JPS585659A - 単クロ−ン性抗体を使用する免疫学的、抑制試験 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、血清などの流体中における抗原性物質を検出
および／または皺物質ＯＩＩ度を測定する方法に関する
。他の局面から見ると、本発明は免疫学的、抑制試験法
に係る。更に別の局面から見ると、本発明は単クローン
性抗体に関する。

種々の身体的疾患に伴う、例えば血清もしくは他の体液
中の抗原性物質の存在もしくはＩＩ変の決定は、近時ま
すます免疫学的一定法に頼る傾向となってきている。こ
の方法は、検査すべき抗原性物質と抗体Ｃ／ｌ＊は複数
）との間における錯体の形成に基いておシ、腋錯体０／
’ＬＬ＜は他の成分が、例えば■６■　などの放射性物
質によシ標識され、それｋよって錯化され大標識抗原も
しくは抗体と錨化されなかつ大標識抗原または抗体とを
分離した後、抗原の検出および／ｌたは定量分析が可能
となる。

競合免疫学的橢定法においては、存在を試験すべき流体
試料中の抗原物質と既知量の標識抗原とが限定量の抗体
の結合サイトを奪い合う。かくして、抗体に結合し大標
識抗原の量は試料中の抗原の量に反比例する。これとけ
対照的に、免疫学的測定では標識抗体を使用する。かか
る検定においては、前記錯体に関与する標識抗体の量は
流体試料中の抗原性物質の量に比例する。

免疫学的検定は、とりわけ多価抗原、即ち同時に：１ま
たはそれ以上の抗体と錨化し得る抗原性物質の検出に対
して適していることがわかっ九。このような検定は、典
型的には被検流体試料中に不溶な固体担体に結合し九標
識されていないある量の抗体および放射性同位体などの
標識を有するある量の可溶性抗体を利用し、館岡位体に
よって固相抗体、抗厳および標識抗体との間に形成され
る三元錯体の検出および／ま光はその量の定量的見積り
が可能となる。

蟲東界において公知の免疫学的検定においては、典型的
には１前Ｉ検定が利用され、ここでは面相に結合した抗
体を、まず被検試料と接触させて、二元固相抗体即ち抗
原錯体を形成するととＫよって抗原を試料から抽出する
。適当なインキュベーションの後、皺固体担体を洗浄し
て、存在するかもしれない未反応抗原を食む流体試料の
残渣を除去し、次いで既知量の標識抗体を含む溶液と接
触させる。

皺標識抗体を、標識してない抗体を介して囲体担体に結
合し光抗原と錯化することを可能とする第コのインキュ
ベーションの後、腋固体担体のコｌ！目の洗浄を行って
、未反応の標識抗体を除去する。抗原が被検試料中に存
在するか否かを決定するための簡単な１イエス／ノーＩ
試験において、洗浄し九固体担体は、例えば標識が放射
性元素である場合には放出される放射能を測定すること
により、標識抗体の存在を検出するえめに試験される。

検出され九標識抗体の量は、皺抗原を含まないことが知
られている負の對（照試料に対する値と比着される。負
の対照によシ示されるパックグラウンド水準を実質的に
越える量で標識抗体を検出することは、問題とする抗原
の存在を示す４のと鱗釈される。定量的検出は、標識抗
体の量と腋抗原の既知量を含む較正試料について得られ
走置とを比較するととによ抄達成することができる。

この種の検定はしばしば「コーサイ）１４Ｌ＜は「サン
ドウィッチ」検査といわれる。というのは抗原がその表
面の異っ九位置に結合しぇ一つの抗体を有するからであ
る。このおよびこれ忙関連する技術ＦｉＷｉｄｅの「放
射線免疫検定法（Ｒａｄｌｏｌｍｕｎｏａｓｓａｖ　Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ）Ｊ　　／　９９−　：ｌＯ４頁（／？り
θ）、Ｋｉｒｋｈａｒｎ　＆　Ｈｕｎｔ＠ｒ監修、Ｅ、
＆Ｓ。

Ｌｌｖｌｎｇｓｔｏｎｅ　、　Ｅｄｌｎｂｕｒｇｈ　Ｋ
１１ｅｌ！されている。

１１１Ｔ　標識抗体を使用する血清肝炎Ｖｃｌｌ連する
抗原や検、出の丸めのこの技術による検定ＰｌｉＪＩＲ
国特許第３．ｔふり、３７７号に記載されている。

これらの大き壜有用性にもかかわらず、従来の免疫学的
検定法は時間のかかる手法であることが認識されている
。というのは一部には二度の洗浄工１が必要とされるか
らであり、また平衡即ち時間の増加に伴う形成され九錯
体の量の変化が生じなくなる点、の達成のために長期に
亘るインキュベーションが必要とされることによる。

この方法に関連する洗浄工程の少なくともｌっを排除す
るためｋ、いわゆる１同時′および１逆′検定法が提案
されている。同時検定法は固体担体に結合した抗体およ
び標識抗体両者が同時に被検試料に添加された際にお叶
る九だ／ｆだけのインキュベーシロンエ震を含んでいる
。このインキユベーションの優、固体担体を洗浄して流
体試料の残渣並びに錯化しなかった標識抗体を除去すゐ
。

該固体担体と会合し九ｍｍ抗体の存在は、次いで従来、
の％＠Ｉサンドウィッナ検定におけるようにして検出さ
れる。

逆積定法は段階的添加を含み、そのｗＥｌは標識抗体溶
液の流体試料への添加であ勤、引亀続き適ｍ１にインキ
エペーシロンＯ１＆１１体担体に結合し九標識されてい
ない抗体の添加が行われる。ｇコのインキュページ四ン
後、跋固体相を常法に従って洗浄して、被検試１４０残
渣並びに未反応標識抗体の溶液を除去する。次いで、■
体担体と会合した標識抗体の決定は同時並びに前検定法
におけると同様にして行われる。

同時並びに逆積定法両者においては、存在する抗原の殆
ども１．　＜は全てを結合するために士分圧過剰量の固
相抗体を使用して、人為的に負のもしくは低い抗原量が
極めて高い抗原横変の下でＩ！察される高貴フック作用
（ｈｉｇｈ　ｄｏｓｅ　ｈｏｏｋ　ｅｆｆｅｃｔ）を避
けることが必要とされる。このために１前検定法が烏業
者にとっては好ましい方法であり九。

これが前検定法が轟業者によ゛つて好まれる理由である
。またこれが、十分な抗原結合能を有する固相を製造す
るために、問題とする抗原に対して特異的な、高純度の
、活性な抗体を、従来法忙おいて使用されていた１多ク
ロ一ン性ｌ抗体から大量に得ることが困難であった理由
である。免疫原性物質が生体中和導入された場合、該生
体の免疫系が該免疫原性物質を認識する免疫原上の各サ
イトに抗体を生成することＫよ抄応答する。大きな免疫
原性蒼白分子は数十のサイトを有し、異種細胞は数百の
サイトを有し得る。かくｉ−て、細胞をつくる各抗体は
単一の抗原性サイトに対してＩｆ＃異的な抗体をつくる
が、免疫系は認識された各免疫原性サイ）Ｋ対して、細
胞をつくるＩＷＩＪ％的抗体種を発生すゐ。ＷＫ、生体
は問題とする抗原以外の抗原に対する抗体を比較的大量
に生成するので、多り四−ン性混合物中の抗体の大部分
は問題とする抗原に対してＩＩ＃興的ではない。従って
、従来の免疫学的検査において使用されていた抗体は必
然的に％多り四−ン性′であった。というのは、この抗
体が動物中に普通の様丈゛で生じる抗血清から誘導され
、かつこれらの精製が１１１１ｍであるからである。か
かゐ抗体の親和性精製法は一般に時間のかかる、低収率
を与える、かつ高い親和性の抗体の損失をまねくもので
あり九。

前配逆および同時検定において、従来の多クローン性抗
体混合物を使用し光場合、異ったサイトにおいて抗原と
錯化する、−まえはそれ以上の標識抗体により錯化され
九抗原を會む１サンドイツチｌの形成が可能である。被
検試料中における可溶性を艙持し得るこれらの錯体は次
の洗浄子ＩＩＫより除去されるので、ｌ１ＩＩｉＩＩが
固相に結合り走標識抗体忙ついて分析される−に＃１計
算され瞠い。これがかな秒のＩ！変で匂こった場合、検
定の感Ｗｌけ減少し、誤った結果を４える。しかしなが
ら、標識されていない結合抗体を、前記の前サンドイッ
チ検定におけるようＫｆｉず試料に添加すると、立体的
考察から、ｌｌｌｌｌ１ｍ抗体が排除され、かつ抗原に
結合されている１、、２ｆ７ｔけそれ以上の標識されて
い危い抗体に錯化され九抗原を含むサンドイッチの形成
が妨げられる。従って、し抗原は標識抗体分子と自由に
反応する。それＫもかかわらず、固相に結合し丸太過剰
の標識してない抗体を使用して可溶性１１１１ｍ抗体に
よる可溶性錯体の形成を最小化することによって、ヒト
早秋ＷｓＩＩ１１激ホルモン（ＨＴＳＨ）Ｋ対する同時
検定法を利用することが提案されていた。ＪｅＯｎｇ等
の１ヒト甲状腺刺激ホルモン（ＨＴＳＨ’）の検出に適
用される放射線免疫１１定（Ｒ１＾）と固有の単−一イ
ンキュベーシ冒ンコーサイト免疫学的放射線検定（ＩＲ
Ｍ＾）とめ比較’Ｂｌｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ　、　／　９り９参照のこと。

同時検定の変法が米ａｉ＊許禦軌ｉ’ｙａ、　３ｅｅ号
に記載されている。この検定においては、杭免疫グロブ
リンＩｇＧ（ヒト）の別々の部分が夫々螢光性発色団（
フルオレセイン）および発色団（ａダミン）、これはフ
ルオレセインから放出される光を吸収する、Ｋよって標
識される。可溶性状１１ＫＩる両抗体はヒ）ＩｇＧを含
む試料と接触させられる。

抗−ＩｇＧとＩｇＧとの反応は１００人屯１〈はそれ以
下の相互に十分近接した二種の発色団をもたらし、螢光
性発色団によ抄発せられた光は他方の発色団により吸収
（消光）される。試料の最大螢光の割合を決定し、試料
中のＩｇＧの量の尺度として使用される。

ＨＴＳＨ２肝炎関連抗１［（ＨＭＡ）および癌胎児性抗
原（ＣＥ＾）Ｋ対して、標識抗体を保証するのに十分攻
欅識抗体の量、ただし抗原錯体を形成するが、試料中に
存在するすべての抗原の１サンドイツチ′を形成するＫ
は不充分な量を使用するととによ抄逆検定を応用するこ
とが提案されている。

米Ｓ特許第ダ、０９ｔ、　ｔｅｌ、号参照のこと。

ｍｌＩ′１ｉＫ公知の３つのすべての手続きが抗体の多
クローン性混合物を使用しているので、試験すべき抗原
以外の流体もしくは血清中の他の物質との交叉反応の可
能性が大きく女る。他の抗原との交叉−反応性の出現は
また、問題とする抗原の試験の感度を減じ、かつゝ誤っ
た接圧“の検定の可能性を増す。更に１　同時も１．く
け逆積定において多クローン性抗体を使用することは、
固相抗体および／ｌたけ存在する抗原の量に関して、使
用すべき標識抗体の量の注意深い考察を必要とする。螢
光の消光を利用する場合には、感度が低い。これは螢光
発色団と消光発色団との間の最小間隔が、多クローン性
抗体を使用した場合には、偉証されないととＫよる。

これら緒欠点から４、当業界において公知℃免疫的手法
の限界はまったく明らかである。従来の前検定はよ染少
カい工程数で達成されるが、大量の固相ｌｌ１１４的抗
体を必要とし、かつ低濃度の抗原の検出ＫＦｉ不適当で
ある。なんとなれば、抗原と多数の標識抗体分子とのサ
ンドイッチの形成が、結合し大抗体、抗原、標識抗体を
含むサンドイッチの形成と競合し、もしくは螢光の消光
を利用する場合には、螢光発色団と消光発色団との対形
成なしに、サンドイッチが形成される可能性がおる。

しかも抗体の多クローン性に基く正の誤差の誤った解釈
に導く。

従って、本発明の目的の／−）は抗原性物質に対する改
良された免疫学的検定法を提供することである。

更に詳しくは、本発明の目的はより短時間の免疫検定法
を提供することである。

本発明の他の目的はよハ感変の高い免疫検定法を提供す
ることである。

本発明の更に別の目的は改良され九１同時′並びに％逆
ｌ免疫検宇法を提供することである。

更虻別の本発明の目的は、改良された阻害試験法を提供
することである。

上記並びに他の目的が本発明によって実現される様式は
以下に示す詳細な記載から明らかとなろう。

本発明によれば、免疫検定において使用される多クロー
ン性抗体、例えば固体担体に結合した未標識抗体、およ
び可溶性標識抗体として使用される抗体または螢光消光
による検定の場合には螢光もしくは消光発色団を有する
抗体は少なくともｌおよび通常はコまたはそれ以上の異
る単クローン性抗体、即ち単一の抗原性サイトに対して
特異的で、単一の細胞系からのクローンによって別々に
つくちれる各抗体、によって置換される。

本発明によれば、流体試料を検査する九めの免疫検定法
が提供され、この方法は抗原性物質、第７抗体および第
コ抗体（九だしこの第コ杭体は第１抗体とは異つ喪サイ
トにおいて抗原と結合している）の三元錯体を、試料と
＃第１および嬉コ抗体とを接触させることにより形成す
ることを含み、１１１１／およびｇコ抗体夫々に対して
単クローン性抗体を使用するととＫより改良した方法で
ある。

本本発明の好ましい具体例においては、固体担体に結合
する抗体として使用される単クローン性抗体は、標識抗
体に使用する単クローン性抗体とは１つ九細胞系の生成
物でＴｏ抄、これら一種の単クローン性抗体は相互に興
ったサイ）において抗原性物質を結合するように遺ばれ
、抗原に対する他の抗体の結合が阻害されないようにす
る。螢光消光の場合にも、これらコ種の抗体は通常速つ
九細胞系の生成”物であり、他の抗体の結合を阻害しな
いように、かつコ種の発色団が十分に近接して（即ち、
通常は約１００λ以内）螢光の消失が可能となるように
選ばれる。本発明の、ＩＩＩＶｃ１ｗＩ時並びに逆積定
法の、従来技ｗＫ勝る利点は添付図の考察および以下の
本発明の詳細な記載から明らかとなろう。

また、本発明によれば、単クローン性抗体は阻害試験に
おいても使用される。このような試験において、既知量
の抗原および単クローン性抗体が、該単クローン性抗体
に添加され九既知抗厘に対応する抗原を含む、問題とす
る試料と接触させられる。抗体と抗原との間の錯体、ｑ
）阻害が、単り四−ン性抗体と試料からの抗原とを含む
錯体が形成するために生じ、七のＳｔは被検定試料中に
おける抗原の存在および／ま九は量Ｏ尺度となる。

更に１本発明によれば、以下の工１を含む、流体中の抗
原性物質の存在もしくはその濃度を決定する方法が提供
される： （ａ）　　流体試料を、添加された既知量の抗原性物質
および抗原性物質と結合する単クローン性抗体と接触さ
せる工程、および （ロ）該抗体と添加された抗原性物質との間の錯体Ｏ形
成の阻害を、館単クローン性抗体と１流体内の抗原性物
質とを結合して第コの錯体を形成することによシ測定す
る工程。

好ましい具体例においては、抗体と抗原とけ夫夫一対の
螢光発色団と消光発色団の一方のものと結合する。標識
抗原と抗体との間の錯体の形成を、被検試料中の抗原に
より阻害することによ〉、消光の１１度の減少および螢
光の増大が起こる。消光の阻害の１１［は、試料中にお
ける抗原製置の尺度である。他の好ましい阻害試験の具
体例においては、既知の抗原と抗体との元の錯体は、凝
集体形成を可能とする大きさの例えばラテックス粒子な
どの較”子に結合する。抗原を含む、問題とする試料を
抗体と接触させて抗原を結合させる場合、凝集体形成の
阻害が、凝集体を形成し得ない試料の抗原と結合した抗
体との間で錯化が起こる九めに生じる。凝集の減少は濁
度測定法を利用するととｋよ＃）測定することができる
。

上で述べ友ようＫ、本実＠によれば抗原性物質に対する
免疫学的検定法において使用されていえ多クローン性抗
体が単クローン性抗体で置換される。同様に、単クロー
ン性抗体が抑制試験において使用される。本発明は、多
価抗原性物質を含めて、極めて広範な種々の抗原性物質
の存在も１．〈はその濃度の決定のために有用である。

従って、本明細書で使用する用語「抗原」または「抗原
性物質」は抗体を生成する広範囲の物質を意味する。

このような物質として、特にハプテン、ホルモン、例え
ばインシュリンおよびヒト甲状腺刺激ホルモン（ＨＴ！
３Ｈ）、ｒ−グロブリン、アレルゲン、ウィルス、ウィ
ルスサブユニット、細菌、強縮に関る４の並びに動物毒
液などの毒素およびある種の薬剤などを例示することが
できる。本発明の方法によって検定することのできる特
定の抗原としては癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、肝炎ウィル
ス＾および８、肝炎ウィルスノン（Ｎｏｎ　）　Ａおよ
びノン日、ＩｇＥ並びにα−フェトプロティンを例示す
ることができる。

本発明において有用な単クローン性抗体はＭｌ　１ｓｔ
ｅｌｎ　＆　Ｋｏｈｌｅｒ　Ｋよシ議論され、Ｎａｔｕ
ｒｅ　。

主１．ダ９！ｒ−１Ｉ９７（／９り３）に報告された方
法によって得ることができる。この方法の詳細は周知で
あシ、ここであらためて述べるＫはあたらないであろう
。しかしながら、基本的にはこの方法はネズミもしくは
他の適当な動物に免疫原を注射することを含んでいるう
このネズミは次いで殺され、その膵臓から暖り出され九
細胞を骨髄細胞で融解する。得られるものはハイブリッ
ド細胞で「ハイブリドーマ１と呼−れ、生体外で再生さ
れる。ハイブリドーマの集団を部側し、個々の分枝系を
単離するように処理され、各分校系は抗原に対する単一
の抗体種を分泌する。このようにして得られ九個々の抗
体種は、免疫原性物質上で認識された特定の抗原性サイ
トに応答して生成された、免疫性動物からの単−日ｌ１
１８胞の生成物である。

免疫原性物質が生きている宿主中に導入された場合、皺
宿主の免疫系は該免疫原性物質上の認識し得るすべての
サイトに対する抗体を生成することにより応答する。侵
入物に対抗するために抗体を生成するこのような隼−シ
ョットガンｌ的対応は、該免疫原性物質に対して異った
親和性並びに％異性を有する抗体の生成に導く。従って
、種々のハイブリドーマ細胞系を選別して、所定の抗原
に対する抗体を製造するものを固定した後、個々のＩ・
イブリドーマ細胞系によって生成された抗体を選別１．
て、本発明において使用することを決めるに先立って、
固有の生産を模倣する免疫原性物質に対して最も高い親
和性を有するものを固定することが好ましい。この規準
に基く選択が、従来法において使用された多クローン性
抗体と比較して、単クローン性抗体を使用する本発明の
免疫学的検定並びに抑制試験における高い感度を達成す
るのに役立つものと考えられる。１多クローン性抗体は
抗原に対する親和性として、よくても免疫系により生産
されるすべての抗体の親和性のほぼ平均値を有するＫす
ぎない。選ばれた単りμｍン性抗体は所定の感度に匹敵
する親和性を有し、対象とするテスト系に対する範囲内
にあることが好プしい。抗体は少なくともｌｏ・２１モ
ル、更に好ましくは少なくとも約１０’　２１モルの親
和性を有することが望ましい。

更Ｋ、最も高い親和性を有するこれらの単クローン性抗
体を、従来の多クローン性抗体を使用し友方法で一つ友
正の結果を与えることが知られている試験体について模
擬検定を行うことにより、更に選別して、交叉反応を示
さずかつ誤った正の結果を与えない単クローン性抗体を
同定することができる。

コサイト免疫学的検定は抗体：抗原：抗体サンドイッチ
の形成に基いているので、通常抗原に対する相互の結合
を妨害しない２種の異っ喪単クローン性抗体が結合抗体
および可溶性標識抗体もしくは螢光消光法が使用された
際における抗体対として選ばれる。二者が前記サンドイ
ッチを完成するのに必要とされるので、逆並びに同時検
定は、例えば標識抗体：抗Ｎ：標識抗体なる錯体が形成
されるという懸念なしに行うことができ、かかる錯体の
形成は固相と結合する抗体と抗原との間の錯体形成を妨
害する。ここに本発明の特別の利点がある。更に１前検
定は中間的洗浄工程を経ることなしに達成できる。とい
うのは前記一種の抗体がコ種の異ったサイトに結合する
からである。我々はコＯヨうな方法を１急速前（ｆａｓ
ｔ　ｆｏｒｗａｒｄ）　’検定と呼ぶ。

しかしながら、特に前検定の場合において、抗原性物質
が十分な間隔を有する同等な抗体結合サイトを有してお
夛、その結果ｌよシ多くの抗体分子が同時に結合するこ
とが可能である場合には、同一の単クローン性抗体を標
識抗体並びに固体担体に結合し九抗体、両者に対して使
用することができる。このような系において、初めに試
料に結合抗体を添加することにより、サンドイッチの形
成が阻止されるが、これは立体的障碍によるものである
。次いで標識率クローン性抗体が添加されると、固体担
体上の未標識抗体と結合した抗原と錯化することも可能
である。

被検試料から抗原性物質を抽出するための本発明の方法
において使用する未標識率クローン性抗体は免疫学的検
定において普通に使用されているいずれかの担体上に固
定することができる。これらの中で一紙、プラスチック
ビーズもしくはポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロ
ピレンもシくは他の適当な物質でつくられ九試験管を例
示することができる。ｆ＆、アガロース、架橋デキスト
ランおよび他のポリサッカライドなどの粒状物質も有用
である。抗体をこのような物質に結合する大めの方法は
当業者には周知のことである。例えば、抗体を米国特許
第３．　Ａ＜＜＆、　ｆｆ、＄−−号に記載され良方法
を利用することにょシ、ポリサッカライドポリマーに結
合することができる。

本実ｔＩＡにおいて使用する標識率クローン性抗体には
従来の免疫学的検定において使用されているもＯと同じ
標識を与えることができる。この中で、螢光法による検
定に対しては米国特許第３、デダ０．４７１号に記載さ
れているように螢光発光性標識を、米５１４？許嬉３．
　Ａ！４１．０９０号におけるような酵素系標識を例示
することができる。現在のところ、抗体を１２６！　　
などの放射性同位元素によって、例えばＨｕｎｔｅｒ　
＆　Ｇｒｅ＠ｎｗｏｏｄ　ｓのＮａｔｕｒ＠。

、！！、９４ＩＣＩｔＡコ）に記載されたもしくはＤａ
ｖｌｄ等の８１ｏｃｈｅｗｌｓｔｒｙ　、　ｊＪ、　１
０　／４Ｉ−１０コｌ（／９クダ）に記載された手法を
利用して、標識することが好ましい。

典聾的検定においては、不溶性ナンドイツチ錯体と会合
する標識抗体の量は遣轟な手段によって不溶性担体物質
を検査するととによって決められる。しかしながら、被
検流体試料中の抗原の存在もしくは不在を、検定中に反
応せずに可Ｎｌ形で残された標識抗体の量に関連ずける
ことも可能である。多クローン性抗体と比較して、単ク
ローン性抗体を使用する本発明ＯＳ疫学的検定の利点は
以下の実施例を参照することによって理解されよう。

この実施例においては、参つＯ対照検定、同時検定、逆
積定、前検定および「急速」前検定を、単クローン性抗
体および多クローン性抗体を使用し、かつ正Ｏ試料とし
てヒ）　ＩｇＥを１０ＯＩＩＪ／ｍｌ含有する標準血清
を便１Ｍして行っ九。負の対照として、ＩＩＩＥを含ま
ない常態の馬の血清を使用し喪。

試料中における標識抗体として使用し光、ＩｇＥに対す
る多クローン性抗体はＰｈａｒｍａｃｌａＤｌａｇｎｏ
ｓｔｌｃｓ　ｏｆ　Ｐｌｓｃａｔａｗａｙ　（Ｎｅｗ　
Ｊｅｒｓｅｙ　）から得喪。固体担体に結合した多クロ
ーン性抗体はＴａｇｏ　、　　Ｉｎｃ、　ｏｆ　Ｂｕｒ
ｌｌｎｇａｍｅ　（Ｃａｌ　１ｆｏｒｎｌａ　）から得
九。

ＩｇＥ　Ｋ対する単り゛ローン性抗体は前述のＭＩｌｓ
ｆｅｉｎ＆に０旧ｏｒの方法を利用して得た。二種の抗
体としては、各々ＩＯ’ｔ１モルより大きなＩｇＨに対
する親和性を示すものが選ばれ、これらはＩｇＥに対す
る他のものの結合を妨害しなかつ喪。

検定はアガロースに結合した未標識抗体を使用九塩水（
ｐｌり、４Ｉ）を、すべての試料を洗浄する喪めに使用
し友。

実施例 ／ン同時検定法 アガロース粒子上に固定した抗体の懸濁ｔｔｉｏ。

ｐＬ　ｔ　／　００　ｆｉｂの検体（血清）および／　
００　ｆｉｔの可溶性ｌＩ■　で標識し九抗体と混合し
て、一対の試料について実施し九。この混合物を以下の
纂／表（多クローン性抗体）およびにコ表（単クローン
性抗体）に示し要所定の時間および更に３０分間インキ
ュベーションし九。余分の３０分間のインキュベーショ
ンは、ＩＩ−の添加試薬に対する追加の３０分間のイン
キュベーション時間が必要とされる他の検定法と拳法と
を同一条件とするために加えられた。イン會エベーショ
ン期間の経過後、アガロース粒子を緩衝液を添加して洗
浄し、次いで遠心分離した。吸引によシ洗液を除いた後
、得られ九アガｐ−ス粒子のペレット番、結合し九ｌ＄
Ｉ−標識抗体について計数し九。特定のインキュベーシ
ョン時間の後肢錯体０各々に対して得られ光計数値Ｆｉ
第１Ｉｌ！および第−表に示す。

コ）逆積定法 ／　Ｑ　Ｏｓｌの検体（ＩＩ１清）をｌｏＯμｔの可溶
性ｔ＊ｓ１ｇ識抗体と混合し、第７表および第二表に示
し要所定時間インキュベーションして、一対の試料につ
いて実施した。次いで、アガロース粒子上に固定し喪抗
体の懸濁液を添加し、得られた混合物を夏に・３０分間
インキュベーションし良、次いで、７ガロ一ス粒子を洗
浄し、同時検定法におけるように計数し良。計数量は第
１表および第２表に示す。

３）前検定法 一対の試料について行った６ｉｏｏμｔの検定（血清）
を／　００　ｐＬ　のアガロース粒子上に固定した抗体
の懸濁液と混合し、かつ第７表および第２表に示し要所
定時間の間インキュベーションし友。このアガロース粒
子をユ３〜３．０ｄｌの緩衝液を添加し、混合後遠心分
離することにより１回洗浄し、液を吸引により除去した
。次いで、可溶性１１１（−標識抗体ｌθθμｔを添加
し、混合物を更に３０分間インキュベーションした。次
いで、アガロース粒子を洗浄し、同時検定法ｆｃおけみ
ように計数し九。計数値をＩＩ／ｌ！および第コＩＩＫ
示す。

ダ）急速前検定法 検定は一変行い、アガロース粒子上に固定された抗体を
含む検体の最初のインキエベーシ璽ンと可溶性ｌｌｌｌ
−標識抗体の添加ｌ１との間の洗浄工程を省略し大以外
は前検定法と同様に実施した。

一対の対照に対する計数値７分並びに多クローン性抗体
および単クローン性抗体を使用してＩｇＥを含有する一
対の試料の検定における計数値７分の結果を第１！！お
よび第２表に夫々示した。これらのデータを以下のよう
にして嬉１図および第２図を作るために使用した。所定
のインキエベーション時間に対する対照の計数値７分の
平均は対応するＩｇＥ検定に対する計数値の平均から算
出し喪。

差を試料に添加した標識抗体の全計数値７分に対する割
合として計算し、同相に結合した抗体の合計数値７分に
対する割合としてＹ軸上にプロットした。インキュペー
ジ冒ン時間をＸ軸上にプロット　　しプヒ、。

単り四−ン性抗体を使用し九検定り結果を示す第一図に
示し九プロットと多クローン性抗体を使用した検定の結
果を示す第１図とを比較すると、各々の検定、即ち同時
、逆、前および急速藺検定において、単り寵−ン性抗体
を使用し喪検定がより感度が高いことがわかる。このこ
とはｌθθＩＵ　ＩｇＥ／−検定について得られた、同
相に結合したものの全計数値の高い割合によって示され
る。

予想外にも、同時並びに逆検定の場合において、単クロ
ーン性抗体を使用して行った検定が多クローン性抗体を
使用して行った対応する検定よりも一層急速に平衡に達
することがわかった。従って、これらの手法において単
クローン性抗体を使用することにより、検定に要する時
間を、単に洗浄工程を省くことにより達成される時間の
節約をはるかに越えて節減することができる。この点に
ついて、単クローン性抗体を使用した逆検定は１時間以
内で平衡に違した。多クローン性抗体を使用した同様な
検定実験でＦｉａ時間経過するまで平衡に遺しなかつ喪
。同様に１同時検定の場合にも、単クローン性抗体を使
用した検定ではｔ時間以内に平衡に達するが、多クロー
ン性抗体を使用した検定では２４ｃ時間以内で平衡に達
することはなかった。結局、本発明は従来法よりも極め
て急速かつ感度の高い同時並びに逆積定法を与え、力１
−）可溶性「ナンドイツチ」錯体の形成が所定の不溶性
一体の形成と競合するという懸念を排除する。

前述の議論において、焦点Ｆｉ一つのサイト即ちサンド
イッチ検定にあった。そこでは抗体の一つは不溶化され
るが、他方は分析される媒体中に可溶性である。これ以
外の変法も可能である。好ましい変法の１つでは粒子例
えばラテックス粒子などに結合し九抗体が使用され、そ
こで各粒子は多数の抗体を担持することになる。第１の
単クローン性抗体が結合するある量の粒子が、例えば第
一の単クローン性抗体が結合するある量の粒子と混合さ
れ九場合、乳白色の懸濁液が得られる。しかしながら、
試料が多価抗原を食有し、抗体が該抗原に対して特異的
魯場合、該試料（前記懸濁液に導入すると、粒子の凝集
鬼しくけ凝着を生じ、容易に検出し得る凝集塊を形成す
る。

凝集体形成の内置的検出が、抗原の存在に対する予検試
験（おいて利用することができる。この検出は一方の単
クローン性抗体を担持する粒子の色と、他方の抗体を担
持する粒子の色とを違えるととＫより促進される。しか
しながら、凝集の１寂を試料中における抗原存在量の尺
度として決定することも可能である。例えば、濁度変化
を比濁法などの標準的方法を利用して測定することがで
きる。

現在のところ、当業者に周知の方法を利用して抗体を共
有結合的に結合させたラテックス粒子を使用することが
好ましい。しかし、他の粒状担体を使用することも可能
である。その中で、シリカ、ガラス、細胞、ボリアクリ
ルアＺド、ポリメチルメタクリレートおよびアガロース
などを挙げることができる。好！シ〈は該粒子０粒径は
約０．−〜約ＩＯ−の範囲で変化する。肉眼的予検法は
、しかしながら、少なくとも約／、θμの大きさの粒子
を必要とする。

同別の変法において、抗体の一方はビーズ、試験管壁も
しくは他の巨視的園体担体上に固定され、他方の抗体は
ラテックス４しくは他の適蟲な物質の小粒子に結合され
る。抗原の存在下で、巨視的に結合した抗体と粒子に結
合している抗体との間に抗原を有するサンドイッチが形
成される。例えば粒子を着色することにより、サンドイ
ッチの形成を肉眼的に検出することがで負る。粒子に結
合した抗体の螢光、酵素、放射能もしくは他の標識を、
前述の可溶性抗体を使用する場合と全く同様に、定量的
検出のために使用することができる。

コーサイト検定の他の好ましい変法においては、二つの
興る単クローン性抗体のうちの少なくとも一つが酵素に
結合される。該酵素は一１他の単クローン性抗体に結合
する物質を含む反応を触媒して検出可能な物質を生成す
るか、もしくはｇコの抗゛体上の物質と相互作用して錯
体即ち抗体：抗原：抗体の検出を可能とする。検出は、
例えば比色法、螢光法、発光法、分光々度法などくよっ
て行うことができる。このような方法を利用すれば、抗
体両者を不溶性とする必要がなく、検定が著しく単純化
されることが理解されよう。

現在好ましい具体例においては　ｇコ抗体上の物質も酵
素でちり、検定は酵素で標識し友一対の抗体を使用して
、後の反応を触媒させる。抗体の一方は他のものが必要
とする生成物を製造する。

これらの反応においては、一種の抗体が抗原と結合する
場合、立体的に配向され、第１酵素反志の生成物Ｆｉ第
一の酵素で標識された抗体に近接するように発生され、
第一の反応は第１の反応の生成物が環境の媒質中に大き
く拡散する前に起こるように、一種の抗体が選ばれる。

この方法を一対の単り誼−ン性抗体を使用して説明する
ことができる。紋抗体の７つをヘキソキナーゼ（ＨＫ）
で標識し、他の抗体をグルコース−−６−ホス７エート
デヒドロゲナーゼ（Ｇ−Ａ−ＰＤＨ）で標識し、以下の
一連の反応を行う。

この検定は問題とする抗原を含む試料に、ＩＩ抗原と結
合する標識抗体、＾ＴＰ、　　グルコースおよび補酵素
ＮＡＤ＋を添加することにょ抄行われる。

抗原が存在する場合、以下に示すような錯体が形成され
る： ＨＫでｌ［ｌｌＬ九抗体は、Ｇ−Ａ−ＰＤＨで標識し九
抗体の近傍におけるグルコース−６−ホスフェートの形
成を触媒し、そこでグルコノラクトン−６−ホスフェー
トに転化される。この反応においてＮ＾０＋の還元によ
って形成されるＮＡＤＨは分光々寂法により検出するこ
とができる。というのはジヒド四ニコチンアミドが３４
ＩＯｒｖｍ￥Ｃおける強い吸収で特徴ずけられるからで
ある。

ＮＡＤＨの形成と同様に、グルコースのグルコノラクト
ン−み−ホスフェートへの転化も媒質中で起こり、これ
は錯化されなかった標識抗体によって触媒されるが、二
種の抗体が錯体即ち抗体：抗原：抗体において相互に近
接して配置される場合よりも一層低い速度である。従っ
て、対照試料と比較してｊｌＯｎｍＫおける吸収の増大
は試料中における抗原の存在を確認している。吸収にお
ける増加は錯体中の抗原の量とも関係ずけることができ
る。

適当に標識された問題とする抗Ｊ［Ｋ結合する抗体を使
用する２−サイト検定において、任意の他の適当な一対
の連続的な酵素触媒反応を使用することができる。その
中で、グルコノラクトンと過酸化水素とを形成し、引き
続きパーオキシダーゼにより触媒されて着色成分を生成
する過酸化水素と０−フェニレンジアミンとの反応を伴
うような、グルコースオキシダーゼにより触媒されるグ
ルコースの反応を挙げることができる。この検定におい
ては、単クローン性抗体の一方がグルコースオキシダー
ゼで標識され、他方はパーオキシダーゼで標識される。

対照と比較して、得られる色の強度は被検試料中におけ
る抗原の存在および／ｌたはその量と関係ずけることが
できる。酵素の存在下で、着色成分に酸化し得る他の物
質で０−フェニレンジアミンを代替することができるも
のと理解すべきである。

夫々ＮＡＰ）オキシドリダクターゼおよびルシフェラー
ゼで［１ｉＩ！した、所定の、佐原に結合する一対の抗
体を使用するｊ！に別の適し虎一連の反応は以下のもの
でめる： （、ｌ　ＦＭＮＨｍ　＋　ＲＣＨＯ＋　ｏｓ　−一→Ｆ
ＭＦｊ”＋　ＲＣＯＯＨ＋ＨｍＣ） ここでＲＣＨＯは典ｍ的にＦｉｌｏまたはそれ以上の炭
素原子′数を有する直幽アルデヒドで漬る。

Ｆ　Ｍ　Ｎ−畳１．即、ち励起波１ａの下Ｍｕの発生は
光子。

とができる。

酵素で標識し九一対の抗体を使用する他の具体例では、
酵素的に触媒される第１の反応の生成物け、一連の酵素
触媒反応のアロステリック性活性因子もしくは抑制因子
であシ得る。アロステリック性活性因子Ｆｉ第、ｚの反
応において消費されるというよりもむしろ酵素と相互作
用して基質に対する親和性を増すか、もしくけ酵素−基
質錯体が形成された後、基質を生成物に転化する速度を
増大する。一方、アロステリック性抑制因子は逆の効果
を有し、基質に対する酵素の親和性を減少もしくは基質
の生成物への転化速度を減する。アロステリック性抑制
は競合的もしくは非蓋合的歴の４のであり得る。

夫々ホスホフルクトキナーゼおよびホスホエノールピル
ベートで標識し九一対の抗体を使用する、アロステリッ
ク性活性因子を含む横走のガは以下のような反応を利用
する： （１）　　フルクトース−６−ホス７エー）＋ＡＴＰ−
−−−−−−→フルクトース−／、Ａ−ジホスフェート
＋＾ＤＰ（０＾＾） 反応いで形成されるフルクトース−／、Ａ−ジホスツエ
ートハホスホエノールビルペートカルボキシラーゼとア
ロステリック的に相互作用して、反応Ｑ）の触媒を活性
化し、ＰＥＰからのオキザロアセテートの形成を活性化
する。反応■は囲ｆれた媒質中で起こり、第３の単クロ
ーン性抗体にマレエートデヒドクゲナーゼを結合する必
ｙｈない。

問題とする抗原の存在および／またはその量は、３’ｌ
ＯｎｍＫおけるＮＡＤＨＫよる吸収の減少と関係ずける
ことにより測定することができる。ＮＡＤＨは反応■に
おいてＮＡＤ”Ｋ酸化される。

夫々アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ
）おヨヒホスホエノールビルベートカルボキシラーゼで
標識した一対の抗体を使用する、アロステリック性抑制
因子を含む検定の−では以ト＋α−ケトゲルトレート （２）　　　ＰＥＰ＋ＮＡＤＨ ホスホエ　−ルビルベー　カルボ中シラーゼ　ＯＡ＾十
Ｎ＾０＋反応（１）で形成されるアスノ（ルテートはホ
スホエノールピルベートカルボキシラーゼとアロステリ
ック的に相互作用することにより第一の反応を抑制する
。これはＮＡＤＨが酸化されてＮＡＤ　　になる速度を
減する。従って、ＮＡＤＨの示す３１ＩＯｒｒｎＫおけ
る吸収の減少を、被検試料中における抗原の存在および
／ま喪はその量と関係ずけることができ、該吸収におけ
る減少は抗原が存在することを示す対照試料について生
ずる減少量よ抄も小さい。

当業者は、第一の酵素により触媒される反応の活性化も
しくは抑制を含む他の多数Ｏ反応の対を２−サイト検定
において使用するために前記し九例に対して代用し得る
ことを理解するであろう。

他の具体例では、抗体対の一方のみを酵素で標識し、他
方を、例えば＃−素により触媒される反応を生じて第一
の生成物を形成するような物質で標識する。該ｇコの生
成物は比色法、螢光法、発光性、分光々変法もしくは他
の方法によって検出および／または定量し得るものであ
る。このようなガの／”）Ｆｉ一対の単クローン性抗体
を使用し、その一方はパーオキシダーゼにより標識され
、他方はルミノールで標識され、以下の反応を生ずる：
υ ルミノール この反応によシ放出され走光子Ｃｈ、＞は光学的方法に
より検出することができ、被検試料中における抗原の存
在および／またはその量と関係ずけることができる。

コーサイト検定の好ましい淘別の変形では、夫々螢光発
色団および該螢光体の放出する波長の党を吸収し得る消
光発色団と結合した一種の単クローン性抗体が使用され
る。この一種の抗体は、これらと−特異的な抗原と結合
した際に、これらコつの発色団が十分に接近して配置さ
れて、螢光体から放出された党を他の発色団が吸収し得
るように選ばれる。通常、これらは相’［Ｋ＃１０ＯＡ
以内、好ましくは３０Ａ以内におかれる。適当な抗体の
選択は予検法を介して行われ、そこでは螢光体および消
光体で標識された抗体の混合物が既知量の抗原を含む試
料と接触させられる。螢光の減少は前記一種の発色団が
相互に十分近接して配置していることを示すものである
。

螢光の消光を別層すれば、２種の抗体のいずれかを不溶
化する必要がなくなる。定量的測定は、単に最大螢光、
即ち抗原をまったく含まない対照試料の示す螢光におけ
る減少量を測定することによシ、もしくは試料の螢光と
既知量の抗原を含有する対照試料の螢光とを比較するこ
とにより行うことができる。しかしながら、螢光−消光
発色団対を、粒子凝集法と組合せて使用することもでき
、その場合には抗体の一方が試験管壁もしくはビーズな
どの固体担体に結合されて不溶化される。というのは、
螢光−消光発色団の対形成が起こるからである。この場
合も、螢光における減少が試料中における抗原の存在お
よび／またはその量の指標となる。

適当な螢光並びに消光発色団およびこれらを抗体と結合
する方法は米国特許第４４．　／７４’、　３ざｑ号に
記載されている。現在のところ、フルオレセインおよび
ロダミンを夫々螢光発色団および消光発色団として使用
することが好ましい。

本発明の前記議論において、我々は螢光−消光法を記載
したが、そこで必畳な発色団を担持する抗体対が、分析
すべき試料中に抗原が存在する場合に、該抗原との結合
を生じ、その立体的配列は螢光発色団の放出する光、を
該消光発色団が吸収し得るような配列にあろう存在する
抗原の量の定量的測定は最大螢光における減少を測るこ
とによって行われる。

これらの方法は、極めて広範囲の濃度に亘って試料中に
存在する抗原を測定するのに極めて適している。しかし
ながら、低抗原濃度に相当する、螢光におけるわ、ずか
な減少は検出困難であり、かつ正確な測定も困難である
。逆に、螢光にお叶るわずかな増加は比較的検定が容易
でかつ正確な測定が可能である。従って、本発明の他の
局面では、我々は消光の抑制を開択し、螢光における増
加を測定することが好ましい。

特殊な抗原に対する検定において、これを達成するため
に１抗原および腋抗原に結合する抗体のめる量を１夫々
螢光−消光発色団の一方屯しくけ他方で標識する。発色
団で標識した抗原並びに抗体を、次に結合して錯体を形
成する。該錯体において、螢光発色団は、これが放出す
る光が消光発色団により１１収されるように配置される
。これを達成するために１抗原を螢光体でｓｇｉ＊する
ことができ、一方抗体を消光体で標識することができ、
かつ逆もま九可能である。

被検抗原を含有する問題の試料は、次に発色団で標識し
た抗原と抗体とに接触させられる。適当なインキュベー
ジロン期間の後、螢光を測定する。

抗原が被検試料中に存在する場合、発色団で標識した抗
原と抗体との間の錯体形成を、試料中の抗原自身が単ク
ローン性抗体との錯体を形成することＫよって、少なく
とも部分的に抑制する。このことがある程ｆまで起こる
と、螢光発色団は最早その結果螢光発色団の放出する光
が消光発色団により吸収されるようＫは配置されない。

このことは’ｑＨ，における増加をもたらす。螢光にお
ける増加を測定し、抗原を含まないもしくは既知量の抗
原を含む対照試料の示す螢光と比較することにより、分
析中の試・答中の抗体の濃度と、前記螢光における増加
とを関係ずけることができる。

以上の記載から、発色団で標識した抗原：抗体錯体が可
溶性錯体で多ることは明らかであろう。

しかしながら、現在のところ、ラテックスもしくは他の
適当な粒子、例えば上述し友ような、錯体が形成された
場合に凝集体を形成するような寸法の粒子、に結合し九
発色団−ＷＡＷＩ＆抗原並びに単クローン性抗体を使用
することが好ましい。約ａコ〜約１０Ｓの範囲の寸法を
有する粒子が、通常この目的に適している。問題とする
抗原を含有する未知試料を抗体並びに抗原の凝集体形成
粒子と接触させ九ＩＩＫ、凝集抑制が起こる。というの
は”試料中の抗原が粒子に結合した抗体と結合するから
でおる。消光は最早起こらないので、螢光における増大
がもたらされ、これは検出しかつ測定して、既知量の抗
原を含む試料について観測された螢光と比較することＫ
よシ、試料中における抗原の量と関係ずけることができ
る。

凝集の抑制を直ｍ測定する検定ＫＪＭいて、結合抗原お
よび粒子に結合した単クローン性抗体を使用すること基
本発明の範囲内ＶＣＴｏる、この方法においては抗原も
抗体も標識されない。抗原を含有する試料を該粒子と接
触させると、インキュベージロン期間中に凝集の抑制が
起こる。これは少なくとも部分豹な凝集体形成の減少を
きたす。この抑制は比濁法もしくは濁度を測定する九め
の他の方法を利用することにより決定することができる
。

濁度における減少は試料中の抗原の量と関係ずけること
ができる。

ＩｇＥに関る検定に対する本発明の適用性を証明する本
発明の前記々載並びに実施例は、本発明を利用すること
のできる種々の方法の内示にすぎない。他の変法も有用
であることは当業者Ｋｒｉ明らかでめろう。従って、本
発明Ｆｉｅ許請求の範囲のみによって限定されるものと
１解すべきで娶る。

【図面の簡単な説明】

第１図はと）　ＩｇＨのための、を種の免疫検定法にお
いて、多クローン性抗体を使用して得られたれた結果に
おける差を示す第１図と同様な図である。 図面の浄書（内容に変更ｒ（ｉ：１ −特許庁長官　殿 １．事件の表示　昭和ｊｔ　　年特許願　第７９≠３３
乙　号３、補正をする者 事件との関係　　出願人 名称　　　　　ハイプリチック　インコーホレーテッド
４、代理人 ５、補正命令の日付　　昭和５７年３月３０日６、補正
の対象　　明細書　全図面 ７、補正の内容　　別紙の通り

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （ハ　抗原性物質、第１抗体および第１抗体とは異るサ
   イトにて該抗原に結合する第２の抗体の三元錯体を、流
   体試料と第１および第２抗体とを接触させることにより
   形成することを含む、流体試料中の抗原性物質の存在も
   しくはその濃度を検査するだめの免疫学的検定法におい
   て、前記第１および第２抗体の夫々に対して単クローン
   性抗体を使用することを含む、改良された前記免疫学的
   検定法。 ■　螢光発色団が前記第１抗体に結合し、該螢光発色団
   の放出する波長の光を吸収し得る発色団が前記第２の抗
   体に結合し、かつ前記試料を第１並びに第２抗体を含む
   溶液と接触させて三元錯体を形成して、螢光強度を決定
   し、これを該抗原を含まないもしくは既知量の該抗原を
   含有する標準試料の螢光強度と比較することを特徴とす
   る特許請求の範囲第（ハ項記載の方法。 儲　前記請ｌ並びＫＩＩＥコ抗体の１つが固体担体に結
   合しており、該担体が前記流体試料に不溶であり、かつ
   Ｉｔ＠／並びに第コ抗体の他方が皺流体試料に可溶であ
   る、特許請求の範囲第０項記載の方法。 闇　前記流体試料が同時に＃第１並びにに２抗体と接触
   させられて不溶性の三元錯体を形威し、かつ皺三元錯体
   の螢光強度を決定し、前記抗原を含まない、もしくけ既
   知量で皺抗原を含有する標準溶液の螢光強度と比較する
   ことを特徴とする特許請求の範囲第（２）項記載の方法
   。 （６）前記流体試料をまず前記第１および第コ抗体の１
   つと接触させて抗体−抗原の二元錯体を形成し、次いで
   １第１および第コ抗体の他方と接触させて三元錯体を形
   成し、かつ皺錯体のもしくは皺流体の螢光強度を決定し
   、前記抗原を含まないもしくは既知量の該抗原を含有す
   る標準試料の値と比較することを特徴とする特許請求の
   範Ｉ！１ｌｌＩ（Ｊ）項記載の方法。 （Ａ＞　　前記第１抗体が前記流体試料に不溶な粒子に
   結合ｌ、ており、かつ該試料を三元錯体の形成を起こす
   のに十分な時間、１懸濁液と接触させ、それＫよって前
   記第１およびｇ二抗体に結合した粒子の凝集を起こさせ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第（１）項記載の方
   法。 （７）前記粒子の大きさが約０．２μ〜約１０μの範囲
   内である、特許請求の範囲第（６）項記載の方法。 （イ）　前記粒子がラテックス、シリカ、ガラス、細胞
   、ポリアクリルアミド、ポリメチルメタクリレートおよ
   びアガロースからなる群から選ばれる、特許請求の範囲
   第■項記載の方法。 （η　第１抗体を結合する前記粒子が、第一抗体を結合
   する粒子とは違つ九色を有するものであることを特徴と
   する特許請求の範囲第（θ、（カおよび（９）項のいず
   れか１項に記載の方法。 Ｃｌ０）前記粒子の′サイズが約／、０−１０ｔｔの範
   囲内にあることを特徴とする特許請求の範Ｉ！Ｉ第仏）
   、（７）、鎖および（９項のいずれか１項に記載の方法
   。 Ｃｌｆ）　　前記三元錯体の形成螢、試料の濁度を決定
   し、かつ抗原を含まないもしくけ既知量の抗原を含有す
   ることがわかっている対照試料の温間と比較することを
   特徴とする特許請求の範囲第（６）、■、＠）および（
   ０項のいずれか１項記載の方法。 （０螢光発色団を前記第１の抗体に結合させ、皺螢光発
   色団によって発せられる波長の光を吸収することのでき
   る発色団を第一の抗体に結合させ、かつ該接触の後螢光
   強変を決定し、皺抗原を含まないもしくけ既知濃度で館
   抗原を含有する標準試料の普光強変と比較することを特
   徴とする特許請求の範囲第（１，）、（７）、■および
   （１０）項のいずれか１項に記載の方法。 （／３）前記螢光発色団がフルオレセ、インであり、放
   出され走光を吸収し得る発色団がロダミンである、特許
   請求の範囲第０１儲、（至）、（至）および（／２）項
   のいずれかに記載の方法。 （／４）前記第１抗体に酵素を帖合し、前記第一抗体に
   ある物質を結合し、それによって該酵素と物質とを相互
   作用させて、抗体；抗原：抗体錯体の検出を行うことを
   特徴とする特許請求の範囲第（１）項記載の方法。 （／Ｓ）第２抗体に結合させる前記物質が酵素である、
   特許請求の範囲第（μ）項記載の方法。 （ン）第１抗体と結合した酵素が、第一の抗体に結合１
   ７た酵素によシ触皺される反応に必要な生成物を生成す
   る反応を触媒することを特徴とする特許請求の範囲第（
   ／、１）項記載の方法。 （／７）ＩＩＥ／抗体と結合した酵素により触媒される
   反応の生成物が、第一抗体と結合した酵素により触媒さ
   れる反応において消費されることを特徴とする特許請求
   の範囲第（ム項記載の方法。 （脣第１抗体と結合した酵素により触媒される反応の生
   成物が、第一抗体と結合し喪酵素とアロステリックな相
   互作用をする、特許請求の範囲第（ム）項記載の方法。 （／ｑ）第７の抗体と結合し喪酵素Ｋｘ勤触媒される反
   応の生成物が第一の抗体と結合した酵素をアロステリッ
   ク的に活性化しもしくはアロステリック的に抑制する、
   特許請求の範囲第（／ｆｆ）項記載の方法。 （、ｒ））第一の抗体と結合した酵素によって触媒され
   る反応が検出可能な生成物を特徴する特許請求の範囲１
   １１Ｅ（／４）−（／９）項のいずれか１項に記載の方
   法。 ＜ｙ）第一の抗体に結合した酵素によって触媒される反
   応が検出可能な物質を特徴する特許請求の範囲第（／Ａ
   ）〜叡）項のいずれか１項に記載の方法。 （、Ｌ２）前記検出可能な物質の形成もしくけ消費が比
   色法、螢光法、ルミネッセンスまたは分光光度法により
   検出される、特許請求の範囲第■）またＶ！（，２／　
   ）項記載の方法。 Ｃ２３）第二の抗体上の前記物質が、第７の抗体に結合
   した酵素によや触媒される反応を特徴する特許請求の範
   囲第（ル）項記載の方法。 （Ｊ）前記反応が比色法、螢光法、ルミネッセンスもし
   くは分光光度法により検出し得る物質を特徴する特許請
   求の範囲１ｎ項記載の方法。 ■）（ａ）流体試料を、添加した既知量の抗原性物質お
   よび抗原性物質と結合する単クローン性抗体と接触させ
   、かつ （ｂ）　　皺抗体と添加され九抗原性物質との間の錯体
   形成の阻書を、前記単クローン性抗体と抗・原性物質と
   を結合させて嬉コの錯体を形成することによって一定す
   る、 工程を食む、流体中における抗原性物質の存在もしくは
   そのＩＩ変を決定する方法。 （ＪＡ）螢光発色団を前記添加され九抗原性物質と結合
   させ、該螢光発色団により発せられる波長の光を吸収す
   ることのできる発色団を前記単クローン性抗体と結合さ
   せ、かつ皺箇触の螢、螢光強度を決定し、腋杭原性物質
   を貴家ないもしくは既知１１度で皺抗原性物質を含有す
   る標準試料の螢光と比較することを特徴とする特許請求
   の範Ｉ！第の）項記載の方法。 （２７）螢光発色団を単クローン性抗体と結合させ、該
   螢光発色団によって発せられゐ波長の党を吸収すること
   のできる発色団を前記添加され大抗厘性物質と結合させ
   、かつ＃接触の後、螢光強度を決定し、訪抗原性物質を
   含まないもしくは既知濃度で館抗原性物質を含有する標
   準試−料の螢光と比較することを特徴とする特許請求の
   範囲第（３）項記載の方法。 （Ｘ）前記螢光発色団がフルオレセインであ秒、放出さ
   れ走光を吸し得る発色団がロダミンである、特許請求の
   範囲第（、Ｕ）またはＷ）項記載の方法。 （，２Ｆ）前記単クローン性抗体と前記添加され九抗原
   性物質が粒子に結合されており、ＩＩＥ／の錯体が単ク
   ローン性抗体を結合している粒−五を皺抗原性物質を結
   合している粒子との凝集体を含む、特許請求の範ＩＩ！
   ＩＩ（：ｗまえけ１２７）項記載の方法。 （Ｘｌ）前記粒子がラテックス、シリカ、ガラス、細胞
   、ボリアクリルア２ド、ポリメチルメタクリレートおよ
   びアガロースの粒子からなる群から遺ばれる、特許請求
   の範囲＃（２９）項記載の方法。 Ｃ３ｎ前記単クロ一ン性抗体と前記添加され九抗原性物
   質とが粒子に結合されてお抄、第１の錯体が腋添加され
   九抗原性物質を結合している粒子の凝集体を含み、かつ
   皺接触の後、試料の濁度を一定し、紋抗厘性物質を含ま
   ないもしくは既知量の皺抗原性物質を含有する標準試料
   の濁度と比較することを特徴とする特許請求の範囲組Ｊ
   項記載の方法。 （３２）前記粒子がラテックス、シリカ、ガラス、細胞
   、ポリアクリルアミド、ポリメチルメタクリレートおよ
   びアガロースの粒子から選ばれる、特許請求の範１５ｇ
   （、？／）項記載の方法。 （３３）前記粒子のサイズが約θ、−〜約ｌＯμの範囲
   内にある、特許請求の範［１＄１（２ｉ’）、■）、ω
   乃および（Ω項のいずれか７項に記載の方法。 （１）（→　流体試料を、抗原性物質と結合する第１の
   可溶性単クローン性抗体と接触させて、腋抗体と該試料
   中の抗原性物質との可溶性錯体を形成し、ただし該第１
   単クローン性抗体は標識されている； 伽）該可溶性錯体を、１流体中に不溶性の固体担体と結
   合する第コの単クローン性抗体と接触させて、前記第１
   単クローン性抗体、前記抗原性物質および皺園体担体と
   結合する第コの単クローン性抗体の不溶性錯体を形成し
   ；（ｃ）１９流体試料と未反応標識抗体から＃固体担体
   を分離し； ＠　腋固体担体と会合している標識抗体の量または未反
   応標識抗体の量のいずれかを測定し：かつ （６）得られた標識抗体の量と、前記抗原性物質を含ま
   ないことがわかっている、工程（尋〜＠に従って調製し
   た対照試料について得られ九標識抗体の量とを比較して
   、前記流体試料中における抗原性物質の存在を決定する
   か、もしくＶｉ測測定れた前記標識抗体の量と、前　゛
   記工程（ａ）〜（ｄｌＫ従って調製し九既知量の抗原性
   物質を含有する試料について得られ九標識抗体の量とを
   比較して、皺流体試料中における抗原性物質の濃度を測
   定する、各工程を含む、流体中の抗原性物質の存在もし
   くけその濃度を測定する九めの、特許請求の範囲第（０
   項記載の方法。 （ａ）　　流体試料を、その中の抗原性物質と結合する
   第７および第−単クローン性抗体と同時に接触させて、
   鮪ｌ単りローン性抗体、第コ麺りローン性抗体および腋
   抗原性物質の不溶性錯体を形成する工程、ただし該第１
   単り冒−ン性抗体は標識されており、かつＩｔ第２単ク
   ローン性抗体は前記流体中に不溶性の固体担体に結合し
   ている： （ｂ）＃固体担体を、皺流体試料および未反応標識抗体
   から分離する工程； （Ｃ）＃固体担体と会合している標識抗体の量もしくは
   未反応標識抗体の量Ｏいずれかを測定する工程； （ｄ）ｌＩｌ定された標識抗体の量を、抗原性物質を含
   ｔＳいことがわかっている前記工＠　（ａ）〜（ｃ）に
   従って調製し九対照試料について得られた標識抗体の量
   とを比較して、館流体試料中における抗原性物質の存在
   を決定するか、もしくは測定した標識抗体の量を、前記
   工ＩＩ　（ａ）〜（ｃ）　Ｋ従って調製し九胱知量の抗
   原性物質を含有する試料についてｌｌ室し九標識抗体の
   量と比較して、館流体試料中の抗原性物質の鰻重を決定
   する工１！： を含む、流体中の抗原性物質の存在もしくはその濃度を
   決定にるための、特許請求の範囲第（１）項記載の方法
   。 （ふ）第１の標識抗体、抗原性物質および流体試料に対
   して不溶性の固体担体に結合している第コの抗体の三元
   錯体を形成し、腋標識抗体および固体担体に結合したｗ
   ｉ−の抗体の各々に対して単クローン性抗体を使用する
   ことを特徴とする、流体試料中の抗原性物質の存在また
   はその濃度を決定するための、特許請求の範囲第ψ項記
   載の免疫学的検定法。 （，７７）流体試料をまずｆｌＸ２の抗体と接触させて
   、抗原性物質と１流体中に不溶な第コ抗体との二元錯体
   を形成し、次いで第１の標識抗体と接触させて三元錯体
   を形成することｆ特徴とする、特許請求の範ｌ！第（異
   ）項記載の方法。 （３ｔ）流体試料をま、ず第コ抗体と接触させて、抗原
   性物質と該流体に不溶なｔｘ２抗体との二元錯体を形成
   し、試料を固体匈体と分離し、蚊固体担体を第１標識抗
   体の溶液と接触させて三元錯体を形成することを特徴と
   する特許請求の範囲第（３Ａ）項記載の方法。 （、？９１）前記Ｉｆ！／単クローり性抗体が前記第コ
   単りローン性抗体とけ異った細胞系からの生成物である
   、特許請求の範１！Ｋ（？Ｋ）〜（ご項のいずれか７項
   に記載の方法。 （す）前記抗原が少なくとも２つの同等な結合サイトを
   有しており、＃票／およびｇコ単りローン性抗体が同一
   の細胞系からの生成物であることを特徴とする特許請求
   の範囲第（、？’！／）〜（１項のいずれか／ｌ［Ｋ記
   載の方法。 （ｌ／）前記請ｌおよび第コ抗体が少なくと本約１ｏ１
   ｔ１モルの抗原に対する親和性を有するように選ばれる
   、特許請求の範ｌ！Ｉ第Ｊ）〜（初項のいずれか７項に
   配電の方法。 （侵）前記親和性が少なくと４約１０・２１モルである
   、特許請求の範Ｉ！！第（４０項記載の方法。 （す）前記固体担体を洗浄して皺担体から流体試料を分
   離することを特徴とする特許請求の範囲第（、匍〜（架
   ）項のいずれか７項に記載の方法。 （＃）　ＩＩ指担体燐酸塩で緩衝した塩水で洗浄する、
   特許請求の範囲第（り項記載の方法。 （枯）抗原を、ＩｇＥ、肝炎ウィルス＾、肝炎ウィルス
   Ｂ、　肝炎ウィルスノンＡ１肝炎ウィルスノン８、α−
   フェトプロティン、癌胎児性抗原、インシュリンおよび
   ヒト甲状腺刺激ホルモンからなる評から選ばれる、特許
   請求の範Ｂ＠Ｃ３’ｌ）’−（Ｑｏ）項のいずれか１項
   に記載の方法。 （砧）前記標−瞭抗体が放射性同位元素、酵素および螢
   光性物質からなる群から選ばれ、かつ測定が放射線法、
   螢光法および酵素法からなる群から選ばれる、特許請求
   の範囲第ｙ）〜（り項のいずれか／）ＪＫ記載の方法。 （Ｗ）前記標識が放射性同位元素＋ｔｓ　１である、特
   許請求の範囲［（＄Ａ）項記載の方法。