CN104237537A - 一种检测心肌肌钙蛋白的免疫层析荧光试剂条及制备方法 - Google Patents
一种检测心肌肌钙蛋白的免疫层析荧光试剂条及制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种检测心肌肌钙蛋白的免疫层析荧光试剂条及制备方法，属于临床医学检测领域。该试剂条包括底板、样品垫、示踪粒子结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述样品垫、示踪粒子结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫水平方向顺序连接固定于底板上。所述示踪粒子结合垫上设有包被在纳米金属粒子表面的cTnI单克隆抗体-荧光颗粒复合物吸附层；所述的硝酸纤维素膜上设置有cTnI单克隆抗体或多克隆抗体捕获分子构成的检测线和兔抗鼠IgG抗体构成的质控线。本发明利用纳米金属粒子提高荧光强度的原理，检测时间短、特异性和灵敏度高、检测结果更加准确。
Description
技术领域
本发明涉及临床医学检验领域，具体涉及一种检测心肌肌钙蛋白的免疫层析荧光试剂条及制备方法。
背景技术
免疫层析技术是体外诊断试剂的一种方法，具有价格低，检测方便，检测快速等特点。它结合了亲和技术、标记技术、印记技术和层析技术等技术方法。
目前所用的免疫层析试剂方法学可分为胶体金法和荧光法。荧光技术逐渐在免疫层析中占主导地位。然而该技术具有灵敏度低，检测时间长，抗体成本高等缺点，进一步提高检测灵敏度，降低检测时间，节约抗体用量十分必要。金属增强是一种利用特殊表面(一般是金属表面)的表面等离子体振荡和电磁场剪裁效应,使分布在表面附近的荧光物种的荧光发射强度比自由态的荧光发射强度有显著增强的现象。专利CN102308211A开发了一种超声辅助金属增强荧光增强（MAMEF）的生物分析手段，提高了检测的灵敏度，间接的节约了成本。然而，CN102308211A主要应用于化学发光方法的生物分析。该方法与干式免疫荧光定量分析法相比价格处于明显劣势。目前，市场上还没有以金属增强免疫层析荧光原理为指导的体外快速诊断产品。
发明内容
为了克服上述现有技术中的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种检测心肌肌钙蛋白的免疫层析荧光试剂条及制备方法，本发明应用纳米金属粒子提高荧光强度的原理，使得免疫检测时间大幅缩短、特异性和灵敏度大幅提高、准确性大幅提高。
本发明所采用的技术方案是：一种心肌肌钙蛋白的免疫层析荧光试剂条，包括底板，其特征在于还包括样品垫、示踪粒子结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述样品垫、示踪粒子结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，水平方向顺序连接并固定于底板上；所述示踪粒子结合垫设有包被在纳米金属粒子表面的cTnI单克隆抗体/多克隆抗体-荧光颗粒复合物吸附层；所述的硝酸纤维素膜上设置有cTnI单克隆抗体或多克隆抗体捕获分子构成的检测线和兔抗鼠IgG抗体构成的质控线。
所述的纳米金属粒子选自纳米金颗粒、纳米银颗粒、金纳米棒或复合纳米粒子，粒径为50~200nm，包被的抗体厚度为10~30nm。
所述荧光颗粒选自荧光素cy5、荧光素cy7、羧基荧光素、2-甲氧基荧光增强素、罗丹明、藻红蛋白中的一种。
本发明一种检测心肌肌钙蛋白的免疫层析荧光试剂条的制备方法是：
1）样品垫的制备：样品垫选用玻璃纤维或聚酯材料，用缓冲盐（PBS，Tris或甘氨酸等）等溶解5mg/ml 的蛋白（BSA，酪蛋白等），然后加入少量的表面活性剂（Tween20等），调节pH到6~8，将璃纤维或聚酯材料置于浸泡2 ～ 4 小时，取出后25℃干燥8 小时可得；
2）示踪粒子结合垫的制备：将处理好的样品垫上均匀的喷上示踪粒子标记抗体/ 抗原标记物，置于25℃干燥4小时即可得，示踪粒子制备可分抗体IgG-荧光素的制备和金属粒子-抗体-荧光复合物的制备两步：
A．抗体IgG-荧光素的制备：抗体IgG溶解于20~100Mmol的PBS缓冲液中，活化的荧光素（FITC，Cy5等）溶解于二甲基亚砜（DMF）中，然后将抗体IgG与荧光素以1:1~1:3混合，充分搅拌反应1h，然后将溶液置于透析袋中梯度换液透析3次，每次6~8h，得到的溶液即为抗体IgG-荧光素复合物；
B．金属粒子-抗体-荧光复合物的制备：将纳米金属粒子与抗体IgG-荧光素以10mg:20~100ug比例充分混合均匀后，然后向溶液中加入稀盐酸调节pH使抗体-荧光素吸附于金属粒子表面，充分反应后加入NaOH调节pH为7~8，离心除去游离抗体-荧光素，以合适的缓冲液恢复到一定的体积即为示踪粒子复合物；
3）硝酸纤维素膜的处理：
A．检测线的制备：将心肌肌钙蛋白相对应的捕获单克隆抗体或多克隆抗体用20mmol/L pH7.2 的PB 缓冲液稀释到2.0mg/ml 的浓度，0.8ul/cm 在硝酸纤维素膜上划线得到检测线6，然后将硝酸纤维素膜4置于干燥箱内20℃鼓风干燥12h即得；
B．质控线的制备：将兔抗鼠IgG 抗体按4mg/ml 的浓度，0.8ul/cm 在硝酸纤维素膜上划线得质控线7，该线与检测线6平行，间隔5mm，干燥条件同检测线6即可制备好质控线7 ；
（4）吸水垫的制备：吸水纸裁剪成30*2.7cm 每条；
（5）组装：塑料底衬，样品垫和吸水纸为本领域通用的部件。将上述硝酸纤维素膜、吸水垫、样品垫粘贴在塑料底衬上，将贴好的中间物用斩切机切成一定宽度的试剂条。
本发明利用纳米金属粒子提高荧光强度的原理在心肌肌钙蛋白上的应用，一方面层析时间只需45s-60s，检测时间大大缩短、特异性与稳定性加强、检测结果更加准确，另一方面，还大大节约了材料，节省了成本。同时该应用可扩展到双抗夹心或竞争法模式的类其他疾病（肾脏类、肿瘤类、传染病等）的诊断。
附图说明
图1一种检测心肌肌钙蛋白的免疫层析荧光试剂条结构示意图；其中，1、底板；2、样品垫；3、示踪粒子结合垫；4、硝酸纤维素膜；5、吸水垫；6、检测线；7、质控线。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明
如图1所示，一种检测心肌肌钙蛋白的免疫层析荧光试剂条，包括底板1、样品垫2、示踪粒子结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸水垫5；所述样品垫2、示踪粒子结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸水垫5，水平方向顺序连接并固定于底本上；所述示踪粒子结合垫3设有包被在纳米金属粒子表面的cTnI单克隆抗体/多克隆抗体-荧光颗粒复合物吸附层；所述的硝酸纤维素膜4上设置有cTnI单克隆抗体或多克隆抗体捕获分子构成的检测线6和兔抗鼠IgG抗体构成的质控线7。
所述的纳米金属粒子选自纳米金颗粒、纳米银颗粒、金纳米棒或复合纳米粒子，粒径为50~200nm，包被的抗体厚度为10~30nm。
所述荧光颗粒选自荧光素cy5、荧光素cy7、羧基荧光素、2-甲氧基荧光增强素、罗丹明、藻红蛋白中的一种。
实施例1示踪粒子结合垫的制备
将处理好的样品垫上均匀的喷上示踪粒子标记抗体/ 抗原标记物，置于25℃干燥4小时即可得，其中示踪粒子制备可分抗体IgG-荧光素的制备和金属粒子-抗体-荧光复合物的制备两步：
A．抗体IgG-荧光素的制备：抗体IgG溶解于20~100Mmol的PBS缓冲液中，活化的荧光素（FITC，Cy5等）溶解于二甲基亚砜（DMF）中，然后将抗体IgG与荧光素以1:1~1:3混合，充分搅拌反应1h，然后将溶液置于透析袋中梯度换液透析3次，每次6~8h，得到的溶液即为抗体IgG-荧光素复合物；
B．金属粒子-抗体-荧光复合物的制备：将50~200nm纳米金属粒子与抗体IgG-荧光素以10mg：20~100ug比例充分混合均匀后，然后向溶液中加入稀盐酸调节pH使抗体-荧光素吸附于金属粒子表面，充分反应后加入NaOH调节pH为7~8，离心除去游离抗体-荧光素，以合适的缓冲液恢复到一定的体积即可得到厚度10~30nm的示踪粒子复合物。
实施例2一种检测心肌肌钙蛋白的免疫层析荧光试剂条制备
一种检测心肌肌钙蛋白的免疫层析荧光试剂条，包括底板1，在底板1上顺次贴上样品垫2、示踪粒子结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸水垫5；其中组分2-5均需要重叠1~2mm，以保证检测样本顺利通过检测区到达吸水垫，各组分的制备方法如下所述：
1）样品垫的制备：样品垫可选用玻璃纤维或聚酯材料，可用缓冲液（PBS，Tris或甘氨酸等）等溶解5mg/ml 的蛋白（BSA，酪蛋白等），然后加入少量的表面活性剂（Tween20等），调节pH到6~8，将璃纤维或聚酯材料置于浸泡2 ～ 4 小时，取出后25℃干燥8 小时可得；
2）示踪粒子结合垫的制备：将处理好的样品垫上均匀的喷上示踪粒子标记抗体/ 抗原标记物，置于25℃干燥4小时即可得，具体制备方法如实施例1；
3）硝酸纤维素膜的处理：
A．检测线的制备：将硝酸纤维素膜4固定心肌肌钙蛋白相对应的捕获单克隆抗体或多克隆抗体用20mmol/L pH7.2 的PB 缓冲液稀释到2.0mg/ml 的浓度，0.8ul/cm 在离硝酸纤维素膜6处划线得到检测线，然后将硝酸纤维素膜4置于干燥箱 ；
B．质控线的制备：所述的兔抗鼠IgG 抗体按4mg/ml 的浓度，0.8ul/cm 在硝酸纤维素膜的7处划质控线，该线与检测线6平行，与检测线间隔5mm，干燥条件同检测线即可制备好质控线7 ；
4）吸水垫的制备：吸水纸裁剪成30*2.7cm 每条；
5）组装：塑料底衬，样品垫和吸水纸为本领域通用的部件，将上述硝酸纤维素膜、吸水垫、样品垫粘贴在塑料底衬上，将贴好的中间物用斩切机切成一定宽度的试剂条，20℃鼓风干燥12h即得。
实施例3 使用本实用所述的试剂检测心肌肌钙蛋白蛋白
将实施例2中如图1所示的试剂条斩切成5mm宽度装在合适的试剂条支撑外壳上，样品垫2对着加样孔，压紧外壳。然后样本检测操作步骤如下：（1）采集血清、血浆或全血样本恢复至室温；（2）将待测样本100ul滴加到样品垫2上反应；（3）结果读取，90s后将所述试剂条置于免疫定量分析仪中读取相应样本的结果。
Claims (4)
1.一种检测心肌肌钙蛋白的免疫层析荧光试剂条，包括底板（1），其特征在于还包括样品垫（2）、示踪粒子结合垫（3）、硝酸纤维素膜（4）和吸水垫（5）；所述样品垫（2）、示踪粒子结合垫（3）、硝酸纤维素膜（4）和吸水垫（5），水平方向顺序连接并固定于底板（1）上；所述示踪粒子结合垫（3）设有包被在纳米金属粒子表面的cTnI单克隆抗体/多克隆抗体-荧光颗粒复合物吸附层；所述的硝酸纤维素膜（4）上设置有cTnI单克隆抗体或多克隆抗体捕获分子构成的检测线（6）和兔抗鼠IgG抗体构成的质控线（7）。
2.根据权利要求1所述的一种检测心肌肌钙蛋白的免疫层析荧光试剂条，其特征在于所述的纳米金属粒子选自纳米金颗粒、纳米银颗粒、金纳米棒或复合纳米粒子，粒径为50~200nm，包被的抗体厚度为10~30nm。
3.根据权利要求1所述的一种检测心肌肌钙蛋白的免疫层析荧光试剂条，其特征在于所述荧光颗粒选自荧光素cy5、荧光素cy7、羧基荧光素、2-甲氧基荧光增强素、罗丹明、藻红蛋白中的一种。
4.一种权利要求1所述的免疫层析荧光试剂条的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）样品垫的制备：样品垫选用玻璃纤维或聚酯材料，用缓冲液（PBS，Tris或甘氨酸等）等溶解5mg/ml 的蛋白（BSA，酪蛋白等），然后加入少量的表面活性剂（Tween20等），调节pH到6~8，将璃纤维或聚酯材料置于浸泡2 ～ 4 小时，取出后25℃干燥8 小时可得；
2）示踪粒子结合垫的制备：将处理好的结合垫上均匀的喷上示踪粒子标记抗体/ 抗原标记物，置于25℃干燥4小时即可得，示踪粒子制备可分抗体IgG-荧光素的制备和金属粒子-抗体-荧光复合物的制备两步；
A．抗体IgG-荧光素的制备：抗体IgG溶解于20~100Mmol的PBS缓冲液中，活化的荧光素（FITC，Cy5等）溶解于二甲基亚砜（DMF）中，然后将抗体IgG与荧光素以1:1~1:3混合，充分搅拌反应1h，然后将溶液置于透析袋中梯度换液透析3次，每次6~8h，得到的溶液即为抗体IgG-荧光素复合物；
B．金属粒子-抗体-荧光复合物的制备：将纳米金属粒子与抗体IgG-荧光素以10mg:20~100ug比例充分混合均匀后，然后向溶液中加入稀盐酸调节pH使抗体-荧光素吸附于金属粒子表面，充分反应后加入NaOH调节pH为7~8，离心除去游离抗体-荧光素，以合适的缓冲液恢复到一定的体积即为示踪粒子复合物；
3）硝酸纤维素膜的处理：
A．检测线的制备：将心肌肌钙蛋白相对应的捕获单克隆抗体或多克隆抗体用20mmol/L pH7.2 的PB 缓冲液稀释到2.0mg/ml 的浓度，0.8ul/cm 在硝酸纤维素膜上划线得到检测线6，然后将硝酸纤维素膜4置于干燥箱内20℃鼓风干燥12h即得；
B．质控线的制备：将兔抗鼠IgG 抗体按4mg/ml 的浓度，0.8ul/cm 在硝酸纤维素膜上划线得质控线7，该线与检测线6平行，间隔5mm，干燥条件同检测线6即可制备好质控线7 ；
4）吸水垫的制备：吸水纸裁剪成30*2.7cm 每条；
5）组装：塑料底衬，样品垫和吸水纸为本领域通用的部件；将上述硝酸纤维素膜、吸水垫、样品垫粘贴在塑料底衬上，将贴好的中间物用斩切机切成一定宽度的试剂条。
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