JPH0572208A - 単クローン性抗体を使用する免疫学的、抑制試験 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 簡便かつ正確なイムノメトリックアッセイ法
を提供すること。 【構成】 抗原性物質を含有する液体試料に第１抗体と
第２抗体を接触させて、当該抗原性物質と当該第１およ
び第２抗体からなる三元複合体を形成せしめる工程を含
むイムノメトリックアッセイ法において、当該第１およ
び第２抗体としてそれぞれ当該抗原性物質に対して少な
くとも約１０⁸リッター／モルの親和性を有する単クロ
ーン性抗体を使用する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、血清などの液体中にお
ける抗原性物質を検出および／または該物質の濃度を測
定する方法に関する。また、本発明は免疫学的、抑制試
験法に関する。更にまた、本発明は単クローン性抗体に
関する。

【０００２】

【従来の技術】種々の身体的疾患に伴う、例えば血清も
しくは他の体液中の抗原性物質の存在もしくは濃度の決
定は、近時ますます免疫学的測定法に頼る傾向となって
きている。この方法は、検査すべき抗原性物質と抗体
(１または複数)との間における錯体の形成に基いてお
り、該錯体の１もしくは他の成分が、例えば¹²⁵Ｉなど
の放射性物質により標識され、それによって錯化された
標識抗原もしくは抗体と錯化されなかった標識抗原また
は抗体とを分離した後、抗原の検出および／または定量
分析が可能となる。競合免疫学的測定法においては、存
在を試験すべき流体試料中の抗原物質と既知量の標識抗
原とが限定量の抗体の結合サイトを奪い合う。かくし
て、抗体に結合した標識抗原の量は試料中の抗原の量に
反比例する。これとは対照的に、免疫学的測定では標識
抗体を使用する。かかる検定においては、前記錯体に関
与する標識抗体の量は流体試料中の抗原性物質の量に比
例する。免疫学的検定は、とりわけ多価抗原、即ち同時
に２またはそれ以上の抗体と錯化し得る抗原性物質の検
出に対して適していることがわかった。このような検定
は、典型的には被検流体試料中に不溶な固体担体を結合
した標識されていないある量の抗体および放射性同位体
などの標識を有するある量の可溶性抗体を利用し、該同
位体によって固相抗体、抗原および標識抗体との間に形
成される三元錯体の検出および／またはその量の定量的
見積りが可能となる。当業界において公知の免疫学的検
定においては、典型的には“前"検定が利用され、ここ
では固相に結合した抗体を、まず被検試料と接触させ
て、二元固相抗体即ち抗原錯体を形成することによって
抗原を試料から抽出する。適当なインキュベーションの
後、該固体担体を洗浄して、存在するかもしれない未反
応抗原を含む流体試料の残渣を除去し、次いで既知量の
標識抗体を含む溶液と接触させる。

【０００３】該標識抗体を、標識していない抗体を介し
て固体担体に結合した抗原と錯化することを可能とする
第２のインキュベーションの後、該固体担体の２度目の
洗浄を行って、未反応の標識抗体を除去する。抗原が被
検試料中に存在するか否かを決定するための簡単な“イ
エス／ノー"試験において、洗浄した固体担体は、例え
ば標識が放射性元素である場合には放出される放射能を
測定することにより、標識抗体の存在を検出するために
試験される。検出された標識抗体の量は、該抗原を含ま
ないことが知られている負の対照試料に対する値と比較
される。負の対照により示されるバックグラウンド水準
を実質的に越える量で標識抗体を検出することは、問題
とする抗原の存在を示すものと解釈される。定量的検出
は、標識抗体の量と該抗原の既知量を含む較正試料につ
いて得られた量とを比較することにより達成することが
できる。この種の検定はしばしば「２−サイト」もしくは
「サンドウィッチ」検査といわれる。というのは抗原がそ
の表面の異なった位置に結合した２つの抗体を有するか
らである。このおよびこれに関連する技術はＷideの「放
射線免疫検定法(Ｒadioimunoassay Ｍethods」１９９〜
２０６頁（１９７０)，Ｋirkham ＆ Ｈunter監修、Ｅ．
＆ Ｓ．Ｌivingstone，Ｅdinburghに記載されている。
¹²⁵Ｉ標識抗体を使用する血清肝炎に関連する抗原の検
出のためのこの技術による検定は米国特許第３,８６７,
５１７号に記載されている。これらの大きな有用性にも
かかわらず、従来の免疫学的検出法は時間のかかる手法
であることが認識されている。というのは一部には二度
の洗浄工程が必要とされるからであり、また平衡即ち時
間の増加に伴う形成された錯体の量の変化が生じなくな
る点、の達成のために長期に亘るインキュベーションが
必要とされることによる。

【０００４】この方法に関連する洗浄工程の少なくとも
１つを排除するために、いわゆる“同時"および“逆"検
定法が提案されている。同時検定法は固体担体に結合し
た抗体および標識抗体両者が同時に被検試料に添加され
た際におけるただ１度だけのインキュベーション工程を
含んでいる。このインキュベーションの後、固体担体を
洗浄して流体試料の残渣並びに錯化しなかった標識抗体
を除去する。該固体担体と会合した標識抗体の存在は、
次いで従来の“前"サンドウィッチ検定におけるように
して検出される。逆検定法は段階的添加を含み、その第
１は標識抗体溶液の流体試料への添加であり、引き続き
適当なインキュベーションの後固体担体に結合した標識
されていない抗体の添加が行われる。第２のインキュベ
ーション後、該固体相を常法に従って洗浄して、被検試
料の残渣並びに未反応標識抗体の溶液を除去する。次い
で、固体担体と会合した標識抗体の決定は同時並びに前
検定法におけると同様にして行われる。同時並びに逆検
定法両者においては、存在する抗原の殆どもしくは全て
を結合するために十分に過剰量の固相抗体を使用して、
人為的に負のもしくは低い抗原量が極めて高い抗原濃度
の下で観察される高量フック作用（high dose hook eff
ect）を避けることが必要とされる。このために、前検
定法が当業者にとっては好ましい方法であった。これが
前検定法が当業者によって好まれる理由である。またこ
れが、十分な抗原結合能を有する固相を製造するため
に、問題とする抗原に対して特異的な、高純度の、活性
な抗体を、従来法において使用されていた“多クローン
性"抗体から大量に得ることが困難であった理由であ
る。免疫原性物質が生体中に導入された場合、該生体の
免疫系が該免疫原性物質を認識する免疫原上の各サイト
に抗体を生成することにより応答する。大きな免疫原性
蛋白分子は数十のサイトを有し、異種細胞は数百のサイ
トを有し得る。かくして、細胞をつくる各抗体は単一の
抗原性サイトに対して特異的な抗体をつくるが、免疫系
は認識された各免疫原性サイトに対して、細胞をつくる
特異的抗体種を発生する。更に、生体は問題とする抗原
以外の抗原に対する抗体を比較的大量に生成するので、
多クローン性混合物中の抗体の大部分は問題とする抗原
に対して特異的ではない。従って、従来の免疫学的検査
において使用されていた抗体は必然的に“多クローン
性"であった。というのは、この抗体が動物中に普通の
様式で生じる抗血清から誘導され、かつこれらの精製が
困難であるからである。かかる抗体の親和性精製法は一
般に時間のかかる、低収率を与える、かつ高い親和性の
抗体の損失をまねくものであった。

【０００５】前記逆および同時検定において、従来の多
クローン性抗体混合物を使用した場合、異ったサイトに
おいて抗原と錯化する、２またはそれ以上の標識抗体に
より錯化された抗原を含む“サンドイッチ"の形成が可
能である。被検試料中における可溶性を維持し得るこれ
らの錯体は次の洗浄工程により除去されるので、固相が
固相に結合した標識抗体について分析される際には計算
されない。これがかなりの程度で起こった場合、検定の
感度は減少し、誤った結果を与える。しかしながら、標
識されていない結合抗体を、前記の前サンドイッチ検定
におけるようにまず試料に添加すると、立体的考察か
ら、標識抗体が排除され、かつ抗原に結合されている、
２またはそれ以上の標識されていない抗体に錯化された
抗原を含むサンドイッチの形成が妨げられる。従って、
該抗原は標識抗体分子と自由に反応する。それにもかか
わらず、固相に結合した大過剰の標識していない抗体を
使用して可溶性標識抗体による可溶性錯体の形成を最小
化することによって、ヒト甲状腺刺激ホルモン（ＨＴＳ
Ｈ）に対する同時検定法を利用することが提案されてい
た。Ｊeong等の“ヒト甲状腺刺激ホルモン（ＨＴＳＨ）
の検出に適用される放射線免疫検定（ＲＩＡ）と固有の
単一−インキュベーション２−サイト免疫学的放射線検
定（ＩＲＭＡ）との比較"Ｂio−Ｒad Ｌaboratories，
１９７９参照のこと。同時検定の変法が米国特許第４,
１７４,３８４号に記載されている。この検定において
は、抗免疫グロブリンＩgＧ（ヒト）の別々の部分が夫
々蛍光性発色団（フルオレセイン）および発色団（ロダ
ミン)、これはフルオレセインから放出される光を吸収
する、によって標識される。可溶性状態にある両抗体は
ヒトＩgＧを含む試料と接触させられる。抗−ＩgＧとＩ
gＧとの反応は１００Åもしくはそれ以下の相互に十分
近接した二種の発色団をもたらし、蛍光性発色団により
発せられた光は他方の発色団により吸収（消光）され
る。試料の最大蛍光の割合を決定し、試料中のＩgＧの
量の尺度として使用される。ＨＴＳＨ、肝炎関連抗原
（ＨＡＡ）および癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に対して、標
識抗体を保証するのに十分な標識抗体の量、ただし抗原
錯体を形成するが、試料中に存在するすべての抗原の
“サンドイッチ"を形成するには不充分な量を使用する
ことにより逆検定を応用することが提案されている。米
国特許第４,０９８,８７６号参照のこと。

【０００６】当業者に公知の３つのすべての手続きが抗
体の多クローン性混合物を使用しているので、試験すべ
き抗原以外の流体もしくは血清中の他の物質との交叉反
応の可能性が大きくなる。他の抗原との交叉−反応性の
出現はまた、問題とする抗原の試験の感度を感じ、かつ
“誤った−正"の検定の可能性を増す。更に、同時もし
くは逆検定において多クローン性抗体を使用すること
は、固相抗体および／または存在する抗原の量に関して
使用すべき標識抗体の量の注意深い考察を必要とする。
蛍光の消光を利用する場合には、感度が低い。これは蛍
光発色団と消光発色団との間の最小間隔が、多クローン
性抗体を使用した場合には、保証されないことになる。
これら諸欠点から、当業界において公知の免疫的手法の
限界はまったく明らかである。従来の前検定はより少な
い工程数で達成されるが、大量の固相特異的抗体を必要
とし、かつ低濃度の抗原の検出には不適当である。なん
となれば、抗原と多数の標識抗体分子とのサンドイッチ
の形成が、結合した抗体、抗原、標識抗体を含むサンド
イッチの形成と競合し、もしくは蛍光の消光を利用する
場合には、蛍光発色団と消光発色団との対形成なしに、
サンドイッチが形成される可能性がある。しかも抗体の
多クローン性に基く正の誤差の誤った解釈に導く。

【０００７】

【発明が解決しようとする問題点】従って、本発明の目
的の１つは抗原性物質に対する改良された免疫学的検定
法を提供することである。更に詳しくは、本発明の目的
はより短時間の免疫検定法を提供することである。本発
明の他の目的はより感度の高い免疫検定法を提供するこ
とである。本発明の更に別の目的は改良された“同時"
並びに“逆"免疫検定法を提供することである。更に別
の本発明の目的は、改良された阻害試験法を提供するこ
とである。上記並びに他の目的が本発明によって実現さ
れる様式は以下に示す詳細な記載から明らかとなろう。
本発明によれば、免疫検定において使用される多クロー
ン性抗体、例えば固体担体に結合した未標識抗体、およ
び可溶性標識抗体として使用される抗体または蛍光消光
による検定の場合には蛍光もしくは消光発色団を有する
抗体は少なくとも１および通常は２またはそれ以上の異
る単クローン性抗体、即ち単一の抗原性サイトに対して
特異的で、単一の細胞系からのクローンによって別々に
つくられる各抗体、によって置換される。

【０００８】

【問題点を解決するための手段】本発明によれば、流体
試料を検査するための免疫検定法が提供され、この方法
は抗原性物質、第１抗体および第２抗体(ただしこの第
２抗体は第１抗体とは異ったサイトにおいて抗原と結合
している)の三元錯体を、試料と該第１および第２抗体
とを接触させることにより形成することを含み、該第１
および第２抗体夫々に対して単クローン性抗体を使用す
ることにより改良した方法である。本発明の好ましい具
体例においては、固体担体に結合する抗体として使用さ
れる単クローン性抗体は、標識抗体に使用する単クロー
ン性抗体とは違った細胞系の生成物であり、これら２種
の単クローン性抗体は相互に異ったサイトにおいて抗原
性物質を結合するように選ばれ、抗原に対する他の抗体
の結合が阻害されないようにする。蛍光消光の場合に
も、これら２種の抗体は通常違った細胞系の生成物であ
り、他の抗体の結合を阻害しないように、かつ２種の発
色団が十分に近接して(即ち、通常は約１００Å以内)蛍
光の消失が可能となるように選ばれる。本発明の、特に
同時並びに逆検定法の、従来技術に勝る利点は添付図の
考察および以下の本発明の詳細な記載から明らかとなろ
う。また、本発明によれば、単クローン性抗体は阻害試
験においても使用される。このような試験において、既
知量の抗原および単クローン性抗体が、該単クローン性
抗体に添加された既知抗原に対応する抗原を含む、問題
とする試料と接触させられる。抗体と抗原との間の錯体
の阻害が、単クローン性抗体と試料からの抗原とを含む
錯体が形成するために生じ、その程度は被検定試料中に
おける抗原の存在および／または量の尺度となる。

【０００９】更に、本発明によれば、以下の工程を含
む、流体中の抗原性物質の存在もしくはその濃度を決定
する方法が提案される: (a) 流体試料を、添加された既知量の抗原性物質およ
び抗原性物質と結合する単クローン性抗体と接触させる
工程、および (b) 該抗体と添加された抗原性物質との間の錯体の形
成の阻害を、該単クローン性抗体と該流体内の抗原性物
質とを結合して第２の錯体を形成することにより測定す
る工程。 好ましい具体例においては、抗体と抗原とは夫々一対の
蛍光発色団と消光発色団の一方のものと結合する。標識
抗原と抗体との間の錯体の形成を、被検試料中の抗原に
より阻害することにより、消光の程度の減少および蛍光
の増大が起こる。消光の阻害の程度は、試料中における
抗原濃度の尺度である。他の好ましい阻害試験の具体例
においては、既知の抗原と抗体との元の錯体は、凝集体
形成を可能とする大きさの例えばラテックス粒子などの
粒子に結合する。抗原を含む、問題とする試料を抗体と
接触させて抗原を結合させる場合、凝集体形成の阻害
が、凝集体を形成し得ない試料の抗原と結合した抗体と
の間で錯化が起こるために生じる。凝集の減少は濁度測
定法を利用することにより測定することができる。上で
述べたように、本発明によれば抗原性物質に対する免疫
学的検定法において使用されていた多クローン性抗体が
単クローン性抗体で置換される。同様に、単クローン性
抗体が抑制試験において使用される。本発明は、多価抗
原性物質を含めて、極めて広範な種々の抗原性物質の存
在もしくはその濃度の決定のために有用である。従っ
て、本明細書で使用する用語「抗原」または「抗原性物質」
は抗体を生成する広範囲の物質を意味する。このような
物質として、特にハプテン、ホルモン、例えばインシュ
リンおよびヒト甲状腺刺激ホルモン(ＨＴＳＨ)、γ−グ
ロブリン、アレルゲン、ウイルス、ウイルスサブユニッ
ト、細菌、強縮に関るもの並びに動物毒液などの毒素お
よびある種の薬剤などを例示することができる。本発明
の方法によって検定することのできる特定の抗原として
は癌胎児性抗原(ＣＥＡ)、肝炎ウイルスＡおよびＢ、肝
炎ウイルスノン(Ｎon)ＡおよびノンＢ、ＩgＥ並びにα
−フェトプロティンを例示することができる。

【００１０】本発明において有用な単クローン性抗体は
Ｍilstein ＆ Ｋohlerにより論議され、Ｎature，２５
６，４９５〜４９７（１９７５）に報告された方法によ
って得ることができる。この方法の詳細は周知であり、
ここであらためて述べるにはあたらないであろう。しか
しながら、基本的にはこの方法はネズミもしくは他の適
当な動物に免疫原を注射することを含んでいる。このネ
ズミは次いで殺され、その脾臓から取り出された細胞を
骨髄細胞で融解する。得られるものはハイブリッド細胞
で「ハイブリドーマ」と呼ばれ、生体外で再生される。
ハイブリドーマの集団を篩別し、個々の分枝系を単離す
るように処理され、各分枝系は抗原に対する単一の抗体
種を分泌する。このようにして得られた個々の抗体種
は、免疫原性物質上で認識された特定の抗原性サイトに
応答して生成された、免疫性動物からの単一Ｂ細胞の生
成物である。免疫原性物質が生きている宿主中に導入さ
れた場合、該宿主の免疫系は該免疫原性物質上の認識し
得るすべてのサイトに対する抗体を生成することにより
応答する。侵入物に対抗するために抗体を生成するこの
ような“ショットガン"的対応は該免疫原性物質に対し
て異った親和性並びに特異的性を有する抗体の生成に導
く。従って、種々のハイブリドーマ細胞系を選別して、
所定の抗原に対する抗体を製造するものを固定した後、
個々のハイブリドーマ細胞系によって生成された抗体を
選別して、本発明において使用することを決めるに先立
って、固有の生産を模倣する免疫原性物質に対して最も
高い親和性を有するものを固定することが好ましい。こ
の基準に基く選択が従来法において使用された多クロー
ン性抗体と比較して、単クローン性抗体を使用する本発
明の免疫学的検定並びに抑制試験における高い感度を達
成するのに役立つものと考えられる。該多クローン性抗
体は抗原に対する親和性として、よくても免疫系により
生産されるすべての抗体の親和性のほぼ平均値を有する
にすぎない。選ばれたクローン性抗体は所定の感度に匹
敵する親和性を有し、対象とするテスト系に対する範囲
内にあることが好ましい。抗体は少なくとも１０⁸リッ
ター／モル、更に好ましくは少なくとも役立１０⁹リッ
ター／モルの親和性を有することが望ましい。

【００１１】更に、最も高い親和性を有するこれらの単
クローン性抗体を、従来の多クローン性抗体を使用した
方法で誤った正の結果を与えることが知られている試験
体について模擬検定を行うことにより、更に選別して、
交叉反応を示さずかつ誤った正の結果を与えない単クロ
ーン性抗体を同定することができる。２サイト免疫学的
検定は抗体:抗原:抗体サンドイッチの形成に基いている
ので、通常抗原に対する相互の結合を妨害しない２種の
異った単クローン性抗体が結合抗体および可溶性標識抗
体もしくは蛍光消光法が使用された際における抗体対と
して選ばれる。二者が前記サンドイッチを完成するのに
必要とされるので、逆並びに同時検定は、例えば標識抗
体:抗原:標識抗体なる錯体が形成されるという懸念なし
に行うことができ、かかる錯体の形成は固相と結合する
抗体と抗原との間の錯体形成を妨害する。ここに本発明
の特別の利点がある。更に、前検定は中間的洗浄工程を
経ることなしに達成できる。というのは前記２種の抗体
が２種の異ったサイトに結合するからである。我々はこ
のような方法を“急速前(fast forward)"検定と呼ぶ。
しかしながら、特に前検定の場合において、抗原性物質
が十分な間隔を有する同等な抗体結合サイトを有してお
り、その結果／より多くの抗体分子が同時に結合するこ
とが可能である場合には、同一の単クローン性抗体を標
識抗体並びに固体担体に結合した抗体、両者に対して使
用することができる。このような系において、初めに試
料に結合抗体を添加することにより、サンドイッチの形
成が阻止されるが、これは立体的障碍によるものであ
る。次いで標識単クローン性抗体が添加されると、固体
担体上の未標識抗体と結合した抗原と錯化することも可
能である。

【００１２】被検試料から抗原性物質を抽出するための
本発明の方法において使用する未標識単クローン性抗体
は免疫学的検定において普通に使用されているいずれか
の担体上に固定することができる。これらの中で濾紙、
プラスチックピーズもしくはポリエチレン、ポリスチレ
ン、ポリプロピレンもしくは他の適当な物質でつくられ
た試験管を例示することができる。また、アガロース、
架橋デキストランおよび他のポリサッカライドなどの粒
状物質も有用である。抗体をこのような物質に結合する
ための方法は当業者には周知のことである。例えば、抗
体を米国特許第３,６４５,８５２号に記載された方法を
利用することにより、ポリサッカライドポリマーに結合
することができる。本発明において使用する標識単クロ
ーン性抗体には従来の免疫学的検定において使用されて
いるものと同じ標識を与えることができる。この中で、
蛍光法による検定に対しては米国特許第３,９４０,４７
５号に記載されているように蛍光発光性標識を、米国特
許第３,６５４,０９０号におけるような酵素系標識を例
示することができる。現在のところ、抗体を¹²⁵Ｉなど
の放射性同位元素によって、例えばＨunter ＆ Ｃreenw
oodのＮature、１４４、９４５（１９６２）に記載され
たもしくはＤavid等のＢiochewistry，１３，１０１４
〜１０２１（１９７４）に記載された手法を利用して、
標識することが好ましい。典型的検定においては、不溶
性サンドイッチ錯体と会合する標識抗体の量は適当な手
段によって不溶状抗体物質を検査することによって決め
られる。しかしながら、被検流体試料中の抗原の存在も
しくは不在を、検定中に反応せずに可溶形で残された標
識抗体の量に関連ずけることも可能である。多クローン
性抗体と比較して、単クローン性抗体を使用する本発明
の免疫学的検定の利点は以下の実施例を参照することに
よって理解されよう。この実施例においては、４つの対
照検定、同時検定、逆検定、前検定および「急速」前検定
を、単クローン性抗体および多クローン性抗体を使用
し、かつ正の試料としてヒトＩgＥを１００ＩＵ／ml含
有する標識血清を使用して行った。負の対照として、Ｉ
gＥを含まない常態の馬の血清を使用した。

【００１３】試料中における標識抗体として使用した、
ＩgＥに対する多クローン性抗体はＰharmacia Ｄiagnos
tics of Ｐiscataway（Ｎew Ｊersey）から得た。固体
担体に結合した多クローン性抗体はＴago，Ｉnc．of Ｂ
urlingame（Ｃalifornia）から得た。ＩgＥに対する単
クローン性抗体は前述のＭilstein ＆Ｋohlerの方法を
利用して得た。二種の抗体としては、各々１０⁹リッタ
ー／モルより大きなＩgＥに対する親和性を示すものが
選ばれ、これらはＩgＥに対する他のものの結合を妨害
しなかった。検定はアガロースに結合した未標識抗体を
使用し、米国特許第３,６４５,８５２号に記載の方法に
より行った。抗体の標識はＤavid等の前述の方法に従っ
て¹²⁵Ｉによって行った。燐酸塩で緩衝した塩水（pＨ
７.４）をすべての試料を洗浄するために使用した。

【００１４】

【実施例】

実施例 １)同時検定法 アガロース粒子上に固定した抗体の懸濁液１００μlを
１００μlの検体(血清）および１００μｌの可溶性¹²⁵
Ｉで標識した抗体と混合して、一対の試料について実施
した。この混合物を以下の第１表(多クローン性抗体)お
よび第２表(単クローン性抗体)に示した所定の時間およ
び更に３０分間インキュベーションした。余分の３０分
間のインキュベーションは、第２の添加試薬に対する追
加の３０分間のインキュベーション時間が必要とされる
他の検定法と本法とを同一条件とするために加えられ
た。インキュベーション期間の経過後、アガロース粒子
を緩衝液を添加して洗浄し、次いで遠心分離した。吸引
により洗液を除いた後、得られたアガロース粒子のペレ
ットを、結合した¹²⁵Ｉ−標識抗体について計数した。
特定のインキュベーション時間の後該錯体の各々に対し
て得られた計数値は第１表および第２表に示す。 ２)逆検定法 １００μlの検体(血清)を１００μlの可溶性¹²⁵Ｉ−標
識抗体と混合し、第１表および第２表に示した所定時間
インキュベーションして、一対の試料について実施し
た。次いで、アガロース粒子上に固定した抗体の懸濁液
を添加し、得られた混合物を更に３０分間インキュベー
ションした。次いで、アガロース粒子を洗浄し、同時検
定法におけるように計数した。計数量は第１表および第
２表に示す。

【００１５】３)前検定法 一対の試料について行った。１００μlの検定(血清)を
１００μlのアガロース粒子上に固定した抗体の懸濁液
と混合し、かつ第１表および第２表に示した所定時間の
間インキュベーションした。このアガロース粒子を２.
５〜３.０mlの緩衝液を添加し、混合後遠心分離するこ
とにより１回洗浄し、液を吸引により除去した。次い
で、可溶性¹²⁵Ｉ−標識抗体１００μlを添加し、混合物
を更に３０分間インキュベーションした。次いで、アガ
ロース粒子を洗浄し、同時検定法におけるように計数し
た。計数値を第１表および第２表に示す。 ４)急速前検定法 検定は２度行い、アガロース粒子上に固定された抗体を
含む検体の最初のインキュベーションと可溶性¹²⁵Ｉ−
標識抗体の添加工程との間の洗浄工程を省略した以外は
前検定法と同様に実施した。一対の対照に対する計数値
／分並びに多クローン性抗体および単クローン性抗体を
使用してＩgＥを含有する一対の試料の検定における計
数値／分の結果を第１表および第２表に夫々示した。こ
れらのデータを以下のようにして第１図および第２図を
作るために使用した。所定のインキュベーション時間に
対する対照の計数値／分の平均は対応するＩgＥ検定に
対する計数値の平均から算出した。差を試料に添加した
標識抗体の全計数値／分に対する割合として計算し、固
相に結合した抗体の合計数値／分に対する割合としてＹ
軸上にプロットした。インキュベーション時間をＸ軸上
にプロットした。

【００１６】単クローン性抗体を使用した検定の結果を
示す第２図に示したプロットと多クローン性抗体を使用
した検定の結果を示す第１図とを比較すると、各々の検
定、即ち同時、逆、前および急速前検定において、単ク
ローン性抗体を使用した検定がより感度が高いことがわ
かる。このことは１００ＩＵ ＩgＥ／ml検定について
得られた、固相に結合したものの全計数値の高い割合に
よって示される。予想外にも、同時並びに逆検定の場合
において、単クローン性抗体を使用して行った検定が多
クローン性抗体を使用して行った対応する検定よりも一
層急速に平衡に達することがわかった。従って、これら
の手法において単クローン性抗体を使用することによ
り、検定に要する時間を、単に洗浄工程を省くことによ
り達成される時間の節約をはるかに越えて節減すること
ができる。この点について、単クローン性抗体を使用し
た逆検定は１時間以内で平衡に達した。多クローン性抗
体を使用した同様な検定実験では４時間経過するまで平
衡に達しなかった。同様に、同時検定の場合にも、単ク
ローン性抗体を使用した検定では８時間以内に平衡に達
するが、多クローン性抗体を使用した検定では２４時間
以内で平衡に達することはなかった。結局、本発明は従
来法よりも極めて急速かつ感度の高い同時並びに逆検定
法を与え、かつ可溶性「サンドイッチ」錯体の形成が所定
の不溶性錯体の形成と競合するという懸念を排除する。

【表１】

【表２】

【００１７】前述の議論において、焦点は２つのサイト
即ちサンドイッチ検定にあった。そこでは抗体の一つは
不溶化されるが、他方は分析される媒体中に可溶性であ
る。これ以外の変法も可能である。好ましい変法の１つ
では粒子例えばラテックス粒子などに結合した抗体が使
用され、そこで各粒子は多数の抗体を坦持することにな
る。第１の単クローン性抗体が結合するある量の粒子
が、例えば第２の単クローン性抗体が結合するある量の
粒子と混合された場合、乳白色の懸濁液が得られる。し
かしながら、試料が多価抗原を含有し、抗体が該抗原に
対して特異的な場合、該試料を前記懸濁液に導入する
と、粒子の凝集もしくは凝着を生じ、容易に検出し得る
凝集塊を形成する。凝集体形成の肉眼的検出が、抗原の
存在に対する予検試験において利用することができる。
この検出は一方の単クローン性抗体を坦持する粒子の色
と、他方の抗体を坦持する粒子の色とを違えることによ
り促進される。しかしながら、凝集の程度を試料中にお
ける抗原存在量の尺度として決定することも可能であ
る。例えば、濁度変化を比濁法などの標準的方法を利用
して測定することができる。現在のところ、当業者に周
知の方法を利用して抗体を共有結合的に結合させたラテ
ックス粒子を使用することが好ましい。しかし、他の粒
状坦体を使用することも可能である。その中で、シリ
カ、ガラス、細胞、ポリアクリルアミド、ボリメチルメ
タクリレートおよびアガロースなどを挙げることができ
る。好ましくは該粒子の粒径は約０.２〜約１０μの範
囲で変化する。肉眼的予検法は、しかしながら、少なく
とも約１.０μの大きさの粒子を必要とする。

【００１８】尚、別の変法において、抗体の一方はピー
ズ、試験管壁もしくは他の巨視的固体坦体上に固定さ
れ、他方の抗体はラテックスもしくは他の適当な物質の
小粒子に結合される。抗原の存在下で、巨視的に結合し
た抗体と粒子に結合している抗体との間に抗原を有する
サンドイッチが形成される。例えば粒子を着色すること
により、サンドイッチの形成を肉眼的に検出することが
できる。粒子に結合した抗体の蛍光、酵素、放射能もし
くは他の標識を、前述の可溶性抗体を使用する場合と全
く同様に、定量的検出のために使用することができる。
２−サイト検定の他の好ましい変法においては、二つの
異る単クローン性抗体のうちの少なくとも一つが酵素に
結合される。該酵素は、他の単クローン性抗体に結合す
る物質を含む反応を触媒して検出可能な物質を生成する
か、もしくは第２の抗体上の物質と相互作用して錯体即
ち抗体：抗原：抗体の検出を可能とする。検出は、例え
ば比色法、蛍光法、発光法、分光光度法などによって行
うことができる。このような方法を利用すれば、抗体両
者を不溶性とする必要がなく、検定が著しく単純化され
ることが理解されよう。現在好ましい具体例において
は、第２抗体上の物質も酵素であり、検定は酵素で標識
した一対の抗体を使用して、後の反応を触媒させる。抗
体の一方は他のものが必要とする生成物を製造する。こ
れらの反応においては、２種の抗体が抗原と結合する場
合、立体的に配向され、第１酵素反応の生成物は第２の
酵素で標識された抗体に近接するように発生され、第２
の反応は第１の反応の生成物が環境の媒質中に大きく拡
散する前に起こるように、２種の抗体が選ばれる。この
方法を一対の単クローン性抗体を使用して説明すること
ができる。該抗体の１つをヘキソキナーゼ(ＨＫ)で標識
し、他の抗体をグルコース−６−ホスフェートデヒドロ
ゲナーゼ(Ｇ−６−ＰＤＨ)で標識し、以下の一連の反応
を行う。

【００１９】

【化１】

【化２】 この検定は問題とする抗原を含む試料に、該抗原と結合
する標識抗体、ＡＴＰ、グルコースおよび補酵素ＮＡＤ
＋を添加することにより行われる。抗原が存在する場
合、以下に示すような錯体が形成される：

【化３】

【００２０】ＨＫで標識した抗体は、Ｇ−６−ＰＤＨで
標識した抗体の近傍におけるグルコース−６−ホスフェ
ートの形成を触媒し、そこでグルコノラクトン−６−ホ
スフェートに転化される。この反応においてＮＡＤ＋の
還元によって形成されるＮＡＤＨ分光光度により検出す
ることができる。というのはジヒドロニコチンアミドが
３４０ｍｍにおける強い吸収で特徴ずけられるからであ
る。ＮＡＤＨの形成と同様に、グルコースのグルコノラ
クトン−６−ホスフェートへの転化も媒質中で起こり、
これは錯化されなかった標識抗体によって触媒される
が、二種の抗体が錯体即ち抗体:抗原:抗体において相互
に近接して配置される場合よりも一層低い速度である。
従って、対照試料と比較して３４０mmにおける吸収の増
大は試料中における抗原の存在を確認している。吸収に
おける増加は錯体中の抗原の量とも関係ずけることがで
きる。適当に標識された問題とする抗原に結合する抗体
を使用する２−サイト検定において、任意の他の適当な
一対の連続的な酵素触媒反応を使用することができる。
その中で、グルコノラクトンと過酸化水素とを形成し、
引き続きパーオキシダーゼにより触媒されて着色成分を
生成する過酸化水素とＯ−フェニレンジアミンとの反応
を伴うような、グルコースオキシダーゼにより触媒され
るグルコースの反応を挙げることができる。この検定に
おいては、単クローン性抗体の一方がグルコースオキシ
ダーゼで標識され、他方はパーオキシダーゼで標識され
る。対照と比較して、得られる色の強度は被検試料中に
おける抗原の存在および／またはその量と関係ずけるこ
とができる。酵素の存在下で、着色成分に酸化し得る他
の物質でＯ−フェニレンジアミンを代替えすることがで
きるものと理解すべきである。

【００２１】夫々ＮＡＤオキシドリダクターゼおよびル
シフェラーゼで標識した、所定の抗原に結合する一対の
抗体を使用する更に別の適した一連の反応は以下のもの
である：

【化４】

【化５】 ここでＲＣＨＯは典型的には１０またはそれ以上の炭素
原子数を有する直鎖アルデヒドである。ＦＭＮ※、即ち
励起状態のＦＭＮの発生は光子の放出を伴い、この光子
は被検試料中における抗原の存在および／またはその量
を示すために、対照試料との相関関係から、光学的方法
で検出することができる。酵素で標識した一対の抗体を
使用する他の具体例では、酵素的に触媒される第１の反
応の生成物は、一連の酵素触媒反応のアロステリック性
活性因子もしくは抑制因子であり得る。アロステリック
性活性因子は第２の反応において消費されるというより
もむしろ酵素と相互作用して基質に対する親和性を増す
か、もしくは酵素−基質錯体が形成された後、基質を生
成物に転化する速度を増大する。他方、アロステリック
性抑制因子は逆の効果を有し、基質に対する酵素の親和
性を減少もしくは基質の生成物への転化速度を減ずる。
アロステリック性抑制は競合的もしくは非競合的型のも
のであり得る。

【００２２】夫々ホスホフルクトキナーゼおよびホスホ
エノールピルベートで標識した一対の抗体を使用する、
アロステリック性活性因子を含む検定の例は以下のよう
な反応を利用する：

【化６】

【化７】

【化８】 反応(１)で形成されるフルクトース−１,６−ジホスフ
ェートはホスホエノールピルベートカルボキシラーゼと
アロステリック的に相互作用して、反応(２)の触媒を活
性化し、ＰＥＰからのオキザロアセテートの形成を活性
化する。反応(３)は囲まれた媒質中で起こり、第３の単
クローン性抗体にマレエートデヒドロゲナーゼを結合す
る必要はない。問題とする抗原の存在および／またはそ
の量は、３４０mmにおけるＮＡＤＨによる吸収の減少と
関係ずけることにより測定することができる。ＮＡＤＨ
は反応(３)においてＮＡＤ＋に酸化される。

【００２３】夫々アスパルテートアミノトランスフェラ
ーゼ(ＡＳＴ)およびホスホエノールピルベートカルボキ
シラーゼで標識した一対の抗体を使用する、アロステリ
ック性抑制因子を含む検定の例では以下の反応系が利用
される：

【化９】

【化１０】 反応（１)で形成されるアスパルテートはホスホエノー
ルピルベートカルボキシラーゼとアロステリック的に相
互作用することにより第２の反応を抑制する。これはＮ
ＡＤＨが酸化されてＮＡＤ＋になる速度を減ずる。従っ
て、ＮＡＤＨの示す３４０mmにおける吸収の減少を、被
検試料中における抗原の存在および／またはその量と関
係ずけることができ、該吸収における減少は抗原が存在
することを示す対照試料について生ずる減少度よりも小
さい。当業者は、第２の酵素により触媒される反応の活
性化もしくは抑制を含む他の多数の反応の対を２−サイ
ト検定において使用するために前記した例に対して代用
し得ることを理解するであろう。

【００２４】他の具体例では、抗体対の一方のみを酵素
で標識し、他方を、例えば該酵素により触媒される反応
を生じて第２の生成物を形成するような物質で標識す
る。該第２の生成物は比色法、蛍光法、発光法、分光光
度法もしくは他の方法によって検出および／または定量
し得るものである。このような例の１つは一対の単クロ
ーン性抗体を使用し、その一方はパーオキシダーゼによ
り標識され、他方はルミノールで標識され、以下の反応
を生ずる：

【化１１】 この反応により放出された光子（ｈν)は光学的方法に
より検出することができ、被検試料中における抗原の存
在および／またはその量と関係ずけることができる。２
−サイト検定の好ましい尚別の変形では、夫々蛍光発色
団および該蛍光体の放出する波長の光を吸収し得る消光
発色団と結合した２種の単クローン性抗体が使用され
る。この２種の抗体は、これらと特異的な抗原と結合し
た際に、これら２つの発色団が十分に接近して配置され
て、蛍光体から放出された光を他の発色団が吸収し得る
ように選ばれる。通常、これらは相互に約１００Å以
内、好ましくは５０Å以内におかれる。適当な抗体の選
択は予検法を介して行われ、そこでは蛍光体および消光
体で標識された抗体の混合物が既知量の抗原を含む試料
と接触させられる。蛍光の減少は前記２種の発色団が相
互に十分近接して配置していることを示すものである。

【００２５】蛍光の消光を利用すれば、２種の抗体のい
ずれかを不溶化する必要がなくなる。定量的測定は、単
に最大蛍光、即ち抗原をまったく含まない対照試料の示
す蛍光における減少量を測定することにより、もしくは
試料の蛍光と既知量の抗原を含有する対照試料の蛍光と
を比較することにより行うことができる。しかしなが
ら、蛍光−消光発色団対を、粒子凝集法と組合せて使用
することもでき、その場合には抗体の一方が試験管壁も
しくはビーズなどの固体坦体に結合されて不溶化され
る。というのは、蛍光−消光発色団の対形成が起こるか
らである。この場合も、蛍光における減少が試料中にお
ける抗原の存在および／またはその量の指標となる。適
当な蛍光並びに消光発色団およびこれらを抗体と結合す
る方法は米国特許第４,１７４,３８４号に記載されてい
る。現在のところ、フルオレセインおよびロダミンを夫
々蛍光発色団および消光発色団として使用することが好
ましい。本発明の前記議論において、我々は蛍光−消光
法を記載したが、そこで必要な発色団を坦持する抗体対
が、分析すべき試料中に抗原が存在する場合に、該抗原
との結合を生じ、その立体的配列は蛍光発色団の放出す
る光を該消光発色団が吸収し得るような配列にある。存
在する抗原の量の定量的測定は最大蛍光における減少を
測ることによって行われる。

【００２６】これらの方法は、極めて広範囲の濃度に亘
って試料中に存在する抗原を測定するのに極めて適して
いる。しかしながら、抵抗原濃度に相当する、蛍光にお
けるわずかな減少は検出困難であり、かつ正確な測定も
困難である。逆に、蛍光におけるわずかな増加は比較的
検定が容易でかつ正確な測定が可能である。従って、本
発明の他の局面では、我々は消光の抑制を開択し、蛍光
における増加を測定することが好ましい。特殊な抗原に
対する検定において、これを達成するために、抗原およ
び該抗原に結合する抗体のある量を、夫々蛍光−消光発
色団の一方もしくは他方で標識する。発色団で標識した
抗原並びに抗体を、次に結合して錯体を形成する。該錯
体において、蛍光発色団は、これが放出する光が消光発
色団により吸収されるように配置される。これを達成す
るために、抗原を蛍光体で標識することができ、一方抗
体を消光体で標識することができ、かつ逆もまた可能で
ある。被検抗原を含有する問題の試料は、次に発色団で
標識した抗原と抗体とに接触させられる。適当なインキ
ュベーション期間の後、蛍光を測定する。抗原が被検試
料中に存在する場合、発色団で標識した抗原と抗体との
間の錯体形成を、試料中の抗原自身が単クローン性抗体
との錯体を形成することによって、少なくとも部分的に
抑制する。このことがある程度まで起こると、蛍光発色
団は最早その結果蛍光発色団の放出する光が消光発色団
により吸収されるようには配置されない。このことは蛍
光における増加をもたらす。蛍光における増加を測定
し、抗原を含まないもしくは既知量の抗原を含む対照試
料の示す蛍光と比較することにより、分析中の試料中の
抗体の濃度と、前記蛍光における増加とを関係ずけるこ
とができる。

【００２７】以上の記載から、発色団で標識した抗原:
抗体錯体が可溶性錯体であることは明らかであろう。し
かしながら、現在のところ、ラテックスもしくは他の適
当な粒子、例えば上述したような、錯体が形成された場
合に凝集体を形成するような寸法の粒子、に結合した発
色団−標識抗原並びに単クローン性抗体を使用すること
が好ましい。約０.２〜約１０μの範囲の寸法を有する
粒子が、通常この目的に適している。問題とする抗原を
含有する未知試料を抗体並びに抗原の凝集体形成粒子と
接触させた際に、凝集抑制が起こる。というのは試料中
の抗原が粒子に結合した抗体と結合するからである。消
光は最早起こらないので、蛍光における増大がもたらさ
れ、これは検出しかつ測定して、既知量の抗原を含む試
料について観測された蛍光と比較することにより、試料
中における抗原の量と関係ずけることができる。凝集の
抑制を直接測定する検定において、結合抗原および粒子
に結合した単クローン性抗体を使用することも本発明の
範囲内にある。この方法においては抗原も抗体も標識さ
れない。抗原を含有する試料を該粒子と接触させると、
インキュベーション期間中に凝集の抑制が起こる。これ
は少なくとも部分的な凝集体形成の減少をきたす。この
抑制は比濁法もしくは濁度を測定するための他の方法を
利用することにより決定することができる濁度における
減少は試料中の抗原の量と関係ずけることができる。Ｉ
gＥに関る検定に対する本発明の適用性を証明する本発
明の前記記載並びに実施例は、本発明を利用することの
できる種々の方法の例示にすぎない。他の変法も有用で
あることは当業者には明らかであろう。従って、本発明
は特許請求の範囲のみによって限定されるものと理解す
べきである。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ヒトＩgＥのための、４種の免疫検定法にお
いて、多クローン性抗体を使用して得られた結果を示す
図である。

【図２】 ヒトＩgＥに対して、前記４種の免疫検定法
において、単クローン性抗体を使用して得られた結果に
おける差を示す第１図と同様な図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/543 Ｄ 7906−2Ｊ

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 抗原性物質を含有する液体試料に第１抗
   体と第２抗体を接触させることによって前記抗原性物質
   と前記第１抗体と前記第２抗体とからなる三元複合体
   （ただし、第１抗体と第２抗体とはそれぞれ異なったサ
   イトで抗原性物質と結合する。）を形成させる工程を含
   む、液体試料中の抗原性物質の存在または濃度を決定す
   るためのイムノメトリックアッセイにおいて、 前記第１抗体と前記第２抗体のそれぞれが前記抗原性物
   質に対して少なくとも約１０⁸リッター／モルの親和性
   を有する単クローン性抗体であり、 前記第１抗体と前
   記第２抗体のいずれか一方が液相中に存在し、他方が前
   記液体試料に不溶性の粒子に結合しており、 前記液体試料に抗体が結合した当該粒子を接触させて前
   記三元複合体を形成せしめ、これによって当該三元複合
   体に結合した粒子の凝集を起こさせることを特徴とする
   方法。
2. 【請求項２】 粒子の大きさが約０.２〜１０ミクロン
   の範囲にある、請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 粒子の大きさが約１.０〜１０ミクロン
   の範囲にある、請求項１記載の方法。
4. 【請求項４】 粒子がラテックス、シリカ、ガラス、セ
   ル、ポリアクリルアミド、ポリメチルメタアクリレート
   およびアガロースからなる群から選ばれたものである、
   請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
5. 【請求項５】 三元複合体を形成した後の液体試料の濁
   度を決定し、これを抗原性物質を含まないまたは抗原性
   物質の既知量を含む対照試料の濁度と比較する、請求項
   １〜４のいずれかに記載の方法。
6. 【請求項６】 第１抗体と第２抗体のいずれか一方が蛍
   光発色団によって標識されており、他方が当該蛍光発色
   団によって放出される波長の光を吸収することが出来る
   消色団によって標識されており、 三元複合体を形成させた後、その蛍光の強さを決定し、
   これを抗原性物質を含まないまたは抗原性物質の既知量
   を含む標準試料の蛍光と比較する、請求項１〜４のいず
   れかに記載の方法。
7. 【請求項７】 蛍光発色団がフルオロエッセインであ
   り、消色団がローダミンである請求項６に記載の方法。
8. 【請求項８】 抗原性物質を含有する液体試料に第１抗
   体と第２抗体を接触させることによって前記抗原性物質
   と前記第１抗体と前記第２抗体とからなる三元複合体
   （ただし、第１抗体と第２抗体とはそれぞれ異なったサ
   イトで抗原性物質と結合する。）を形成させる工程を含
   む、液体試料中の抗原性物質の存在または濃度を決定す
   るためのイムノメトリックアッセイにおいて、 前記第１抗体と前記第２抗体のそれぞれが前記抗原性物
   質に対して少なくとも約１０⁸リッター／モルの親和性
   を有する単クローン性抗体であり、 前記第１抗体と前記第２抗体の少なくともいずれか一方
   が液相中に存在し、 前記第１抗体と前記第２抗体のいずれか一方が酵素によ
   って標識されており、他方が当該酵素に対する基質によ
   って標識されており、当該酵素が当該基質と反応するこ
   とによって前記三元複合体の検出を可能ならしめること
   を特徴とする方法。
9. 【請求項９】 第１抗体が酵素で標識されており、第２
   抗体が基質で標識されている、請求項８に記載の方法。
10. 【請求項１０】 基質が酵素である、請求項９記載の方
    法。
11. 【請求項１１】 第１抗体標識酵素が、第２抗体標識酵
    素が触媒として作用する反応によって必要とされる生成
    物を生産する反応に触媒として作用するものである、請
    求項９〜１０のいずれかに記載の方法。
12. 【請求項１２】 第１抗体標識酵素が触媒として作用す
    る反応の生成物が第２抗体標識酵素が触媒として作用す
    る反応において消費されるものである、請求項１１に記
    載の方法。
13. 【請求項１３】 第１抗体標識酵素が触媒として作用す
    る反応の生成物が第２抗体標識酵素とアロステリックに
    反応するものである、請求項１２記載の方法。
14. 【請求項１４】 第１抗体標識酵素が触媒として作用す
    る反応の生成物が第２抗体標識酵素をアロステリックに
    活性化するかまたは阻害するものである、請求項１３記
    載の方法。
15. 【請求項１５】 第２抗体標識酵素が触媒として作用す
    る反応が検出し得る物質を生産するものである、請求項
    １４記載の方法。
16. 【請求項１６】 第２抗体標識酵素が触媒として作用す
    る反応が検出し得る物質を消費するものである、請求項
    １４記載の方法。
17. 【請求項１７】 検出し得る物質の生産または消費がカ
    ラリメトリー、フルオロメトリー、ルミネッセンスまた
    はスペクトロフォトメトリーで検出し得るものである、
    請求項１５〜１６のいずれかに記載の方法。
18. 【請求項１８】 第２抗体標識基質が、第１抗体標識酵
    素によって触媒される反応を受けるものである、請求項
    １７記載の方法。
19. 【請求項１９】 反応がカラリメトリー、フルオロメト
    リー、ルミネッセンスまたはスペクトロフォトメトリー
    で検出し得る物質を生産するものである、請求項１８に
    記載の方法。