CN111175500A - 一种用于检测人类维生素d浓度的免疫层析试剂条 - Google Patents
一种用于检测人类维生素d浓度的免疫层析试剂条 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及免疫检测技术领域，尤其指一种用于检测人类维生素D浓度的免疫层析试剂条，包括样品垫、荧光垫、包被硝酸纤维素膜、吸水纸和PVC衬底，所述荧光垫的上方喷抹有维生素D单克隆抗体标记荧光胶乳，所述包被硝酸纤维素膜包括包被有多克隆质控抗体的质控区和包被有维生素D‑蛋白偶联物的检测区，所述维生素D单克隆抗体标记荧光胶乳由链霉亲和素荧光纳米颗粒与生物素化维生素D单克隆抗体、生物素化质控抗体反应得到。本发明采用链霉亲和素荧光纳米颗粒与生物素化维生素D单克隆抗体、生物素化质控抗体反应，制备维生素D单克隆抗体标记荧光胶乳，利用链霉亲和素‑生物素系统的高度稳定性以及质控抗体配对展层的同步性，提升标记的稳定性和展层一致性，从而提高了检测重复性。
Description
技术领域
本发明涉及免疫检测技术领域，尤其指一种用于检测人类维生素D浓度的免疫层析试剂条。
背景技术
维生素D（简称VD）是一种脂溶性维生素，乃环戊烷多氢菲类化合物，一组结构上与固醇有关，功能上可防止佝偻病的维生素，最主要的是维生素D3与D2，前者由人皮下的7-脱氢胆固醇经紫外线照射而成，后者由植物或酵母中含有的麦角固醇经紫外线照射而成。维生素D的主要功用是促进小肠粘膜细胞对钙和磷的吸收。肠中钙离子吸收需要一种钙结合蛋白，1，25-二羟基维生素D3可诱导此蛋白合成，促进Ca2+吸收，又可促进钙盐的更新及新骨生成，也促进磷吸收与肾小管细胞对钙、磷的重吸收，故可提高血钙、血磷浓度，有利于新骨生成和钙化。
此外维生素D还有促进皮肤细胞生长、分化及调节免疫功能作用。一般成年人经常接触日光不致发生缺乏病，婴幼儿、孕妇、乳母及不常到户外活动的老人要增加维生素D供给量到每日10μg（相当于400国际单位）。缺乏维生素D儿童可患佝偻病，成人患骨质软化症。
目前市场上维生素D检测主要依赖国外进口的大型仪器，如罗氏、贝克曼等，这些大型仪器存在投入大、出值时间久等缺点。与本发明最相似的现有技术实现方案发明人韩雅君申请并获得授权的CN 104062440 A专利介绍了通过免疫层析技术平台检测血清中维生素D激素含量。该发明是一种微球免疫层析定量检测试纸，其包含：试纸检测区，数显区，手柄，样本垫，结合点，NC膜，吸水纸，粘性板低，点样孔，观察窗，读书框，荧光感应器，检测线，质控线，保护膜。现有技术主要的问题主要包括，大型仪器成本大，出值慢；小型便携式仪器，存在出值不稳定，易跳值的问题。
发明内容
针对上述现有技术存在的技术问题，本发明提供一种检测速度快、准确度高、重复性好的用于检测人类维生素D浓度的免疫层析试剂条。
为了达成上述技术目的，本发明采用如下技术方案：
一种用于检测人类维生素D浓度的免疫层析试剂条，包括样品垫、荧光垫、包被硝酸纤维素膜、吸水纸和PVC衬底，所述荧光垫的上方喷抹有维生素D单克隆抗体标记荧光胶乳，所述包被硝酸纤维素膜包括包被有多克隆质控抗体的质控区和包被有维生素D-蛋白偶联物的检测区，所述包被硝酸纤维素膜粘贴于所述PVC衬底的中部，所述样品垫和吸水纸粘贴于所述PVC衬底的两端，所述荧光垫设置于所述样品垫和包被硝酸纤维素膜之间；其中，所述维生素D单克隆抗体标记荧光胶乳由链霉亲和素荧光纳米颗粒与生物素化维生素D单克隆抗体、生物素化质控抗体反应得到。
进一步的，所述生物素化质控抗体由质控抗体与生物素反应得到，所述质控抗体为存在于鸟类、爬行动物和两栖类动物的IGY抗体。
进一步的，所述多克隆质控抗体为抗IGY抗体多克隆抗体。
进一步的，所述维生素D-蛋白偶联物的蛋白包括BSA和OVA。
进一步的，所述链霉亲和素荧光纳米颗粒由链霉亲和素与发光标记物反应得到，所述荧光纳米颗粒为内部含有荧光颗粒的纳米颗粒，所述纳米颗粒包括纳米金颗粒、纳米银颗粒和金纳米棒，所述发光标记物选自荧光素cy5、荧光素cy7、羧基荧光素、2-甲氧基荧光增强素、罗丹明和藻红蛋白中的任意一种。
进一步的，所述免疫层析试剂条的制备方法包括以下步骤：
步骤一，链霉亲和素荧光纳米颗粒制备，取链霉亲和素与荧光纳米颗粒按照质量比（5-15）:1 快速混匀，4℃避光反应2小时，避光透析，得到链霉亲和素荧光纳米颗粒；
步骤二，生物素化维生素D单克隆抗体制备，取维生素D单克隆抗体与生物素按照质量比1:（0.01-0.05）快速混匀，4℃反应2小时，4℃下透析，得到生物素化维生素D单克隆抗体；
步骤三，生物素化质控抗体制备，取质控抗体与生物素按照质量比1:（0.01-0.05）快速混匀，4℃反应2小时，4℃下透析得到生物素化质控抗体。
步骤四，维生素D单克隆抗体标记荧光胶乳制备，取步骤二得到的生物素化维生素D单克隆抗体和步骤三得到的生物素化质控抗体按照质量比1:1混合，充分混匀，得到混合生物素化抗体，再加入步骤一得到的链霉亲和素荧光纳米颗粒，快速混匀，4℃避光反应12小时，得到维生素D单克隆抗体标记荧光胶乳；
其中，所述链霉亲和素荧光纳米颗粒与混合生物素化抗体的质量比为20：（1-10）；
步骤五，荧光垫制备，将步骤四得到的维生素D单克隆抗体标记荧光胶乳稀释1-10倍，再通过喷金仪均匀喷抹在玻纤垫上，得到荧光垫；
步骤六，包被硝酸纤维素膜制备，将多克隆质控抗体通过划线仪包被在硝酸纤维素膜上的质控区，将维生素D-蛋白偶联物通过划线仪包被在硝酸纤维素膜上的检测区，干燥稳定后得到包被硝酸纤维素膜；
步骤七，组装切条，将样品垫、荧光垫、包被硝酸纤维素膜和吸水纸依次粘贴在PVC衬底上，组装得到检测大板，再将检测大板切成宽度2.5-7.5mm试纸条，得到检测人类维生素D浓度的免疫层析试剂条。
进一步的，所述步骤一中链霉亲和素与荧光纳米颗粒的质量比优选为10:1。
进一步的，所述步骤二中维生素D单克隆抗体与生物素的质量比优选为1:0.03。
进一步的，所述步骤三中质控抗体与生物素的质量比优选为1:0.03。
进一步的，所述步骤四中链霉亲和素荧光纳米颗粒与混合生物素化抗体的质量比优选为20：1。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
（1）本发明采用链霉亲和素荧光纳米颗粒与生物素化维生素D单克隆抗体、生物素化质控抗体反应，制备维生素D单克隆抗体标记荧光胶乳，利用链霉亲和素-生物素系统的高度稳定性，提升标记的稳定性，从而提高了本发明的稳定性和重复性；
（2）本发明采用存在于鸟类、爬行动物和两栖类动物的IGY抗体，能够降低检测抗体对质控区显色的影响，提升质控区的荧光强度的稳定性，同时质控抗体配对展层情况与检测项目抗体配对保持一致，从而提升T/C的重复性，进而达到提升检测结果重复性的效果；
（3）本发明采用生物素化维生素D单克隆抗体与生物素化质控抗体等比例混合得到混合生物素化抗体，然后再与链霉亲和素荧光纳米颗粒按照精选比例反应完成检测抗体和质控抗体标记，使链霉亲和素荧光纳米颗粒同时结合的检测抗体和质控抗体的量，及链霉亲和素荧光纳米颗粒分别结合检测抗体和质控抗体的量，最适合于免疫检测反应，提升了灵敏度，提高了检测区和质控区荧光强度比（T/C）的重复性。
附图说明
图1是本发明的结构示意图；
附图说明：1、样品垫；2、荧光垫；3、包被硝酸纤维素膜；4、吸水纸；5、PVC衬底；6、检测区；7、质控区。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。
实施例 1
1.检测人类维生素D浓度的免疫层析试剂条制备
1.1 链霉亲和素荧光纳米颗粒制备，
取浓度为4mg/ml的链霉亲和素（SA）溶液5ml，然后取浓度为10mg/ml的荧光素cy5-纳米金颗粒 200ul，加入链霉亲和素溶液（SA）中，快速混匀，然后在4℃、避光条件下摇床以100rpm 转速混匀，2小时后完成反应，避光透析12小时，每6小时换液一次 ，透析液为0.02M 磷酸盐缓冲液，得到链霉亲和素荧光纳米颗粒。
1.2 生物素化维生素D单克隆抗体制备
取浓度为2mg/ml的维生素D单克隆抗体溶液 1ml，然后取浓度为10mg/ml的生物素（SB）6ul 加入维生素D单克隆抗体溶液中，用移液枪快速吹打混匀，完成混匀后，在4℃条件下摇床以100rpm转速混匀，2小时后完成反应，4℃下透析12小时 ，每6小时换液一次，透析液为0.02M 磷酸盐缓冲液，得到生物素化维生素D单克隆抗体。
1.3 生物素化质控抗体制备
取浓度为2mg/ml的鸡IGY抗体溶液 1ml，然后取浓度为10mg/ml的生物素（SB） 6ul加入质控抗体溶液中，用移液枪快速吹打混匀，完成混匀后，在4℃条件下摇床以100rpm转速混匀，2小时后完成反应，4℃下透析12小时，每6小时换液一次，透析液为0.02M磷酸盐缓冲液，得到生物素化质控抗体制备。
1.4 生物素化质控抗体制备
用0.02M 磷酸缓冲液稀释生物素化维生素D单克隆抗体和生物素化质控抗体至0.5mg/ml，分别取2ml稀释后的生物素化维生素D单克隆抗体和2ml稀释后的生物素化质控抗体，充分混匀，得到4ml混合生物素化抗体溶液，用0.02M 磷酸缓冲液稀释链霉亲和素荧光纳米颗粒制备2mg/mL，取5ml浓度为2mg/ml的链霉亲和素荧光纳米颗粒至离心管内，再向离心管内加入4ml混合生物素化抗体，用移液枪快速吹打混匀，完成混匀后，在4℃环境下反应12小时，得到维生素D单克隆抗体标记荧光胶乳。
1.5 荧光垫制备
用0.02M 磷酸缓冲液将维生素D单克隆抗体标记荧光胶乳稀释液5倍，得到维生素D单克隆抗体标记荧光胶乳工作液，并用喷金仪均匀涂抹与玻纤垫上，喷量1.5ul/cm，得到荧光垫。
1.6 包被硝酸纤维素膜制备
将羊抗鸡IGY抗体通过划线仪包被在硝酸纤维素膜上的质控区（C线），被浓度0.5mg/ml，包被量1ul/cm，将维生素D-BSA联物通过划线仪包被在硝酸纤维素膜上的检测区（T线），包被浓度0.5mg/ml，包被量1ul/cm，37℃烘干12小时，得到包被硝酸纤维素膜。
1.7 组装切条
按照图1将样品垫、荧光垫、包被硝酸纤维素膜和吸水纸依次粘贴在PVC衬底上，组装得到检测大板，再用切条机将检测大板切成宽度4.0mm试纸条，得到检测人类维生素D浓度的免疫层析试剂条。
2 结果检测
2.1 样本收集
收集150例人血清样本（男性81例、女性69例），其中0-15岁样本46例、17-35岁样本52例、36-55岁样本31例、56-75岁样本21例。
2.2 样本检测
选择贝克曼检测系统作为参比，检测收集到的150例人血清样本，将样本稀释后，滴加到本发明的样品垫上，竖向层析10分钟，采用荧光检测仪对本发明的质控区（C线）和检测区（T线）的荧光信号进行检测，将检测到的光信号转变为电信号，得到T值和C值，计算T/C，根据主曲线计算样本的浓度值，并通过荧光检测仪显示浓度值，记录样本的检测结果。
2.3 结果统计
对150例样本的检测结果进行统计分析得到，本发明的检测结果与参比系统的相关性为0.9626，阳性符合率为98%，阴性符合率100%，本发明的重复性为11.3%。
从以上实施例可以看出，本发明的相关性好，检测速度快、检测结果准确，重复性高，能够满足医疗机构快速简洁地检测出人体内维生素D激素含量的需求。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的简单修改或变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (10)
1.一种用于检测人类维生素D浓度的免疫层析试剂条，包括样品垫、荧光垫、包被硝酸纤维素膜、吸水纸和PVC衬底，其特征在于，所述荧光垫的上方喷抹有维生素D单克隆抗体标记荧光胶乳，所述包被硝酸纤维素膜包括包被有多克隆质控抗体的质控区和包被有维生素D-蛋白偶联物的检测区，所述包被硝酸纤维素膜粘贴于所述PVC衬底的中部，所述样品垫和吸水纸粘贴于所述PVC衬底的两端，所述荧光垫设置于所述样品垫和包被硝酸纤维素膜之间；
其中，所述维生素D单克隆抗体标记荧光胶乳由链霉亲和素荧光纳米颗粒与生物素化维生素D单克隆抗体、生物素化质控抗体反应得到。
2.根据权利要求1所述的用于检测人类维生素D浓度的免疫层析试剂条，其特征在于，所述生物素化质控抗体由质控抗体与生物素反应得到，所述质控抗体为存在于鸟类、爬行动物和两栖类动物的IGY抗体。
3.根据权利要求2所述的用于检测人类维生素D浓度的免疫层析试剂条，其特征在于，所述多克隆质控抗体为抗IGY抗体多克隆抗体。
4.根据权利要求1所述的用于检测人类维生素D浓度的免疫层析试剂条，其特征在于，所述维生素D-蛋白偶联物的蛋白包括BSA和OVA。
5.根据权利要求1所述的用于检测人类维生素D浓度的免疫层析试剂条，其特征在于，所述链霉亲和素荧光纳米颗粒由链霉亲和素与发光标记物反应得到，所述荧光纳米颗粒为内部含有荧光颗粒的纳米颗粒，所述纳米颗粒包括纳米金颗粒、纳米银颗粒和金纳米棒，所述发光标记物选自荧光素cy5、荧光素cy7、羧基荧光素、2-甲氧基荧光增强素、罗丹明和藻红蛋白中的任意一种。
6.根据权利要求1所述的用于检测人类维生素D浓度的免疫层析试剂条，其特征在于，所述免疫层析试剂条的制备方法包括以下步骤：
步骤一，链霉亲和素荧光纳米颗粒制备，取链霉亲和素与荧光纳米颗粒按照质量比（5-15）:1 快速混匀，4℃避光反应2小时，避光透析，得到链霉亲和素荧光纳米颗粒；
步骤二，生物素化维生素D单克隆抗体制备，取维生素D单克隆抗体与生物素按照质量比1:（0.01-0.05）快速混匀，4℃反应2小时，4℃下透析，得到生物素化维生素D单克隆抗体；
步骤三，生物素化质控抗体制备，取质控抗体与生物素按照质量比1:（0.01-0.05）快速混匀，4℃反应2小时，4℃下透析得到生物素化质控抗体；
步骤四，维生素D单克隆抗体标记荧光胶乳制备，取步骤二得到的生物素化维生素D单克隆抗体和步骤三得到的生物素化质控抗体按照质量比1:1混合，充分混匀，得到混合生物素化抗体，再加入步骤一得到的链霉亲和素荧光纳米颗粒，快速混匀，4℃避光反应12小时，得到维生素D单克隆抗体标记荧光胶乳；
其中，所述链霉亲和素荧光纳米颗粒与混合生物素化抗体的质量比为20：（1-10）；
步骤五，荧光垫制备，将步骤四得到的维生素D单克隆抗体标记荧光胶乳稀释1-10倍，再通过喷金仪均匀喷抹在玻纤垫上，得到荧光垫；
步骤六，包被硝酸纤维素膜制备，将多克隆质控抗体通过划线仪包被在硝酸纤维素膜上的质控区，将维生素D-蛋白偶联物通过划线仪包被在硝酸纤维素膜上的检测区，干燥稳定后得到包被硝酸纤维素膜；
步骤七，组装切条，将样品垫、荧光垫、包被硝酸纤维素膜和吸水纸依次粘贴在PVC衬底上，组装得到检测大板，再将检测大板切成宽度2.5-7.5mm试纸条，得到检测人类维生素D浓度的免疫层析试剂条。
7.根据权利要求6所述的用于检测人类维生素D浓度的免疫层析试剂条，其特征在于，所述步骤一中链霉亲和素与荧光纳米颗粒的质量比优选为10:1。
8.根据权利要求6所述的用于检测人类维生素D浓度的免疫层析试剂条，其特征在于，所述步骤二中维生素D单克隆抗体与生物素的质量比优选为1:0.03。
9.根据权利要求6所述的用于检测人类维生素D浓度的免疫层析试剂条，其特征在于，所述步骤三中质控抗体与生物素的质量比优选为1:0.03。
10.根据权利要求6所述的用于检测人类维生素D浓度的免疫层析试剂条，其特征在于，所述步骤四中链霉亲和素荧光纳米颗粒与混合生物素化抗体的质量比优选为20：1。
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