JP2011513749A - 電位開口型金属増強蛍光、化学発光若しくは生物発光の方法及びシステム - Google Patents

Abstract

【課題】
現在、金属−蛍光体相互作用並びに生物学及び臨床診断におけるそれらの適用に関する研究が熱心に行われているので、金属増強蛍光を（要求に応じて）オン又はオフすることができ、ラボオンチップや光子検出器などの技術に有用である金属増強蛍光の他の適用可能な使用を見出すことは有利であろう。
【解決手段】
本発明では、表面プラズモンが蛍光シグネチャーを増幅する能力に対する電流の影響について初めて実証する。電気抵抗が低い銀の島状膜（ＳｉＦ）に直流を印加すると、近接する蛍光体の蛍光増強が摂動される。所与の印加電流では、「かろうじて連続的な」低抵抗膜での表面プラズモンは、蛍光体双極子カップリングに疎らにしか利用できず、したがって、増強蛍光は、印加電流に応じてゲート制御される。
【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
[001] 本出願は、２００８年３月３日出願の米国仮特許出願第６１／０３３，２３１号の優先権を主張し、その内容をあらゆる目的で参照により本明細書に組み込む。

[002] 本発明は、一般に、金属増強蛍光（ＭＥＦ）、より特定すれば、電気抵抗が低い金属性相互連結粒子に直流を通過させて、発光を「オン及びオフ」することによってＭＥＦ発光を操作する能力に関する。

[003] 長年、プラズモン共鳴粒子近傍の蛍光体の効果が、金属増強蛍光（ＭＥＦ）^１〜３現象の基本的な理解の発展と、第２に、蛍光体の増強された光物理的性質の生物学的用途への適用と、の両方の観点から報告されている。^４これらの報告のすべてで、図４上に示すように、表面プラズモンは蛍光体双極子のすぐ近くの近接場で誘起され、次いで、表面プラズモンは結合量子を放出し、その結果、蛍光が増幅される。結合蛍光は、放射寿命が著しくより短いということを除いて、金属がない状態で観察される自由空間蛍光に大部分で非常に似ており、これは、プラズモン減衰^１〜３及び結合発光の角度依存発光によって実証されると考えられている。^５

[004] 現在、金属−蛍光体相互作用並びに生物学及び臨床診断におけるそれらの適用に関する研究が熱心に行われているので、ＭＥＦを（要求に応じて）オン又はオフすることができ、ラボオンチップや光子検出器などの技術に有用であるＭＥＦの他の適用可能な使用を見出すことは有利であろう。

[005] 本発明は、電気抵抗が低い金属性の「かろうじて連続的な」膜に直流を導入及び通過させて、発光を「オン及びオフ」することによってＭＥＦ発光を操作する能力に関する。

[006] 一態様では、本発明は、金属増強蛍光システムからの発光を操作する方法であって、
ａ）基板上に導電性金属面を設けるステップであって、導電性金属面が、基板上にかろうじて連続的な膜を有し、基板がガラス、石英、銅、又はポリマー材料を含むステップと；
ｂ）この導電性金属面の近くに分子を配置するステップであって、分子が、検出可能な電磁エネルギーを放出することができ、その分子が、放出される検出可能な電磁エネルギーの強度を増強するような導電性金属面からの距離に配置されるステップと；
ｃ）分子を励起し、かつ検出可能な電磁エネルギー放出を引き起こすのに充分な波長における電磁エネルギーを加えるステップと；
ｄ）この導電性金属面を、バッテリー、ソーラーパネル、水素燃料電池、又は風源などの電圧源と、作動可能スイッチと、に接続させるステップであって、スイッチを開けると、導電性金属面を通して直流を伝送させることが可能になり、それによって、検出可能な電磁エネルギー放出が減少又は停止され、スイッチを閉めると、検出可能な電磁エネルギーが放出されるステップとを含む方法に関する。

[007] 上述の方法は、マイクロ波促進金属増強蛍光（ＭＡＭＥＦ）、マイクロ波誘発金属増強化学発光（ＭＴ ＭＥＣ）、又はマイクロ波促進表面増強ラマン散乱（ＭＡＳＥＲＳ）を含むがそれらだけに限らない複合的な蛍光検出システムにおいて使用することができる。上述の方法は、マイクロ波促進金属増強蛍光（ＭＡＭＥＦ）及びマイクロ波促進表面増強ラマン散乱（ＭＡＳＥＲＳ）を含むがそれらだけに限らない複合的な蛍光検出システムにおいて使用することができる。さらに、このシステムは、イムノアッセイ、ハイブリダイゼーションアッセイ、共鳴エネルギー移動アッセイ、偏光／異方性に基づくアッセイ、生物発光に基づくアッセイ、化学発光に基づくアッセイ、発光に基づくアッセイ、又は酵素結合イムノソルベントアッセイを含むが、それらだけに限らない多くの様々なアッセイにおいて使用することができる。

[008] 一実施形態では、分子は、ＵＶ又はＩＲからの範囲の放射線と接したとき蛍光を発する能力を有する蛍光成分を含む。好ましくは、この蛍光成分は、アッセイシステムにおけるいずれの化学反応も妨害しない分子である。

[009] 好ましくは、導電性金属面は、連続的な導電面及び非連続的な面とは異なる「かろうじて連続的な」面の形をとるが、これは、ここの「かろうじて連続的な」面が、金属材料又は粒子の連結するウェブであり、このウェブが、それだけに限らないが、ナノ構造体、島、多孔性の金属マトリックス、コロイド、又は厚さが約１２〜１７ｎｍの薄い金属膜を含み、亀裂の入った膜に粒子の性質を与えるようにアニールされたものであるということを踏まえたものである。金属材料としては、銀、金、白金、アルミニウム、ロジウム、及び銅をはじめとする任意の形の導電性金属を挙げることができ、より好ましくは、金属材料は、銀又は銅である。

[0010] 検出可能な電磁エネルギーを放出することができる分子としては、蛍光体、発色体、又は発光体が挙げられるが、それらだけに限らない。蛍光を発することができる化合物は、内在の蛍光体でも、外在の蛍光体に結合した化合物でもよい。

[0011] 別の態様では、本発明は、アッセイとして使用するためのデバイスシステムであって、
ａ）基板上の導電性金属面であって、導電性金属面が、基板上でほぼ連続し、低い抵抗を示しており、基板が、ガラス、石英、又はポリマー材料を含む導電性金属面と；
ｂ）この導電性金属面上又は近くに配置された分子であって、分子が、励起時に電磁エネルギーを放出することができる分子と；
ｃ）分子を励起し、かつ電磁エネルギーの放出を引き起こす電磁エネルギー源と；
ｄ）オン及びオフする能力を有する、導電性金属面に取り付けられた直流源であって、直流が、バッテリー、ソーラーパネル、水素燃料電池、又は風源によって生成される直流源と；
ｅ）放出される電磁エネルギーを測定するための検出器、及び／又は導電性金属面を通過する直流を測定するための検出器と、を含むデバイスシステムに関する。

[0012] さらに別の態様では、本発明は、検出デバイスにおいて使用することができるオン若しくはオフモード間の蛍光信号を切り替えるための方法及びシステムに関し、強度の変化は、定量であり、放射分子の量に比例している。

[0013] 本発明の他の態様及び利点は、以下の開示及び添付の特許請求の範囲からより充分に明らかとなるであろう。

[0014] 「オン」及び「オフ」電圧（２．１Ｖ、０．３Ａ）を印加した半連続ＳｉＦ上のＦＩＴＣの時間依存性蛍光発光（５４４ｎｍで測定）を示す図である（上図）。上図の挿入図は、半連続ＳｉＦ膜のＳＥＭ画像を示している。下図は、２．１Ｖ、０．３Ａのゲートオン及びオフしたＳｉＦ上のＦＩＴＣの蛍光スペクトルである。下図の挿入図は、実験構成の概略図及び４７３ｎｍのノッチフィルターを通して得られた写真を示している。 [0015] 印加電圧／電流をゲート「オン」及び「オフ」したほぼ連続的なＳｉＦ（上図）、並びに印加電圧／電流をゲート「オン」及び「オフ」した非連続的なＳｉＦ（下図）上のＦＩＴＣの時間依存性蛍光発光（５４４ｎｍで測定）を示す図である。挿入図は、それぞれのＳｉＦのＳＥＭ画像を示している。 [0016] 印加電圧／電流をゲート「オン」及び「オフ」したＦＩＴＣの発光を示す図であり、電流がオフのとき、発光の強度は検出可能である。 [0017] 金属増強蛍光（上図）、電圧／電流の印加で摂動された金属増強蛍光（下図）の流れを説明するグラフィック図である。Ｆは蛍光体、ＭＥＦは金属増強蛍光、Ａｇは銀のナノ粒子である。 [0018] 平均ＳｉＦ抵抗と、様々なＳｉＦ作製時間と、の関係を示すグラフである（上図）。電圧／電流をゲート「オン」及び「オフ」したほぼ連続的な約７Ω膜のＳｉＦからの時間依存性のバックグラウンド発光（５４４ｎｍで測定）（下図）。 [0019] 印加電圧／電流に応じたＳｉＦの吸収スペクトルを示す図である（上図）。様々な温度に加熱したＳｉＦの吸光度スペクトル（下図）。 [0020] 印加電圧／電流をゲート「オン」したほぼ連続的なＳｉＦ（７Ω）上のＦＩＴＣの蛍光スペクトルを示す図である（上図）。温度に応じたキュベット中のＦＩＴＣの蛍光スペクトル（下図）。 [0021] 印加電圧／電流をゲート「オン」及び「オフ」した、半連続的なＳｉＦ上にスピンコーティングした０．２５％ＰＶＡにおいてドープされたＦＩＴＣの時間依存性蛍光発光（５２４ｎｍで測定）を示す図である（上図）。印加電圧／電流をゲート「オン」及び「オフ」したＳｉＦ上のＦＩＴＣの蛍光スペクトル（下図）。

[0022] 本発明では、表面プラズモンが蛍光特性を増幅する能力に対する、すなわち、金属増強蛍光（ＭＥＦ）に対する電流の影響について初めて実証する。電気抵抗が低い銀の島状膜（ＳｉＦ）に直流を印加すると、近接する蛍光体の蛍光増強が摂動される。所与の印加電流では、「かろうじて連続的な」低抵抗膜での表面プラズモンは、蛍光体双極子カップリングに疎らにしか（ｓｐａｒｓｅｌｙ）利用できず、したがって、増強蛍光は、印加電流に応じてゲート制御される。次に、より厚く、抵抗の低い膜では、ＭＥＦをそれほどではないにせよ摂動する金属中に充分な電荷キャリヤが存在し、誘起された表面プラズモンが、双極子が近接する表面上に容易に形成される。

[0023] 本明細書で使用する用語「かろうじて連続的な膜」の意味は、抵抗が約２〜２００Ω、より好ましくは、約５〜約６０Ω、最も好ましくは、約７〜２５Ωの範囲の導電性金属膜を示し、導電性金属膜に導通接続された（ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｖｅｌｙ ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ）直流は、直流が接続されていない膜と比較して、隣接する蛍光体、発色体、又は発光体によって放出される電磁放射強度を低下させる。

[0024] 本発明の方法及びシステムは、ＨＩＧＨ−ＳＥＮＳＩＴＩＶＩＴＹ ＡＳＳＡＹＳ ＦＯＲ ＰＡＴＨＯＧＥＮ ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ ＵＳＩＮＧ ＭＥＴＡＬ ＥＮＨＡＮＣＥＤ ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ）という名称の米国特許出願第１０／５３６，５０２号；ＭＥＴＡＬ−ＥＮＨＡＮＣＥＤ ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ−ＢＡＳＥＤ ＳＥＮＳＩＮＧ ＭＥＴＨＯＤＳという名称の米国特許出願第１１／９１７，８０４号；ＭＥＴＡＬ−ＥＮＨＡＮＣＥＤ ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ ＦＲＯＭ ＰＬＡＳＴＩＣ ＳＵＢＳＴＲＡＴＥＳという名称の米国特許出願第１１／７１８，５６０号；ＭＩＣＲＯＷＡＶＥ ＡＣＣＥＬＥＲＡＴＥＤ ＡＳＳＡＹＳという名称の米国特許出願第１１／７１９，７３１号；ＭＩＣＲＯＷＡＶＥ ＡＣＣＥＬＥＲＡＴＥＤ ＰＬＡＳＭＯＮＩＣＳという名称の米国特許出願第１１／６９５，３９７号；ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ ＭＩＣＲＯＷＡＶＥ ＭＩＣＲＯＳＣＯＰＹという名称の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０８／６５８０１号；ＭＩＣＲＯＷＡＶＥ ＦＯＣＵＳＥＤ ＣＨＥＭＩＬＵＭＩＮＥＳＣＥＮＣＥという名称の米国特許出願第１２／０３６，４０２号；ＡＮＧＵＬＡＲ ＤＥＰＥＮＤＥＮＴ ＭＥＴＡＬ−ＥＮＨＡＮＣＥＤ ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥという名称の米国特許出願第１１／７５０，１１９号；ＭＥＴＡＬ−ＥＮＨＡＮＣＥＤ ＳＩＮＧＬＥＴ ＯＸＹＧＥＮ ＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮという名称の米国特許出願第１２／０２０，５７１号；ＢＩＯＡＳＳＡＹＳ ＵＳＩＮＧ ＰＬＡＳＭＯＮＩＣ ＳＣＡＴＴＥＲＩＮＧ ＦＲＯＭ ＮＯＢＬＥ ＭＥＴＡＬ ＮＡＮＯＳＴＲＵＣＴＵＲＥＳという名称の米国特許出願第１１／９１７，０７５号；及びＮＡＮＯＳＴＲＵＣＴＵＲＥＳ ＦＯＲ ＰＯＬＡＲＩＺＥＤ ＩＭＡＧＩＮＧ ＡＮＤ ＲＥＣＥＰＴＯＲ／ＬＩＧＡＮＤ ＱＵＡＮＴＩＺＡＴＩＯＮという名称の米国特許出願第１１／９９７，７７８号に記載されるものをはじめとする多数のシステム及び方法において使用することができ、このような出願の内容は、あらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。

[0025] 導電性金属面が、蛍光体の振動双極子に応答し、固有の放射減衰速度である発光速度、及び放出された放射線の空間分布を変更することができることは周知である。理論家は、蛍光体近くの光子モード密度の変化に起因するものとしてこの効果を述べている。ほとんどの分光測定では、溶液又は媒体は、放出された放射線とサンプル放射線の両方に対して透明である。しかし、自由空間条件にはいくつかの重要な例外がある。よく知られている一例は、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）である。金属面が存在すると、ラマン信号は１０^３〜１０^８倍増強され得ることが知られており、さらに大きな１０^１４〜１０^１６倍の増強についても報告されている。また、近くに金属膜、島、又は粒子を存在させると、蛍光体の発光特性を変更することができる。最もよく知られている効果は、近傍の金属による蛍光の消光である。金属面の５０Å以内の蛍光体の発光は、ほぼ完全に消光される。この効果は、エバネッセント波励起を用いた蛍光顕微鏡法において使用される。石英−水界面近くの細胞膜と細胞領域からの発光が消光され、それによって、固液界面からより離れた細胞質領域からの発光を選択的に観察することができる。消光に加えて、金属面又は粒子が、蛍光の著しい増加を引き起こすことが知られている。注目すべきことに、距離及び幾何構造に応じて、金属面又は粒子は、蛍光体の蛍光発光を何千倍にも増強することができる。

[0026] 「蛍光体」又は「蛍光標識」は、本明細書で互換的に使用され、物質がある波長（励起波長）の放射線で照射されたとき、異なる波長（放出波長）の、光などの電磁エネルギーを放出する任意の物質を意味し、試料中の対象分析物と特異的に相互作用又は反応して、１種又は複数の光信号を提供することができる化学若しくは生化学分子又はそのフラグメントを包含することを意図する。さらに、蛍光体としては、外在及び内在の蛍光体の両方が挙げられる。外在の蛍光体は、別の物質に結合した蛍光体を指す。内在の蛍光体は、蛍光体自体の物質を指す。典型的な蛍光体としては、参照により本明細書に組み込まれるＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｃａｔａｌｏｇｕｅに列挙されるものが挙げられるが、それらだけに限らない。

[0027] 代表的な蛍光体としては、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、塩化ダンシル（ＤＮＳ−Ｃｌ）、５−（ヨードアセトアミダ（ｉｏｄｏａｃｅｔａｍｉｄａ））フルオレセイン（５−ＩＡＦ）；フルオレセイン５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミン５−（及び６−）イソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、６−アクリロイル−２−ジメチルアミノナフタレン（アクリロダン）、７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イルクロリド（ＮＢＤ−Ｃｌ）、臭化エチジウム、ルシファーイエロー、５−カルボキシローダミン６Ｇ塩酸塩、リサミンローダミンＢ塩化スルホニル、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（商標）塩化スルホニル、ＢＯＤＩＰＹ（商標）、１−アニリノナフタレン−８−スルホン酸（ＡＮＳ）及び６−（ｐ−トルイジニル）ナフタレン−２−スルホン酸（ＴＮＳ）を含むがそれらだけに限らないナフタルアミンスルホン酸、アントロイル脂肪酸、ＤＰＨ、パリナリン酸、ＴＭＡ−ＤＰＨ、フルオレニル脂肪酸、フルオレセイン−ホスファチジルエタノールアミン、Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ−ホスファチジルエタノールアミン、ピレニル−ホスファチジルコリン（ｐｈｏｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、フルオレニル−ホスホチジルコリン（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、メロシアニン（Ｍｅｒｏｃｙａｎｉｎｅ）５４０、１−（３−スルホナトプロピル）−４−［β−［２−［（ジ−ｎ−ブチルアミノ）−６−ナフチル］ビニル］ピリジニウムベタイン（ナフチルスチリル）、３，３’−ジプロピルチアジカルボシアニン（ｄｉＳ−Ｃ_３−（５））、４−（ｐ−ジペンチルアミノスチリル）−１−メチルピリジニウム（ｄｉ−５−ＡＳＰ）、Ｃｙ−３ヨードアセトアミド、Ｃｙ−５−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｃｙ−７−イソチオシアネート、ローダミン８００、ＩＲ−１２５、チアゾールオレンジ、アズールＢ、ナイルブルー、アルミニウムフタロシアニン、オキサキシン（Ｏｘａｘｉｎｅ）−１，４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、ヘキスト３３３４２、ＴＯＴＯ、アクリジンオレンジ、エチジウムホモダイマー、Ｎ−（エトキシカルボニルメチル）−６−メトキシキノリニウム（ＭＱＡＥ）、フラ−２、カルシウムグリーン、カルボキシＳＮＡＲＦ−６、ＢＡＰＴＡ、クマリン、フィトフルオース（ｐｈｙｔｏｆｌｕｏｒｓ）、コロネン、並びに金属配位子錯体が挙げられるが、それらだけに限らない。

[0028] 代表的な内在の蛍光体としては、ＮＡＤＨ、ＦＡＤ、チロシン、トリプトファン、プリン、ピリルミジン（ｐｙｒｉｒｍｉｄｉｎｅ）、脂質、脂肪酸、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、アミノ酸、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、及びビタミンを含むがそれらだけに限らない芳香族環構造を有する有機化合物が挙げられるが、それらだけに限らない。別の適切な蛍光体としては、酵素補因子、ランタニド、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、又はその突然変異体及び誘導体が挙げられる。

[0029] 適切な化学発光標識の例としては、ペルオキシダーゼ、細菌性ルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、官能化鉄−ポルフィリン誘導体、ルミナール、イソルミノール、アクリジニウムエステル、スルホンアミドなどが挙げられるが、それらだけに限らない。最近の化学発光標識としては、基質としてヒポキサンチンを有するキサンチンオキシダーゼが挙げられる。トリガー剤としては、過ホウ酸塩、Ｆｅ−ＥＤＴＡ錯体、及びルミノールが挙げられる。特定の化学発光標識の選択は、標識済み要素（ｍｅｍｂｅｒ）の作製費、検出（ｄｅｔｅｃｔｏｒ）分子への共有結合カップリングに使用される方法、並びに検出分子及び／又は化学発光標識のサイズをはじめとするいくつかの要因に依存する。同様に、化学発光トリガー剤の選択は、使用されている特定の化学発光標識に依存する。

[0030] 好ましくは、生物発光産生系の成分は、ルシフェラーゼ及びルシフェリンである。生物発光産生系は、有櫛動物、腔腸動物（ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｓｅｓ）、軟体動物、魚、貝虫類、昆虫、細菌、甲殻類、環形動物、及びミミズから単離されたものからなる群から選択することができる。ルシフェラーゼは、オワンクラゲ、ウミホタル、ウミシイタケ、オベリン（Ｏｂｅｌｉｎ）、イサリビガマアンコウ、発光ゴカイ、アゴヌケホシエソ、クレナイホシエソ、ホタル、及び細菌系からなる群から選択することができる。

[0031] 金属増強蛍光は、強度を増強すると同時に発光寿命を短縮する。発光増強は、膜と、金属性の島又はコロイドと、の違いに注意して、検出される蛍光体のタイプ、及び金属材料のタイプ、形に応じた距離で観察することができる。例えば、発光増強は、蛍光体と金属面が約７ｎｍ〜約４０ｎｍの距離に位置するとき観察することができる。金属面との好ましい距離は、約７ｎｍ〜約３０ｎｍ、より好ましくは、１０ｎｍ〜約２０ｎｍである。

[0032] 蛍光は、光源及び検出器を有する分光蛍光計を含むがそれだけに限らない装置を使用して検出することができる。別の検出器としては、ＧａＡｓ−カソードＰＭＴが挙げられる。さらなる検出器としては、光電子増倍管を挙げることができる。さらに、装置では、特定の光の波長を使用して、分子を励起させ、又は特定の波長の発光を検出することができるように、モノクロメーターを有することが有利である。

[0033] 励起光源としては、アークランプ及びレーザー、レーザーダイオード及び発光ダイオード源、並びに単一光子励起光源及び多光子励起光源の両方を挙げることができる。別の実施形態では、チタン−サファイアレーザー、レーザーダイオード（ＬＤ）、又は発光ダイオード源（ＬＥＤ）を、本発明のＲＮＡアッセイと共に使用することができる。例えば、７００〜１０００ｎｍの２光子励起を使用し、また、短パルス幅（＜５０ｐｉ）、高繰返し数（１〜８０ＭＨｚ）、レーザーダイオード及びＬＥＤ（１ｎｓ、１〜１０ＭＨｚ）源を使用する。２光子励起を使用するアッセイの増強感度は、１光子と比較して、最初にチタン−サファイアシステム、その後にＬＥＤ及びＬＤを用いて、ＲＮＡによる系列希釈を使用することによって示され得る。蛍光体が２光子を同時に吸収した場合、それは励起状態に上がるのに充分なエネルギーを吸収することになる。次いで、蛍光体は、使用する蛍光体に依存する、通常は可視スペクトルの波長を有する単一光子を放出する。赤外光を備えたチタン−サファイアレーザーを使用すると、より長い波長の散乱がより少なくなるという別の利点がもたらされ、これは高分解画像化に対する利点である。重要なことには、金属粒子近くの局在励起を利用することによって、２光子励起を使用して得られるバックグラウンド信号レベルが、１光子励起に比べて低減される。

[0034] 蛍光体、発色体、又は発光体を含有する試料を、励起する放射量に曝露させるか、あるいは発光化学反応に関与させた場合、その蛍光体、発色体、又は発光体は、検出可能な放射線を放出する。金属粒子と、蛍光体、発色体、又は発光体と、の間の距離が約５ｎｍ〜約２００ｎｍである場合、励起する放射線量に応じて、発光強度を増大させることができる。発光強度の増強は、蛍光体が金属面のすぐ近くにあるとき、その蛍光体の局在励起に部分的に起因し、発光分子の光安定性を向上させる。さらに、金属材料の表面上の各プラズモンの相互作用及びカップリングは、さらなる増強をもたらす。

[0035] 一実施形態では、金属粒子は、様々な還元剤を使用して、金属イオンの還元によって調製することができる。例えば、水酸化ナトリウムを、急速に撹拌する硝酸銀溶液に添加して、茶色の沈澱物を形成させることができる。次いで、水酸化アンモニウムを添加して、沈澱物を再溶解させる。溶液を冷却し、乾燥石英スライドをビーカーに加え、続いて、グルコースを添加する。２分間撹拌した後、混合物を３０℃に温める。１０〜１５分後、混合物は黄緑色に変わり、濁る。銀粒子の薄膜がスライド上に形成されるが、それはその緑褐色から知ることができる。特に、混合物中にスライドを留める時間の長さにより、様々な厚さの膜がもたらされる。例えば、堆積プロセスを約５〜１０分間行った場合、堆積膜は「かろうじて連続的」と考えられる。好ましい金属は、銀及び金である。さらに、金はより短い波長を吸収するので、金を使用してもよい。

[0036] 銀の島状膜はまた、石英面上での銀塩の化学的還元によって形成することができ、これは比較的簡単に作製される。

[0037] ガラス又はポリマー基板上にシアニド（ＣＮ）、アミン（ＮＨ_２）、又はチオール（ＳＨ）などの官能性化学基を付けることによって、かろうじて連続的な膜を形成する量の金属材料を面に結合させることができる。

[0038] 所望の距離に生体分子又は金属粒子を配置させることは、膜を使用することで実現できる。膜は、ポリマーフィルム、ラングミュア−ブロジェット膜、又は酸化膜とすることできる。

[0039] さらに、金属膜は、真空蒸着で作製することができる。基板は、金属膜を蒸着する前に、１×１０^−４ｍｂａｒ下で３分間空気プラズマによって前処理することができる。銀線をフィラメント上に溶解させ、１×１０^−７ｍｂａｒより大きい圧力下で蒸発させ、ガラススライド上に蒸着させることができる。蒸着速度は、フィラメント電流（１Å／秒）によって調整することができ、膜の厚さは、蒸着チャンバー内のガラス基板近くに位置する水晶発振子微量天秤で測定することができる。好ましくは、膜の厚さは約１２〜１７ｎｍであり、次にこれを約２００℃で約１時間アニールすることができる。アニーリングプロセスは、酸素がない状態で行われる。アニーリングプロセスが始まる前に、システムを超高純度窒素（エアガス、ＭＤ）でパージすることと真空にポンプダウンさせることとを交互に行うことによって酸素を除去することができる。

[0040] 方法及び材料
[0041] 様々な抵抗を有する銀の島状膜（ＳｉＦ）の作製。
[0042] ＳｉＦは、すでに公表されている通りに作製した。^４典型的なＳｉＦ作製では、硝酸銀溶液（脱イオン水６０ｍｌ中に０．５ｇ）を、きれいな１００ｍＬ容のガラスビーカーに調製した。新しく調製した５％（ｗ／ｖ）水酸化ナトリウム溶液２００μＬ及び水酸化アンモニウム２ｍｌを、連続撹拌している硝酸銀溶液に室温で添加した。次に、氷浴中にビーカーを置いて、溶液を５℃に冷却し、続いて、溶液にＳｉｌａｎｅｐｒｅｐ（商標）ガラススライドを浸し、新しいＤ−グルコース溶液（水１５ｍｌ中に０．７２ｇ）を添加した。次いで、混合物の温度を３０℃に温めた。混合物の色が黄緑色から黄褐色に変わったとき、ビーカーを熱源から外し、スライドを所要の抵抗に応じて５〜３０分間溶液中に保持した。次いで、スライドを混合物から取り出し、水で洗浄し、Ｎ_２下で乾燥させ、スライドの抵抗をＧＤＴ−１１電圧計（ＧＢ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（商標））で測定した。

[0043] 面上の乾燥試料の作製。
[0044] ＦＩＴＣ（２．５ｍＭ）のエタノール溶液３００μＬを、様々な抵抗を有するＳｉＦ面に滴下させた。溶媒を蒸発させ、試料を調べた。酸化及び双極子再配向の研究（対照試料）のために、ＦＩＴＣ１００μＬを０．２５％（ｗ／ｖ）ＰＶＡ水溶液１ｍＬに滴下し、ＳｉＦ上にスピンコーティング（約７Ω）した。この手順で製造した約３７ｎｍ厚の膜（ＡＦＭを使用して測定）は、電流が流れている間の酸素の拡散と、蛍光体の双極子再配向と、を共に防止した。

[0045] 吸収及び蛍光の測定。吸光度スペクトルをＶａｒｉａｎ Ｃａｒｙ ５０ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計で記録した。蛍光測定値は、Ｏｃｅａｎ Ｏｐｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．のファイバ光学分光器（ＨＤ２０００）を使用して、ガラス／銀メッキ表面に４５度で入射する４７３ｎｍの励起光によって、その表面に対して９０度の角度で収集した。電圧ゲート制御実験。直流（Ｅｘｔｅｃｈ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ３８２２１３）を様々な抵抗を有するＳｉＦに印加し（図１の下図の挿入図）、蛍光測定中に「オン及びオフ」のゲート制御を行った。

[0046] ＳＥＭ測定。
[0047] 走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）は、日立ＳＵ−７０機器で行った。試料を切断し、アルミニウム支持体にマウントした。２０ｋＶの高電圧を使用し、試料を１４９９４倍の倍率で調査した。

[0048] 結果及び考察
[0049] 興味深いことに、抵抗が高い非連続的な膜は、直流による効果を示さず、抵抗が低い厚みのある連続的な膜は、先に示したようにプラズモンカップリングにまったく適していない。^６続いて、本明細書に記載する研究結果は、電気抵抗が低いかろうじて連続的な膜を使用して、ＭＥＦをゲート「オン及びオフ」できることを、確かにその発光強度「間に」示唆している。最近ＭＥＦの使用に関心が高まっているので、これらの研究結果は、ラボオンアチップに基づく技術にとって、及び結合量子／蛍光を直接測定する新規な蛍光検出器の開発において非常に重要なものであろう。^７

[0050] 以前からＭＥＦに使用されているＳｉＦ ^４、８は、アミンがコーティングされたガラススライド（Sigma）上に堆積されていた。図５の上図に示すように、表面の電気抵抗を調整するために、この手順を修正して、より長期間にわたるＳｉＦの堆積を可能にした。具体的に、１５分間より長く堆積された膜は、完全な導電性（抵抗１Ω未満）を示し、一方、５分間より短く堆積された膜は、非導電性（抵抗１０^６Ωより大）を示した。約５〜１３分間堆積された膜は、「かろうじて（just）」導電性であり、その膜は、最高で数百Ωの抵抗を示した。表面の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像は、その膜の粒子状（高抵抗）と、連続状（低抵抗）と、の性質を示している（図１及び２の挿入図）。

[0051] 図１は、半連続（かろうじて連続的な）膜（７Ω）上にコーティングされたフルオレセイン（FITC）に対する印加電圧の効果を示している（図１の下図の挿入図に示す実験構成）。注目すべきことに、電圧をゲート制御したとき、ＦＩＴＣ蛍光が、増加と減少の両方をそれぞれ起こしていることが分かる。蛍光発光スペクトルは、強度の大きさのみ変動するが、その他の点では、ゲート制御中のスペクトルは同一である。図１の下図の挿入図の写真は、ゲート制御中の実際の蛍光を示している。

[0052] 一連の詳細な対照実験では、印加電流／電圧に応じたプラズモン吸収における銀のバックグラウンド発光（図５、下図）及び変化を、図６に示すように、影響の原因になり得るとして除去した。興味深いことに、電圧及び電流が次第に変動するにつれて、ＦＩＴＣ発光がその後それぞれゲート制御されており（図７の上図）、この観察が直流を印加した結果であることが強く示唆された。

[0053] 図８に示すように、表面酸化及び双極子再配向もまた、影響の原因になり得ると考えた。しかし、窒素パージした厚い０．２５％ｗ／ｖＰＶＡ膜（約３７ｎｍ）において、蛍光のゲート制御効果がやはり容易に観察されている。蛍光信号の観察された変化の大きさを考慮することは興味深いことである。図１の上図から、電流ゲート制御中の信号において約５０％の変化が見られたが、蛍光信号はさらに大きな範囲では変化しないという説明にいくつかの要因が考えられる：
（１）ＦＩＴＣ分子が銀の島の上と間のどちらにもコーティングされており、したがって、大半が印加電流の影響を受けない可能性が高い；
（２）ゲート制御中にわずかな温度上昇があり、ＦＩＴＣ発光が増大され、その結果、観察された影響の大きさは相殺される。図７の下図は、ＦＩＴＣ発光が温度に応じて増加することを示しており、したがって、ゲート制御の現象を説明することができない。この点に関して、図６の下図に示すように、ＳｉＦのプラズモン吸収はまた、温度上昇によって動じないことが示されている；
（３）ゲート制御した時間とゲート制御していない時間に関する蛍光信号の全般的な減少は、定常ＣＷ４７３ｎｍのレーザー励起によるＦＩＴＣの光安定性に起因するものと考えられる。

[0054] したがって、励起性（excitable）分子に応じて、電流ゲート制御中の信号の変化は、ＦＩＴＣに見られるように５０％を超える可能性がある。

[0055] 非常に厚い膜と、非常に薄い膜と、の両方に対する直流の効果を、すなわち、低抵抗と、高抵抗と、のそれぞれを研究した（図２）。興味深いことに、より厚い膜では、ＭＥＦ効果の大きさは、図１に示す低抵抗の膜、すなわち１９０ａ．ｕと比較して、著しくより小さくなる（時間ｔ＝０で５５ａ．ｕ）。この観察は、ここで使用した条件下においてＭＥＦに関する現在の理解及び解釈^{１〜４、８}と完全に一致しており、連続膜は、表面プラズモン、ひいてはＭＥＦの発生をサポートすることができない。電気抵抗が非常に高い（すなわち弱電流）非連続膜は、より大きな最初のＭＥＦ効果、すなわち２６０ａ．ｕを示し（図２の下図）、これはＳｉＦからのＭＥＦに関する他の報告と一致している。^{１〜４、８}興味深いことに、両方の面が、図１に示す銀膜ほど明白な蛍光ゲート制御効果を示さず、「かろうじて連続的な」膜ではこの効果がより明白に示されている。

[0056] 図１及び２に示される観察効果をもたらすと考えられるメカニズムには、図１に示す、電気抵抗が低いかろうじて連続的な膜でのプラズモンが、電流が印加されているときに双極子カップリング及びＭＥＦに利用できず、したがって、ＭＥＦ効果がゲート制御されることが含まれることが、理論付けられる。厚い膜では（図２の上図）、膜は電流が流れるのに充分に厚く、プラズモンはＭＥＦにふんだんに利用可能であり、観察された蛍光の純変化は、非常に小さい。ＭＥＦにとって理想的な基板である非連続膜では、電流に対する抵抗が非常に高く、したがって、ゲート制御効果が観察されない（図２の下図）。図４の下図の概略図は、電圧／電流のゲート制御によるＭＥＦ効果に関するメカニズムを提案するものである。

[0057] 最後に、本発明の実験に見られる結果は、最近の刊行物^９、１０に示されている、走査型トンネル顕微鏡を使用して、チップの局所場に起因する、金属ナノ粒子の局在プラズモン共鳴を励起させる、という内容に沿うものである。Ｉｗａｓａｋｉらは、ナノ粒子に近接する発光体が次に続いて励起し、その結果、分子の発光が起こることを示している。^１０本発明のシステムは、事実上肉眼で見え、実際にほぼ逆のメカニズムである。光学的励起が起こり、かつ表面プラズモンが誘起された後、ナノ粒子膜にさらに電流を印加すると、蛍光体双極子カップリングの程度が低減されて、全体的なＭＥＦ効果が減少される（図４の下図）。興味深いことに、これらの他の報告書は、ナノ粒子膜ではなく単一ナノ粒子ベースの膜であるが^１０、我々も同様に、光学的励起をさらに必要としない蛍光を観察することができなかった。Ｉｗａｓａｋｉらと同様に、本明細書に記載する研究結果は、極性に依存せず、単に電気リード線の配置を入れ替えることによって同一の結果が得られた（データは示さず）。

[0058] 図１から、蛍光発光のほぼ双指数関数的な損失を、電圧をゲート制御したとき見ることができ、最終的には数百秒かけて、すなわち３分未満で横這い状態に達する。興味深いことに、電流の印加開始時では、蛍光強度は、非常に急速に、実際に数秒の内に低下する。その後、発光の損失は、はるかに遅い速度となる。蛍光のこの速い、次いで遅い減衰は、２つの競争過程によって実証されると考えられる。最初に、蛍光は、電流の通過によってオフゲート制御される。これは、上述のように、表面プラズモンの双極子カップリング、ひいては蛍光増強に対する能力低下のためである。その後、銀の島状膜は、図７の下図に示すように、わずかに温まったことが観察された。これは、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）蛍光を増加させる。続いて、膜の電流に対する抵抗に起因する急速なオフゲート制御効果、その後に続くゆっくりな表面加熱が、図１の上図に観察される蛍光の双指数関数的な損失の説明に考えられる。

[0059] 最初の考えでは、表面加熱は蛍光のゲート制御の観察を複雑にするように見えるが、集束低電力マイクロ波及び金属ナノ粒子の使用によって最近報告されているように^{１１〜１３}、表面試料のわずかな加熱が、迅速なアッセイの発展をかなり促進するかもしれないと考えられる。

[0060] 結論として、本発明において、ゲート制御ＭＥＦに関する初めての観察を、かろうじて連続的な銀膜に印加電流を加えることによって示す。この結果は、電流が印加されたかろうじて連続的な膜では、表面プラズモンは、近接場双極子カップリングに容易には利用できず、より厚い金属が使用されるにつれ、本質的に、電流を流すのに利用できる電荷キャリヤの数を増加させ、表面プラズモンを双極子カップリングに利用できる状態にする（free up）という効果が減少することを示唆している。

[0061] 参考文献

[0062] 本明細書に引用される参考文献の内容は、あらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。
[0061] REFERENCES
[0062] The contents of the references cited herein are incorporated by reference herein for all purposes.
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Claims (21)

1. アッセイとして使用されるデバイスシステムであって、
   ａ）基板上の導電性金属面であって、前記導電性金属面が、前記基板上に堆積され、低い抵抗を示すかろうじて連続的な膜であり、前記基板が、ガラス、石英、又はポリマー材料を含む導電性金属面と；
   ｂ）前記導電性金属面上又は近くに配置された分子であって、前記分子が、励起時に電磁エネルギーを放出することができる分子と；
   ｃ）前記分子を励起し、かつ電磁エネルギーの放出を引き起こす電磁エネルギー源と；
   ｄ）オン及びオフされることができる、前記導電性金属面に取り付けられた直流源と；
   ｅ）放出される電磁エネルギーを測定するための検出器、及び／又は前記導電性金属面を通過する直流を測定するための検出器と
   を含むデバイスシステム。
2. 前記分子が、蛍光体、発色体、又は発光体である、請求項１に記載のシステム。
3. 前記導電性金属面が、金、銀、アルミニウム、及び銅からなる群から選択される金属から作製される、請求項１に記載のシステム。
4. 前記かろうじて連続的な膜が、抵抗範囲が約２〜２００Ωの導電性金属膜である、請求項１に記載のシステム。
5. 前記かろうじて連続的な膜が、抵抗範囲が約５〜２５Ωの導電性金属膜である、請求項１に記載のシステム。
6. 前記導電性金属膜に導通接続された直流の通過が、前記直流が接続されていない膜と比較して、隣接する蛍光体、発色体、又は発光体によって放出される前記電磁放射強度を低下させる、請求項１に記載のシステム。
7. 前記電圧源が、バッテリー、太陽電池、又は水素燃料電池である、請求項１に記載のシステム。
8. 前記蛍光体、発色体、又は発光体が、前記金属面から約１０〜２０ｎｍに配置される、請求項１に記載のシステム。
9. （原文に記載なし）
10. イムノアッセイ、ハイブリダイゼーションアッセイ、共鳴エネルギー移動アッセイ、及び偏光／異方性に基づくアッセイ、生物発光に基づくアッセイ、化学発光に基づくアッセイ、発光に基づくアッセイ、又は酵素結合イムノソルベントアッセイにおいて使用される、請求項８に記載のシステム。
11. 前記励起電磁エネルギーが、ＵＶ又はＩＲＥからの範囲にある、請求項１に記載のシステム。
12. 金属増強蛍光システムからの発光を操作する方法であって、
    ａ）基板上に導電性金属面を設けるステップであって、前記導電性金属面が、前記基板上にかろうじて連続的な膜を有し、前記基板が、ガラス、石英、銅、又はポリマー材料を含むステップと；
    ｂ）前記導電性金属面の近くに分子を配置するステップであって、前記分子が、検出可能な電磁エネルギーを放出することができ、前記分子が、前記放出される検出可能な電磁エネルギーの強度を増強するような前記導電性金属面からの距離に配置されるステップと；
    ｃ）前記分子を励起し、かつ検出可能な電磁エネルギー放出を引き起こすのに充分な波長における電磁エネルギーを加えるステップと；
    ｄ）前記導電性金属面を電圧源及び作動可能スイッチと接続させるステップであって、前記スイッチを開けると、前記導電性金属面を通して直流を伝送させることが可能になり、それによって、検出可能な電磁エネルギー放出が減少又は停止され、前記スイッチを閉めると、検出可能な電磁エネルギーが放出されるステップと
    を含む方法。
13. 前記分子が、蛍光体、発色体、又は発光体である、請求項１２に記載のシステム。
14. 前記導電性金属面が、金、銀、アルミニウム、及び銅からなる群から選択される金属から作製される、請求項１２に記載のシステム。
15. 前記かろうじて連続的な膜が、抵抗範囲が約２〜２００Ωの導電性金属膜である、請求項１２に記載のシステム。
16. 前記かろうじて連続的な膜が、抵抗範囲が約５〜２５Ωの導電性金属膜である、請求項１２に記載のシステム。
17. 前記導電性金属膜に導通接続された直流の通過が、前記直流が接続されていない膜と比較して、隣接する蛍光体、発色体、又は発光体によって放出される前記電磁放射強度を低下させる、請求項１２に記載のシステム。
18. 前記電圧源が、バッテリー、太陽電池、又は水素燃料電池である、請求項１２に記載のシステム。
19. 前記蛍光体、発色体、又は発光体が、前記金属面から約１０〜２０ｎｍに配置される、請求項１２に記載のシステム。
20. イムノアッセイ、ハイブリダイゼーションアッセイ、共鳴エネルギー移動アッセイ、及び偏光／異方性に基づくアッセイ、生物発光に基づくアッセイ、化学発光に基づくアッセイ、発光に基づくアッセイ、又は酵素結合イムノソルベントアッセイにおいて使用される、請求項１９に記載のシステム。
21. 前記励起電磁エネルギーが、ＵＶ又はＩＲからの範囲にある、請求項１２に記載のシステム。

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