JPH01282447A - 散乱された全内部反射による免疫定量系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は一般的には免疫定量法（ｉｍｍｕｎｏａｓｓａ
ｙ）に関し、更に詳細にはコロイド状の金を用いる突際
的な均−免疫定量法を行う際の新規な系を提供すること
である。

多くの人の病気の状態は免疫定量技術をベースに定義さ
れ、この方法はモノクローナルまたはポリクローナルの
いずれにおいてもイムノグロブリン及びハプテン、抗原
または他のアナライト（ａｎａｌｙｔｅ）であり得るそ
のそれぞれの結合パートナ−（ｐａｒｔｎｅｒ）間の特
異性を基礎とし、そのすべてを以後本明細書において集
合的に、且つ交互に「リガンド（ｌｉｇａｎｄ）　Ｊ及
び「リガンド結合パートナ−（ｌｉｇａｎｄ　ｂｉｎｄ
ｉｎｇ　ｐａｒｔｎｅｒ）　Ｊとして称する。更にまた
、「リガンド」はキレータ−（ｃｈｅｌａｔｏｒ）　、
免疫結合剤、核酸ストランド（ｓｔｒａｎｄ）バイオリ
セプター及び疎水性結合剤を含めた「リガンド結合パー
トナ−」と結合するか、まＩ：は錯形成する際に親和性
（ａｆｆｉｎｉｔｙ）を有するいずれの分子も意味する
。過去１５年間程度にわたって、いわゆるサンドイッチ
（ｓａｎｄｗｉｃｈ）及び競争技術を用いる免疫定量技
術の発展に包含される実質的な量の努力があった。サン
ドインチ技術は１つの抗体による抗原の固定化及び続い
て検出し得る標識と結合した第二の抗体の結合による標
識化を含む。抗体の検出に対する逆免疫定量法は試料抗
体との反応に対して抗原を表面上に置く以外は同様であ
る。競争技術は抗体との反応に対する単一のエピトープ
性（ｅｐｉｔｏｐｉｃ）部位のみを有する抗原に対して
有用である。従って、そして名称が示すように、かかる
技術は固定化された抗体上の結合部位に対する抗原と他
の標識化された抗原との競争を基礎とする。抗体検出試
験に必要な代用物は明らかであり、そしてここに多大に
詳細に説明する必要はない。

実験室において大変重要なことはバッチ・ランダム令ア
クセス（ｂａｔｃｈ　ｒａｎｄｏｍ　ａｃｃｅｓｓ）　
、パネルまたはスタット（ｓｔａｔ）モードのいずれか
において行い得る高度に敏感な技術の発達である。好ま
しくは、かかる技術は元来均一系であり、即ち、そして
本明細書に用いられるように、これらのものは測定中で
の統いての反応で成分を物理的に分別する必要を併用せ
ずに１つの容器内で単独に行われる。

高度に敏感であり、そして元来均一系である新規な免疫
定量系を提供することが本発明の１つの目的である。

クロニック（ｋｒｏｎｉｃｋ）による米国特許第３，９
３９．３５０号及びそこで引用されるクロニックの文献
に液体試料中でのケイ光による生化学的アナライトのみ
定を行い得る免疫定量系が記載されている。クロニック
は全内部反射なる名称で公知である物理現象を用いてい
る。この光学的現象は光が高い屈折率の物質を通してこ
の物質とより低い屈折率を有する第二の物質との界面に
臨界角より大きい角度で当てる場合に、第二の物質中を
短かい距離のみ伝搬する顕微鏡的なエバネッセント（ｅ
ｖａｎｅｓｃｅｎｔ）波を除いてすべての光がこの界面
から反射されることである。第二の物質は例えばその中
で測定を行う水または他の水性媒質であり得る。クロニ
ックによれば、ケイ光標識した物質を界面下及びエバネ
ツセント波場内に置いた場合、ケイ光分子を励起し、そ
して次に周囲の溶液中に放出されるケイ光を検出するこ
とができた。しかしながら、クロニックの系はこの系を
研究対照に適するようにケイ光標識物を代えることによ
り容易に改良し得ないケイ光下で観察するものである。

励起周波数の波長に関するケイ光標識の特異的な性質の
ために、臨界励起周波数を与える個々の光源に限定され
る。現在、多くの研究者はその信頼性及び低価格並びに
付属の光学系の低価格のためにＨｅ−Ｎｅレーザー光源
を好んでいる。しかしながら、かかる光源はケイ光分子
をＨｅ−Ｎｅレーザー出力により励起されるように調製
する際に付随する困難を有する。必要とされる有機、無
機及び生物有機技術は免疫定量分野において制御する際
に殊に困難である。更に、ケイ光に対するクロニックの
方法の信頼性にはケイ光分子の退色及び良好な量子効率
を得るために必要とされるケイ光分子励起波長とレーザ
ー出力波長との一般的に臨界的マツチング（ｍａｔｃｈ
ｉｎｇ）に付随される追加の欠点がある。

ケイ光標識に付随する欠点及び励起源をマツチングさせ
る際に付随する臨界性を回避する新規な免疫定量系を提
供することが本発明の目的である。

全内部反射の原理を用いるが、照射源の選択に関して十
分大きい柔軟性を有する方法を用いることが本発明の他
の目的である。

ノラー（Ｎｏｌｌｅｒ）による米国特許第４．１８１゜
４４１号にクロニックのものと同様の系が記載されてい
る。しかしながら、ノラーは定量法は液体試料中の光吸
収の測定により行うべきであり、次に生化学的アナライ
トの存在に相関させ得たことを教示した。ノラーの系は
クロニックの系と異なる物理的原理を用いるが、光吸収
測定は同様に大きい信号における小さい差違のために乏
しい信号対ノイズ比であり、これによりがかる系は所望
のものより固有的により低感度のものとなる。

全内部反射現象により与えられる利点は保持する一方、
光吸収測定を使用することを避けることが本発明の他の
目的である。

またルンドストロム（Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ）による米国
特許第４，５２１，５２２号は反射及びブリュースター
（Ｂｒｅｗｓｔｅｒ　’ｓ）角の使用をベースとする他
の免疫定量法を教示している。この系は入射の血中で偏
光された光線を例えばプラスチック及び液体間で生じる
界面上に向けることにより、かかる光がブリュースター
角で界面に当たる場合に強い光線の液体中への透過が生
じる異なった光学現象を基礎としている。ブリュースタ
ー角で、実ｉ　的ｔ：光は反射しない。

ブリュースター角は２つの物質の屈折率並びに偏光の方
向の関数である。ルンドストロムは界面での生化学層の
生長の際に、ブリュースター角条件は分裂され、殊にブ
リュースター角より小さい角度で増加した光反射を生じ
させることを記述した。不運なことに、ルンドストロム
は洗浄工程に関してのみ効率的に測定し、その理由は流
体中への光線の透過は光散乱及びかくて偽信号も生じさ
せるからである。

光散乱を利用するが、通常光がブリュースター角で界面
に当たる場合に生じる液体中への光の透過により発生す
る光散乱を避けることが本発明の他の目的である。従っ
てまた、ブリュースター角条件を用いることを避けるこ
とが本発明の他の目的である。

本発明の種々の特徴及び原理によれば、水溶液中で測定
される特殊な配位子の存在の尺度として散乱された全内
部反射（ＳＴＩＲ）を利用する免疫定量系が提供される
。本発明は部分的に全内部反射に付随する臨界角の定義
に基礎を置く。角度は大部分入射光波が当たる物質例え
ばプラスチックの屈折率及び免疫定量が行われる物質例
えば水溶液の比較的低い屈折率の関数である。このもの
は２つの物質量の界面に垂直な線から測定され、か（て
その最大値９０°で界面の面にある。

プラスチックを通して水性試料及びプラスチック材料に
より生じる界面に臨界角で当たる光はプラスチック内で
光の全内部反射を生じさせる。実際の世界において完全
な材料は認められておらず、従って全内部反射の基本的
条件を満足させることを保証するために入射光を臨界角
より数度、最も好ましくは約６″の範囲より大きい角度
で界面に当てることが好ましい。かかる角度で、プラス
チックの表面及び表面から１／４λに平行なエバネツセ
ント波の伝搬を除いて好ましくはレーザーからの入射平
行光はプラスチック内で全体的に内部反射する。同様に
、最適な信号性能に対して界面での滑らかな表面が好ま
しい。クロニックのものを含む通常のケイ光技術とは異
なって、本発明の測定系は粒径を許容し得る光散乱を与
えるように入手できる光源（またはその逆）に合わせる
ように容易に調整し得るために光の波長に関して柔軟で
ある。ケイ光分子は励起波長に関して容易に調整するこ
とはできない。

最も理想的には、光源はＨｅ−Ｎｅ光源であるが、異な
った波長出力を有する他のレーザーも使用され、そして
また光放射ダイオード及び他の非レーザー光源を含む他
の光源が示唆される。

更に本出願者の免疫定量系は通常の免疫定量技術を基礎
とする。しかしながらまた、本出願者の免疫定量系は溶
液より高く、最も好ましくはまた第一の光透過性材料、
例えば上の例におけるプラスチックより高い屈折率を有
する粒状の標識を用いる。かかる粒子には例えば赤面細
胞、高い屈折表面を有する他の物質例えば金属粒子、及
び非金属物質例えばガラスまたはプラスチック例えばラ
テックス粒子などが含まれる。最も好ましくは、免疫的
に活性な成分である溶液相に対する標識としてコロイド
状の金を用いる。例えばロイバーリング（Ｌｅｕｖｅｒ
　ｉｎｇ）による米国特許第４，３１３゜７３４号を参
照して標識としてコロイド状金の使用は公知であるが、
現在まで殊に均一タイプ系におけるその検出に付随する
困難のために標識の非凝集関連の使用が殆んど行われて
いなかった。ＩＩくべきことに５ＴＩＲとコロイド状金
の独特の組合せにより極めて効率的で、且つ敏感な均−
測定系が生じることが本発明者により見い出された。

このことは主にコロイド状金粒子とエバネッセント波と
の相互作用によると考えられるが、公知ではない。事実
、経験により下に敷かれた固体より増大した屈折率を有
する粒子が一般に光を増々散乱させることが示される。

下に敷かれた固体より小さい屈折率を有する粒子は、こ
れらのものがまた水性媒質に等しくない場合に光を散乱
させるが、かかることはより好ましくはない。

通常のサンドインチ技術に対して、ある免疫グロブリン
またはリガンド結合パートナ−を表面上に固定化し、そ
して測定される抗原または他のリガンドを結合する。そ
の後、（または同時に、もしくは前もってではない場合
）リガンド上の第二のエピトープ性部位で結合し、そし
て直接または間接にコロイド状金で標識された第二の免
疫グロブリンをリガンドに結合していわゆる［サンドイ
ッチ」を生成させる。この配置において、コロイド状金
が存在することにより光増倍器または他の光センサーに
より検出して応答信号を与え得る散乱光を生じさせるエ
バネツセント波の伝搬が分裂される。本発明の他の重要
な特徴は検出器の物理的位置を含む。検出器は理想的に
は臨界角より大きい角度で、そして光源に対して後方に
散乱された光のみが検出される位置に置く。これにより
この位置は理想的にはバルクの液体媒質内の偽散乱光の
検出を避ける。

本発明の他の特徴は免疫定量法が拡散速度制御され、そ
して殊に温度依存性ではないことである。

このことは温度制御が臨界的であるＥＬＩＳＡ及び種々
の他の免疫定量技術に強力に対比されるものであり、そ
の理由はかかる系における温度の少々の変化が時間の単
位当りの定量結果に広い変化を生じさせるからである。

驚くべきことに、本発明によりこれらの要素の組合せの
結果として従来コロイド状金定量技術に付随した複雑な
装置を必要とせずに均一な環境において迅速で、鋭敏な
結果を得られることが見い出された。

第１図は屈折率ｎ２を有し、ｎ２より小さい屈折率ｎ１
を有する流体５４と接触する流体接触面５２を有する光
学的に透明な員５３を表わす。流体接触表面５１の面に
垂直な線５０から測定される全内部反射臨界角５７は表
面５２で全内部反射を与えるに必要とされる照射の最小
角度である。この角度は次式により定義される： 臨界角θＣは高い屈折率の媒質においてのみ定義され、
モして０〜９０″′の範囲であり得る。全内部反射臨界
角５５で流体触媒表面５８上の点から伝搬する光は５７
として表わされる径路に従う。

試料流体接触表面５１の面及び流体接触表面の全内部反
射臨界角５７間の流体接触表面５８上の点から光学的に
透明な員５３を通って伝搬するすべての光は５６として
表わされる範囲で伝搬する。

第２図は照射し、そして読み取るために用いられるクベ
ット（ｃｌｖｅｔｔｅ）及び回転光学機構の簡略された
立面図である。

第３図はクベットの断面図である。

第４図はクベット及び受光器の最初の成分であるバラポ
ロイド状（ｐａｒａｂｏｌｏｉｄａｌ）反射器の透視図
である。

第５図は臨界角以上のレーザー照射を備えた装置を表わ
す。

第６図は照射が臨界角以上である場合に使用される照射
及び検出光を表わす。

第７図は第５図の装置で得られたデータを示す。

第８図は臨界角以上での光放射ダイオード照射を有する
装置を表わす。

第９図は第８図の装置で得られたデータを示す。

本発明は試料中の興味あるアナライトの存在を検出する
ための装置を提供する。この装置は光源：試料接触表面
を有する光学的に透明な員を受けるためのハウジング装
置において、該ハウジング装置中の数置が試料接触表面
が該光源から放射される光で照射されるように配置され
るハウジング装置；並びに光源から幾何学的光路中に伝
搬する光の検出を除外する光検出装置において、該光検
出装置が試料接触表面の面及び試料接触表面の全内部反
射臨界角間で、照射された試料接触表面から光学的に透
明な員を通って伝搬する弾性散乱光を検出し得る光検出
装置からなる。本明細書において、「光検出装置」は照
射光の波長に等しい波長を有する光子を検出する系とし
て定義され、そして光子検出器（例えば光増倍管）、レ
ンズ、ミラー、光フイルタ−、光学ファイバー、プリズ
ム、アパーチャー及びマスクの組合せを含む。幾何学的
光路は光線の群が第−次反射及び理想化された表面（欠
陥のない）の屈折をベースとし、そして表面及びバルク
の物質の欠陥、回折、干渉、散乱及び表面での部分的反
射の効果を無視できる径路である。更に、本明細書にお
いて、「弾性散乱」　（またここに「散乱」及び「散乱
光」としても表わされる）は対象物及びその周囲媒質の
屈折率の差により、ドツプラーシフティング（ｄｏｐｌ
ｅｒｓｈｉｆｔｉｎｇ）以外により光の波長が変化せず
に対象物により変向された入射光を意味する。また非弾
性散乱としても知られるケイ光は分子が光の光子を吸収
した後に光吸収分子により放出される光である。吸収さ
れた光の波長は放射される光の波長より短かい。ケイ光
は常に光吸収分子に対する入射光と異なった波長のもの
である。

本明細書で「全内部反射臨界角」としても表わされる「
臨界角」は異なった屈折率の物質量の界面に垂直な線か
ら測定され、その値を超えると全内部反射が生じ得る角
度（９０°より小）であり、そして式 により表わされ、ここに０１は界面を形成する２つの媒
質のより小さい屈折率であり、モしてｎ２はより大きい
屈折率である。臨界角は高い屈折率の媒質中でのみ存在
し得る。低い屈折率の物質からいずれかの角度（０〜９
０″）で界面を照射する光は臨界角より大きいか、また
は等しい角度で高い屈折率の媒質中へ屈折できない。全
内部反射はもっばら異なった屈折率の物質の界面を臨界
角を超えて高い屈折率の媒質から照射する場合に起こり
、その際に回折、散乱または吸収により乱されない場合
はすべての入射光は界面で反射される。

また本発明は試料中の興味あるアナライトの存在を検出
する他の装置も提供する。本発明は光源；試料接触表面
を有する光学的に透明な員を受けるためのハウジング装
置において、該ハウジング装置中の数置が試料接触表面
が光学的に透明な員を通して試料接触表面の面及び全内
部反射に対する臨界角間の角度で伝搬する、該光源から
放射される光で照射されるように配置されるハウジング
装置；並びに光源から幾何学的光路中に伝搬する光の検
出を除外する光検出装置において、該光検出装置が試料
接触表面の面及び全内部反射臨界角間で、照射された試
料接触表面から光学的に透明な員を通って伝搬する弾性
散乱光を検出し得る光検出装置からなる。

本発明の装置に適する光源は平行か、もしくは非平行光
線光、偏光もしくは非偏光された光または単色もしくは
多色光を与える。好適な光源はレーザー（例えばＨｅ−
Ｎｅレーザー）、発光ダイオード（ＬＥＤｓ）　、７ラ
ツシユランプ、アークランプ、白熱ランプ及びケイ光放
出ランプを含む。

適当な光学的に透明な員例えばクベットはガラス、石英
、ケイ素、プラスチック例えばポリカーボネート、アク
リルもしくはポリスチレンまたはシリコーンもしくは高
分子量炭化水素からなる油からなる。

適当な光検出装置は光子検出器例えば光増倍管、ホトダ
イオード（例えばＰＩＮダイオード及びガリウムーアル
ミニウムーヒ素ダイオード）、硫化カドミウム光抵抗電
池、フォトチューブ及び熱分解検出器からなる。

また光学的に透明な材料の表面上の光散乱性分子の存在
を検出する方法が提供される。この方法は該光散乱性分
子を照射し、光学的に透明な該材料を通して、その上に
光散乱性分子が置かれている光学的に透明な材料の表面
の面及びその上に光散乱性分子が置かれている表面の全
内部反射臨界角間で伝搬する該光散乱性分子により弾性
的に散乱された光を検出し、そして検出された、弾性散
乱された光を光学的に透明な材料の表面上の光散乱性分
子の存在に相関させることからなる。本出願において、
「エバネツセント波」は照射光が全内部反射を起こす場
合に生成される。非伝搬性光波例えば照射の反対側の表
面側上の表面の範囲における波を意味する。また本出願
において、「光散乱性分子」は入射光を弾性散乱させる
分子を意味する。「分子」は結晶及び元素状物質の場合
に２個またはそれ以上の原子を含む。

また更に、本発明は光学的に透明な材料上の光散乱性分
子の存在の検出方法を提供する。この方法は該光散乱性
分子を光学的に透明な該材料を通して伝搬する光波から
生じるエバネツセント波で照射し、光学的に透明な該材
料を通して、その上に光散乱性分子が置かれている光学
的に透明な材料の表面の面及びその上に光散乱性分子が
置かれている表面の全内部反射臨界角間で伝搬する該光
散乱性分子により弾性的に散乱された光を検出し、そし
て検出された、弾性散乱された光を光学的に透明な材料
の表面上の光散乱性分子の存在に相関させることからな
る。

更に流体試料中のアナライトを検出する際に該アナライ
トがリガンド−リガンド結合性パートナー対であるアナ
ライトの検出方法を提供する。この方法は ａ）　該流体試料の屈折率より大きい屈折率を有する光
学的に透明な材料を与え、その際に光学的に透明な該材
料が該リガンド−リガンド結合パートナー対の複数のリ
ガンド結合パートナ−が固定化される試料接触表面を有
し： ｂ）　更に固定化された該リガンド結合パートナ−と複
合体を形成し得る光散乱性の粒子標識リガンドを与え； Ｃ）　該流体試料及び該光散乱性粒子標識リガンドを該
アナライト及び該光散乱性粒子標識リガンドが各々固定
化された該リガンド結合パートナ−と複合体を形成する
ような条件下で該試料接触表面と接触させ； ｄ）　該複合体を光学的に透明な該材料を通って伝搬す
る光波から生じるエバネツセント波で照射し； ｅ）　弾性散乱された光を該複合体の該光散乱性粒子に
より検出し； ｆ）　弾性散乱された光を該試料接触表面上での複合体
の存在に相関させ；そして ｇ）　試料接触表面上の複合体の存在を標準対照に対す
る試料接触表面上の複合体の存在と比較し、これにより
流体試料中のアナライトを検出する工程からなる。

本出願において、「粒子」は１個またはそれ以上の分子
を意味する。「標識化された」なる用語は直接結合例え
ば共役、交叉結合もしくは吸着されるか、または間接結
合例えば抗体を介して結合することを意味する。

更にまた、アナライトがリガンド−リガンド結合性パー
トナー対のリガンドである流体試料中の該アナライトの
検出方法を提供する。この方法はａ）　該流体試料の屈
折率より大きい屈折率を有する光学的に透明な材料を与
え、その際に光学的に透明な該材料が該リガンド−リガ
ンド結合パートナー対の複数のリガンド結合パートナ−
が固定化される試料接触表面を有し： ｂ）　更に固定化された該リガンド結合パートナ−と複
合体を形成し得る光散乱性のリガンドを与え： Ｃ）　該流体試料及び該光散乱性リガンドを該アナライ
ト及び該光散乱性リガンドが各々固定化された該リガン
ド結合パートナ−と複合体を形成するような条件下で該
試料接触表面と接触させ：ｄ）　該複合体を照射し； ｅ）　該複合体の光散乱性リガンドにより弾性散乱され
、そして光学的に透明な該材料を通して、試料接触表面
の面及び試料接触表面の全内部反射臨界角間で試料接触
表面から伝搬する光を検出し； ｆ）　弾性散乱された光を該試料接触表面上での複合体
の存在に相関させ：そして ｇ）　試料接触表面上の複合体の存在を標準対照に対す
る試料接触表面上の複合体の存在と比較し、これにより
流体試料中のアナライトを検出する工程からなる。

本出願において、「光散乱性リガンド」は入射光を弾性
散乱させるリガンドまたは光散乱性粒子標識リガンドを
意味する。

更にまた、アナライトがリガンド−リガンド結合パート
ナー対である流体試料中の該アナライトの検出方法を提
供する。この方法は ａ）　該流体試料の屈折率より大きい屈折率を有する光
学的に透明な材料を与え、その際に光学的に透明な該材
料が該リガンド−リガンド結合パートナー対の複数のリ
ガンド結合パートナ−が固定化される試料接触表面を有
し； ｂ）　更に固定化された該リガンド結合パートナ−と複
合体を形成し得る光散乱性のリガンドを与え： Ｃ）　該流体試料及び該光散乱性リガンドを該アナライ
ト及び該光散乱性リガンドが各々固定化された該リガン
ド結合パートナ−と複合体を形成するような条件下で該
試料接触表面と接触させ；ｄ）　該複合体を光学的に透
明な該材料を通って伝搬する光波から生じるエバネツセ
ント波で照射し： ｅ）　該複合体の該光散乱性リガンドにより弾性散乱さ
れ、そして光学的に透明な該材料を通して、試料接触表
面の面及び試料接触表面の全内部反射臨界角間で試料接
触表面から伝搬する光を検出し； ｆ）　弾性散乱された光を該試料接触表面上での複合体
の存在に相関させ：そして ｇ）　試料接触表面上の複合体の存在を標準対照に対す
る試料接触表面上の複合体の存在と比較し、これにより
流体試料中のアナライトを検出する工程からなる。

本発明の具体例において、本明細書に提供される方法は
試料触媒表面をリガンドと接触させる前に流体試料と接
触させることにより行い得る。本発明の他の具体例にお
いて、試料接触表面を流体試料を接触させる前にリガン
ドと接触させる。更にまた本発明の具体例において、試
料接触表面を該流体試料及びリガンドと同時に接触させ
る。まｔ；本発明の他の具体例において、試料をリガン
ドと混合して混合物を生成させ、そして混合物を試料接
触表面と接触させる。

更に、本発明の好適な具体例において、光散乱性粒子標
識リガンドはコロイド状の金粒子で標識されたリガンド
からなる。

また本発明の他の具体例において、流体試料中のアナラ
イトの検出方法を提供する。この方法においてアナライ
トは第一のリガンド結合パートナ−が特異的であるエピ
トープ及び第二のリガンド結合パートナ−が特異的であ
るエピトープを有するリガンドである。この方法は ａ）　該流体の屈折率より大きい屈折率を有する光学的
に透明な材料を与え、その際に光学的に透明な該材料が
複数の第一のリガンド結合パートナ−を固定する試料接
触表面を有し； ｂ）　更に第二の光散乱性粒子標識リガンド結合パート
ナ−を与え； Ｃ）　該流体試料及び第二の該光散乱性粒子標識リガン
ド結合パートナ−を固定化された第一のリガンド結合パ
ートナー：アナライト：第二の光散乱性粒子標識リガン
ド結合パートナ−複合体を生成させる条件下で該試料接
触表面と接触させ；ｄ）　該複合体を光学的に透明な該
材料を通して伝搬する光波から生じるエバネッセント波
で照射し； ｅ）　弾性散乱された光を該複合体を該光散乱性粒子に
より検出し； ｆ）　弾性散乱された光を該試料接触表面上での複合体
の存在に相関させ；そして ｇ）　試料接触表面上の複合体の存在を標準対照に対す
る試料接触表面上の複合体の存在と比較し、これにより
流体試料中のアナライトを検出する工程からなる。

またアナライトが第一のリガンド結合パートナ−が特異
的であるエピトープ及び第二のリガンド結合パートナ−
が特異的であるエピトープを有するリガンドである流体
試料中の該アナライトの検出方法を提供する。この方法
は ａ）　該流体の屈折率より大きい屈折率を有する光学的
に透明な材料を与え、その際に光学的に透明な該材料が
複数の第一のリガンド結合パートナ−を固定する試料接
触表面を有し； ｂ）　更に第二の光散乱性リガンド結合パートナ−を与
え； Ｃ）　該流体試料及び第二の該光散乱性リガンド結合パ
ートナ−を固定化された第一のリガンド結合パートナー
：アナライト：第二の光散乱性リガンド結合パートナ−
複合体を生成させる条件下で該試料接触表面と接触させ
； ｄ）　該複合体を照射し； ｅ）　該複合体の第二の該光散乱性リガンド結合パート
ナ−により弾性散乱され、そして光学的に透明な該材料
を通して、試料接触表面の面及び試料接触表面の全内部
反射臨界角間で試料接触表面から伝搬する光を検出し； ｆ）　弾性散乱された光を該試料接触表面上での複合体
の存在に相関させ；そして ｇ）　試料接触表面上の複合体の存在を標準対照に対す
る試料接触表面上の複合体の存在と比較し、これにより
流体試料中のアナライトを検出する工程からなる。

本出願において、「第二の光散乱性リガンド結合パート
ナ−」は入射光を弾性散乱させる第二のリガンド結合パ
ートナ−または第二の粒子標識リガンド結合パートナ−
を意味する。

また更にアナライトが第一のリガンド結合パートナ−が
特異的であるエピトープ及び第二のリガンド結合パート
ナ−が特異的であるエピトープを有するリガンドである
流体試料中の該アナライトの検出方法を提供する。この
方法は ａ）　該流体の屈折率より大きい屈折率を有する光学的
に透明な材料を与え、その際に光学的に透明な該材料が
複数の第一のリガンド結合パートナ−を固定する試料接
触表面を有し； ｂ）　更に第二の光散乱性リガンド結合パートナーを与
え； Ｃ）　該流体試料及び第二の該光散乱性リガンド結合パ
ートナ−を固定化された第一のリガンド結合パートナー
：アナライト：第二の光散乱性リガンド結合パートナ−
複合体を生成させる条件下で該試料接触表面と接触させ
： ｄ）　該複合体を光学的に透明な該材料を通して伝搬す
る光波から生じるエバネツセント波で照射し； ｅ）　該複合体の第二の該光散乱性リガンド結合パート
ナ−により弾性散乱され、そして光学的に透明な該試料
を通して、試料接触表面の面及び試料接触表面の全内部
反射臨界角間で試料接触表面から伝搬する光を検出し； ｆ）　弾性散乱された光を該試料接触表面上での複合体
の存在に相関させ：そして ｇ）　試料接触表面上の複合体の存在を標準対照に対す
る試料接触表面上の複合体の存在と比較し、これにより
流体試料中のアナライトを検出する工程からなる。

本発明のある具体例において、試料接触表面を第二の光
散乱性粒子標識リガンド結合パートナ−または第二の光
散乱性リガンド結合パートナ−と接触させる前に流体試
料と接触させる方法を提供し得る。本発明の他の具体例
において、試料接触表面を該流体試料と接触させる前に
第二の光散乱性粒子標識リガンド結合パートナ−または
第二の光散乱性リガンド結合パートナ−と接触させる本
明細書に記載される方法を行い得る。また更に、試料接
触表面を流体試料及び第二の光散乱性粒子標識リガンド
結合パートナ−または第二の光散乱性リガンド結合パー
トナ−と同時に接触させることができ、例えば流体試料
を第二の光散乱性粒子標識リガンド結合パートナ−まｌ
；は第二の光散乱性リガンド結合パートナ−と混合して
混合物を生成させ、そして混合物を試料接触表面と接触
させ得る。

最後に、本発明の好適な具体例において、第二の光散乱
性粒子標識リガンド結合パートナ−はコロイド状の金粒
子で標識されｌ；第二のリガンド結合パートナ−からな
る。

第一群の実験 ５ＴＩＲの原理を具体化する装置はＭｅｌｌｅｓ−Ｇｒ
ｉｏから得られる等辺のフリントガラス製プリズムモデ
ルＯ１−ＰＥＳ−００７を用いて組立てた。プリズムは
一面を水平に保持して支持体上に設置した。＋！、１Ｍ
ＵＮＯＬＯＮ　Ｔ★０（スチレン）なる商標下でＤｙｎ
ａｔｅｃｈから入手し得る微量滴定ウェル（ｗｅｌｌ）
の状態の抗体被覆されたクベットを標準の顕微鏡油で水
平のプリズムに光学的に結合した。

臨界角を６°超えてクベットの底面の一部を照射するた
めに５ミリワツトのヘリウム・ネオンレーザ−（Ｈｕｇ
ｈｅｓ　３２２５　　Ｈ−ＰＣ）を用いた。

場合によっては、レーザー光ビームの焦点を合わせるた
めに円筒状レンズを用いた。

最初にスキャニング・エレクトロン・マイクロスコピー
（Ｓｃａｎｎｉｎｇ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｓ
ｃｏｐｙ）第■巻、９−３１（１９８１）、シアー社（
Ｓｅａｒ　Ｉｎｃ、）、ＡＭＦ、オヘア（０’　Ｈａｒ
ｅ）　、シカゴに報告される方法に従って生成され、約
３０〜５０ｎｍの粒径を生じさせるコロイド状金ゾル及
び血清の混合物からなる散乱性水性媒質でプリズム上に
光学的に設置された未被覆のクベットを満たすことによ
り臨界角を測定した。内部反射現象は臨界角で起こるこ
とが知られており、クベット内部で見えるレーザービー
ム路が光学的に消失して入射光がクベットー液体界面で
反射することが示されるまでプリズムを入射光の軸に対
して横方向の軸にそって回転させた。光学的に設置され
たクベットを有する表面を通しての垂直線及びレーザー
ビーム間の臨界角を測定し、プリズムを再設置して水平
表面を与え、そしてレーザーを６６十臨界角に等しい再
度でプリズムを通して内部的に表面を照射するように調
整した。偏光されたレーザーをスチレン液体界面の面に
平行な電場で調節されたその偏光で用いたが、かかるも
のは単に好ましくはあるが必要なことではない。同様に
、プリズムが便利であるが、照射を水性固体界面に向け
るｔ；めのいずれかの光学的カプリング装置を全内部反
射がこの界面で達成し得るように用いることができる。

光検出器（浜松ｋＧ１７４２　　フォトダイオード）を
レーザーに対して後に散乱される光を検出するようにレ
ーザーに物理的に近い位置で臨界角以上であるが９０″
より小さい角度で設置した。

この位置において、界面で存在する不完全性にもかかわ
らず定量前に最少のレーザー光が検出される。

かくて、光が溶液を通して伝搬することを保証するため
には光検出器を臨界角以上に設置することが重要であり
、例えば無関係の光源により誘導される迷光または二次
的光散乱は検出器に到達できない。関連した利点として
、このことが試料の色調まｌ；は濁度及び液体界面で存
在する泡の効果を減少させる。

光検出器からの電気信号を高ゲイン電流増幅器［キース
リー・エレクトロメータ（Ｋｉｓｔｈｌｙ　Ｅｌｅｃｔ
ｒｏｍｅｔｅｒ）　６１０　　Ｃ］に電気的に接続し、
そして出力をストリップ・チャート記録計に記録するか
、またはコンピータ・データ収得システム（ＨＰ９８３
６コンピユータ付きＨＰコントローラー）によりデジタ
ル記録した。次に反応速度を記録計チャート上で図的に
測定するか、またはコンピュータを用いて常法で計算し
ｔ；。

実施例１−ｈＣＧサンドインチ定量 抗ｈＣＧ抗体被覆されたクベット（標準的な物理吸着に
より被覆）をクベットの中心から内部反射するレーザー
付きの油被覆されたプリズム上に設置した。定量緩衝液
（１％牛血清アルブミン、ｌ　Ｍ　ＮａＣ１及び１．５
ｍｇ／＋＋＋４２マウスＩｇＧを含む７．４のｐＨ値で
０．０１Ｍリン酸塩で緩衝された食塩水）をクベットに
加えた。次にコロイド状金（粒径的４４ｎｍ）と結合し
た非ブロッキングの抗ｈＣＧ抗体５０戒を加え、そして
ピペット吸引により混合した。次に血清試料血清ベース
の標準（Ｇｉｌｆｏｒｄ）　２５Ａ１１をクベットに加
え、そして混合した。散乱信号の強さをストリップ・チ
ャート記録計及びデジタル・データ収得システムにより
記録した。反応速度を系が線形になるように最初の５分
間で平衡にし、次に次の５分間動力学的に測定した。ｈ
ＣＧ濃度を計算するために未知血清試料の反応速度（例
えば信号スロープ）を標準の反応速度と比較した。結果
は次のとおりであった： 標準　　　　　信号スロープ（任意単位）ＯｍｒＵ　　
　　　　　　　１．００ １０　ｍｌＵ　　　　　　　　　７．４３２５　ｍｌＵ
　　　　　　　　１６．３３５Ｑ　ｍｌＵ　　　　　　
　　３２．０３１００　ｍｌＵ　　　　　　　　６８．
６７２００　ｍｌＵ　　　　　　　　１３０．９７実施
例２−抗体に対する試験（逆ｈＣＧサンドインチ定量） ｈｃｃ抗原をイムノロン（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｎ）クベッ
ト上に被覆し、そして実施例１におけるように油被覆さ
れたプリズム上に設置した。ｈＣＧで被覆したコロイド
状金（約４５ｎｍ）５０μｍを実施例１にお載の定量緩
衝液と一緒にクベットに加え、そして混合した。標準を
含むマウスモノクローナル抗ｈ　ＣＧ　（ｐＨ８，３Ｈ
ＥＰＥＳ／ＴＲｌ５０．２２５　Ｍ十０．５％ＢＳＡに
希釈）２５戴を加え、そして混合した。平衡化のための
５分間の遅れの後、実施例１と同様に速度を測定した。

抗−ｈＣＧ濃度がｌ−当りＩＯ肉までに増加するため、
光散乱の増加割合は予期された７ツク（ｈｏｏｋ）効果
を与えるこの濃度以上で減少する割合に伴って観察され
た（例えば存在する抗体のすべてを適応させるには不十
分な標識化及び固定化抗原）。データは次のとおりであ
った： Ｑ　ｎｇ　　　　　　　　　８−０２ １０　ｎｇ　　　　　　　　１０．２７１００　ｎｇ　
　　　　　　　１２．３５１μｇ　　　　　　　　７５
．８４ １Ｏ岡　　　　　　　９１．３９ １００μｇ　　　　　　　　３７．００実施例３−抗原
被覆されたクベットとの競争チロキシン（Ｔ、）を次の
方法を用いてＢ５Ａ１分子当り約２０個のＴ１分子でＢ
ＳＡに共有結合させた。Ｔ、−Ｂ　Ｓ　Ａ共役はｐＨ９
〜１０でのＴ、〜ＩＣ，Ｌ−チロキシニルー４−（Ｎ−
マレイミド−メチル）−シクロヘキサン−１−カーボネ
ートのマレイミド基に対するＢＳＡのアミン基による親
核的付加を通してＢＳＡをＴ、ＭＣと結合させることか
ら調製した。Ｔ、ＭＣは中性ｐＨでのアミド化によりＳ
ＭＣＣ，スクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミド−メチ
ル）−シクロヘキサン−１−力ルポキシレート　［ピア
ス・ケミカル（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）　］
　と］Ｌ−チロキンから誘導した。Ｔ、−ＢＳＡ共役物
はｐＨ７に調整した０゜０１Ｍ　　リン酸塩緩衝液中に
て室温で１８時間共役物ｌｌ１１β当り０．１７＋ｎｇ
のもの０．１−を培養することにより市販のストリップ
微量滴定ウェルに吸収させた。ウェルを０．２５　Ｍ　
ＨＥＰＥＳ／ＴＲｌ５緩衝液（ｐＨ８，３で０．０５％
ＮａＮ　３．０．１５Ｍ　ＮａＣｌ２を含む）で３回洗
浄した。次にウェルをＨＥＰＥＳ／ＴＲｌ５緩衝液０．
２ｍｌ＋１％ＢＳＡと共に室温で７２時間培養した。次
にウェルを再びＨＥＰＥＳ／　ＴＲＩ　Ｓ緩衝液で３回
洗浄し、そして緩衝液と共に使用するまで４℃で貯蔵し
た。

平均直径４０ｎｍを有するコロイド状金を前記の方法に
よりモノクローナル抗Ｔ、ＩｇＧで被覆した。ストリッ
プ・ウエン・クベットを実施例１と同様にプリズム上に
設置し、そして０．０２％ＮａＮ、及び２％牛ガンマグ
ロブリンを含むｐＨ７、４ＰＢＳ６５μ１１統いて同様
の緩衝液中のＴ、標準１０辺をクベットに加えた。次に
抗−Ｔ、抗体被覆されたコロイド状金をクベットに加え
、そして混合した。平衡期間後に反応速度を測定した。

予期したように、次のとおりに増加したＴ、濃度は逆数
乱光からの減少した信号と関連していた：Ｔ、（μｇ／
旧）　　信号スロープ（任意単位）０　　　　　　　　
　５１．１ ２　　　　　　　　　４１．９ ４　　　　　　　　　２５．３ ８　　　　　　　　　　９．０８ １２　　　　　　　　　　６．５１ ２４　　　　　　　　　　２．９６ 実施例４−抗原被覆されたコロイド状金との競争 イムノロン・ストリップ・ウェル・クベットをｐＨ７，
４で１ｍＪ当り０．５μｇの抗ジゴキシン０．１ｍβ及
びＯ，１Ｍ　ＫＰＯ，で被覆し、そして使用するまで４
°Ｃで貯蔵した。次にウェルをｐＨ７、４で０、ＯＩＭ
　ＰＢＳで３回洗浄した。平均直径４０ｎｎｌを有する
コロイド状金粒子をＴ、Ｗ、スミス（Ｓｍｉｔｈ）　、
バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅ＋ｎ１ｓｔｒｙ）９
：３３１〜３３７　（１９７０）の論文に示される方法
によりｌ　＋ｏβ当り１１１１ｇのジゴキシン−ＢＳＡ
共役物（ＢＳＡ　　１分子当り約５分子のジゴキシン）
で被覆し、次にｌ対４に希釈した。緩衝液（ｐＨ７，６
で０．ＯＬＭ　ＰＢＳ、　ｌ　、ＯＭ　ＮａＣ１゜１％
ＢＳＡ）３５μｉをクベットルに加え、続いて血清試料
または血清ベース標準２５成及びジゴキンン被覆された
コロイド状金懸濁液５０成を迅速に加え、そして混合し
た。次の５分間中に反応速度を測定し、そして結果を観
察した。増加したジゴキンン濃度により次のように反応
速度は減少しｔこ： ０　　　　　　　　　　　　３７２．２９６０．２５　
　　　　　　１２７．８６ ０．５０　　　　　　　　　　　　３０、２９実施例５
−内部動力学的較正法 定量並びにウェルに加えられる液体試薬間において異な
ったウェルで差があることが認められる。

これらの差は動力学的応答に変化を生じさせ、補正なし
では誤差を生じさせ得る。補正の１つの好適な方法は内
部動力学的較正法を利用することである。このことを行
うために、定濃度の対照試料を定量の開始毎にウェルに
加え、そして同じウェルに試料を添加する直前に反応の
速度を監視する。

かくて対照試量は例えばウェルの感度を測定し、そして
その情報を試料の読取りを補正するために用い、これに
より構造または試薬の被覆の不均一性の差を除去するこ
とにより個々のウェルを較正するために使用し得る。従
って、最初に対照試料を加え、そして検出器出力を監視
することにより均一な速度の定量を理想的に行い得る。

関連した利点として、この方法は重複する定量を行う必
要がなく、これにより時間及び資源の節約になる。

またかかる較正方法は個々の試料の屈折率の強力な関数
である粒子の光散乱効率の試料間の差を除去する。この
方法の例は含まれる原理を示す。

成形されたポリカーボネート製りベットに抗−ｈＣＧ抗
体を吸着被覆させＩ；。定量緩衝液（実施例１から）１
５０μ２、抗−ｈＣＧ被覆されたコロイド状金（直径的
４０ｎｍ）　１００１４１及びギルフォード（Ｇｉｌｆ
ｏｒｄ）ストリップ血清ベース１０ｍ１Ｕ／ｍ２の較正
液を各々のクベットに加え、そして混合しｔ；。培養５
分後、散乱光強度（スロープ）の増加の割合を次の５分
間に測定した。この較正スロープを記録した後、試料と
してギルフォード血清ベースの標準液７ＦＭを加え、混
合し、そして次の５分間に散乱光スロープを読取る前に
５分間培養した。各々のクベットの正味の較正スロープ
を次式により計算した： 正味較正スロープ−［標準液のスロープ／較正液のスロ
ープ］−０，８８２にこに０．８８２６は６つのゼロｈ
ＣＧ標準液の平均スロープをそのそれぞれの較正スロー
プで割ったものである。

次の標準液のくり返しのＣＶ（変動係数）を正味の較正
されたスロープをベースとして計算し、そしてこれらの
標準液の未補正のスロープと比較し　Ｉこ　。

ｔｏ　ｍｌＵ／ｍｊ２　　　１８．３１％　　　　１０
．７９％５０　　　ｍｌＵ／Ｊ　　　　　　　　　　３
０．３　　　％　　　　　　　　　　　　　　２１．４
２％１００　　ｍｌＵ／＋Ｊ　　　　　　　　　　　１
８．８６％　　　　　　　　　　　　　　　５．８８％
２００　　ｍｌＵ／ｍ１２　　　　　　　　　３３．６
３％　　　　　　　　　　　　　　３０．８６％すべて
の場合において、内部較正法を用いてより大きい正確さ
及びくり返し精度が得られたことを知り得る。

実施例６−ラテックス粒子を用いる競争ｈＣＧ定量法 上の実施例１に示すようにイムノロン・ストリップ・ウ
ェルを被覆した。各々のウェルに定量緩衝液３５４を加
えた。次にストリッピングされた血清（ギルフォード）
に溶解しｆ：、　ｈ　ＣＧ　２５μ２を加え、そして混
合した。５分間培養後、「妊娠用のオルト・ベーターｈ
ＣＧスライド試験（Ｏｒｔｈ。

Ｂｅｔａ−ｈＣＧ　５ｌｉｄｅ　Ｔｅ５ｔ　ｆｏｒ　Ｐ
ｒｅｇｎａｎｃｙ）Ｊ　ｈ　ＣＧ被覆されたスチレンラ
テックス（ｉ径０．３７５μｍ）［オルト・ダイアグノ
スティック・システム社（Ｏｒｔｈｏ　Ｄｉａｇｎｏｓ
ｔｉｃ　５ｙｓｔｅＬＩＩＩｎｃ、）］　　５０１ｄを
加え、そして混合した。反応速度を５分間平衡化させ、
一方散乱光の信号のスロープを次の５分間中に計算した
。結果は次のとおりであった：２２３．８７５　ｍ１Ｌ
Ｉ／ｍｊ　　３．６１，３．７６．６．０４　　　４．
４７２２．３８７　　　　　８．９６．９．０２．９．
２５　　　９．０８２．２３８　　　　　１１８．１２
２．１４４　　１２８２２３　　　　　１５８．１６２
．１８７　　１６９２２．３　　　　１４８．１５７．
１９６　　１６７２．２　　　　１３８．１４２．１６
１　　１４７実施例７−赤血球粒子（直径約８ミクロン
）を用いる直接赤血球抗原試験 ポリカーボネート製りベットをＲＨ因子試験に対する抗
−Ｄ（抗−Ｒｈｏ）及びＡＢＯ血液グループ試験に対す
る抗−Ａを吸着させることにより被覆した。人全血０．
５−を遠心分離し、ｐＨ７、４のリン酸塩緩衝化された
食塩水５−に再懸濁させ、遠心分離し、そしてＰＢ５２
ｍＡに再懸濁させた。

この試験懸濁液３００μＱを被覆されｊ；クベットに加
え、そして混合した。２分間培養後、散乱光強度のスロ
ープを次の８または１８分間にわたって計算した。結果
は次のとおりであった：抗−へ被覆されたクベットにお
けるスロープＡ−２５７（８分） Ａ÷　　　　　　　　　　　２４０　　　（１８分）Ｂ
＋　　　　　　　　　　　　−１８，６（８分）ｏ　　
　　　　　　　　　　　１４．９　（１８分）抗−り被
覆されたタペットにおけるスロープ試料血液型　　　　
　　　スロープ（時間）Ａ＋　　　　　　　　　　　　
　５６．６（１８分）Ｂ＋　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　１０．２（１８分）０−Ｄ−（高
［ｔＲＨ）’　　　　　　　３２．３（１８分）Ａ−４
，３（１８分） ０−　　　　　　　　　　　　　４．５（１８分）本ま
れな血液型 本発明の精神または範囲のいずれかから実質的に逸脱せ
ずにある程度の物理的操作をこの系に行い１専ることは
本分野に精通せる者には容易に認められよう。例えば、
タペット及びプリズムの組立はタペット微量滴定ウェル
をタペットの一部を形成するプラスチック製プリズムと
共に成形する１つの積層単位であり得る。同様に、臨界
角を６″超える角度が最も好ましいことが見い出された
が、照射光源及び光検出器の光学特性に依存して、臨界
値以上のある異なった角度がより最適であることができ
、そして本発明書に記載する角度と等価であると考えら
れることが認められよう。更に、タペットの側面または
底面で測定を行い得る。

更に、コロイド状粒子例えば金、ラテックス及び赤血球
を本実施例に記載したが、粒子及びその特殊な粒径範囲
は限定するものとは考えられず、単に広範囲の可能性の
例であることを認めるべきである。事実、粒子の大きさ
は一般に液体媒質中の光の波長（また媒質の屈折率の関
数）を考慮して選ぶべきであり、粒子の屈折率は理想的
には正味の効果が系の共鳴が生じる場合に最も有利に得
られる最適の信号になるように水性媒質及び固体の屈折
率を考慮して選ぶべきである。これらの複雑な相互作用
の現在の理解の度合を考えて、予期することは極めて困
難であるが、実際の最適化の方法は比較的簡単であり、
そして本分野に精通せる者によって容易に行われる。

第二セットの実験 第２図を参照し、長方形の板ｌを縦軸２の周囲を水平面
で一定の速度（図示していないモーター、ベルト及びプ
ーリーにより）で回転させた。

次の部品を回転板上に置き、そして−緒に動かした二２
つの前面鏡５及び６　［メレス・グリオツド（Ｍｅｌｌ
ｅｓ　Ｇｒｉｏｔ）０２ＭＦ　Ｇｏ　００）　　；　　
ｌ　　５０ｍｍの焦点距離レンズ７（メレス・グリオツ
ド０ＩＬＰＸ２３７）；３’ｒ波遅延板（ａ　ｑｕａｒ
ｔｅｒ−ｗａｖｅ　ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ　ｐｌａｔ
ｅ）Ｉ　Ｏ（メレス・グリオツド０２ＷＲＭＯｌ　３−
６３２．８）；放物面状反射鏡（軸断面１３）、レーザ
ービームを通すための間隙ノツチ付き；ノツチなしの第
二の放物面状反射鏡；及びアパーチャー板１５（厚さ０
．２５ｍｍ、回転軸の周りの中心に位置する２ｍｍの穴
）。放物面状反射鏡１３及び１４はｌｏ、２ｍｍの焦点
距離を有している［エアロ・リサーチ・アンシエーツ（
Ａｅｒｏ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ４
８４−００１　］　。

これらのものはその元のパラボラ・コインシデント（ｐ
ａｒａｂｏｌａｓ　ｃｏｉｎｃｉｄｅｎｔ）の光軸で設
置された放物面鏡の軸部品とは離れている。

回転した組立装置の下に偏光したＨ　ｅ　−Ｎ　ｅレー
ザー１８（５ｍＷ、メレス・グリオツド０５ＬＨＰ１５
１）がある。レーザービームは第一の〆彼達延板８（ｌ
Ｏと同様）を通り、前面鏡４（５及び６と同様）で反射
し、そして第二の〆彼達延板９（ｔｏと同様）を通過す
る。各々の％波板（８，９及び１０）はこのものが調整
のためにレーザービームに垂直な面において回転でき、
そして正確に調整された場合にその位置で固定できるよ
うに設置する。レーザービームが板９から出て来る場合
、このものは回転光学組立装置の回転体２の軸と一致す
る。

この具体例においてタペット表面１２での散乱から得ら
れる光学的信号は入射光の偏光に敏感であるために３枚
の〆波板を用いた。かくてタペットの円の周囲での均一
な結果を保証するために、ビームはすべての位置で同じ
偏光の条件でなければならない。このことを達成させる
ために、面偏光されたビームを生じさせるレーザー１８
を用いた。このビームはこのものを適当に向けられた％
彼達延板８を通過させること番こより得られる円形偏光
である。第一の遅延板の特徴における不完全性を補償す
るための微調整を行うために第二の遅延板９を与える。

回転員上の第三の〆波板１０はクベット表面１２の面に
平行な電場を用いて面偏光された光を生じさせるために
用いる。レーザービーム３をレンズに入る際の直径０．
８ｍｍから全内部反射表面１２での直径Ｑ、２ｍｍに収
束させるためにレンズ７を用いる。小さい直径は読み取
りを増幅する際に役立ち、このことは装置の精度を改善
するために平均化される。

４０個のクベットに対する容器を有する板１９を回転光
学装置上に設置する。容器はその中心が回転光学装置の
回転の軸にある円に配置される。

クベットの１つを１１に示す。光学装置は回転するため
に、各々のクベットに順にレーザービーム及び受光系（
２つの放物面状反射鏡）を与える。

各々のクベットにおいて、装置はクベットの光学面を過
ぎて動くために複数の読み取りが得られる。

第３図を参照して、レーザービーム３は面２１に入り、
透明なプラスチック製材料を通して表面２２に達し、そ
こで全内部反射を起こし、そして表面２４でクペットを
出る。アナライト溶液をウェル２０中に包含させる。信
号発生散乱は１２で生じる。

レーザービーム３は表面に対する法線より少々下方で入
口面２１中に導入され、従ってレーザービームのいずれ
の表面反射も受光系から離れた方向を示す。ビームはこ
のものが臨界角より大きい表面２２に対する法線からの
角度で表面２２上に当たるように入口面で屈折させる。

かくてこのものは全内部反射する。

全内部反射表面１２で発生する光学信号を捕集するため
に１３（第２及び４図）で用いられる（完全な放物面状
の）セクタ（ｓｅｃｔｏｒ）は臨界角より大きい角度で
あることが必要であることにより測定され、そしてこれ
により光源に対して後方に散乱される光のみが検出され
る。より小さい角度での放物面状反射鏡１３の部分はつ
や消しの黒色感圧紙テープでマスクする。かくて第２図
に示されるように表面１２に平行に生じる光線に対して
全内部反射臨界角２５から生じる光のみが受は入れられ
る。

放物面は散乱光源１２がその焦点になるように位置させ
る。放物面の焦点で生じる光線はその軸に平行に反射し
、従って２３から２５への信号光（第３及び４図）は第
二の放物面１４へのビーム１７として透過する。（詳細
は第４図参照。）放物面の軸に平行な光線は焦点で収束
する。第二の放物面１４はその焦点で信号エネルギーを
濃縮し、そこにアパーチャー板１５を設置する。アパー
チャー板は受光系により焦点を絞れない迷光（散乱光源
１２から発生するものではない）が光検出器１６に達す
ることを防止する。（浜松社５１７２３−０４）。

光学的符号器［スムタツク（Ｓｕｍｔａｋ）Ｌ　ＨＦ　
−０５０−２０００型、示していない１を回転光学装置
に取付けた。この符号器の出力は回転情報を１８Ｍ　　
ＰＣＡＴ及びデジタル・データ収得システムに与えるた
めに用いた。レーザー／検出器光学組立装置ｌは各々の
クベット下を通るため、デジタル・データ収得システム
／コンピュータをデジタル化し、そして内部反射表面１
２を走査して得られる、検出器１６の増幅された出力の
約１００の信号の読み取りの平均を貯蔵した。かくて各
々のクベットから得られる約１００の読み取りの平均を
各々の回転（約２秒毎に１回転）と共に貯蔵する。また
コンピュータは他の検出器からのレーザー出力に比例す
る読み、並びに低散乱領域（黒色の陰極化されたアルミ
ニウム製りベットホルダー環１９に当たるレーザー）及
び高散乱領域（クベットの場所に設置されたテフロンブ
ロック）の読みを貯蔵した。これらの読みはレーザー強
度の変化及び検出器のドリフトを補償するｔ；めに用い
た。コンピュータが１０分間クりットを監視した場合、
時間−０秒での信号を曲線から差し引き、そして各々の
クベットに対するこの式対時間を積分する際に各々のク
ベットに、対して散乱信号対時間データに対する５次少
ない平方近似式が得られる。次にこの積分値をアナライ
ト濃度と相関させｌこ　。

実施例１ 肝炎ウィルス表面抗厘試験 第３図に示されるポリカーボネート製クベットをｐＨ７
、４の０．ＯＩＭリン酸塩緩衝食塩水中の１１ａｌ当り
１００μｇの抗体溶液２００成を室温で一夜培養し、続
いてｐＨ８、３の緩衝液中の０．０５ＭＨｅｐｅｓ／Ｔ
ｒｉｓ３００μβを３図吸引充填することによりマウス
・モノクローナル抗肝炎コア抗原抗体で被覆した。次に
クベットを１％牛血清アルブミンを含むｐＨ８、３の０
　、０５　Ｍ　Ｈｅｐｅｓ／　Ｔｒｉｓ緩衝液３００Ａ
１で被覆し、被覆溶液３００μ２で２回洗浄し、ｐＨ８
−３のＱ　、　Ｑ　５　Ｍ　Ｈｅｐｅｓ／　Ｔｒｉｓ緩
衝液中の３％トレハローズ（ｔｒｅｈａｌｏｓｅ）　３
００μεと共に室温で１５分間培養し、吸引し、室空気
中で乾燥し、そして相対温度２０％以下のデシケータ中
にて室温で貯蔵した。次にクベットを照射された表面１
２の周囲を１８０°回転させ、そして第３図に示される
クベットの内側の径路に従って回転の軸から離れて伝搬
する間にレーザーがクベットに入る改良以外は第２図に
示される方法と同様な装置中にクベットを設置した。

［メルク（Ｍｅｒｃｋ）］製の適当量の肝炎表面抗原を
陰性血清プールに加えることにより調製された標準液７
２μｌを自動ピペッタ−によりクベット中に分配し、そ
して封鎖された３７°Ｃの装置中で５分間培養した。次
にピペッタ−で緩衝液（２，０Ｍ塩化カリウム、２％牛
血清アルブミン、ｌ−当り５０μｇの正常マウスＩｇＧ
及び０．０５Ｍナトリウムバルビトール緩衝液中にｐＨ
８、５で溶解した０、０５％アジ化ナトリウムを含む）
５４成及び直径１１０５ｎの０．１％モノクロナール抗
−肝炎表面抗原被覆された金コロイド懸濁液（０，０５
％アジ化ナトリウム、３００ｍＭマンニトール及び０．
５％牛血清アルブミンを含むｐＨ７、０の１０　ｍ　Ｍ
　Ｈｅｐｅｓ緩衝液中）１８０艶をクベット中の流体を
混合するに十分な速度で分配した。次に各々のクベット
により散乱された光を次の１０分間で記録した。光散乱
対時間データに合う５次の線形回帰曲線の時間積分を各
々のクベットに対して報告した。６つのゼロ標準の５つ
（１つは他の５つの平均から１４標準値離れていｊ；）
からの信号の平均及び重複標準の平均は次のデータから
知り得るように存在する肝炎表面抗原と比例関係にあっ
た： 肝炎表面抗厘濃度　　　　　平均信号 ０　　　　　　　　　　　１．７３５８０、ｉ　ｎｇ／
＋ｎｊ！　　　　　　　　２．２３７６０．２　ｎｇ／
ｍλ　　　　　　　２．９４２１０．４　ｎｇ／ｍｊ２
　　　　　　　３．９９２３５０．６　ｎｇ／ｍＮ　　
　　　　　　５．０４４２０．８　ｎｇ／ｗ１　　　　
　　　６．７２１８５１、Ｏｎｇ／ｎ＋ｊ　　　　　　
　　７．０１８７１．５　ｎｇ／ｌｎｌ　　　　　　　
　９．３１１７５２．０　ｎｇ／［ａｉ２　　　　　　
　１０．７３６５２．５　ｎｇ／ｍ１　　　　　　１４
．０４４４５、Ｏｎｇ／＋ｎ（１２４，９２７９ １０，０ｎｇ／＋Ｊ　　　　　　　４７．４５８５実施
例２ 抗肝炎コア抗原人抗体試験 第３図に示すポリカーボネート製りベットを実施例１　
（第二セットの実験）と同様に１−当り５μ８の被覆溶
液を用いて再構成肝炎コア抗原で被覆しｔ；。次にクベ
ットを乾燥し、貯蔵し、そして封鎖され、且つ３７℃の
空気循環器を備えた装置（第２図）中に設置した。適当
な試料または対照２２Ａ１．を自動ピペッタ−により別
々のクベットに加え、そして５分間培養し、その後定量
緩衝液（ｐＨ７，４のリン酸塩緩衝化食塩水に溶解した
１％牛血清アルブミン及び１ＭＮａｃｊ！からなる）５
４、！及び直径１１０５ｎのマウス・モノクローナル抗
人ＩｇＧ被覆されたコロイド状金懸濁液の０．１％懸濁
液１８０パをクベットの内容物を混合するに十分な速度
で分配した。次にクベツＩ・により散乱された光を次の
１０分間で記録しｔ；。散乱光対時間データに合う５次
の線形回帰曲線の時間積分を各々のクベットに対する信
号として報告した。各々の血清試料の反復の平均信号は
次のデータに示されるように、陰性対照の平均以上の３
つの標準値からはずれたものを除外した抗肝炎コア抗原
の存在と相関関係にあった： 試料タイプ　反復の回数　平均　試験結果陰性対照　　
　　４　　　０．９５２４　　Ｓ、Ｄ、＝０．５１陽性
対照　　　　４　　　６０．２０９９　　Ｓ、Ｄ、＝６
．５陰性試料１　　　２　　　２．１６７１陽性試料１
　　　２　　　１０．４８３　　　　　　＋陽性試料２
　　　２　　　４１．０５８　　　　　　＋陽性試料３
　　　２　　　３３．４９４　　　　　　＋陽性試料４
　　　２　　　２．６０４３　　　　　　＋陽性試料５
　　　２　　　７４．２２３５　　　　　　＋第三セッ
トの実験 実施例１ 試験 本実施例に用いる装置は第５及び６図に示される。試験
は流通させる試料用の流路を有するアクリル製カートリ
ッジ２６　［アーデン・メディカル・システムズ（Ａｒ
ｄｅｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）　］上で行
った。流路の表面を標準受動吸着法によりポリクローナ
ル山羊抗−ジゴキシン抗体［アトランティック・アンテ
ィボディー（Ａｔｌａｎｔｉｃ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ）］
で被覆した。Ｈｅ−Ｎｅレーザー２８からの光２７は表
面に殆んど垂直な角度で被覆された表面２９の一部を照
射した。照射のこの角度で、光は試料中でエバネツセン
ト波を生じるよりは水性試料中に伝搬した。被覆された
表面２９から散乱された光はレンズ３０により捕集され
、そして光フアイバー３１上に焦点を合わされ、光は光
増倍管３２　（ＰＭＴ）に導びかれな。ＰＭＴの出力電
圧はデジタル化され、そしてコンピュータ３３により記
録された。検出系（レンズ及びファイバー）全注意して
設置し、そして表面の面及び臨界角間の角度でアクリル
を通して伝搬する被覆された表面２９から散乱された光
のみを捕集するように向けた。

コロイド状金を上記のとうりに調製しく直径約４０ｎｍ
）、モしてジゴキシン／牛１ｇＧで被覆しｌ；。スパイ
クされた（　５ｐｉｋｅｄ）全血及びジゴキシン−コロ
イド状金の等しい混合物を含む試料をピペットでカート
リッジ中に移し、そして生じた光散乱を一定時間監視し
た。

第７図は代表的な結果を示す。曲線Ａにおいて、試料は
遊離のジゴキシンを含んでおらず、そして示された７分
間中にジゴキシン−コロイド状金属が表面に結合するに
従って光散乱信号は連続的に増加した。曲線Ｂにおいて
、全血試料は被覆された表面上の部位に対してジゴキシ
ン−コロイド状金と競争するジゴキシン約４，５μｇ／
ｍＡを含んでおり、そして結果として散乱信号は数分後
に平らｌこなった。（曲線は比較のために同じレベルで
出発するように調整した。） この実施例において、試料は被覆された表面の下にあっ
た。試料が被覆された表面の上にある場合、赤血球の沈
降により大きな偽散乱信号が生じる。全血定量に対し、
出願者は被覆された表面を重力が赤血球を表面から引き
離すか、または少なくともこれらを表面に向かわせない
ように配置することが好ましいことを見い出した。

実施例２ 光源としてＬＥＤを用いるコロイド状金の免疫的結合の
観察 本実施例に用いる装置を第８図に示す。試験は実施例１
（第三セットの実験）と同様のアクリル製カートＩＪツ
ジ３４上で行った。光源３５は赤色の発光ダイオード［
Ｌ　Ｅ　Ｄ、スタンレー（Ｓｔａｎｌ、ｅｙＥＲ−３０
０，３００ミリオンデラ、６６０ｎｍピーク波長、３０
ｎｍ半値巾）］であった。ＬＥＤからの光をＩＯＸの顕
微鏡対物レンズにより被覆された表面３６上に焦点を合
わせた。表面からの散乱をレンズ３７によりアパーチャ
ー３８上に、次に実施例１　（第三セットの実験）に記
載と同じ光学的設置条件でＰＭＴ３９に焦点を合わせた
。

ＬＥＤ出力を１ＫＨｚＴ’を気的に変調し、そしてＰＭ
Ｔ出力を装置の信号対ノイズ性能を改善するために同じ
周波数でロック−イン・アンプ４０（ＰＡＲＩ２８Ａ、
）により脱変調した。

この実施例に用いる試薬は山羊−抗マウス抗体［ジャン
セン（Ｊａｎｓｓｅｎ）　　ｒＡｕｒｏ　Ｐｒｏｂｅ」
）で被覆された４０ｎｍのコロイド状金であった。この
試薬をマウスＩｇＧまたは牛血清アルブミン（ＢＳＡ）
で被覆されたカートリッジ中にピペットで移した。

第９図は代表的な結果を示す。曲線ＣはＭＩｇＧで被覆
されたカートリッジに対するＧＡＭ−全結合としての散
乱信号における実質的な増加を示す。曲線りはカートリ
ッジをＢＳＡで被覆した場合の少ない応答を示す。

本発明の主なる特徴及び態様は以下のとおりである。

１、光源；試料接触表面を有する光学的に透明な員を受
けるためのハウジング装置において、該ハウジング装置
中の数置が試料接触表面が該光源から放射される光で照
射されるように配置されるハウジング装置；並びに光源
から幾何学的光路中に伝搬する光の検出を除外する光検
出装置において、該光検出装置が試料接触表面の面及び
試料接触表面の全内部反射臨界角間で、照射されｊ；試
料接触表面から光学的に透明な員を通って伝搬する弾性
散乱光を検出し得る光検出装置、からなる試料中のアナ
ライトの存在の検出装置。

２、光源；試料接触表面を有する光学的に透明な員を受
けるためのハウジング装置において、該ハウジング装置
中の数置が試料接触表面が光学的に透明な員を通して試
料接触表面の面及び全内部反射に対する臨界角間の角度
で伝搬する、該光源から放射される光で照射されるよう
に配置されるハウジング装置；並びに光源から幾何学的
光路中に伝搬する光の検出を除外する光検出装置におい
て、該光検出装置が試料接触表面の面及び全内部反射臨
界角間で、照射された試料接触表面から光学的に透明な
員を通って伝搬する弾性散乱光を検出し得る光検出装置
、からなる試料中の興味あるアナライトの存在の検出装
置。

３、光学的に透明な材料の表面上で光散乱性分子の存在
を検出する際に、該光散乱性分子を照射し、光学的に透
明な該材料を通して、その上に光散乱性分子が置かれて
いる光学的に透明な材料の表面の面及びその上に光散乱
性分子が置かれている表面の全内部反射臨界角間で伝搬
する該光散乱性分子により弾性的に散乱された光を検出
し、そして検出された、弾性散乱された光を光学的に透
明な材料の表面上の光散乱性分子の存在に相関させるこ
とからなる、光学的に透明な材料の表面上の光散乱性分
子の存在の検出方法。

４、光学的に透明な材料の表面上で光散乱性分子の存在
を検出する際に、該光散乱性分子を光学的に透明な該材
料を通して伝搬する光波から生じるエパネツセント波で
照射し、光学的に透明な該材料を通して、その上に光散
乱性分子が置かれている光学的に透明な材料の表面の面
及びその上に光散乱性分子が置かれている表面の全内部
反則臨界角間で伝搬する該光散乱性分子により弾性的に
散乱された光を検出し、そして検出された、弾性散乱さ
れＩ；光を光学的に透明な材料の表面上の光散乱性分子
の存在に相関させることからなる、光学的に透明な材料
の表面上の光散乱性分子の存在の検出方法。

５、流体試料中のアナライトを検出する際に該アナライ
トがリガンド−リガンド結合パートナ−対のリガンドで
あり、その際に ａ）　該流体試料の屈折率より大きい屈折率を有する光
学的に透明な材料を与え、その際に光学的に透明な該材
料が該リガンド−リガンド結合パートナー対の複数のリ
ガンド結合パートナ−が固定化される試料接触表面を有
し： ｂ）　更に固定化された該リガンド結合パートナ−と複
合体を形成し得る光散乱性の粒子標識リガンドを与え； Ｃ）　該流体試料及び該光散乱性粒子標識リガンドを該
アナライト及び該光散乱性粒子標識リガンドが各々固定
化された該リガンド結合パートナ−と複合体を形成する
ような条件下で該試料接触表面と接触させ： ｄ）　該複合体を光学的に透明な該材料を通って伝搬す
る光波から生じるエバネツセント波で照射し； ｅ）　弾性散乱された光を該複合体の該光散乱性分子に
より検出し； 「）　弾性散乱された光を該試料接触表面上での複合体
の存在に相関させ；そして ｇ）　試料接触表面上の複合体の存在を標準対照に対す
る試料接触表面上の複合体の存在と比較し、これにより
流体試料中のアナライトを検出する工程からなる、流体
試料中のアナライトの検出方法。

６、流体試料中のアナライトを検出する際に該アナライ
トかリガンド−リガンド結合パートナ−対のリガンドで
あり、その際に ａ）　該流体試料の屈折率より大きい屈折率を有する光
学的に透明な材料を与え、その際に光学的に透明な該材
料が該リガンド−リガンド結合パートナー対の複数のリ
ガンド結合パートナ−が固定化される試料接触表面を有
し； ｂ）　更に固定化された該リガンド結合パートナ−と複
合体を形成し得る光散乱性のリガンドを与え； Ｃ）　該流体試料及び該光散乱性リガンドを該アナライ
ト及び該光散乱性リガンドが各々固定化された該リガン
ド結合パートナ−と複合体を形成するような条件下で該
試料接触表面と接触させ；ｄ）　該複合体を照射し； ｅ）　該複合体の光散乱性リガンドにより弾性散乱され
、そして光学的に透明な該材料を通して、試料接触表面
の面及び試料接触表面の全内部反射臨界角間で試料接触
表面から伝搬する光を検出し１ ｆ）　弾性散乱された光を該試料接触表面上での複合体
の存在に相関させ；そして ｇ）　試料接触表面上の複合体の存在を標準対照に対す
る試料接触表面上の複合体の存在と比較し、これにより
流体試料中のアナライトを検出する工程からなる、流体
試料中のアナライトの検出方法。

７、流体試料中のアナライトを検出する際に該アナライ
トがリガンド−リガンド結合パートナ−対のリガンドで
あり、その際に ａ）　該流体試料の屈折率より大きい屈折率を有する光
学的に透明な材料を与え、その際に光学的に透明な該材
料が該リガンド−リガンド結合パートナー対の複数のリ
ガンド結合パートナ−が固定化される試料接触表面を有
し； ｂ）　更に固定化された該リガンド結合パートナ−と複
合体を形成し得る光散乱性のリガンドを与え； Ｃ）　該流体試料及び該光散乱性リガンドを該アナライ
ト及び該光散乱性リガンドが各々固定化された該リガン
ド結合パートナ−と複合体を形成するような条件下で該
試料接触表面と接触させ；ｄ）　該複合体を光学的に透
明な該材料を通って伝搬する光波から生じるエバネツセ
ント波で照射し； ｅ）　該複合体の該光散乱性リガンドにより弾性散乱さ
れ、そして光学的に透明な該材料を通して、試料接触表
面の面及び試料接触表面の全内部反射臨界角間で試料接
触表面から伝搬する光を検出し； ｆ）　弾性散乱された光を該試料接触表面上での複合体
の存在に相関させ；そして ｇ）　試料接触表面上の複合体の存在を標準対照に対す
る試料接触表面上の複合体の存在と比較し、これにより
流体試料中のアナライトを検出する工程からなる、流体
試料中のアナライトの検出方法。

８、該試料接触表面を該光散乱性粒子標識リガンドまた
は光散乱性リガンドと接触させる前に該流体試料と接触
させる、上記５．６または７のいずれかに記載の方法。

９、該試料接触表面を該流体試料と接触させる前に該光
散乱性粒子標識リガンドまたは光散乱性リガンドと接触
させる、上記５．６または７のいずれかに記載の方法。

１０、該試料接触表面を該流体試料及び該光散乱性粒子
標識リガンドまたは光散乱性リガンドと同時に接触させ
る、上記５．６または７のいずれかに記載の方法。

１１、該流体試料を混合物を生成させるように該光散乱
性粒子標識リガンドまｔ；は光散乱性リガンドと混合し
、そして該混合物を該試料接触表面と接触させる、上記
ＩＯに記載の方法。

１２、該光散乱性粒子標識リガンドがコロイド状金粒子
で標識されたリガンドからなる、上記５、６または７の
いずれかに記載の方法。

１３．流体試料中のアナライトを検出する際に、該アナ
ライトが第一のリガンド結合パートナ−が特異的である
エピトープ及び第二のリガンド結合パートナ−が特異的
であるエピトープを有するリガンドであり、その際に ａ）　該流体の屈折率より大きい屈折率を有する光学的
に透明な材料を与え、その際に光学的に透明な該材料が
複数の第一のリガンド結合パートナ−を固定する試料接
触表面を有し； ｂ）　更に第二の光散乱性粒子標識リガンド結合パート
ナ−を与え； Ｃ）　該流体試料及び第二の該光散乱性粒子標識リガン
ド結合パートナ−を固定化された第一のリガンド結合パ
ートナー：アナライト：第二の光散乱性粒子標識リガン
ド結合パートナ−複合体を生成させる条件下で該試料接
触表面と接触させ；ｄ）　該複合体を光学的に透明な該
材料を通して伝搬する光波から生じるエバネツセント波
で照射し； ｅ）　弾性散乱された光を該複合体を該光散乱性粒子に
より検出し： ｆ）　弾性散乱された光を該試料接触表面上での複合体
の存在に相関させ；そして ｇ）　試料接触表面上の複合体の存在を標準対照に対す
る試料接触表面上の複合体の存在と比較し、これにより
流体試料中のアナライトを検出する工程からなる、流体
試料中のアナライトの検出方法。

１４、流体試料中のアナライトを検出する際に、該アナ
ライトが第一のリガンド結合パートナ−が特異的である
エピトープ及び第二のリガンド結合パートナ−が特異的
であるエピトープを有するリガンドであり、その際に ａ）　該流体の屈折率より大きい屈折率を有する光学的
に透明な材料を与え、その際に光学的に透明な該材料が
複数の第一のリガンド結合パートナ−を固定する試料接
触表面を有し； ｂ）　更に第二の光散乱性リガンド結合パートナ−を与
え； Ｃ）　該流体試料及び第二の該光散乱性リガンド結合パ
ートナ−を固定化された第一のリガンド結合パートナー
：アナライト：第二の光散乱性リガンド結合パートナ−
複合体を生成させる条件下で該試料接触表面と接触させ
； ｄ）　該複合体を照射し； ｅ）　該複合体の第二の該光散乱性リガンド結合パート
ナ−により弾性散乱され、そして光学的に透明な該材料
を通して、試料接触表面の面及び試料接触表面の全内部
反射臨界角間で試料接触表面から伝搬する光を検出し； ｒ）　弾性散乱された光を該試料接触表面上での複合体
の存在に相関させ；そして ｇ）　試料接触表面上の複合体の存在を標準対照に対す
る試料接触表面上の複合体の存在と比較し、これにより
流体試料中のアナライトを検出する工程からなる、流体
試料中のアナライトの検出方法。

１５、流体試料中のアナライトを検出する際に、該アナ
ライトが第一のリガンド結合パートナ−が特異的である
エピトープ及び第二のリガンド結合パートナ−が特異的
であるエピトープを有するリガンドであり、その際に ａ）　該流体の屈折率より大きい屈折率を有する光学的
に透明な材料を与え、その際に光学的に透明な該材料が
複数の第一のリガンド結合パートナ−を固定する試料接
触表面を有し； ｂ）　更に第二の光散乱性リガンド結合パートナ−を与
え； Ｃ）　該流体試料及び第二の該光散乱性リガンド結合パ
ートナ−を固定化された第一のリガンド結合パートナー
：アナライト：第二の光散乱性リガンド結合パートナ−
複合体を生成させる条件下で該試料接触表面と接触させ
； ｄ）　該複合体を光学的に透明な該材料を通して伝搬す
る光波から生じるエバネンセント波で照射し； ｅ）　該複合体の第二の該光散乱性リガンド結合パート
ナ−により弾性散乱され、そして光学的に透明な該材料
を通して、試料接触表面の面及び試料接触表面の全内部
反射臨界角間で試料接触表面から伝搬する光を検出し： ｆ）　弾性散乱された光を該試料接触表面上での複合体
の存在に相関させ；そして ｇ）　試料接触表面上の複合体の存在を標準対照に対す
る試料接触表面上の複合体の存在と比較し、これにより
流体試料中のアナライトを検出する工程からなる、流体
試料中のアナライトの検出方法。

１６、該試料接触表面を第二の該光散乱性粒子標識リガ
ンド結合パートナ−または第二の該光散乱性リガンド結
合パートナ−と接触させる前に該流体試料と接触させる
、上記１３．１４または１５のいずれかに記載の方法。

１７、該試料接触表面を該流体試料と接触させる而に第
二の該光散乱性粒子標識リガンド結合パートナ−または
第二の該光散乱性リガンド結合パートナ−と接触させる
、上記１３．１４または１５のいずれかに記載の方法。

１８、該試料接触表面を該流体試料及び第二の該光散乱
性粒子標識リガンド結合パートナ−または第二の該光散
乱性リガンド結合パートナ−と同時に接触させる、上記
１３．１４または１５のいずれかに記載の方法。

！９．該流体試料を混合物を生成させるように第二の該
光散乱性粒子標識リガンド結合パートナ−または第二の
該光散乱性リガンド結合パートナ−と混合し、そして該
混合物を該試料接触表面と接触させる、上記１８に記載
の方法。

２０、第二の該光散乱性粒子標識リガンド結合パートナ
−がコロイド状金粒子で標識化された第二のリガンド結
合パートナ−からなる、上記１３．１４または１５のい
ずれかに記載の方法。

【図面の簡単な説明】

第１図は屈折率ｎ２を有し、ｎ２より小さい屈折率ｎ１
を有する流体５４と接触する流体接触面５２を有する光
学的に透明な員５３を表わす。 第２図は照射し、そして読み取るために用いられるクベ
ツ）　（ｃｕｖｅｔｔａ）及び回転光学機構の簡略され
た立面図である。 第３図はクベットの断面図である。 第４図はクベット及び受光器の最初の成分であるパラポ
ロイド状（ｐａｒａｂｏｌｏｉｄａｌ）反射器の透視図
である。 第５図は臨界角以上のレーザー照射を備えた装置を表わ
す。 第６図は照射が臨界角以上である場合に使用される照射
及び検出光を表わす。 第７図は第５図の装置で得られたデータを示す。 第８図は臨界角以上での光放射ダイオード照射を有する
装置を表わす。 第９図は第８図の装置で得られたデータを示す。 Ｆ／Ｇ、　／ 皓　ｂｐ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、光源；試料接触表面を有する光学的に透明な員を受
   けるためのハウジング装置において、該ハウジング装置
   中の該員が試料接触表面が該光源から放射される光で照
   射されるように配置されるハウジング装置；並びに光源
   から幾何学的光路中に伝搬する光の検出を除外する光検
   出装置において、該光検出装置が試料接触表面の面及び
   試料接触表面の全内部反射臨界角間で、照射された試料
   接触表面から光学的に透明な員を通つて伝搬する弾性散
   乱光を検出し得る光検出装置、からなる試料中のアナラ
   イトの存在の検出装置。 ２、光源；試料接触表面を有する光学的に透明な員を受
   けるためのハウジング装置において、該ハウジング装置
   中の該員が試料接触表面が光学的に透明な員を通して試
   料接触表面の面及び全内部反射に対する臨界角間の角度
   で伝搬する、該光源から放射される光で照射されるよう
   に配置されるハウジング装置；並びに光源から幾何学的
   光路中に伝搬する光の検出を除外する光検出装置におい
   て、該光検出装置が試料接触表面の面及び全内部反射臨
   界角間で、照射された試料接触表面から光学的に透明な
   員を通つて伝搬する弾性散乱光を検出し得る光検出装置
   、からなる試料中の興味あるアナライトの存在の検出装
   置。 ３、光学的に透明な材料の表面上で光散乱性分子の存在
   を検出する際に、該光散乱性分子を照射し、光学的に透
   明な該材料を通して、その上に光散乱性分子が置かれて
   いる光学的に透明な材料の表面の面及びその上に光散乱
   性分子が置かれている表面の全内部反射臨界角間で伝搬
   する該光散乱性分子により弾性的に散乱された光を検出
   し、そして検出された、弾性散乱された光を光学的に透
   明な材料の表面上の光散乱性分子の存在に相関させるこ
   とからなる、光学的に透明な材料の表面上の光散乱性分
   子の存在の検出方法。 ４、光学的に透明な材料の表面上で光散乱性分子の存在
   を検出する際に、該光散乱性分子を光学的に透明な該材
   料を通して伝搬する光波から生じるエバネツセント波で
   照射し、光学的に透明な該材料を通して、その上に光散
   乱性分子が置かれている光学的に透明な材料の表面の面
   及びその上に光散乱性分子が置かれている表面の全内部
   反射臨界角間で伝搬する該光散乱性分子により弾性的に
   散乱された光を検出し、そして検出された、弾性散乱さ
   れた光を光学的に透明な材料の表面上の光散乱性分子の
   存在に相関させることからなる、光学的に透明な材料の
   表面上の光散乱性分子の存在の検出方法。 ５、流体試料中のアナライトを検出する際に該アナライ
   トがリガンド−リガンド結合パートナー対のリガンドで
   あり、その際に ａ）該流体試料の屈折率より大きい屈折率を有する光学
   的に透明な材料を与え、その際に光学的に透明な該材料
   が該リガンド−リガンド結合パートナー対の複数のリガ
   ンド結合パートナーが固定化される試料接触表面を有し
   ； ｂ）更に固定化された該リガンド結合パートナーと複合
   体を形成し得る光散乱性の粒子標識リガンドを与え； ｃ）該流体試料及び該光散乱性粒子標識リガンドを該ア
   ナライト及び該光散乱性粒子標識リガンドが各々固定化
   された該リガンド結合パートナーと複合体を形成するよ
   うな条件下で該試料接触表面と接触させ； ｄ）該複合体を光学的に透明な該材料を通つて伝搬する
   光波から生じるエバネツセント波で照射し； ｅ）弾性散乱された光を該複合体の該光散乱性粒子によ
   り検出し； ｆ）弾性散乱された光を該試料接触表面上での複合体の
   存在に相関させ；そして ｇ）試料接触表面上の複合体の存在を標準対照に対する
   試料接触表面上の複合体の存在と比較し、これにより流
   体試料中のアナライトを検出する工程からなる、流体試
   料中のアナライトの検出方法。 ６、流体試料中のアナライトを検出する際に該アナライ
   トがリガンド−リガンド結合パートナー対のリガンドで
   あり、その際に ａ）該流体試料の屈折率より大きい屈折率を有する光学
   的に透明な材料を与え、その際に光学的に透明な該材料
   が該リガンド−リガンド結合パートナー対の複数のリガ
   ンド結合パートナーが固定化される試料接触表面を有し
   ； ｂ）更に固定化された該リガンド結合パートナーと複合
   体を形成し得る光散乱性のリガンドを与え； ｃ）該流体試料及び該光散乱性リガンドを該アナライト
   及び該光散乱性リガンドが各々固定化された該リガンド
   結合パートナーと複合体を形成するような条件下で該試
   料接触表面と接触させ； ｄ）該複合体を照射し； ｅ）該複合体の光散乱性リガンドにより弾性散乱され、
   そして光学的に透明な該材料を通して、試料接触表面の
   面及び試料接触表面の全内部反射臨界角間で試料接触表
   面から伝搬する光を検出し； ｆ）弾性散乱された光を該試料接触表面上での複合体の
   存在に相関させ；そして ｇ）試料接触表面上の複合体の存在を標準対照に対する
   試料接触表面上の複合体の存在と比較し、これにより流
   体試料中のアナライトを検出する工程からなる、流体試
   料中のアナライトの検出方法。 ７、流体試料中のアナライトを検出する際に該アナライ
   トがリガンド−リガンド結合パートナー対のリガンドで
   あり、その際に ａ）該流体試料の屈折率より大きい屈折率を有する光学
   的に透明な材料を与え、その際に光学的に透明な該材料
   が該リガンド−リガンド結合パートナー対の複数のリガ
   ンド結合パートナーが固定化される試料接触表面を有し
   ； ｂ）更に固定化された該リガンド結合パートナーと複合
   体を形成し得る光散乱性のリガンドを与え； ｃ）該流体試料及び該光散乱性リガンドを該アナライト
   及び該光散乱性リガンドが各々固定化された該リガンド
   結合パートナーと複合体を形成するような条件下で該試
   料接触表面と接触させ； ｄ）該複合体を光学的に透明な該材料を通つて伝搬する
   光波から生じるエバネツセント波で照射し； ｅ）該複合体の該光散乱性リガンドにより弾性散乱され
   、そして光学的に透明な該材料を通して、試料接触表面
   の面及び試料接触表面の全内部反射臨界角間で試料接触
   表面から伝搬する光を検出し； ｆ）弾性散乱された光を該試料接触表面上での複合体の
   存在に相関させ；そして ｇ）試料接触表面上の複合体の存在を標準対照に対する
   試料接触表面上の複合体の存在と比較し、これにより流
   体試料中のアナライトを検出する工程からなる、流体試
   料中のアナライトの検出方法。 ８、流体試料中のアナライトを検出する際に、該アナラ
   イトが第一のリガンド結合パートナーが特異的であるエ
   ピトープ及び第二のリガンド結合パートナーが特異的で
   あるエピトープを有するリガンドであり、その際に ａ）該流体の屈折率より大きい屈折率を有する光学的に
   透明な材料を与え、その際に光学的に透明な該材料が複
   数の第一のリガンド結合パートナーを固定する試料接触
   表面を有し； ｂ）更に第二の光散乱性粒子標識リガンド結合パートナ
   ーを与え； ｃ）該流体試料及び第二の該光散乱性粒子標識リガンド
   結合パートナーを固定化された第一のリガンド結合パー
   トナー：アナライト：第二の光散乱性粒子標識リガンド
   結合パートナー複合体を生成させる条件下で該試料接触
   表面と接触させ； ｄ）該複合体を光学的に透明な該材料を通して伝搬する
   光波から生じるエバネツセント波で照射し； ｅ）弾性散乱された光を該複合体を該光散乱性粒子によ
   り検出し； ｆ）弾性散乱された光を該試料接触表面上での複合体の
   存在に相関させ；そして ｇ）試料接触表面上の複合体の存在を標準対照に対する
   試料接触表面上の複合体の存在と比較し、これにより流
   体試料中のアナライトを検出する工程からなる、流体試
   料中のアナライトの検出方法。 ９、流体試料中のアナライトを検出する際に、該アナラ
   イトが第一のリガンド結合パートナーが特異的であるエ
   ピトープ及び第二のリガンド結合パートナーが特異的で
   あるエピトープを有するリガンドであり、その際に ａ）該流体の屈折率より大きい屈折率を有する光学的に
   透明な材料を与え、その際に光学的に透明な該材料が複
   数の第一のリガンド結合パートナーを固定する試料接触
   表面を有し； ｂ）更に第二の光散乱性リガンド結合パートナーを与え
   ； ｃ）該流体試料及び第二の該光散乱性リガンド結合パー
   トナーを固定化された第一のリガンド結合パートナー：
   アナライト：第二の光散乱性リガンド結合パートナー複
   合体を生成させる条件下で該試料接触表面と接触させ； ｄ）該複合体を照射し； ｅ）該複合体の第二の該光散乱性リガンド結合パートナ
   ーにより弾性散乱され、そして光学的に透明な該材料を
   通して、試料接触表面の面及び試料接触表面の全内部反
   射臨界角間で試料接触表面から伝搬する光を検出し； ｆ）弾性散乱された光を該試料接触表面上での複合体の
   存在に相関させ；そして ｇ）試料接触表面上の複合体の存在を標準対照に対する
   試料接触表面上の複合体の存在と比較し、これにより流
   体試料中のアナライトを検出する工程からなる、流体試
   料中のアナライトの検出方法。 １０、流体試料中のアナライトを検出する際に、該アナ
   ライトが第一のリガンド結合パートナーが特異的である
   エピトープ及び第二のリガンド結合パートナーが特異的
   であるエピトープを有するリガンドであり、その際に ａ）該流体の屈折率より大きい屈折率を有する光学的に
   透明な材料を与え、その際に光学的に透明な該材料が複
   数の第一のリガンド結合パートナーを固定する試料接触
   表面を有し； ｂ）更に第二の光散乱性リガンド結合パートナーを与え
   ； ｃ）該流体試料及び第二の該光散乱性リガンド結合パー
   トナーを固定化された第一のリガンド結合パートナー：
   アナライト：第二の光散乱性リガンド結合パートナー複
   合体を生成させる条件下で該試料接触表面と接触させ； ｄ）該複合体を光学的に透明な該材料を通して伝搬する
   光波から生じるエバネツセント波で照射し； ｅ）該複合体の第二の該光散乱性リガンド結合パートナ
   ーにより弾性散乱され、そして光学的に透明な該試料を
   通して、試料接触表面の面及び試料接触表面の全内部反
   射臨界角間で試料接触表面から伝搬する光を検出し； ｆ）弾性散乱された光を該試料接触表面上での複合体の
   存在に相関させ；そして ｇ）試料接触表面上の複合体の存在を標準対照に対する
   試料接触表面上の複合体の存在と比較し、これにより流
   体試料中のアナライトを検出する工程からなる、流体試
   料中のアナライトの検出方法。