JPH03272466A - 多重免疫評価分析方式 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、問題とするそれぞれの反応性成分と特異的に
結合する一つ以上の配位子が関与する化学的および生物
化学的評価分析に関し、さらに詳しくはその型の多重評
価分析に関する。

抗体−抗原複合体の形成が関与する免疫反応は、互いに
非常に特異的に結合する成分の反応により複合体が形成
される、既知の化学的または生物化学的な評価分析物／
配位子反応を代表するものである。その様な反応は他に
も数多く知られており、例えば核酸ハイブリダイゼーシ
ョン、酵素−抑制体、酵素−助酵素、ホルモン−受容体
、酵素−受容体、および類似の基質−特異性反応などで
ある。ここで使用する「成分」および「配位子Ｊの用語
は、−船釣に、その様な複合体、特に抗原−抗体複合体
の反応性部分を、相互に交換的に意味する０例えばこれ
らの用語は、ハブテン、完全抗原、反応性抗原−抗体断
片、および完全抗体などの、免疫学的に反応性があるす
べての部分を含むものとする。用語「評価分析物」は、
定性的、定量的あるいはその両方で評価分析する成分ま
たは配位子を意味し、用語「捕獲体」は、問題とする評
価分析物と特異的に結合する配位子または成分を意味す
る。

これらのよく知られた免疫および他の特異的な結合反応
に基づく評価分析には、広範囲な技術が関与する。評価
分析の中には、配位子または評価分析物に結合し、その
反応生成物または複合体からの放射を測定することによ
り検出できる、放射性、発光または蛍光標識を使用する
ものがある。

−船釣に、基質上に固定した抗体などの捕獲体が、未知
量の、その捕獲体と結合させるための抗原などの反応性
成分または評価分析物を含む溶液中で反応する場合、そ
の抗原の力価は容易に得られる。例えば、公知の競合評
価分析技術では、評価分析物および既知量の標識を付け
た評価分析物の混合物を固定相に塗布し、結合場所を求
めて互いに競合させる。供試評価分析物の量が多い程、
標識評価分析物がその捕獲体に結合する程度は少なくな
る。予め決めた検量曲線を使用し、結合した捕獲体と複
合体を形成した標識抗原がらの放射強度を測定すること
により、標識を付けていない、つまり供試評価分析物の
量を求める、つまり評価分析することができる。。

別の一般的な技術では、評価分析物を含む試験溶液を、
捕獲体の溶液に加える。形成された複合体が十分に凝集
して沈殿するまたは膠着すると仮定して、その様な生じ
たＨ着または沈殿反応を観察することにより、捕獲体に
対して特異性がある評価分析物がその試験溶液に含まれ
ていたがどうかが分かる。この場合、膠着物または沈殿
物から反射されるまたは散乱される放射、または！ｌｆ
着物または沈殿物によって透過率が弱められた放射を観
察する０反応生成物から放射（例えばａ放射、発光放射
または蛍光放射）が起こる免疫評価分析では、その放射
を一般的にはガイガーまたはシンチレーションカウンタ
ー、オートラジオグラフィー、フルオリメーター等によ
り検出および／または測定することができる。

抗体−抗原反応に関与する結合力は、多くの点で他の特
異的結合、例えば酵素−基質および酵素助酵素複合体形
成において生じる特異的な結合に類似した、静電気、水
素結合およびファンデルワールス力の相互作用の組み合
わせであり、それによって非常に強い特異的な結合を与
えると考えられる。しかし、その様な結合反応の特異性
は絶対的なものでない。その様な特異的反応に関与する
成分、特に標識を付けた抗体は他の物質と結合すること
が多いので、結合の特異性に依存する免疫評価分析およ
び捕獲体評価分析などの評価分析においては、その様な
非特異性結合が起こることにより、評価分析の感度およ
び再現性に悪影響を及ぼすことがある。ここで使附する
用語「結合したＪは、特異的または非特異的なあらゆる
種類の結合により結合した配位子に関して使用している
ことは明らかである。

この評価分析に対する非特異的結合の影響を排除するた
めの先行技術の試みは、主として化学的であり、非特異
的結合を抑制する、または阻止するためのタンパク質を
含む試薬を使用することに向けられていた。しかし、そ
の様な試薬は、抗体−抗原評価分析には多くの異なった
種類の阻止物（例えば牛脂血清、ゼラチン、カゼイン、
等）が使用されているので、万能ではない。

分かり易くするために以下の説明では、特異的結合反応
が関与する評価分析を免疫評価分析に関して説明するが
、熱論、そこに関与する原理は、特に注意がない限り、
特異的結合反応が関与する他の種類の評価分析にも適用
することができる。

特異的結合反応が関与する測定の最高感度を達成するこ
とは、最も強力な信号および最も感度の高い機器を使用
するということではない。感度の中には、抗体の親和性
による制限があるために、標識や機器の改良によって向
上させることができないものがある。

例えば、捕獲または非競合性免疫評価分析を考えてみる
。原則的に、抗体の親和性が低いために生じる影響は、
標識を付けた抗体の濃度を高くすることによって克服で
きるので、非競合性免疫評価分析は、競合性免疫評価分
析よりも感度をより高くできる可能性がある。それぞれ
同じ抗体を使用する場合、競合方法に対して非競合方法
が有する潜在的な感度に関する優越性は、抗体の親和性
が低くなる程増加する。抗体親和性１０”Ｍを使用して
、例えば、非特異的結合の影響を１％から０．０１％に
低下させることができる場合、潜在的な評価分析感度は
１０’から１０３分子／ｍｌに増加するであろう。しか
し、標識を付けた抗体の量を増加させると、標識を付け
た抗体の非特異的結合の絶対量が増加することになり、
より量が少ない抗原を見分ける能力が低下し、非競合方
法の実際の感度の長所を排除あるいは低下させることに
なろう。

配位子−結合測定における従来の方法では、通常、先ず
使用する機器のゼロ応答に対する一連の外部測定（つま
り結合の実測とは別に、またはそれに先立って）を行な
う、即ち、実行すべき評価分析に関係ない非特異的結合
の測定を１問題とする評価分析物を全く含まないことが
分かっている試料の評価分析により行なうことによって
、非特異的結合を推定する。一般に、その様な測定は一
定ではなく、ある平均値の辺りで変動する。その様な一
連の測定から、平均非特異的結合［Ｎ５Ｂ）応答、およ
びＮＳＢノイズ水準を決定できるが。

そこではＮＳＢ測定における２乗平均（ＲＭＳ）ノイズ
がＮＳＢ応答の標準偏差と等しい、それに続く未知の評
価分析物の濃度の評価分析では、その系の応答から平均
ＮＳＢ応答を引いたものとして、特異的応答を得る。熱
論、与えられた試料が評価分析物を確実に含んでいるた
めには、特異的応答はノイズよりも大きくなければなら
ない。評価分析物水準が非常に低い場合、ノイズは通常
ＮＳＢノイズにより支配される。

そこで、本発明の主目的は、系の感度を向上させるため
に、「外部のＪ比較測定を補足するのに使用できる「内
部の」基準を使用する配位子−結合測定方式を提供する
ことである。

本発明のもう一つの重要な目的は、抗体などの標識を付
けた配位子の非特異的結合の影響を抑制し、または最小
に抑えることにより、先行技術による免疫評価分析で現
在達成できる感度以上に、評価分析の感度を増加させる
様な方式を提供することである。

本発明の他の目的は、以下に説明する。

したがって１本発明は、構造を有し、素子を組み合わせ
、部品を配列した装置、および幾つかの段階を含み、そ
の様な段階の一つ以上が他のそれぞれと関連した方法か
ら成るが、それらのすべてを以下に詳細に説明し、その
適用範囲を請求項に小す６ 本発明の性格および目的を理解し易くするために１本発
明の原理を具体化した装置を部分的に図式的に、部分的
に断面で示した添付の図面を参照しながら、以下に詳細
に説明する。

本発明の方式は、全体的には多重評価分析方式であり、
そこではその系内の二つの異なった配位子の結合程度に
比例する信号を発信し、それをリアルタイムで、−船釣
に同時期に、即ち本質的に同時に、あるいは評価分析中
の同じ試料に関して比較的短時間の間に行なった観察ま
たは測定の順に評価する。多くの場合、背景における急
速な変化の影響をできるだけ少なくするために、観察を
できるだけ同時に行うのが望ましい。

本発明の多重方式は、それぞれ対応する評価分析物と特
異的に結合する異なった標識を付けた配位子を使用し、
二つ以上の評価分析物を本質的に同時に評価分析する、
公知の多重チャネル評価分析とは区別すべきである。尿
中のモルヒネおよびコカインを検出するための二重無線
免疫評価分析ｆＤｕａｌ　Ｒａｄｉｏｉｍ謬ｕｎｏａｓ
ｓａｙ）、Ａ、Ｓ、Ｙｏｕｎｇ、　Ｆ、Ｒｕｂｉｏおよ
びＳ、Ｅ、Ｉｌａｇｎｅｒ、　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ、第３４巻、第６号、１９８８．１１６
１頁参照。

しかし、本発明の多重評価分析方式の代表的な実施形態
は、ある試料中の問題とする特定の評価分析物との特異
的な結合反応を測定するもので、その方式では、二つ以
上の、異なった標識を付けた、それぞれ固有の異なった
結合特性を持つ配位子を、その系内の試料に関して同時
に観察する。

得られた応答は処理によって、その様な評価分析中の特
異的結合の応答をより正確に決定できる様に、非特異的
結合の影響を少なくする。

したがって１本発明の方法は、試料中の問題となる評価
分析物のための評価分析を提供する。この方法は、少な
くとも二つの異なった配位子を与える工程を含み、各配
位子はそれぞれ異なった、互いに見分けが付く種類の標
識に結合し、その様な配位子の少なくとも第一の配位子
はその評価分析物と特異的に結合することができる。そ
れらの配位子と試料は混合により互いに接触し、少なく
ともその第一の配位子および評価分析物が関与する複合
体を含む試験体（これは液体でよい）を形成する。次い
で、その試験体中の配位子にのみ結合した標識のそれぞ
れを同時に、定量的に、個別に測定し、これらの測定を
比較する。熱論、先ず未結合配位子を洗い流し、結合配
位子を未結合配位子から分離することによって、より簡
単に測定を行なうことができる。

本発明は、反応表面上の固定した配位子に評価分析物を
特異的に結合して、複合体を形成することにより、試料
中の評価分析物を評価分析する装置において具体化され
ている。特異的な結合は。

試料を、固定した配位子、および別の、異なった標識を
付けた第二の配位子に接触させて行なう。

二つの異なった配位子は、互、いに予め決めた比率で与
えられ、免疫学的に相互反応しないものである。第二の
配位子は、評価分析物または試料中の他の成分と特異的
に結合しないのが好ましい。配位子上の異なった標識は
定量的に測定できる。装置に対する、これらの配位子の
相対的な非特異的結合特性は、既知の、あるいは予め決
めた関数または関係にある９次いで、結合した量の配位
子にのみ結合したこれらの！！４識の定量測定を本質的
に同時に行う、試験体中の配位子の既知の比率、装置に
対する配位子の非特異的結合特性間の既知の関係、およ
び結合標識の定量測定から、第一の配位子の評価分析物
に対する特異的結合を比較的正確に求めることができる
。

特に、互いに容易に区別できる信号、例えば異なった波
長における蛍光、をそれぞれ与えられる様に、異なった
標識を選択する。この様に、評価分析の中で特異的およ
び非特異的の両方で結合した配位子に結合した励起標識
から与えられる信号の振幅を定量測定するのである。試
験体または試薬中の配位子の相互の比率は既知であるの
で、また評価分析装置に対するこれらの配位子の非特異
的結合特性間の関係も既知である、または予め決定でき
るので、評価分析物に特異的に結合するであろう配位子
のみに関して測定した信号が、その様な特異的に結合し
た配位子のためにどの程度生じるかをリアルタイムで決
定するのは比較的簡単になる。

例えば、評価分析物に特異的に結合する配位子（Ｌ、）
およびその評価分析物に特異的に結合しない配位子（Ｌ
、）が試験体中に試薬の形で、ｌ：１の比（Ｒ１）で存
在すると仮定する。さらに、問題の評価分析物が全く存
在しない状態で評価分析装置中の試薬の予備試験を行な
い、その配位子が非特異的に１　：２　（Ｌ、　：Ｌ、
）の比（Ｒ２）で結合することが分かったとする。次い
で、評価分析は、問題の評価分析物を含む可能性がある
試料を試薬体に接触させる必要がある。これにより、評
価分析物とＲ８の特異的結合および配位子の評価分析装
置への非特異的結合（この用語は、本文では、評価分析
物のＲ８への特異的結合以外の、生じる結合反応のすべ
てを含むものとする）の両方が起こる。次いで、結合し
た配位子上のそれぞれの標識から来る、特有の、個別の
信号（即ち別チャネル測定）を同時に測定する。理想的
な場合には、Ｌ、、から来る信号は、非特異的に結合し
た配位子Ｌｎにのみ帰せられるのに対し、Ｌよから来る
信号は、特異的および非特異的の両方で結合した配位子
から発生する。配位子は比Ｒ５で存在し、試薬中のこれ
らの配位子の相対的な非特異的結合特性はＲ２であるこ
とが分かっているので、これらの関係を使って特異的に
結合したＬｌから発生した信号の程度を求めることがで
きる。

例えば、信号の振幅をＡｇ１３よびＡ１で測定し、それ
ぞれ特異的および非特異的に結合したり、および非特異
的に結合したり、、を表わすと仮定すると、特異的に結
合したり、にのみ帰せられる信号Ａ、の部分Ｓは１次の
式で表わされ、＋１１５＝Ａ、−Ａ、、ｆ（Ｒ，、Ｒ，
１ここでｆ　（Ｒ，、Ｒ２＋は値Ｒ＋およびＲ２の関数
（直線または非直線である必要はない）である。

積としての関数の簡単な代表的な形は、（２１ｆ＝に、
Ｒ，に、Ｒ２ であり、ここでに１およびに２は単に実験的に求める比
例定数または荷重定数である。

本発明の上記の評価分析装置の変形では、定量的に測定
でき、他の二つの配位子上の標識から容易に区別でき、
問題の評価分析物上の異なった場所に、あるいは異なっ
た評価分析物に特異的に結合する標識を付けた、他のま
たは第三の配位子を追加便用する。熱論、三つの配位子
はすべて、互いに予め決めた比率になっており、これら
の配位子は免疫学的に相互反応しない。これら三つの配
位子の、装置に関する相対的な非特異的結合特性は、既
知のまたは予め決めた関数または関係にある。この方式
は三つのチャネル、すなわち二つの特異的および一つの
非特異的チャネルを与え、そのチャネルから二つの特異
的結合配位子の特異的結合特性を求めることができる。

本発明の一実施形態は、蛍光標識を使用する蛍光免疫評
価分析方式、特に減衰全反射（ＡＴＲ）セルを使用する
評価分析で説明するが、熱論、本発明の原理は、特異的
結合反応が関与し、他の種類の検出可能な標識を使用す
る。他の型の評価分析にも及ぶ。

放射伝達性材料から成るスラブ形状のＡＴＲセルを使用
して、凋落波によりセル表面に誘発され、そのセル表面
に対して本質的に直角にセルを横切って進む蛍光を観察
し測定することが、最初にＴ、ヒルシュフェルトにより
、米国特許筒３．６０４，９２７号に提案されている。

より高度なＡＴＲ免疫評価分析装置が１９８５年１２月
１０日付米国特許第４，５５８，０１４号に詳細に記載
されているが、その様なＡＴＲセルの説明および操作を
ここに参考として含める。その様なセルにより検出され
る蛍光信号はそのセルの反応表面に近接する凋落区域内
にのみ生じるので、発明においてその様なＡ　ＴＲセル
を使用することにより、明らかな利点が得られる。この
様に、セル自体が、反応表面に非特異的に結合し、およ
び反応表面で形成された複合体に特異的に結合した配位
子から、遊離の配位子を自動的に分離する。

図面に関して、完全に内部反射する評価分析セル１０の
部分断面を示す、セル１０の好ましい実施形態は、円筒
状の棒またはファイバー１２を含むが、これは引伸した
、本質的に円筒状の、光学的に透明な物体であり、多重
内部全反射によりその長さに沿って光を伝える様になっ
ており、光学放射は、そのファイバーの縦軸を中心とす
る本質的に回転対称の立体角度内で、そのファイバーの
一端に入射する。例として、ファイバー１２は、評価分
析する液体試料の屈折率よりも大きな屈折率を持つもの
であれば、ガラス、石英、サファイア、ポリプロピレン
、ポリオレフィン、ナイロン、等の多くの光学的に透明
な材質のどれでもよい。以下に説明する様に１合成重合
体はガラスなどの無機基材よりも、以下に述べる被覆が
密着し易いので、合成重合体の方が好ましい。好ましく
は、ファイバー１２は、評価分析する液体に比較的不溶
性で、非反応性の材料から成る毛細管１４内に収容する
。ファイバー１２は毛細管１４の中を通り、−数的に栓
１６により同軸状に支えてあり、末端表面１８を除いて
ファイバーの全体が管１４の中に位置している。

ファイバー１２の外側表面の部分に、例えば免疫型反応
の反応体、即ち抗体−抗原複合体の成分の一つから形成
できる、固定した、つまり予め結合した被［２０がある
。−数的に、被覆は、先ずファイバー表面または基材に
複数の結合場所を与え、次いで抗体−抗原複合体の望ま
しい成分の多くをこれらの結合場所に、好ましくは共有
結合により、公知の方法で結合させる。抗体−抗原複合
体の選択した成分を先ず固定する基材上の結合場所は、
複合体の補完部分のための成分の親和性およびアビジチ
ー（ａｖｉ＋Ｈｔｙｌ　を著しく損なわずに、必要な固
定性を与える様に選択する。ファイバー１２がガラスで
ある場合、好適な結合場所は、良く知られている様に、
ガラス表面にシリル化合物を反応させることによって得
られる。他の好適なシリル化合物の結合、および抗体ま
たは抗原のカルボキシル、アミノおよび他の反応性の基
を各種の無機材料と結合させる方法は、Ｉ！５ｅｔａｌ
ｌにより米国特許第３，６５２，７６１号に記載されて
いる。重合体との結合の方が容易である場合が多く、重
合体の表面に抗体および抗原を固定する方法を記載した
文献が多数ある。場合により、適切に選択した成分を有
する好適な試薬でセルの表面を単に濡らすことにより、
被覆２０を吸着により施すこともできる。

例えば、公知のサンドイッチ評価分析には。

ＡＴＲＴＲ上に固定する選択成分は、問題の評価分析物
に特異的に結合する配位子であろう。その様な配位子は
、好ましくは十分な量で与え、評価分析すべき評価分析
物分子または成分の数を優に上回る、多数の反応場所を
獲得し、反応場所がその後で飽和しない様にする。次い
で被覆したセルを、評価分析する評価分析物を含むこと
がある試料、および二つの標識を付けた配位子を含む試
薬の両方に接触させ、結合反応が確実に完了するのに十
分な時間、反応物を処理する１次いで、固定した評価分
析物に結合し、評価分析装置の他の部分に非特異的に結
合した、標識を付けた配位子から得た信号を測定する。

そこで第二の結合配位子（即ち評価分析物に特異的に結
合できない配位子）から測定した信号は、第一の結合配
位子から受けた信号のどれだけの量または比率が後者の
評価分析物への特異的な結合から発生しているのかを予
見する（計算図表、表または公式により）のに使用でき
る。

例として説明したＡＴＲにおいては、光源２４がセル１
０に光線２２を送るように設けられでいる。光線２４は
、白熱電球、発光ダイオード、日光１等から放射される
光で照明したコンデンサの様な、広帯域光源でよいが２
光源２４は、一対の狭い波長帯内で励起放射するための
二重光源を備えているのが好ましく、この目的のために
、適当な帯域フィルターを含むことができる。二つの帯
域の中央波長は、照明した時にｆｆ［配位子を励起して
蛍光を出させるために、標識配位子上の標識として使用
する発蛍光団の吸収特性により選択する。また、光源２
４は、対物レンズ２８を適当な緑を持った光線で口開し
、レンズ２８が光源の口径（ａｐｅｒｔｕｒｅｌを末端
表面Ｉ８に映し、好ましくはファイバーの口径数に相当
する角度よりも大きな角度で末端表面１８に光線が入射
しない様にするために、当業者なら理解できる様な、好
適な光線の形状を調整する手段を含む。

光線分割器３０の様な手段を光源２４とレンズ２８の間
に配置する。好ましい実施形態では、光線分割器３０は
、二つの励起波長帯域を反射し、表面１８から来るそれ
ぞれの蛍光放射を透過する様に形成する。

評価分析物を含む試料をファイバー１２と管１４との間
の内部空間３２に導入した場合、被覆２０中の固定配位
子がその評価分析物と特異的に結合する様に選択してあ
り、その試料中にその評価分析物がある程度含まれてい
れば、試料中の評価分析物は被Ｗ１２０中の固定配位子
と反応する。

ここで、サンドイッチ評価分析を行なうには、二つの異
なった標識を付けた、異なった配位子を内部空間２６に
導入するが、第一の標識を付けた配位子は遊離の評価分
析物および固定配位子に結合した評価分析物の両方に特
異的に結合する。第二の標識を４１けた配位子は、その
評価分析物に特異的に結合しないが、第一の標識を付け
た配位子の幾らかがする様に、ファイバー１２の表面に
非特異的に結合することが予想できる。光源２４から光
線を適当な角度でファイバー１２の表面１８に導入する
と、光線はファイバーを通して内部全反射により伝播し
、ファイバー表面に連続した凋落区域（図には示してい
ない）で凋落波を生じる。

凋落波は、その様な結合した配位子に入射する所で、二
つの異なった波長、即ち二つの異なったチャネルで標識
に蛍光を発生させ、その蛍光の大部分は、幾らかは臨界
角以上で、幾らかは臨界角未満でファイバー１２の中に
戻される。

臨界角以上でセル内に戻る光はファイバー１２を通して
伝播し、その幾らかが人力面１８から外に現れる。

表面１８から外客こ出る、二つの異なった波長を持つ蛍
光のそれぞれの振幅を、電子光学的検出手段３４により
測定し、結合配位子のそれぞれの在在量を示１°この目
的のために１手段３４は、それぞれの波長に感応する二
つの電子光学的検出器を含むことができる。あるいは、
光源２４および検出手段３４の代わりに、それぞれ励起
および対応する標識からの放射を検出するのに適した。

スイッチ操作できる励起および放射フィルターを有する
フルオリメーターを使用することもできる。

その様な標識から来る信号の振幅測定並びにＲ１および
Ｒ２の値に関する予め決定した他の情報を、適切にプロ
グラム化したデジタルコンピュータまたは適当に配線し
た回路の様な手段３６に供給し、達成された特異的結合
の程度を上記の様に求める。

特異的結合の存在下にオケる非特異的結合を測定するた
めの多重方式の有用性を、下記の詳細な実施例における
試験機構で示す、試験試薬は、公知の方法でフルオレセ
インで標識を付けたヤギの抗ウシＩｇＧ　　（ウシＩｇ
Ｇに特異的に結合すると予想される第一の配位子）、お
よび公知の方法でローダミンで標識をイ」けた　ヤギの
抗マウスＩｇＧ　　（第一の配位子として）から成る。

ポリスチレン被覆石英ファイバー製のＡ　Ｔ’　Ｒセル
の、少なくともその表面の反応区域に、ウシＩｇＧを塗
布したにれらの試薬はジャクソン免疫会社（Ｊａｃｋｓ
ｏｎＩｍｎ＋ｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔ
ｉｏｎｌから入手し、抗体は供給者側で相互反応性に対
して予めスクリーンしである。。

両抗体の非特異的結合の予備測定を行なうために、先ず
、多数の本質的に同一の、剥き出しの、ポリスチレン被
ｆｆｉした石英ファイバーに関して、これを先ずシグマ
　ケミカルから入手したリン酸塩緩衝食塩（ＰＢＳ）水
溶液（ｐＨ７，４）中で後者を処理した。処理の後、各
ファイバーをフルオレセインおよびＯ−ダミンの主波長
（５３０ｎｍおよび５８０　ｎｍｌにそれぞれ応答する
一対の検出チャネルを有するＡＴＲフルオリメーターの
フローセルの中に入れた６好ましい実施形態は、フルオ
レセインおよびローダミンを励起し、そこから放射され
る蛍光を検出するのに適した、スイッチ操作できる励起
および放射フィルター、即ちフルオレセイン用に４８０
／２０　（４８０ｎｍ中央波長、２０ｎｍ帯域）および
ローダミン用に５３０／３０の励起フィルター、フルオ
レセイン用に５３０７３０およびローダミン用ｊに５８
０／２０の蛍光フィルターを有するフルオリメーターを
使用する。

各ファイバーはＰＢＳｉの中で２分間洗浄した。流れを
止め、一定強度の励起光、ＩＩ（順に４８０ｎｍおよび
５３０　ｎｒａｌ　を７ｙイハ−（７）　一端カら導入
し、および−一一つけフルオレセイン検出チャネル、も
う一つはローダミン検出チャネルにｉｓけるバックグラ
ウンドを読み、−゛つのチャネルのそれぞれについてバ
ックグラウンドの読みｆｍＶｌを記録した。次に、ＰＢ
Ｓをフローセルから流し９等体積の、　７．５）Ａｇ＃
ＱＪの〔１−ダミン標識抗マウスＴｇＧ　８よび７．０
．ｕｇ／ｍＪのフルオレセイン標識抗ウシＩｇＧの溶液
の流れに置き換えた。流れを止め、ファイバーを室温で
２分間処理した６次いで、抗体溶液をＰＢＳの流れで４
分間洗い流した６同じ励起光線を再びファイバー中に導
入し、それぞれのバックグラウンドおよび非特異的結合
の合計を表わす読み（ｍＶｌを取り、４本のその様なフ
ァイバーのそれぞれについてフルオレセインおよびロー
ダミンに対するＡ、およびＡ、の値を得た。

データを下記の表にまとめて示すが、そこではＡｔｇよ
びＡ、は、それぞれ結合したフルオレセインおよびロー
ダミン標識を付けたＩｇＧから得た信号の振幅を＋ｎｖ
で表わしである４処理前および処理後は、それぞれ処理
前および処理および洗浄後に測定した信号を表わす。結
合応答は、単に処理前および処理後それぞれの信号の差
であり、結合率は結合応答の比率である。

第　　１　　表 ３９７３５５　８９５５　７６４　４９８　４０９　　
１．２１８平均結合率は１．２１５で、標準偏差００７
０およびＣ，Ｖ、が５．７９８％であることに注意する
。Ａ、に対する平均ＮＳＢ応答は５２１ｍｖ、標準偏差
は１７２　、５ｍｖｆＣ，Ｖ、　　３３％）であるが、
これは事実上、ゼロ評価分析物水準におけるノーイズの
尺度である。

熱論、上記の応答は抗原の無い表面でなされたものであ
る。しかし、どちらの抗体とも特異的に結合しないタン
パク質または他の閉塞剤で閉塞したファイバーで、類似
の一連の測定が可能であることは明らかである。その様
な閉塞物を使用すると、閉塞したファイバーと剥き出し
のファイバーのそれぞれに対する抗体の非特異的結合特
性に差があるために生じる、好ましく無い効果を少なく
するのに役立つ。

次に、同じ抗体の混合物を、前に使用した様な５本の同
一のファイバーと反応させた。ファイバーをＰＢＳ中で
処理するのではなく、０５μｇ７ｍｌのウシＩｇＧ中で
５分間処理して調製した以外は、上記と同じ手順を繰り
返した。この実施例の結果を第２表に示す。

第　　２　　表 ７２９　５０１　　　１６５０　１１８３　　　　９２
１　　６８２５６８　４３５　　　１５０８　９８７　
　　　９４０　５５２４７８　４５７　　　１３５５　
１０３０　　　　８７７　５７３４２０　３２２　　　
　７２２　５６９　　　　３０２　２４７５４２　　５
０２　　　　１５３０１１６１　　　　　９８８　　６
５９このデータから、フルオレセイン標識ＩｇＧによっ
て与えられる特異的応答は、全平均Ａ、結合応答から１
．２１５　（第１表から分かった。予め決定した結合比
率）を引き、平均Ａ、を乗じたものである、と言うこと
ができる、ここから、平均結合応答１４６．２ｍｖ、標
準偏差１．０２　ｍｖが得られる。

先行技術による従来のデータ解析方法では、第２表から
平均Ａｔ値を取り、そこから、第１表で平均Ａｔとして
示される非特異的結合にのみ帰せられる平均Ａｆ値を差
し引く。この方法に従うと、平均特異的結合応答は２８
４．６ｍｖで、標準偏差は２８４．３ｍｖになる。先行
技術の方法と本発明に係わる方法とを比較する都合の良
い方法は、使用する評価分析物水準における平均の信号
対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）を求めることである。

先行技術の方法によれば、Ｓ／Ｎは２８４．６／２８４
．３つまり１．００であるが、本発明の方法ではＳ／Ｎ
が１４６．２／１０２つまり１．４３となる。このこと
から１選択した評価分析物水準でＳ／〜が約１５改善さ
れ、ゼロ評価分析物水準では約２８のファクターでノイ
ズ水準が低下することになる。

ＮＳＢ測定に使用する、本発明の多重装置のちう一つの
実施例を以下に説明する。ウィルスは一種類以上の抗体
、例えばそのウィルスの外皮および核のそれぞれに特異
的な、二つの異なった抗体を形成できることが分かって
いる。詮断目的には、その様な特異的なウィルスの種類
に抗体を含むと疑われる試料、例えば血液の試料を評価
分析するのが望ましい場合がある。

その場合、そのウィルスの溶解質を、例えば吸着により
付着させた被覆として、光学ファイバの表面に固定する
ことができる１次いで、その被覆したファイバーを試料
と接触させ、核および外皮の溶解質部分を、その試料中
に存在する可能性があるそれぞれの対応する抗体と特異
的に結合させることによって、複合体を形成する。その
ウィルスの核および外皮のタンパク質にそれぞれ対応し
、公知の方法でフルオレセインおよびローダミンの様な
蛍光標識をそれぞれ付けた、第一および第二の合成また
は天然タンパク質を既知の比率で含む試薬を調製する。

この試薬を試料および被覆したファイバーと混合し、そ
の試薬中のタンパク質が、溶解質被覆に予め結合した抗
体に特異的に結合し、ファイバーのその他の場所に非特
異的に結合できる様にする。

二つのタンパク質の特異的結合比率を、その試料中に存
在し、被覆に結合した二種類の抗体の相対鑓により与え
られる結合場所の比率により決定する。その様な結合場
所の比率が予め分かっていれば、その結合場所の比率と
明らかに異なった比率のタンパク質で試薬を調製する。

ファイバーに結合した標識タンパク質を個別におよび本
質的に同時に本発明の装置で励起し、蛍光を発生させ、
標識タンパク質の特異的および非特異的結合の組み合わ
せにより造られた信号を得る。しかし、熱論、特異的に
結合したタンパク買上の標識から発生するそれぞれの信
号の比率は結合場所の比率に相当するが、非特異的に結
合した標識タンパク質から発生する信号の比率は、試薬
中に配合したそれぞれのタンパク質の既知の比率に・相
当する。結合場所または抗体の比率も分かつている場合
には、二つの比率は著しく異なっている（試薬を調製す
る者によって決定される）ので、それぞれの信号の振幅
をそれに応じて調整し、非特異的結合の影響を除くこと
ができる。

結合場所の比率、即ち抗体の比率が予め分かっていない
場合は、タンパク質が第一の比率、例えば単独で存在す
る他の試薬を使用して予備評価分析を行なうことができ
る。その評価分析の結果を使用して、タンパク質の比率
が１例えば第一の評価分析における信号測定の逆数とし
て決定されている第二の試薬で第二の評価分析を行なう
、第二の評価分析における信号測定から、非特異的結合
の影響を排除する計算を行なうことができる十分な情報
が得られる。

上記の方法および装置は、本発明の範囲から逸脱するこ
となく、ある一定の変形が可能であるので、上記の説明
に含まれる。または添付の図面に示されるすべての事項
は、説明のために記載されているのであって、限定する
ものではない。

【図面の簡単な説明】

図面は本発明による多重免疫評価分析方式に使用される
装置の一例を示す機略図である。 （図の主要な部分を表わす符号の説明）ｉｏ−−−一評
価分析セル。 １２−−−−ファイバー １４−−−一管、　　１６−−−−栓、１８−−−−フ
ァイバーの末端表面。 ２０−−−一被覆、　２２−−−一光線、２４−−−一
光源、　２８−−−一対物レンズ、３０−−−一光線分
割器、 ３２−−−一内部空間。 ３４−−−一光検出器、 ３６−−−−コンピユータ。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、試料中の問題とする評価分析物の評価分析方法にお
   いて、 互いに区別できる、それぞれ異なった種類 の標識に結合した少なくとも二つの異なった配位子を用
   意し、該配位子の内の少なくとも第一の配位子は該評価
   分析物に特異的に結合することができ、 該配位子および該試料を接触させて、少な くとも該第一配位子および該評価分析物が関与する複合
   体を含む物体を形成し、 該物体中の結合した配位子にのみ結合した 該標識のそれぞれを同時に、定量的且つ個別に測定し、
   および 該標識の測定を比較する 工程からなることを特徴とする方法。 ２、前記評価分析を行なうべき装置を用意し、互いに予
   め決定した比率の、異なった標識 を付けた二つの異なった配位子を用意し、前記配位子の
   それぞれが、問題とする前記の評価分析物に対して異な
   った特異的結合特性を有し、前記装置に対する前記配位
   子の非特異的結合解特性が互いに既知の相関関係にあ り、 前記装置内で前記配位子を前記試料に接触 させ、前記の特異的結合を達成し、前記複合体を形成し
   、および 前記測定、前記の既知の比率および前記の 既知の相関関係から、前記評価分析物に対する前記第一
   配位子の特異的結合を測定する 工程を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。 ３、前記接触工程の後に、前記評価分析物および前記装
   置に結合している配位子から、本質的にすべての前記評
   価分析物および配位子を分離する工程を含むことを特徴
   とする請求項２記載の方法。 ４、前記の異なった標識のそれぞれが、励起した時に、
   互いに区別できる信号を与えることができ、本質的に、
   結合した配位子から来る前記信号の振幅だけを測定する
   ことを特徴とする請求項３記載の方法。 ５、前記の異なった標識のそれぞれが、励起した時に、
   互いに区別できる波長で蛍光を放射することを特徴とす
   る請求項４記載の方法。 ６、前記配位子の第二の配位子が、前記試料中の前記評
   価分析物または他の成分と、特異的に結合しないことを
   特徴とする請求項２記載の方法。 ７、前記第一の配位子を、前記試料中の前記評価分析物
   と特異的に結合すると予想される量を超える量で用意す
   ることを特徴とする請求項６記載の方法。 ８、前記評価分析物が存在しない状態で、前記装置中の
   前記配位子を予備評価分析し、その予備評価分析中に非
   特異的に結合した前記標識配位子から発せられるそれぞ
   れの信号の振幅を定量的に測定し、 前記配位子の、前記第一配位子および第二 配位子から測定した信号の振幅の比率を求めることによ
   って前記相関関係を決定する工程を含むことを特徴とす
   る請求項４記載の方 法。 ９、前記の決定する工程を、前記の既知の比率および前
   記の既知の割合の関数により、前記配位子の第二の配位
   子から来る信号の値を修正して修正値を与え、前記第一
   配位子から来る信号の振幅を前記修正値と比較すること
   によって行なうことを特徴とする請求項４記載の方法。 １０、前記の決定する工程を、前記第一配位子から来る
   信号の振幅から、前記の既知の割合に前記の既知の比率
   と前記配位子の第二の配位子から来る信号の振幅とを乗
   じた積を差し引くことによって行なうことを特徴とする
   請求項４記載の方法。 １１、配位子の少なくとも第一の配位子は評価分析物と
   特異的に結合でき、定量的に測定できる標識が存在し、
   それぞれの標識を付けた少なくとも二つの異なる標識配
   位子、 少なくとも前記の第一配位子が前記の評価 分析物と特異的に結合した複合体を形成できる反応表面
   、および 前記表面に結合した前記標識のそれぞれを 同時に、定量的且つ別個に測定するための手段を組み合
   わせた、問題となる評価分析物の溶液を評価分析するた
   めの装置。 １２、前記第一配位子が前記反応表面上に固定してある
   ことを特徴とする請求項１１記載の装置。 １３、前記反応表面が細い全反射セルの表面であること
   を特徴とする請求項１１記載の装置。 １４、前記標識の両方を励起し、それぞれ異なった信号
   を発信させることができる波長で、前記セル中に放射を
   導入するための手段を含むことを特徴とする請求項１３
   記載の装置。 １５、前記の、同時に、定量的且つ別個に測定するため
   の手段が、前記のそれぞれ異なった信号の一つに対して
   それぞれ感応する一対の検出器から成ることを特徴とす
   る請求項１４記載の装置。 １６、前記の、同時に、定量的且つ別個に測定するため
   の手段が、前記標識の励起およびそこからの放射を検出
   するのにそれぞれ適した、スイッチ操作できる励起およ
   び放射フィル ターを有するフルオリメーターであることを特徴とする
   請求項１４記載の装置。