を固
   定剤と合一する工程から成る、前項（１）または（２）
   に記載の方法。
6. （６）工程（ａ）が先ず前記細胞懸濁液を固定剤と合一
   し、次にかくして固定された細胞を一次抗体試薬と合一
   する工程から成る、前項（１）または（２）に記載の方
   法。
7. （７）前記細胞懸濁液と一次抗体との合一が、該細胞懸
   濁液をポリクローナルまたはモノクローナル抗体と合一
   することから成る、前項（１）、（２）、（５）または
   （６）のいずれかに記載の方法。
8. （８）前記細胞懸濁液と一次抗体との合一が、該細胞懸
   濁液を一次抗体−ビオチン複合体と合一することから成
   る、前項（１）、（５）または（６）のいずれかに記載
   の方法。
9. （９）前記細胞懸濁液をアルデヒドにより固定する、前
   項（１）または（２）に記載の方法。
10. （１０）前記細胞懸濁液をホルムアルデヒドにより固定
    する、前項（９）に記載の方法。
11. （１１）工程（ｂ）が工程（ａ）後の固定され抗体を結
    合した細胞を、先ずビオチニル化した二次抗体を含有し
    て成る組成物と、次に酵素で標識した複合体を含有して
    成る組成物と合一することから成る、前項（１）に記載
    の方法。
12. （１２）工程（ｂ）が一部、細胞懸濁液をビオチニル化
    したポリクローナル二次抗体と合一することから成る、
    前項（１）に記載の方法。
13. （１３）工程（ｂ）が一部、細胞懸濁液を酵素−アビジ
    ン複合体と合一することから成る、前項（８）に記載の
    方法。
14. （１４）前記細胞懸濁液と酵素−アビジン複合体との合
    一が該懸濁液をペルオキシダーゼ−アビジン複合体と合
    一することから成る、前項（１３）に記載の方法。
15. （１５）前記細胞懸濁液と酵素−アビジン複合体との合
    一が該懸濁液をアルカリ性ホスフアターゼ−アビジン複
    合体と合一することから成る、前項（１３）に記載の方
    法。
16. （１６）前記結合工程（ｂ）がアビジン−ビオチン−酵
    素複合体を前記細胞懸濁液に添加することから成る、前
    項（８）に記載の方法。
17. （１７）前記結合工程（ｂ）がアビジン−ビオチン−ペ
    ルオキシダーゼ複合体を前記細胞懸濁液に添加すること
    から成る、前項（１６）に記載の方法。
18. （１８）前記結合工程（ｂ）がアビジン−ビオチン−ア
    ルカリ性ホスフアターゼ複合体を前記細胞懸濁液に添加
    することから成る、前項（１６）に記載の方法。
19. （１９）工程（ｃ）の前記一種の組成物が３−アミノ−
    ９−エチルカルバゾールおよび４−クロロ−１−ナフト
    ールから成る群から選ばれる色原体を含有する、前項（
    １）または（２）に記載の方法。