JPS63173963A - 免疫分析用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、補体活性により溶解作用を受けるマイクロカ
プセルであって、その内部に定量可能なマーカー物質を
有するものを用いる免疫分析用試薬の改良に関する。

〔従来技術・発明が解決しようとする問題点〕従来の免
疫分析法として、例えばラジオイムノアッセイ法（ＲＩ
Ａ法）、エンザイムイムノアフセイ法（ＥＩＡ法）等が
ある。

ＲＩＡ法は定量的ではあるが、放射性同位元素を用いる
ので使用場所が制限され、また設備が大損りとなる。Ｅ
ＩＡ法は操作が繁雑である。また、上記いずれの測定法
とも分析に数時間から数十時間という長時間を要すると
いう問題点がある。

これに対し補体による溶解作用を利用した免疫分析法は
、簡便にしかも短時間（１〜２時間）のうちに定量でき
るという利点を有する。

当該分析法は、次°の如くして行われるものである。即
ち、本方法は抗体を結合し補体活性により溶解作用を受
ける膜よりなるマイクロカプセルであって、その内部に
定量可能なマーカー物質を包含させたものを使用するも
のである。まず、上記マイクロカプセルに検体であるヒ
ト血清または血漿を接触させると、当該検体中にマイク
ロカプセルに結合した抗体に対応する抗原が含まれてい
る場合、前記抗体と検体中の抗原との間に特異的に抗原
抗体反応が生起する。これに、更に二次抗体を反応させ
ると、結合された抗原に対し二次抗体が反応する。しか
して、当該二次抗体の結合したマイクロカプセルは補体
活性による溶解作用を受けて、そこに包含されているマ
ーカー物質が溶出される。かくして溶出されたマーカー
物質を定量して、検体中の抗原の定量が行われる。なお
、検体中にマイクロカプセルに結合した抗体に対応する
抗原が含まれていない場合には二次抗体は結合しないの
で、補体活性によるマイクロカプセルの溶解は生起せず
、マーカー物質の溶出も起こらない。

ところで、検体であるヒト血漿または血清中には２０〜
３０ＣＨｓｏ／＋ｗｌの補体が含まれている。

しかし、このヒト由来の補体は補体価が低く、しかも通
常の採血および保存方法では補体価の低下が起こるため
利用されることがなく、代わりにモルモット補体を別個
に添加することが一般的である。この際、検体中に含ま
れるヒト由来補体の影響を除くために検体を予め予備希
釈する必要がある。このため検体予備希釈の操作が加わ
るばかりでなく、検体中の抗原濃度が低い場合、陰性と
判定してしまう懸念があり、測定の精度に問題がある。

本発明の目的は、補体による溶解作用を利用する、マイ
クロカプセルを用いた免疫分析試薬において、上記に示
すような予備希釈等に付随する問題点を解消することに
ある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは上記の実情に鑑み種々研究を重ねた結果、
補体としてモルモア）補体等を新たに添加するのではな
く、検体であるヒト血清または血漿中に含まれる補体を
用いることにより上記目的が達成されることを見出した
。

すなわち、本発明は抗体を結合し、補体活性により溶解
作用を受ける膜よりなり、内部に定量可能なマーカー物
質を包含するマイクロカプセルよりなり、補体として検
体であるヒト血清または血漿中に含まれる補体を用いて
なる免疫分析用試薬であって、検体であるヒト血清また
は血漿としてＭｇ　２＋、Ｃａ２＋の添加時にこれらイ
オンが実質的に損失しないものまたは保存時に補体が失
活しないものを用いることを特徴とする免疫分析用試薬
に関する。

本発明で使用されるマイクロカプセルとしては、ヒト補
体活性により溶解作用を受ける膜よりなるものであれば
特に制限はなく、好適には、ヒト赤血球（特に、０型赤
血球）、リポソーム（特開昭６１−９９８６７号）等が
使用される。

本発明で使用されるリポソームには特に制限はなく、た
とえばリン脂質よりなるもの（必要に応じてさらにＩｉ
類を添加したもの）が例示され、その構造としても、マ
ルチラメ′ラベシクル、スモールユニラメラベシクル、
ラージユニラメラベシクル、リバースフェーズエバボレ
ーシロンベシクルなど特に制限はない。

マイクロカプセル内部に包含される定量可能なマーカー
物質としては、本発明の目的に通い、かつかかる機能を
有するものであれば特に制限はなく、赤血球の場合はヘ
モグロビンであり、リポソームの場合はカルボキシフル
オレセインのような螢光物質、ルミノールやルシフェリ
ンのような発光性化合物、特異的吸収帯を有する吸光性
化合物（水溶性色素等）等が好適に用いられる。

マイクロカプセルに感作させる抗体は被検目的（被検抗
原）に応じて適宜選択される。例えば、後記被検物質と
して列挙した抗原に対応する抗体が例示される。

当該抗体は動物への免疫、モノクローナル抗体作製の通
常技術等〔免疫学実験入門（学会出版センター）、モノ
クローナル抗体（講談社）等参照〕によって製造される
。

抗体のマイクロカプセルへの結合（感作）は、公知の方
法に従えばよい。対象が動物赤血球の場合、抗体の結合
はたとえば、公知の塩化クロム法により行われる。また
リポソームへの抗体の結合は、例えばＬｅＳｅｒｍａｎ
等の方法（Ｎａｔｕｒｅ、　２８８．６０６−６０４．
１９８０）＋　Ｍａｒｔｉｎ等の方法（！１ｉｏｃｈｅ
ｍｔｓｔｒｙ＋　２（Ｌ４２２９−４２３８．１９８１
）により行われる。

本発明で使用される補体は、検体であるヒト血清または
血漿から供給される（ヒト血清または血漿中には一般に
平均２０〜３０ＣＨｓｏ／ｍｌ程度の補体が含まれてい
る）。検体はＭｇ　２＋、　Ｃ３２ｔの添加時にこれら
のイオンを実質的に損失しないこと〔即ち、検体を測定
する時、補体を活性化するためにＭ　ｇ２中、Ｃａ２十
（たとえば、ベロナール緩衝液）を添加するが、このＭ
ｇ　２＊、（、Ｂ　２１を検体が損失せしめない（吸収
しない）ごと又は／及び保存時に補体が失活しないこと
の条件を満足するものであれば特に制限はない、このよ
うな補体を供給することの出来る検体としては、たとえ
ば補体の活性化に必要なＭｇ　２◆、Ｃａ　”を損失せ
しめないようにするためにクエン酸採血以外の方法を使
用すること〔例えば、■ヘパリン採血などを使用して採
血された血簗であること：■低温（通常２〜６℃、好ま
しくは４℃程度）保存にて脱フィブリンした血清である
こと〕　；■補体価の低下、被検物質の失活の防止、分
離および無菌性を維持するために検体を冷蔵または凍結
保存しておくことがより好ましい。上記条件中、特に■
または■の検体であることが好ましい。

本発明の試薬による測定は、次のようにして行われる。

まず、抗体結合（怒作）マイクロカプセルと検体（たと
えば、ヒト血清または血漿）とを反応させた後、さらに
二次抗体を反応させると同時に検体中に含まれる補体に
より溶解をおこさせる。溶解後、上澄液中のヘモグロビ
ンまたはマーカー物質を、たとえば吸光度で測定し、検
体中の抗原等を測定する。即ち、検体中に測定を意図す
る抗原が存在しなければ、二次抗体が反応せず、ひいて
は補体による溶解現象が起こらず、マーカー物質の溶出
もないので、陰性となる。逆に測定を意図する抗原が存
在すれば、反応した当該抗原にさらに二次抗体が反応し
、補体による溶解現象が起こるので、溶出して来たマー
カー物質を測定して定量が行われる。

二次抗体としては、各種哺乳動物に目的とする抗原（被
検物質）を免疫して得られたポリクローナル抗体、具体
的にはウサギやウマ由来のポリクローナル抗体が使用さ
れる。

被検物質としてはＡＦＰ　（アルファーフェトプロティ
ン）、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、β２−ミクログロブリ
ン、ＣＡ（カルボハイドレート・アンティゲン）１９−
９等の各種癌抗原、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ、Ａｎｔ　
１ＨＢｓ、ＨＴＬＶ　（ヒユーマン・Ｔセル・ロイケミ
ア・ウィルス）−１１ＨＴＬＶ−ＩＩＩ等のウィルス関
連の抗原・抗体、更には血中の各種ホルモンやＩｇＧ等
の血漿蛋白質が好適に例示される。

〔効果〕

本発明は、検体であるヒト血清または血漿の予備希釈操
作を必要としない、新たなヒト補体またはモルモット補
体などの添加操作を必要としない、検体を希釈する必要
がない等の特徴を有するので、検査における操作が簡単
でしかも測定感度が上昇するなどの優れた効果を有する
ものである。

〔実施例〕

本発明をより詳細に説明するために実施例を挙げるが、
本発明はこれらにより同等限定されるものではない。

実施例１ マイクロカプセルとしてヒト０型赤血球を用い、ＡＦＰ
陽性ヒト血清に関し、本発明に係る試薬、即ち検体中に
存在する補体を用いた場合の血清中のＡＦＰ濃度と、添
加ヒト補体を用いた場合の血清中のＡＦＰｔ１度を、Ｒ
ＩＡ法で求めた血清中のＡＦＰ濃度とを比較した。

まず、ヒト補体を添加する方法について説明する。４倍
希釈したヒト検体血清５０Ｐｔを抗ＡＦＰマウスモノク
ローナル抗体結合ヒト０型赤血球（ヘマトクリット値３
％（Ｖ／Ｖ）３５０μに添加し、３７℃、５分間反応さ
せた。次に、抗ＡＦＰウマス抗体（濃度１ｍｇ／ａ＋１
）　５０μを添加して３７℃、５分間反応させ、更にベ
ロナール緩衝液にて希釈し、４ＣＨ（資）／　ｍ　ｌと
したヒト補体１ｍｌを加え３７℃、３００分間反応せた
後、低速遠心し、その上澄液中のヘモグロビンの吸光度
（４１４ｎｍ）を測定した。この値を上記に準じた方法
で既知量の抗原を用いて得た標準曲線と対比させて含有
ＡＦＰ濃度を求めた。

これに対して検体中に存在する補体を用いた方法につい
て次に説明する。原液のヒト検体血清５０μを抗ＡＦＰ
マウスモノクローナル抗体結合ヒト０型赤血球〔ヘマト
クリット値３％（Ｖ／Ｖ））５０Ｐｌに添加し、３７℃
、５分間反応させた。更に、抗ＣＥＡウマ抗体（濃度１
ｍｇ／ｍｌ）　５０ｐ＃を添加し３７℃、３００分間反
応せ、次いでＥＤＴＡ溶液１溶液１加ｌて反応を停止さ
せ、後は前述した方法と同様に含有ＡＦＰ濃度を求めた
。この結果を第１表に示した。ＲＩＡ法による値と本発
明の検体中の補体を用いる方法の値とは低いレベルまで
一致したが、ヒト補体を添加する方法では検体血清を希
釈したためＡＦＰ濃度の低い検体は測定できなかった。

実施例２ マイクロカプセルとしてリポソームを用い、実施例１と
同様のことをＣＥＡを対象に行った。

まずヒト補体添加法について説明する。１０倍希釈した
ヒト検体血清２５Ｐ４を抗ＣＥＡマウスモノクローナル
抗体と結合し螢光物質（カルボキシフルオレセイン）を
封入したリポソーム（脂質濃度１０μＭ）５μに添加し
、３７℃、５分間反応させた０次に抗ＣＥＡウマ抗体（
濃度０．１　ＩＩＩｇ／ｍ１）２５ＩＪを添加して３７
℃、５分間反応させ、更にベロナール緩衝液にて希釈し
、５　ＣＨｓｏ　／ｍｌとしたヒト補体２５μを加え、
３７℃、３００分間反応せた６次にＥＤＴＡ溶液１５０
ｐＪを加え反応を停止させた後、螢光強度を測定した。

この値を実施例１と同様に標準曲線と対比させ、含有Ｃ
ＥＡ濃度を求めた。

次に検体中に存在する補体を用いた方法について説明す
る。原液のヒト検体血清２５Ｐ４を抗ＣＥＡマウスモノ
クローナル抗体結合リポソーム（脂質濃度ｌＯμＭ）５
ｕＪに添加し、３７℃、５分間反応させた。更に抗ＣＥ
Ａウマ抗体（濃度ｏ、１ｍｇ／ｍ１）２５／１ｊを添加
して３７℃、３００分間反応せ、次いでＥＤＴＡ溶液１
５０−を加えて反応を停止させ、後は前述した方法と同
様に含有ＣＥＡ濃度を求めた。その結果を第２表に示し
た。ＲＩＡ法による値と本発明の検体中の補体を用いる
方法の値とは低いレベルまで一敗したが、ヒト補体を添
加する方法では検体血清を希釈したためＣＥＡ濃度の低
い検体は測定できなかった。

第１表　ＲＩＡ法と本発明法とのＡＦＰ定量に関する比
較 第２表　ＲＩＡ法と本発明法とのＣＥＡ定量に関する比
較 なお、実施例１および実施例２で使用したヒト血清は、
ヒト血清を４℃保存にて脱フィブリンした血清である。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）抗体を結合し、補体活性により溶解作用を受ける
   膜よりなり、内部に定量可能なマーカー物質を包含する
   マイクロカプセルよりなり、補体として検体であるヒト
   血清または血漿中に含まれる補体を用いてなる免疫分析
   用試薬であって、検体であるヒト血清または血漿として
   Ｍｇ＾２＾＋、Ｃａ＾２＾＋の添加時にこれらイオンが
   実質的に損失しないものまたは保存時に補体が失活しな
   いものを用いることを特徴とする免疫分析用試薬。
2. （２）検体としてヘパリン採血により得られるヒト血漿
   または低温保存にて脱フィブリンした血清を使用するこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第（１）項記載の免疫分
   析用試薬。