CN102308211B - 基于超声辅助金属增强荧光(samef)的生物分析 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了超声辅助金属增强荧光、发光和/或化学发光分析系统，所述系统使用低强度超声波，通过增加系统内分子的动力学运动，显著减少了分析时间。

Description

基于超声辅助金属增强荧光(SAMEF)的生物分析
与相关申请的交叉引用
本申请要求2008年9月11日提交的美国临时申请No.61/096,181的优先权，所述临时申请的内容在此为所有目的引为参考。
发明背景
技术领域
本发明涉及金属增强检测系统以及用于增加所述检测系统的灵敏度和快速性的方法，更具体来说，涉及组合使用超声与金属增强的荧光或化学发光检测分析，以增加检测系统的速度和灵敏度。
相关技术背景
使用生物分析法鉴定和定量蛋白质和其他生物分子，在生物医学和生物化学应用中是极为重要的1-3。荧光在大多数这样的应用中是主流技术，其中目标生物分子通过其荧光团标记的结合配偶体的荧光发射进行检测4，5。在平面表面上执行的基于荧光的生物分析一般灵敏度欠缺并需要昂贵的光学仪器6，7。此外，在这些分析中的生物识别事件固有地缓慢(几分钟至数小时)6，7。通过在这些分析中引入等离子体激元(plasmon)共振粒子(PSP)，不使用尖端光学仪器即可改进基于荧光的分析的灵敏度8，9。灵敏度的提高可能是由荧光特征的增加和与PSP紧邻放置的荧光团的寿命降低所造成的，这种现象被称为金属增强荧光(MEF)8，10。在基于MEF的生物分析中，将PSP(一般为银纳粒)沉积在平面表面上，并在PSP上建立生物分析8。因为大多数生物分子的尺寸小于PSP(20-100nm)，因此荧光团位于其发射将由于它们与PSP的表面等离子体激元的相互作用而增加的距离内10。
尽管基于荧光的生物分析的灵敏度通过MEF来解决，但生物分析的速度仍然是有待克服的巨大挑战。就此而言，一种将低功率微波加热与MEF相结合的被称为微波加速金属增强荧光(MAMEF)11的新技术，显示出将完成生物分析的时间减少到不到1分钟。在MAMEF中，分析组分的低功率加热在主体(存在靶生物分子和荧光探针)与分析表面处的银纳粒(存在捕获探针)之间产生温度梯度，其驱动靶生物分子和荧光探针朝向表面，并建立起生物分析11。微波加热步骤可以对每种分析组分分别进行，或者对于三组分DNA杂交分析(3-piece DNAhybridization assay)来说在一步中进行12。然而，几个因素影响MAMEF技术的效率：1)分析表面必须被改性以消除过度加热(特别是在使用小体积液体进行的分析中)11，2)具有多个锐角的大型分析平台13(例如高通量筛选孔)的加热需要较长加热时间，这随后导致样品蒸发。
在其中化学诱导的电子激发态的发光与金属化粒子或表面中的表面等离子体激元耦合的表面等离子体激元耦合化学发光(SPCC)中，系统的动力学取决于没有外部激发源即可出现的化学诱导电子激发态。但是，在化学发光系统中，检测受到化学发光反应或探针的量子效率以及反应物耗尽前的时间的限制。因此，增加反应物的运动对于增加化学发光反应的速度将是有利的。
就此而言，对于适用于所有可商购分析平台而不牺牲样品的更通用的技术，仍存在需求。
发明概述
本发明提供了超声辅助金属增强荧光、发光和/或化学发光分析系统，所述系统使用低强度超声波，通过增加系统内分子的动力学运动，显著减少了分析时间。
一方面，本发明涉及一种分析检测方法，所述方法包含：
提供导电金属材料；其中所述金属材料被成形为刚好连续的薄膜或粒子，包括纳米结构、岛状物或胶体；
导入至少一种用于布置在导电金属材料附近的分子和/或荧光团，其中所述分子和/或荧光团能够发光，并通过接近到距金属材料约5nm到50nm范围内而增强；
施加超声能量以引起包含分子的化学反应的动力学增加；以及
测量从系统发出的光。
上述方法可用于多种检测系统，包括但不限于免疫分析、杂交分析、共振能量转移分析、基于偏振/各向异性的分析、基于化学发光的分析、基于发光的分析和酶联免疫吸附分析。
另一方面，本发明提供一种检测系统，所述系统包含：
位于容器内的导电金属材料，其中所述金属材料被造型成刚好连续的薄膜、粒子、纳米结构、岛状物或胶体；
至少一种用于布置在导电金属材料附近的生物分子，其中所述生物分子在被电磁源激发时能够发光，并通过与金属材料的预定接近度而增强；
声能量源，其引起流体中至少靠近金属表面的生物分子的运动增加，从而增加包含生物分子的化学反应的动力学；以及
测量从系统发出的光的测量装置。
在本实施方案中，生物分子包含外来或固有的荧光发射组分，其当与UV到IR范围内的辐射接触时具有发射荧光的能力。优选，荧光发射组分是不干扰生物分子的化学反应的分子。
另一方面，本发明涉及减少用于检测靶分子的金属增强荧光分析的检测时间的方法，所述方法包含：
向分析系统中使用的基材表面施加大量金属粒子；
将捕获分子连接到金属粒子上，其中捕获分子对靶分子具有结合亲和性；
导入怀疑包含靶分子的溶液；
向分析系统施加声能，其时间足以增加分子向金属粒子的运动，从而与捕获分子结合；
导入对靶分子具有亲和性的荧光检测剂分子，其中荧光检测剂分子可以在施加声能之前、期间或之后加入；
以激发荧光分子的频率施加电磁能；以及
测量任何荧光信号。
另一方面，本发明涉及金属增强的荧光传感的方法，所述方法包含：
向检测系统中使用的表面基材施加导电金属材料，其中所述表面包括玻璃、石英或聚合材料；
导入含有至少一种用于布置在导电金属表面附近的分子的溶液，其中所述分子能够发射荧光或能够与荧光发射分子结合；
施加20至200kHz范围内的声能，以引起溶液中分子运动的增加，从而增加检测系统内发生的任何化学反应的动力学；
使用电磁源激发分子，引起荧光发射；以及
测量系统内的荧光发射。
在所有实施方案中，金属材料可以包含银、金、铜、锌、镍、铁、钯、铝、铂或任何显示出等离子体激元发射的金属。金属材料可以采取金属岛、纳米结构、胶体、多孔基质、浸渗在玻璃或聚合物表面内的金属粒子和/或图案形状的金属表面的形式。
图案形状包括含有金属的具有至少一个顶点的形状，其中所述形状包括但不限于三角形、正方形、长方形、梯形、多边形、椭圆形、长椭圆形或其组合。此外，通过放置具有带顶点区域的形状的金属结构、并将这些顶点区域定位成彼此邻近和在其间产生反应性区，可以增强发射和反应性。制备其间的反应性区是用于放置与靶分子互补的固定化捕获分子。金属结构在制造成包含用于形成反应性区的顶点区域的几何形状时，可以放置在具有多个孔的分析系统上，其中反应性区包括所述孔，而且暴露于低强度超声增加了检测分析的反应性并缩短了其完成时间。
表面基材可以由聚合材料、玻璃、纸、硝酸纤维素、其组合或为金属结构的放置提供足够稳定性的任何材料制成。
另一方面，本发明提供了用于在样品中检测靶病原体的方法，所述方法包括：
提供系统，所述系统包含：
位于表面基材上的固定化金属材料，其中固定化金属材料上附有与靶病原体的已知DNA序列互补的固定化捕获DNA序列探针；以及
与靶病原体的已知DNA序列互补的游离捕获DNA序列探针，其中游离捕获DNA序列探针上附有荧光团；
将样品与固定化的捕获DNA序列探针相接触，其中靶病原体的DNA序列与固定化的捕获DNA序列探针结合；
将靶病原体被结合的DNA序列与游离的捕获DNA序列探针相接触，其中游离的捕获DNA序列探针与靶病原体的DNA序列的结合导致荧光团定位到距固定化金属材料足以增强荧光发射的距离；
向系统施加超声能量，其量足以增加靶病原体的任何DNA分子向固定化探针的移动，以增强游离的捕获DNA序列探针与靶病原体的DNA序列的结合，从而引起反应速度的增加；以及
使用UV到IR范围的电磁能量辐照系统，以增加定位在距金属材料预定距离处的荧光团的荧光发射，其中辐照可以在施加超声能量之前、期间或之后进行。
能够发射荧光和/或在被电磁能量激发后发光的生物分子包括但不限于荧光团、发色团或发光团。能够发射荧光的化合物可以是固有荧光团或附有外来荧光团的化合物。
另一方面，本发明涉及包含金属表面的生物分析系统，所述金属表面用于增强位于金属表面附近的基于化学发光的反应的效应，其中金属表面等离子体激元由化学发光物质的化学诱导的电子激发态和从其发出的辐射进行激发，提供增强的信号。表面等离子体激元耦合的化学发光信号可以包括非偏振、p-偏振和/或s-偏振的信号。
另一方面，本发明涉及使用高通量筛选(HTS)的分析方法，所述方法包含：
提供在HTS系统中使用的包含大量孔的多孔板；
将金属纳米结构导入孔中，
导入至少一种用于布置在金属纳米结构附近的生物分子，其中所述生物分子能够通过电磁能量或化学反应激发而发光，并通过与金属纳米结构预定的接近度而增强；
施加一定范围的声能以引起孔内运动的增加，从而增加包含生物分子的化学反应的动力学和/或加快检测时间的速度；以及
测量从系统发出的光。
另一方面，本发明涉及用于检测样品中的靶分子的试剂盒，所述试剂盒包含：
容器，其包含沉积在由聚合或石英材料制成的基材上的一层固定化的金属粒子，其中固定化探针与金属粒子相连，并且其中固定化探针对靶分子具有亲和性；
对靶分子具有亲和性的荧光团，其中靶分子与固定化探针和荧光团二者的结合导致荧光团定位于距固定化金属粒子足以增强荧光发射的距离；以及
用于增加系统中的运动的超声能量源和用于激发荧光团的能量源。
另一方面，本发明涉及金属增强的化学发光传感的方法，所述方法包含：
向检测系统中使用的表面施加金属材料；
导入包含至少一种用于布置在金属表面附近的生物分子的溶液，其中生物分子包含化学发光标记物；
触发化学发光标记物以诱导化学电子激发态，由此产生金属表面等离子体激元，并在触发化学发光标记物之前或期间向检测系统施加声能；以及
测量化学发光信号。
另一方面，本发明提供了用于在样品中检测靶病原体的方法，所述方法包含：
提供系统，所述系统包含：
金属表面，其中所述金属表面连接有与靶病原体的已知核酸序列互补的固定化的捕获核酸序列探针；以及
与靶病原体的已知核酸序列互补的游离的捕获核酸序列探针，其中游离的捕获核酸序列探针上附有化学发光标记物；
将样品与固定化的捕获核酸序列探针相接触，其中靶病原体的核酸序列与固定化的捕获核酸序列探针结合；
向系统施加声能，其量能够增加系统内核酸的运动；
将靶病原体被结合的核酸序列与游离的捕获核酸序列探针相接触以与其结合；
导入与化学发光标记物化学反应的触发组分；
测量化学发光信号强度，其中相对于不包含金属表面的系统来说信号增强。
另一方面，本发明涉及用于测量荧光或化学发光信号的系统，所述系统包含：
位于表面基材上的大量金属化粒子；
与金属化粒子相连或靠近金属化粒子的连接剂分子，用于结合或捕获测试样品中的目标分子；
对目标分子具有亲和性的检测剂分子，其中检测剂分子包含荧光或化学发光标记物；
与化学发光标记物进行化学反应以产生化学诱导的电子激发态的触发组分，或激发荧光标记物的电磁源；
声能量源；以及
用于测量表面等离子体激元耦合发射的测量装置。
从后面的公开内容和所附的权利要求书，本发明的其他方面和优点将得到更充分的显现。
附图简述
图1(A)银岛膜(SIF)的吸收光谱随超声时间的变化，同一样品被超声总共30分钟(将500微升去离子水放置在样品顶部)，(B)在1分钟的超声之前(A)和之后(B)SIF的原子力显微镜照片。反射镜板放置在距玻璃表面2cm处。
图2(A)涂在SIF上的FITC-HSA的荧光发射光谱随超声时间的变化，(B)在20分钟的超声之前和之后涂有FITC-HSA的SIF的真彩色(real-color)照片(这些样品使用空气流干燥)。在所有这些实验中，将500微升去离子水放置在样品顶部(白色虚线圆圈)。反射镜板放置在距玻璃表面2cm处。
图3(A)在室温下(RT)或使用超声进行的模型蛋白分析的实验流程图，(B)金属增强荧光现象的草图，以及从SIF和玻璃发出的荧光的真彩色照片，在视觉上证实了MEF的效用，(C)在RT和使用超声下在SIF和玻璃上进行的模型蛋白分析中使用的FITC-亲和素的荧光发射光谱，插图——在使用超声进行模型蛋白分析后SIF的真彩色照片，SIF显得没有被1分钟的超声所破坏，(D)对照实验，其中对应于(B)中显示的在SIF(1)和玻璃(3)进行的模型分析来说，从表面上省略了生物素化的BSA(B-BSA)。
图4(A)使用超声(1分钟)在SIF(上图)和玻璃(下图)上进行的模型蛋白分析中使用的FITC-亲和素的荧光发射光谱，(B)室温下在SIF(上图)和玻璃(下图)上进行的同样的模型蛋白分析。
图5室温下并使用超声(1分钟)在SIF和玻璃上进行的模型蛋白分析中，荧光发射强度(在520nm处)随所使用的FITC-亲和素的浓度的变化。
图6(A)用于在超声(总超声时间：1分钟)之前、期间和之后对SIF和玻璃进行实时温度成像的实验流程，(B)1分钟的超声之前和之后SIF和玻璃的热图像。玻璃载片的位置用实线(白色和黑色)标出。水的平均温度值从玻璃载片中间的白色虚线圆圈所显示的区域测量，(C)超声(1分钟)之前、期间和之后SIF和玻璃上的水的实时温度。超声分别以t＝5和65秒打开和关闭。
图7在SIF上进行的荧光共振能量转移研究。供体(FITC)和受体(罗丹明B)分子与不同的亲和素分子结合，其随后与SIF表面上的生物素化BSA结合。供体与受体分子的摩尔比例为(A)5∶1，(B)1∶5。
图8显示了生物分子向结合基材的移动和混合。
发明详述
本发明涉及用于增加和检测荧光、非荧光化合物的荧光以及从化学发光反应发出的光的系统和方法，所述系统和方法通过使用低强度超声增加系统的动力学，从而增加化学或结合反应以增加检测系统的速度。
自从在1895年首次观察到超声引起的空化效应以来14，已发现超声在化学和物理过程中、尤其是在加速化学反应中的许多应用(即声化学)15。空化效应是指小气泡在液体中的快速形成和内爆，典型地在超声波频率低于1MHz时观察到16。气泡的内爆(对称空化)在液体中产生热点，且气泡内的温度能够达到超过5000K，内爆随后被周围的水分子以1010K/秒的速率淬灭17。当气泡在比气泡大几个数量级的固体表面附近溃灭时，对称空化受到阻碍并发生了不对称的气泡溃灭18。这随后导致形成了与表面垂直的液体微射流，其速度据估计达到100m/s18。液体微射流的形成和溃灭除了它们公知的清洁效应之外，还导致主体中液体的搅动。
本发明涉及基于低强度超声和MEF的组合的新技术，被称为SAMEF。使用低强度超声导致生物分析时间(1分钟)与室温下进行的不使用超声的分析(30分钟)相比显著减少。此外，MEF部分通过增强荧光特征提供了生物分析灵敏度的增加。
本文中使用的“荧光团或荧光分子”是指当物质被某种波长(激发波长)的辐射辐照时发出不同波长(发射波长)的电磁能量例如光的任何物质，并打算涵盖能够与样品中目标分析物特异性相互作用或反应、以提供一种或多种光学信号的化学或生物化学分子或其片段。此外，荧光团包括外来和固有荧光团两者。外来荧光团是指与另一种物质结合的荧光团。固有荧光团是指自身是荧光团的物质。示例性荧光团包括但不限于在本文引为参考的《分子探针目录》(MolecularProbes Catalogue)中列出的那些。
代表性的荧光团包括但不限于Alexa Fluor 350、丹磺酰氯(DNS-Cl)、5-(碘乙酰氨基)荧光素(5-IAF)；荧光素5-异硫氰酸酯(FITC)、四甲基罗丹明5-(和6-)异硫氰酸酯(TRITC)、6-丙烯酰-2-二甲基氨基萘(acrylodan)、7-硝基苯并-2-噁-1，3，-二唑-4-基氯化物(NBD-Cl)、溴化乙锭、萤黄、5-羧基罗丹明6G盐酸盐、丝丽胺罗丹明B磺酰氯、德克萨斯红TM磺酰氯、BODIPYTM、萘胺磺酸包括但不限于1-苯胺萘-8-磺酸(ANS)和6-(对甲苯胺基)萘-2-磺酸(TNS)、蒽基脂肪酸、DPH、十八碳四烯酸、TMA-DPH、芴基脂肪酸、荧光素-磷脂酰乙醇胺、德克萨斯红-磷脂酰乙醇胺、芘基-磷脂酰胆碱、芴基-磷脂酰胆碱、部花青540、1-(3-磺酸根合丙基)-4-[-β-[2[(二-正丁基氨基)-ó萘基]乙烯基]吡啶鎓甜菜碱(Naphtyl Styryl)、3，3′-二丙基硫杂二羰花青(diS-C3-(5))、4-(对-二戊基氨基苯乙烯基)-1-甲基吡啶鎓(di-5-ASP)、Cy-3lodo乙酰胺、Cy-5-N-羟基琥珀酰亚胺、Cy-7-异硫氰酸酯、罗丹明800、IR-125、噻唑橙、天青B、尼罗蓝、铝酞菁、Oxaxine 1、4′，6-二咪基-2-苯基吲哚(DAPI)、Hoechst 33342、TOTO、吖啶橙、乙锭同二聚体、N(乙氧羰基甲基)-6-甲氧基喹啉鎓(MQAE)、Fura-2、钙绿、羧基SNARF-6、BAPTA、香豆素、植物荧光素(phytofluor)、晕苯和金属配体络合物。
代表性的固有荧光团包括但不限于具有芳环结构的有机化合物，包括但不限于NADH、FAD、酪氨酸、色氨酸、嘌呤、嘧啶、脂类、脂肪酸、核酸、核苷酸、核苷、氨基酸、蛋白质、肽类、DNA、RNA、糖类和维生素。其他适合的荧光团包括酶-辅因子、镧系元素、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白或其突变体和衍生物。
还包括新的季氮杂环含硼酸化合物，包括：
其中X是氯、溴或碘基，R选自H、直链或支链C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、芳基、羟基、氰基、磺酰基和NR1R2，其中R1和R2可以彼此相同或不同并且独立地选自H和C1-C4烷基。
术语“生物分子”是指自然界存在的任何分子或这种分子的衍生物。生物分子可以处于活性或无活性形式。“活性形式”是指生物分子处于能够执行生物学功能的形式。“无活性形式”是指在生物分子能够执行生物学功能之前，该生物分子必须通过天然或合成加工。实例性生物分子包括核酸、芳香族碳环结构、NADH、FAD、氨基酸、碳水化合物、甾类、黄素、蛋白质、DNA、RNA、寡核苷酸、肽、核酸、脂肪酸、肌红蛋白、糖族例如葡萄糖等、维生素、辅因子、嘌呤、嘧啶、间型霉素、脂类、植物色素、植物荧光素、脂类、抗体和藻胆蛋白。
本发明的实施方案还可应用于在触发剂或辅因子存在下参与光产生反应的化学发光标记物或部分。在本申请中，出于示例而非限制的目的，将根据化学发光标记物和触发剂对优选实施方案进行讨论。附连到检测剂分子上的标记物将被称为“标记物”或“标记试剂”。出于本文的目的，“触发剂或辅因子”在广义上用于描述除了化学发光标记物之外参与反应并产生可检测响应的任何化学物质。化学发光标记物和触发剂产生光响应。
适合的化学发光标记物的实例包括但不限于过氧化物酶、细菌萤光素酶、萤火虫萤光素酶、功能化铁-卟啉衍生物、鲁米那、异鲁米诺、吖啶酯、磺酰胺等。最新的化学发光标记物包括以次黄嘌呤为底物的黄嘌呤氧化酶。触发剂包含过硼酸盐、Fe-EDTA络合物和发光氨。具体化学发光标记物的选择取决于几种因素，其包括制备被标记成员的成本、共价偶联到检测剂分子上所用的方法、以及检测剂分子和/或化学发光标记物的大小。相应地，化学发光触发剂的选择将取决于所使用的具体化学发光标记物。
对化学发光反应已进行大量深入研究，并在文献中有详尽记录。例如，过氧化物酶非常适合于附着到检测剂分子上用作化学发光剂。因而，在第一个反应中有效诱导发光的触发剂将包括过氧化氢和鲁米诺。其他也能在过氧化物酶存在下用来诱导光响应的触发剂包括异丁醛和氧。
用过氧化物酶标记检测剂分子例如抗体或抗原的程序在本技术领域中是已知的。例如，为了制备过氧化物酶标记的抗体或抗原，将过氧化物酶和抗原或抗体各自分别地与N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(在后文中称为SPDP)反应。然后将SPDP标记的过氧化物酶或SPDP标记的抗原或抗体与二硫苏糖醇反应，以产生硫醇标记的过氧化物酶或硫醇标记的抗原或抗体。然后使硫醇衍生物与SPDP标记的抗原或抗体、或SPDP标记的过氧化物酶偶联。
用于将抗体或抗原附着到固相基材上的技术在本技术领域中也是公知的。例如，可以使用戊二醛将抗体共价偶联到硼硅酸盐玻璃的硅烷衍生物上。
尽管化学发光检测已被成功实施，但这些反应的灵敏度和特异性需要进一步改进以促进早期诊断疾病的流行。此外，不在高灵敏度检测方案上投资，大多数蛋白检测方法、尤其是western印迹法，仍然不是用于低蛋白浓度的准确定量的可靠方法。蛋白检测方法也受到抗原-抗体识别步骤的限制，该步骤一般在动力学上非常缓慢并需要长的温育时间；例如western印迹需要超过4小时的处理时间。因此，为了改进分析检测，小分子分析的快速性和灵敏度两者仍然是有待解决的关键问题。就此而言，使用低强度超声波将增加分析的快速性。
有许多重要分析法能够从增强的信号强度和更快的动力学直接获益。例如，心脏病发作患者、中毒性休克和胰腺炎患者的肌红蛋白浓度。所有这些分析广泛用于医院急诊室，其分析时间超过30分钟。因此，本发明可用于急诊室的医护现场(point-of-care)临床评估。
本发明通过使用任何能够产生声能并将其发送穿过任何运送超声雾化能的介质的装置来实现。超声发射装置可以置于容器内部或位于其附近，以将能量传送到汽化容器中。装置可以包括用于压电换能器的传统电磁刺激的元件(人造或天然存在的)、纯机械装置(例如高频气笛或麦克风)和激光装置。用于声能系统的各种元件可以从大量制造商处商购，其可以根据具体应用和频率范围进行配置。(参见《Thomas美国制造商目录》(Thomas Directory of AmericanManufacturers)、《光学元件购买者指南》(Photonics Buyer′s Guide)1996、《微波和RF》(Microwave and RF)以及《电子工程师名人目录》(Electronic Engineer′s Master Catalogue))。
可以使用任何能够产生具有预定特征例如频率、模式、脉冲持续时间、形状和重复率的信号的振荡器或信号发生器，来产生适用于本发明系统的声频。各种振荡器或信号发生器可以从许许多多的制造商处购买并有针对具体应用和频率进行配置的各种设计。适用的换能器包括产生一定范围频率内(宽频)或一种特定频率(窄频)的声波的类型，所述声波频率在赫兹到千兆赫兹范围内。
声波投送系统可以随着应用而变。例如，可以通过将源材料与换能器直接接触，或通过与声波传送过另一种介质、另一种介质本身与源材料直接接触的偶联，使声能波传送到液体或固体源材料中。如果源材料是液体，换能器可以放置在液体源材料中，或者汽化容器的壁可以由担当换能器的材料制成，从而使液体源材料与换能器直接接触。此外，声能发射装置可以位于传送适合能量的系统容器的外部。如果源材料是固体，换能器可以放置成与其直接接触，或固体源材料可以放置在用作偶联剂的气体或液体中。
在优选的声频中，可以利用任何产生声能的系统。优选情，超声波发生器的输出频率足以提供系统容器内的移动流，将分子移向结合源或反应位点而不引起系统中热量的大量增加。例如，在10至200kHz、更优选约20至60kHz、最优选约40kHz频率下，使用0.5至50W的功率输出。
为了获得声能从一种介质向另一种介质的最大转移，每种介质的特征性声阻抗优选尽可能彼此近似相等。匹配介质夹在另外两种介质之间，而且应该具有相对于所传送声音的波长来说适合的厚度，并且其声阻抗R应该近似等于(Ri R2)。在本发明中可以利用可商购的任何阻抗匹配装置。
系统可以包括超声容器，其中容器的至少一部分包括换能器例如压电换能器以产生声振动。这样的换能器可以位于容器的底部或在其上可以放置容器的板中。此外，这样的换能器可以放置在容器壁的不同水平处，以增强容器内的流体流动。
本发明的分析系统还可以包含光或激光源，用于将能量束导向任何包含的荧光团上以提供激发能。激光束可以位于用于将光束导向分子组分的系统附近。激光器可以是能够将能量束聚焦于用于激发的固体或液体源材料上的特定点处的任何装置，并且激光器可以发射RF、红外、微波到UV能量。
可以使用本技术领域的专业人员已知的任何发射光的源，例如激光器，其中的光以其广义意义使用，是指通过空间传播的电磁辐射，并且不仅包括可见光，还包括红外、紫外辐射和/或声能。因此，可使用放置在分析表面上方的单一仪器来产生声能和激发荧光发射分子或化学发光反应的能量。在需要时，光波或声波可以从纤维连续或间歇地发射，以增加分析系统内化学反应的速度。
本发明使用椭圆形、球形、三角形或杆状形式的金属化岛提供增强的发射。在示例情形下，椭圆形岛具有3/2的纵横比，球形胶体具有20-60nm的直径。但是，本发明不限于任何具体的几何形状。使用已知的涂布技术，可以精确地控制相隔近至50nm的金属岛的放置。在连续金属膜的情形下，可以在距金属表面最多500nm远的分析物溶液中检测到荧光团发射。在金属涂层由岛形成的情形下，可以在距金属表面最多200nm远的溶液中检测到增强的荧光团发射。
在一个实施方案中，本发明提供了金属材料和能够发射荧光的生物分子，其中所述金属材料和生物分子被至少一个膜分隔层隔开。可以对所述膜的厚度进行选择，从而通过生物分子与金属材料的距离增加生物分子的荧光。膜分隔层可以是一层或多层聚合物膜、由脂肪酸形成的层或由氧化物形成的层。在优选实施方案中，膜分隔层和金属材料是化学惰性的，并且不与待检测的生物分子或与待检测化合物结合例如共价结合的中间体结合。由脂肪酸形成的层可以通过Langmuir-Blodgett技术形成。膜分隔层可以是旋涂的聚合物膜。氧化物层可以从沉积技术例如气相沉积形成。
此外，金属材料可以是多孔三维基质的形式。三维基质可以是纳米孔三维基质。金属材料可以包括金属胶体粒子和/或金属-二氧化硅复合材料粒子。金属材料可以包含聚合物基质中聚团的金属粒子和/或二元连接的粒子或金属粒子。三维基质可以由可控孔度玻璃或使用由银-二氧化硅复合材料自身的聚集而装配的基质来形成。基质可以是金属纳米孔基质，物质将通过其流动并被更有效地检测和计数。
辐射衰变速率的增加
已知附近的金属能够增加荧光团的固有衰变速率，也就是说改变荧光团发射光子的速率。在荧光中，光谱可观察量由相对于非辐射衰变速率knr例如内部转化和淬灭的总和的辐射速率λ的量值所控制。
具有高辐射速率的荧光团具有高量子产率和短的寿命。增加量子产率需要降低非辐射速率kn，这往往只有在使用低溶液温度或束缚在更刚性环境中的荧光团时才能实现。荧光团的天然寿命τn是辐射衰变速率的倒数或在其量子产率一致时观察到的寿命。该值由电子跃迁的振荡强度(消光系数)决定。因此，对于目前在荧光光谱术中使用的几乎所有实例来说，辐射衰变速率是基本上恒定的。辐射速率的改变和控制也已被称为辐射衰变工程(RDE)或“避雷针”荧光增强效应。例如，最近已观察到金属粒子上方增强的固有DNA荧光，由于DNA小于10-4的非常低的量子产率，这种现象典型是不容易观察到的。其次有利的“避雷针”效应也通过局部增强的激发而增加荧光强度。在这种情况下，不论其量子产率如何，荧光团的发射可以被显著增强。
金属附近的荧光团寿命的减少是由于荧光团与金属粒子之间的相互作用，其增加了辐射衰变速率(量子产率增加)或取决于距离d3而引起淬灭。应该注意的是，具有高量子产率(0.5)的荧光团与具有低量子产率(0.1和0.01)的荧光团相比，寿命明显降低得更多。较短的激发态寿命也使得光化学反应较少，这随后导致荧光团的光稳定性增加。值得注意的是，使用低量子产率的荧光团将导致大得多的荧光增强(即1/Qo)，并可以显著降低来自含银分析远处的荧光团的不想要的背景发射。
在许多荧光应用中，荧光团的光稳定性是首要的关注点。在单分子光谱术中尤为如此。较短的寿命也使得光子流量较大。每秒钟由荧光团发射的光子的最大数量，大体上受到其激发态寿命的限制。例如10ns的寿命能够获得每个分子每秒钟约108个光子的产率，但是在实际中只容易观测到103个光子。观测到的光子数量少典型是由于光破坏和各向同性发射两者。如果金属表面减少寿命，人们通过适当增加入射强度能够获得每分子每秒钟更多的光子。
另一方面，金属增强荧光提供了增强的强度而同时缩短寿命。也就是说，可能可以降低激发强度而仍能看到发射强度和光稳定性的显著增加。
增加辐射衰变速率的能力表明，任何发色团、即使是非荧光物质例如胆红素、富勒烯、金属-配体络合物或卟啉，当适当放置到接近金属表面时，都能显示出有用的高量子产率。金属表面-荧光团相互作用的效应高度依赖于金属表面与物质之间的距离以及金属表面的性质。
根据待检测荧光团的类型和金属的类型，可以在不同距离处观察到发射增强。例如，当荧光团距金属表面约4nm至约200nm时可以观察到发射增强。优选的距离是距金属表面约5nm至约50nm，更优选为10nm至约30nm。在这种尺度上，为新的传感、操作和控制水平提供机会的现象很少。此外，在该尺度处，装置可以产生显著增加的性能、灵敏度和可靠性，以及显著降低的尺寸、重量和由此所致的成本。
对于镜子、亚波长或半透明金属表面、银岛膜或金属胶体来说，预计有不同的表面增强荧光效应。与连续金属表面相比，岛状物和胶体典型地观察到更显著的效应。银岛具有引人注目的效应，强度增加5倍同时寿命减少100倍。这样的效应只能用辐射衰变速率的增加来解释。
荧光或化学发光信号可以使用装置、包括但不限于具有光源和检测器的荧光分光光度计来检测。光源可以包括弧灯和激光器。检测器可以包括光电倍增管。此外，装置具有单色器是有利的，以便可以使用特定波长的光来激发分子或检测特定波长下的发射。当含有荧光团的样品放置在荧光分光光度计中并暴露于一定量的激发辐射时，荧光团发射辐射，辐射被光电倍增管检测。当金属粒子与生物分子之间的距离为约4nm至约200nm时，生物分子的荧光强度可以响应激发辐射的量而增加。优选的距离为约5nm至约50nm，更优选为10nm至约30nm。供选地，当生物分子与金属粒子之间的距离小于时，由于淬灭，生物分子的荧光强度可以降低。
本发明提供了用于增加荧光标记的生物分子的荧光强度的方法，所述方法包括下列步骤：用荧光团标记生物分子，将标记的生物分子定位在距金属粒子一定距离处以便响应激发辐射的量，荧光团发射辐射。
在MEF的应用中，发现紧邻(＜10nm)金属纳米结构的荧光团的荧光信号增强(量子产率-Qm)可以用下列方程很好地描述：
Qm＝(r+rm)/(r+rm+km)           (1)
其中F是未改变的辐射衰变速率，Fm是金属改变的辐射衰变速率，km是非辐射速率。类似地，荧光团的金属改变的寿命τm随着辐射衰变速率的增加而减小：
τm＝1/(T+rm+km)                (2)
这些方程产生了对荧光团-金属组合的最不寻常的预测，并且正是这些预测和观察导致现在发现了基于荧光的纳米技术的深远意义和应用。由于荧光现今已成为生物技术中的主流工具，因此金属增强的和等离子体激元耦合的荧光为改变观察荧光的方式提供了希望。从方程1和2可以看出，当Fm的值增加时，量子产率Qm增加，而寿命τm减少。这与在荧光中的大多数观察相反，在那些观察中自由空间量子产率Qo和寿命τo通常如下面公知的方程所述协调变化：
Qo＝r/(r+km)             (3)
τo＝l/(T+km)            (4)
此外，在当前的免疫分析中选择荧光团的一个主要标准是高量子产率。这能够引起来自未标记荧光团的高背景或来自非特异性分析吸附的高荧光背景。然而，由于低量子产率的荧光团更加有利，因此金属增强荧光在这方面非常适合，在银纳米结构存在下的荧光增强倍率由1/Qo给出，其中Qo是不存在金属情况下的自由空间量子产率。随后，MEF在应用于免疫分析时产生超亮分析，与不利用MEF现象的同样分析相比，具有高得多的信噪比。
金属岛的制备
在干净烧杯中，通过使用各种还原剂还原金属离子来制备岛粒子。例如，向快速搅拌过的硝酸银溶液加入氢氧化钠，形成棕色沉淀。加入氢氧化铵以重新溶解沉淀。将溶液冷却并向烧杯加入干燥的石英载片，然后加入葡萄糖。在搅拌2分钟后，将混合物加温到30℃。10-15分钟后，混合物转为黄绿色并变浑浊。银粒子薄膜形成在载片上，可以从它们的棕绿颜色看出。载片在使用前用纯水漂洗。
也可以使用其他制备金属粒子的程序。主要使用银是由于对来自银的较长表面等离子体激元吸收的颜色熟悉。
银胶体的制备
通过柠檬酸盐还原金属，可以将胶体制备成悬液。优选的金属是银和金。同样地，可以使用金是因为金在较短波长处的吸收。但是，金胶体可以与较长波长的红色和NIR荧光团一起使用。
胶体的尺寸及其同质性可以通过对可用的金属粒子的光学性质的广泛报道以及界面化学对胶体光学性质的影响来确定。
银岛膜可以通过银盐在石英表面上的化学还原来形成，其制造相对简单。但是，这种方法不能提供对粒度或荧光团距表面的距离的控制。已经实现了1000倍的增强，样品的几何形状是非均质的，并且增强倍率是在空间平均过的。
可以通过在玻璃或聚合物基材上放置功能性化学基团例如氰基(CN)、胺基(NH2)或巯基(SH)，将金属粒子结合到表面上。已知金属胶体自发地以高亲和性结合到这样的表面上。
生物分子或金属粒子在所需距离处的定位，可以通过使用膜来实现。膜可以是聚合物膜、Langmuir-Blodgett膜或氧化物膜。
Langmuir-B lodgett膜
金属-荧光团的距离可以通过使用具有脂肪酸间隔物的Langmuir-Blodgett膜来达到。脂肪酸可以来自于天然来源、包括浓缩的馏出物或馏分，或来自合成的烷基羧酸。脂肪酸的实例包括但不限于辛酸(C8)、癸酸(C10)、月桂酸(C12)、肉豆蔻酸(Cn)、棕榈酸(C16)、硬脂酸(C18)、油酸(C18)、亚油酸(C18)、亚麻酸(C18)、蓖麻油酸(C18)、花生酸(C20)、鳕油酸(gadolic acid)(C20)、山萮酸(C22)和芥酸(C22)。作为说明给出了具有偶数碳链长度的脂肪酸，尽管奇数脂肪酸也可以使用。
金属-荧光团的距离可以通过使用聚合物膜来达到。聚合物的实例包括但不限于聚乙烯醇(PVA)。吸光度测量和椭圆光度法可用于确定聚合物膜的厚度。一种类型的聚合物膜是旋涂聚合物膜。旋涂聚合物隔离膜技术使膜容易地涂布在具有＞0.1wm的不同厚度的各种表面上。涂布可以在旋涂机上进行，其通过改变聚合物浓度(黏度)和旋转速度可以产生均匀的表面厚度。例如，P6700型旋涂机(SpecialtyCoating Systems Inc.)通过改变聚合物浓度(黏度)和旋转速度可以产生均匀的表面厚度。
在一个实施方案中，检测的进行不需分子结合到传感器或支持物上。待检测分子不被化学结合。待检测分子可以保留在溶液中，并且不直接或间接地与金属粒子、涂层或膜分隔层相互作用。
金属胶体(或各种其他非球形形状/粒子)也可以共价或非共价掺入到有机聚合物中，以形成聚合物基质，其中距扩散物质的距离造成辐射衰变速率的增加并因而增加量子产率。这样的聚合物基质对于低浓度物质的传感/流动传感应用来说是理想的。
含有金属粒子的聚合物可以具有其他应用，包括但不限于非荧光物质的尺寸包含/排阻传感、增加包埋荧光团的光稳定性、单孔单分子检测，以及允许分析物或抗体扩散、在分析物或抗体或相应的转导元件中引起可检测和可定量的信号变化的多孔聚合物。
本发明的该实施方案在临床医学、环境监测应用、国家安全例如快速检测低浓度物质、工业过程、制药工业例如监测物质、以及用于稀薄气氛例如生物危害清洁室和空间光中的传感器中，也具有大量应用。
实验部分
材料：荧光素异硫氰酸酯标记的人血清白蛋白(FITC-HSA)、生物素酰胺己酰标记的牛血清白蛋白(生物素化BSA)、FITC标记的亲和素、罗丹明B标记的亲和素以及silane-prepTM玻璃显微镜载片购自Sigma-Aldrich化学品公司(Milwaukee，WI，USA)。
方法：银岛膜(SIF)。SIF按照以前发表的程序11制备。
使用吸收光谱法对超声之前和之后的SIF进行表征。使用VarianCary 50Bio UV-vis分光光度计，测量了在最长30分钟(累积时间)的超声(可商购超声浴(Branson Ultrasonic Bath，型号B200，在40kHz下输入和输出功率分别为25和19W；辐射表面积≈23cm2))之前和之后SIF的吸收光谱(在超声之前将500μl去离子水放置在SIF上)。SIF和玻璃载片直接放置在没有水的超声浴的底部。
荧光光谱法。将10μM FITC-HSA水溶液在SIF上温育30分钟，然后清洗以除去未结合的材料。使用Cary Eclipse荧光计，测量了在最长20分钟(累积时间)的超声之前和之后沉积在SIF上的FITC-HSA的荧光发射光谱(在超声之前将500μl去离子水放置在SIF上)。
原子力显微镜(AFM)测量，使用Molecular Imaging Picoplus，在敲击模式(tapping mode)下以1Hz扫描速率以及512x512像素分辨率，获取了在1分钟超声之前和之后SIF的AFM图像。
基于SAMEF的模型生物分析。模型生物分析是基于生物素与亲和素分子之间发生的生物识别事件。在基于SAMEF的分析中，通过将10wM生物素化BSA水溶液在SIF上温育30分钟，将生物素基团导入SIF和玻璃表面。众所周知，白蛋白已知与银表面结合并事实上形成单层19，20。通过用去离子水多次清洗来除去未结合的材料。将涂有生物素化BSA的SIF和玻璃表面放置在超声浴内部(不含任何液体)。通过与生物素的结合配偶体——FITC标记的亲和素的水溶液500μl在连续超声下温育1分钟(关上超声浴的盖子)，来执行基于SAMEF的分析。在超声关闭后，通过用去离子水多次清洗除去未结合的材料。使用Cary Eclipse荧光计测量SIF和玻璃表面上FITC-亲和素的荧光光谱。在室温下不使用超声进行同样分析的对照实验也进行了30分钟，以验证基于SAMEF的分析的终点结果。还按照上述执行了其他对照实验，其中从表面上省略了一种结合配偶体(生物素)。
荧光共振能量转移(FRET)研究。为了研究超声是否在基于SAMEF的分析中使蛋白质变性，进行了FRET研究。就此而言，在如前面章节所述导入生物素基团后，将用供体荧光团(FITC)和受体荧光团(罗丹明B)标记的两种不同亲和素分子，在SIF表面上在室温下温育30分钟，并且在另外的实验中在连续超声下温育1分钟。在两个分开的实验中，供体与受体的摩尔比率被调整到5∶1和1∶5。对来自这两个不同表面和两个实验的荧光光谱定性比较供体和受体分子之间的FRET程度。
超声过程中SIF和玻璃表面的实时热成像。使用可商购的热成像相机(Silver 420M；Electrophysics Corp，Fairfield，NJ，装备有近摄镜头，其提供约300wm的分辨率)测量SIF和玻璃表面上温度变化的实时监测。就此而言，将500μl去离子水放置在置于超声浴内部的SIF和玻璃表面上。两个表面(在分开的实验中)上水的温度被测量2分钟，包括1分钟的超声时间。
结果和讨论
对于准备在MEF应用中使用的低强度超声来说，研究超声对SIF物理性质的影响是恰当的。为此，使用了光吸收光谱法、原子力显微术和荧光光谱技术。图1A显示了总时间为30分钟的超声之前和之后SIF的吸收光谱。尽管没有观察到表面等离子体激元共振(SPR)波长对于银纳米结构的迁移(～420nm)，但较长波长(＞550nm)处吸收光谱的略微变宽是明显的。这意味着在超声1分钟后，从玻璃表面失去的银纳粒可以忽略，并且没有发生纳粒形状的变化。为了验证吸收光谱研究的结果，在1分钟的超声之前和之后获取了SIF的AFM图像，参见图1B和1C。AFM图像显示SIF保持其形状和高度。AFM图像还显示，在超声处理后纳粒的数量减少(图1C)。由于SIF的异质性质以及在超声之前用AFM对SIF上同样位置进行成像的困难性，这些结果对于1分钟的超声导致纳粒从玻璃表面丢失的方面，被视为是非结论性的。
因为基于SAMEF的生物分析涉及SIF上生物材料的相互作用以及随后从表面发射的荧光的检测，因此研究超声对SIF和MEF现象的影响也是重要的。图2A显示了涂布在SIF上的FITC-HSA的荧光发射谱随超声时间的变化。来自FITC的荧光发射在1分钟超声后显示出～15％的降低，其在3分钟后增加到～40％。在仅仅4分钟超声后，没有观察到可检测的荧光发射，这意味着FITC-HSA从表面被移除。这可能是由于作为超声的结果，FITC-HSA分子被单独移除或FITC-HSA分子与银纳粒一起被移除。FITC-HSA/SIF移除的视觉证据由涂有FITC-HSA的SIF在20分钟的超声之前和之后的真彩色照片——图2B所提供，其显示了SIF从表面的明显移除。根据上述观察得出结论，能够同时维持基于SAMEF的生物分析的所有组分的功能的最长超声时间，约为30秒到90秒，更优选为约60秒。
图3概述了建立在生物素与亲和素的相互作用上的基于SAMEF的生物分析——一种模型分析的实验设计和概念证明。为此，将生物素化BSA附着于SIF和玻璃表面，参见图3A。然后，将荧光团(FITC)标记的亲和素在这些表面上超声温育1分钟，或不超声在室温下温育30分钟。从SIF和玻璃两者上测量FITC-亲和素的荧光发射，以显示MEF的益处。因为SAMEF技术也是基于MEF现象，因此简要讨论一下MEF是重要的。在MEF中(图3B)，典型地观察到来自荧光团/SIF“系统”与玻璃表面相比荧光发射的增加。这归因于荧光团与表面等离子体激元之间的部分能量转移(与表面等离子体激元耦合)以及纳粒附近电场增加所引起的荧光团光吸收的增加21。图3C显示了超声1分钟和不超声在室温下30分钟(对照分析)的情况下，在SIF和玻璃表面上进行的模型分析的荧光发射。来自对照分析的520nm处的发射强度被用作使用超声进行的分析的靶发射强度，以验证使用超声的分析达到的终点确实与室温下进行的分析相同。图3C显示，在SIF和玻璃表面两者上进行的模型分析与室温分析相比，在1分钟内达到＞95％的完成。该模型分析在520nm处的发射强度在SIF上是在玻璃上大≈6倍，证明了在表面分析中使用银纳粒的益处。为了确定使用超声进行的分析中FITC-亲和素与表面的非特异性结合的程度，进行了其他对照实验，其中从表面上省略了生物素化BSA，参见图3D。发现非特异性结合是在SIF和玻璃两者上进行的分析的三分之一。重要的是注意到在本研究中，没有使用其他表面化学来减少非特异性结合，也就是说在表面上只存在生物结合配偶体。人们可以通过用对抗蛋白质非特异性结合的聚乙二醇改性的烷基硫醇的自组装单层来阻断银纳粒的表面，来减少非特异性结合22。
接下来，确定了使用基于SAMEF技术的FITC-亲和素浓度的动态范围，并将结果与不使用超声进行的模型分析进行比较，如图4和5中所示。图4A到D分别显示了对于使用超声和不使用超声进行的分析来说，随着浓度的增加来自FITC-亲和素的荧光发射增加。图5显示出在SIF和玻璃表面两者上使用和不使用超声进行的分析，其在520nm处的发射强度的终点值是一致的，证明了超声在MEF分析中的成功使用。图5还显示了当考虑到在不存在生物素化BSA的情况下使用最大浓度的FITC-亲和素进行对照实验时，在SIF和玻璃表面二者上使用超声进行的分析的检测下限＞0.2μM。与玻璃相比，使用银纳粒在FITC-亲和素的浓度动态范围内增加强度的益处，也可以从图5中明显看出。
在图1-3中显示的数据的收集过程中，观察到了SIF和玻璃表面的温度增加。为了确定水温增加的程度，使用热相机记录了SIF和玻璃表面上分析的温度的实时成像。图6A显示了实时温度测量的实验性几何结构。为了一致性起见，实验性几何结构与分析的几何结构保持一致。在该实验性几何结构中，将SIF和玻璃基材放置在超声浴的底部(在分开的实验中)，其中水和SIF/玻璃表面的热图像被捕集2分钟，包括1分钟的超声。图6B显示了1分钟超声之前和之后SIF和玻璃表面的热图像。在SIF和玻璃表面二者上，置于这些表面上的水的平均温度显示出≈2℃的增加，而没有用水覆盖的SIF和玻璃表面(干燥的，没有在这些区域上建立分析)的温度增加了高达≈13℃。由于热传导，这造成了水温的进一步增加，即使在超声被关闭后(进一步≈3℃)，如图6C中所示。重要的是注意到，在1分钟后超声被关闭后，停止分析(图3和4)并将未结合的材料立即洗掉。
据认为，超声与温度升高的组合能够导致分析表面上的蛋白质变性和/或构象变化，并对基于MEF的分析的灵敏度造成不利影响。因为MEF是距离依赖性现象，由超声和温度升高引起的蛋白质的任何构象变化，能够产生与使用常规方法进行的分析不可比的结果，因此可以认为基于SAMEF的分析不可用。为此，使用了一种在蛋白质构象变化的研究中广泛应用的技术——FRET，来调查超声和温度升高对分析组分的影响。在FRET实验中，将与不同亲和素分子结合的供体(FITC)和受体(罗丹明B)分子，在涂有生物素化BSA的表面上使用超声(1分钟)和不使用超声(在室温下进行30分钟的对照试验)进行温育，如图7A中所示。图7B显示了对于两种不同的供体与受体摩尔比率(5∶1和1∶5)来说，这些FRET实验的结果。对于5∶1的比率来说，发射光谱以FITC发射为主(主要是因为它过量)，并且对于使用和不使用超声运行的两种分析来说，发射光谱是一致的，表明生物素化BSA和亲和素没有经历构象变化，并且这些分析在使用和不使用超声时分别在1和30分钟内达到同样的终点。当供体与受体的分子比率为1∶5时也观察到了对于这一点的进一步证据，如图1C所示。发射不再以供体发射为主，而是对受体观察到了显著的FRET。这些结果也意味着蛋白对超声的吸收不影响它们结合其他蛋白的能力。
因为基于SAMEF的分析方法是基于低强度超声、MEF和表面的组合使用，因此对使用超声时观察到的更快的分析时间的可能解释进行讨论是重要的。超声(40kHz)被用于通过空化效应从表面、通常是在水中(在表面活性剂的帮助下)移除物质。空化通过将超声波导入液体中而产生，是指液体中小气泡的快速形成和内爆15。气泡的内爆在液体中产生热点，并且气泡内的温度能够达到超过5000K，内爆随后被周围的水分子以1010K/秒的速率淬灭15。在40kHz下，超声波远离表面(几微米)形成，并且随着超声波频率增加，该距离减小，这意味着超声波不与平面表面上纳米尺度的粒子相互作用。当空化发生在靠近固体表面(像本研究中的玻璃载片)的液体中时，气泡内爆导致液体射流，其以高速朝向固体表面移动18。液体的这种移动能够引起本体溶液中的蛋白向表面转移，其减少了溶液本体中的蛋白量。此外，超声波在分析介质的本体中形成驻波15，这提供了移动蛋白的手段，有效混合了本体溶液中的分析组分。随后，据认为蛋白在超声期间(1分钟)持续向表面移动，而更长的超声时间引起分析组分从表面的移除。因此，使用低强度超声时观察到的较快分析时间归因于超声与分析组分相互作用产生的蛋白质量传递的增加。
讨论
报道了一种被称为超声辅助金属增强荧光的新的生物分析技术，该技术是基于组合使用超声波和银纳粒以分别加速生物分析动力学和增强荧光特征。为此，在SIF上建立起基于生物素和荧光团标记的亲和素的相互作用的模型生物分析，并随后使用30至50kHz、优选为40kHz的超声，在约30至90秒、优选为60秒中完成了所述生物分析。测量到来自超声处理的分析的荧光发射终点值与不使用超声在室温下进行的分析所测量到的值相似，这证实了新技术的准确性。使用光吸收光谱法、原子力显微镜和荧光光谱技术详细研究了超声对分析组分的影响。光吸收研究显示，对SIF连续超声约60秒不会从表面移除银纳粒。此外，观察到了在约60秒的超声后在SIF上吸收的荧光团标记的蛋白的荧光发射轻微降低。AFM的结果显示银纳粒的尺寸和形状没有经历任何变化，但是由于使用AFM对超声前SIF上的相同位置进行成像的困难性，这些结果被视为非结论性的。分析的热图像显示，在约60秒的超声后分析组分的温度增加～2℃。使用FRET实验研究了超声对蛋白质变性或构象变化的影响，其显示约60秒的超声(以及随后温度的升高)不引起蛋白质构象变化。
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Claims (10)

1.一种减少用于检测靶分子的金属增强荧光分析的检测时间的方法，所述方法包含：
向分析系统中使用的基材表面施加大量金属粒子，其中金属粒子是纳米结构、岛状物或胶体；
将捕获分子与金属粒子连接，其中捕获分子对靶分子具有结合亲和性；
导入怀疑包含靶分子的溶液；
向分析系统施加声能，施加声能的时间足以增加分子向金属粒子的运动，从而与捕获分子结合，其中施加声能30秒至90秒，并且投送的声能在20kHz至60kHz范围内；
导入对靶分子具有亲和性的荧光检测剂分子，其中荧光检测剂分子能够在施加声能之前、期间或之后加入，并且其中荧光检测剂分子定位于距金属粒子5nm至50nm；
以激发荧光分子的频率施加电磁能；以及
测量荧光信号。
2.权利要求1的方法，其中表面基材是玻璃、石英或聚合材料。
3.权利要求1的方法，其中金属粒子包含银、金、铜、锌、镍、铁、铝、钯或铂。
4.权利要求1的方法，其中金属粒子具有带有至少一个顶点的形状，其中所述形状是三角形、正方形、长方形、梯形、多边形、椭圆形、长椭圆形或其组合。
5.权利要求1的方法，其中荧光检测剂分子包含生物分子，并且其中所述生物分子对靶分子具有亲和性。
6.权利要求5的方法，其中捕获分子、靶分子和荧光检测剂分子包含DNA序列。
7.权利要求1的方法，其中辐照可以在施加声能之前、期间或之后进行。
8.用于检测样品中的靶病原体的方法，所述方法包含：
提供系统，所述系统包含：
位于表面基材上的固定化金属材料，其中金属材料是纳米结构、岛状物或胶体，其中固定化金属材料上附着有与靶病原体的已知DNA序列互补的固定化的捕获DNA序列探针；以及
与靶病原体的已知DNA序列互补的游离的捕获DNA序列探针，其中游离的捕获DNA序列探针上附着有荧光团；
将样品与固定化的捕获DNA序列探针相接触，其中靶病原体的DNA序列与固定化的捕获DNA序列探针结合；
将靶病原体与固定化的捕获DNA序列探针结合的DNA序列与游离的捕获DNA序列探针相接触，其中游离的捕获DNA序列探针与靶病原体的DNA序列的结合导致荧光团定位到距固定化金属材料5nm至50nm，以增强荧光发射；
向系统施加超声能量，施加超声能量的量足以增加靶病原体的任何DNA向固定化探针的移动，以增强游离的捕获DNA序列探针与靶病原体的DNA序列的结合，从而引起反应速度的增加，其中施加超声能量30秒至90秒，并且投送的超声能量在20kHz至60kHz范围内；以及
使用UV到IR范围内的电磁能量辐照系统，以增加定位在距金属材料预定距离处的荧光团的荧光发射。
9.权利要求8的方法，其中金属材料包含银、金、铜、锌、镍、铁、铝、钯或铂。
10.一种用于测量荧光信号的系统，所述系统包含：
位于表面基材上的大量金属化粒子；
与金属化粒子相连的连接剂分子，用于结合或捕获测试样品中的目标分子；
对测试样品中的目标分子具有亲和性的检测剂分子，其中检测剂分子包含荧光标记物；
用于诱导荧光标记物进入电子激发态的电磁能量源；
声能量源，其中施加超声能量30秒至90秒，并且投送的超声能量在20kHz至60kHz范围内；以及
当荧光标记物定位于距金属粒子5nm至50nm时，用于测量来自所述荧光标记物的荧光发射的检测装置。
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